발명의 명칭:울다비오시드 A화합물을함유하는상처치료용 조성물

기술분야

[1] 본발명은유근피 //« ' davidiana Planch)추출물로부터분리한을다비오시드

A(Uldavioside A)화합물을유효성분으로함유하는상처치료용� ��성물에관한 것이다.

배경기술

[2] 신체를외부침입자로부터지키고수분과체온을 유지하는피부조직이손상된 것이상처 (wound)이며，상처치료 (wound healing)는손상된조직의기능과형태적 특성을다시정상화시키기위한필수적인반웅이 다.상처가났을때적절히 치료되지않으면세균감염등으로체내장기에치 명적인손상을일으킬수도 있으므로상처발생사손상된피부부위가가능한 한빨리，또본래피부구조와 유사하게복원되도록조취를취하는것이중요하 다.

[3] 상처치료는지혈 (hemostasis)과염증기 (inflammation)의 1단계 ,

증식기 (proliferation)의 2단계및성숙기 (remodeling)의 3단계로이루어지며，각 단계는증첩되어연속적으로진행된다 (Bello Y.M., et al., 2000; Midwood K.S., et al., 2004; Stadelmann W.K., et al., 1998).

[4] 상처가나면첫번째단계인지혈과염증반웅이일 어나는데，지혈은수분내에 혈소판이상처부위로집합하여섬유소성웅고 (fibrin clot)를형성하는반웅으로 출혈을막는역할을한다 (Midwood K.S., et al., 2004; Sandeman S.R., et al., 2000). 염증반웅은박테리아나조직잔해들이식균작용 (phagocytosis)에의해

제거되면서마크로파지 (macrophage)로부터여러사이토카인 (cytokine)들이 방출되어증식기에분화 (differentiation)되는세포의이주 (migration)와

분열 (mitosis)을둡게된다.

[5] 두번째단계인증식기에는신생혈관형성,콜라� �축적,육아조직 (granulation tissue)형성，상피화 (epithelialization),상처수축등이일어난다 (Midwood K.S., et al., 2004; Chang H.Y., et al., 2004).이시기는상처유합과교원질섬유 (collagenous fiber)의재배열을위한초기단계로서섬유아세포 (fibroblast)들이상처부위에 출현하게된다 (Byl N.N., etal., 1992).

[6] 최종적으로성숙기에는상처의공간이육아조직 으로완전히대체되고혈관 생성이최고조에달하며교원섬유의양이풍부해 져상피세포가점점정상 두께를회복하여상처치료가완료된다 (Galeano M., et al, 2008; Garg H.G., et al., 2000).

[7] 상처치료의단계증염증기에파괴돤조직,이물� �,괴사된조직의잔해등이 염증세포에의해제거되지않으면다음단계인증 식기로넘어갈때상차치료 과정이지연되기때문에염중기의역할이매우중 요하다 (Enoch P., et al., 2004).

[8] 염증기에일어나는반웅을자세히살펴보면，조 직손상시국소혈관이

수축되었다가상처부위에서히스타민 (histamine),브라디키닌 (bradykinin), 프로스타글란딘 (prostaglandin),세로토닌 (serotonin),

노르에피네프린 (norepinephrine)등이방출됨에따라혈관이확장된� �.확장된 혈관으로인해내피세포사이에름이생기게되고 ,이러한틈사이로혈장과 백혈구가；간질액으로빠져나가게된다.조직� �손상된후수시간내에 다형핵백혈구 (polymorphonuclear leukocyte)는보체 (complement)의영향을받아 상처부위로이동하게되며그곳에서손상된조직 잔해와세균을포식한다.상처 생성후몇시간이지나면마크로파지도손상부위 에도달하여식균작용을하게 되는데，활성화된마크로파지는여러사이토카 인과활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)을생성하여염증반웅의전사인자인 NF-KB(nuclear factor-κΒ)를 활성화시키고,그결과 iNOS(inducible nitric oxide ^: synthase)와

COX-2(cyclooxygenase-2)의발현과활성을증가시켜과� ��의 NO(nkric oxide)와 PGE ₂ (prostaglandin E2)를생성함으로써염증반웅을일으킨다.또한

마크로파지로부터생성된활성산소종은상처부 위의박테라아를제거해감염을 예방하고세포내 2차신호전달물질 (second messenger)로작용하여상처치료 단계에서필수적인역할을한다.그러나활성산� �종이과다하게생성되면 상처부위에산화적스트레스 (oxidative stress)를유발하여염증반웅매개물질의 발현을조절함으로써상처치료시염증반웅에영 향을미쳐상처치료속도를 늦추는것으로알려져있어과도한활성산소종의 생성을억제하는항산화 물질을찾으려는시도가이루어지고있다 (박은교, 2011).

[9] 유^피 (JJlmus davidiana Planch)는느롭나무과 (Ulmaceae)에속하는느롭나무(

C/ / davidiana var. ^pcra ^' ra Nakai)의코르크층을벗긴수피및근피를건조한 것이다.한방에서유근피는맛이달고，무독하� �，종창，관절염，위궤양，위장병 등에사용되고，거담,항암，상처치료약및염� �에도탁월한효과가있다고 보고되어있다 (Duke J.A., 1985).유근피증에존재하는천연물로서

β-시:토스테롤 (β-sitosterol),피토스테를 (phytosterol),스티마스테롤 (stimasterol), 탄닌 (tannin),전분 (starch),다당류 (polysaccharide)등이존재한다.또한

진통작용을나타내는성분인프리델린 (Medelin)과

에피프리엔데라를 (epifriendelalol),타락세를 (taraxerol)등의분리 (Matsuzaki T., et al„ 1985)와화학적조성에관한연구 (Duke J.A., 1985)등이많이이루어져 있으나유근피의다양한생리활성을연구한시도 는아직까지거의이루어지지 않았다.

[10] 이에，본발명자는유근피의추출물을함유하는 상처치료조성물을연구하는 과정에서,유근피추출물로부터분리된울다비� �시드 A화합물이상처치료 효능이뛰어남을확인함으로써본발명을완성할 수있었다.

[11] 종래선행기술로서한국공개특허제 2000-0041190호에는유백피를포함하는 약제조성물의염증,상처와같은질환의예방및� �료가기재되어있고， 한국공개특허제 2004-0050154호에는유근피추출물을함유하는상처 치료용 조성물이기재되어있어있으나,울다비오시드 A화합물이기재된바가없어본 발명의구성과차이가：있다.한국등록특허제 0893166호에는느롭나무추출물의 섬유아세포의증식및항산화효과가기재되어있 으나，울다비오시드 A화합물 및상처치료는언급된바가없어본발명의구성과 차이가있다.

[12] 또한，비특허문헌으로서 Son B.W., et al.은느롭나무에서분리한을다비오시드 A화합물이기재되어있으나，상처치료효과는� �재된바가없다.

발명의상세한설명

기술적과제

[13] 본발명의목적은유근피 ( mi davidiana Planch)추출물로부터분리한

울다비오시드 A(Uldavioside A)화합물을유효성분으로함유하는상처치료용 조성물을제공하는데에있다.

과제해결수단

[14] 본발명은하기화학식 1의울다비오시드 A(Uldavioside A)화합물을

유효성분으로함유하는상처치료용조성물에관 한것이다.

[15] [화학식 1]

[17] 상기상처는창상，욕창，화상，찰과상,천자,� ��양성창상，자상，활성산소에 의한만성피부창상，타박상,절상,인후또는구� ��점막의창상,열상,당뇨병성 궤양，하지궤양，고혈압허혈궤양，정맥궤양 및족부궤양으로이루어진군에서 선택될수있다.

[18] 상기조성물은울다비오시드 A화합물이조성물총증량에대하여

0.001 ~50중량 %로함유될수있다.

[19] 상기조성물은경구용투여제,스프레이제,겔제, 연고제，크림제또는외용제로 제형화된약학적조상물일수있다.

[20] 이하본발명을상세하게설명한다.

[21] 본발명은하기화학식 1의을다비오시드 A화합물을유효성분으로함유하는 상처치료용조성물에관한것이다.

[22] [화학식 1]

[24] 상기화학식 1의울다비오시드 A화합물은통상적인방법에따라합성할수 있으며，약학적으로허용가능한염으로제조될 수도있으며,또는유근피 추출물로부터분리，정제될수있다.

[25] 상기유근피는느롭나무과 (Ulmaceae)에속하는느롭나무 (t/Z/ davidiana var. japonica Nakai)의코르크층을벗긴수피및근피를건조한것 이다.

[26] 상기유근피추출물은유근피를물, C1내지 C4의저급알코올또는이들의

흔합용액을용매로하여추출할수있다.상기 C1내지 C4알코올은메탄올， 프로판올,이소프로판올，부탄올및이소부탄� �로이루어진군에서선택될수 ¾다.바람직하게는물로추출한다.

[27] 상기유근피추출물로부터분리된화합물은컬럼 크로마토그래피를이용하여 정제할수있다.상기크로마토그래피는실리카� �컬럼크로마토그래피 (silica gel column chromatography), HP-20컬럼크로마토그래피 (HP-20 column

chromatography), RP-18 ¾ ¾크로마토그래피 _. (RP- 18 column chromatography), LH-20컬럼크로마토그래피 (LH— 20 column chromatography),고성능액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography)등에서선택하여 사용할수있다.

[28] 상기상처치료용조성물은피부조직이손상된상 처를치료하기위한것으로， 상기상처는,창상，욕창，화상,찰과상，천자� ��궤양성창상，자상,활성산소에의한 만성피부창상，타박상，절상,인후또는구강� �막와창상,열상,당뇨병성궤양, 하지궤양,고혈압허혈궤양,정맥궤양및족부궤� ��으로이루어진군에서선택될 수있다.

[29] 상기당뇨병성궤양은당뇨병성족부궤양일수있 다

[30] 상기조성물은상기화학식 1의울다비오시드 A화합물및부형제를포함하는 약학적조성물을제공한다.상기울다비오시드 A화합물은조성물총중량에 대하여 0.001-50중량 %，바람직하게는 0.001~40중량%，더바람직하게는

0.001 30중량 %로하여함유될수있다.

[31] 상기약학적조성물은,각각통상의방법에따라� �제，과립제，정제，캡술제, 현탁액，에멀젼，시럽,에어로졸，스프레이� �의경구형제형，외용제，좌제및 멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있 다.상기약학적조성물에 포함될수있는담체,부형제및희석제로는락토� �,덱스트로즈，수크로스， 솔비톨，만니를，자일리를，에리스리를，말 티를，전분,아카시아고무，

알지네이트，젤라틴，칼슘포스페이트,칼슘� �리케이트，셀를로즈,메틸

셀를로즈,미정질셀롤로스，:폴리비닐피를리� ��，물,메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트,탈크，마그네슴� �테아레이트및광물유를들수 있다.제제화할경우에는보통사용하는층진제� �증량제，결합제，습윤제, 붕해제，계면활성제등의희석제또는부형제를 사용하여조제된다.경구투여를 위한고형제제에는정제，환제，산제，과립제 ,캡슐제등이포함되며 ,이러한 고형제제는본발명의울다비오시드 A화합물에적어도하나이상의부형제, 예를들면，전분,：탄산칼슘，수크로스또는� �토즈，젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슴스테아레이 트，탈크같은윤활제들도 사용된다.경구를위한액상제제로는현탁제，� �용액제，유제，시럽제등이 해당되는데흔히사용되는단순희석제인물，리 퀴드파라핀이외에여러:가지 부형제,예를들면습윤제,감미제,방향제，보존 제등이포함될수있다.비경구 투여를위한제제에는멸균된수용액,비수성용� �,현탁제,유제，동결건조제제， 좌제가포함된다.비수성용제，현탁제로는프� �필렌글;리콜,폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름，에틸올레이트 와같은주사가능한에스테르 둥이사용될수있다.좌제의기제로는위텝솔 (witepsol),마크로골，

트원 (tween)-61 ,카카오지,라우린지，글리세로제라틴등이사� ��될수있다.

[32] 상기상처치료용조성물은경구용투여제,스프� �이제,겔제,연고제，크림제 또는외용제로제형화된약학적조성물일수있으 나,이에한정되지는않는다.

[33] 본:발명의약학적조성물의투여량은치료받을� �상의연령,성별，체중과, 치료할특정질환또는병리상태,질환또는병리� �태의심각도,투여경로및 처방자의판단에따라달라질것이다.이러한인� �에기초한투여량결정은 당업자의수준내에있으며，일반적으로투여량 은 0.01 rag/kg/일내지대략

2000mg/kg/일의범위이다.더바람직한투여량은; lmg/kg/일내지 500mg/kg/일이다. 투여는하루에한번투여할수도있고,수화나누� �투여할수도있다.상기 투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정 하는것은아니다.

[34] 본발명의약학적조성물은쥐,가축,인간등와포� ��동물에:다양한경로로

투여될수있다.투여의모든방식은예상될수있� �데，예를들면，경구，직장 또는정맥,근육：,피하，자궁내경막또는뇌혈� ��내주사및피부도포에의해 투여될수있다.본발명의화합물은독성및부작� �이거의없으므로예방 목적으로장기간복용시에도안심하고사용할수 있는약제이다.

발명의효과

[35] 본발명은유근피 Ulm davidiana Planch)추출불로부터분리한울다비오시드 A(Uldavioside A)화합물을유효성분으로함유하는상처치료용� ��성물에관한 것으로，상기울다비오시드 A화합물이상처치료효능이있음을확인하였다. [36] 이를통해，본발명의을다비오시드 A화합물이창상,욕창,화상，찰과상，천자 궤양성창상，자상,활성산소에의한만성피부� �상，타박상，절상，인후또는 구강점막등의창상,열상및당뇨병성궤양，하� �궤양，고혈압허혈궤양， 정맥궤양및족부궤양등과같은상처치료제로용 이하게이용될수있을것으로 기대된다.

도면의간단한설명

[37] 도 1은본발명의울다비오시드 A(Uldavioside A)화합물에대한 ΉΉ

COSY(bold lines)및 ¾- ¹³ C HMBC상관관계 (arrow)를나타내는그림이다.

[38] 도 2는본발명의을다비오시드 A화합물의 C2C12(A)및 NIH3T3(B)

세포에서의세포독성결과를보여주고있다. ^: ：

[39] 도 3은본발명의을다비오시드 A화합물의염증스트레스에대한 C2C12(A, B) 및 NIH3T3(C, D)세포에서의상처치료효과를보여주고있다.

[40] 도 4는본발명의을다비오시드 A화합물의당산화적스트레스에대한

C2C12(A, B)및: NIH3T3(C, D)세포에서의상처치료효과를보여주고있다. .

[41] 도 5는본발명의울다비오시드 A화합물의동물모델에서의창상치료효과를 보여주고있다. (A)는울다비오시드 A화합물처리시간에따른상처부위 이미지를， (B)는상처부위를정량화한그래프를보여주고있 다.

[42] 도 6은본발명의울다비오시드 A화합물의동물모델에서의창상치료에따른 조직학적변화를관찰한결과를보여주고았다. (A)는 H&E염색결과를, (B)는 트리크롬염색결과를보여주고있다.

[43] 도 7은본발명의울다비오시드 A화합물의동물모델에서의창상치료에따른 혈관생성관련단백질인 VEGF와 CD31(A)및조직재생관련단백질인 bFGF와 β-카테닌 (B)의발현정도를확인한결과를보여주고있다.

[44] 도 8은고당환경에서의본발명의울다비오시드 Α화합물의당산화적

스트레스에대한 HDF(A)및 C2C12(B)세포보호효과를보여주고있다:.

[45] 도: 9는본발명의을다비오시드 A화합물의당뇨병유발동물모델에서의

원형절상치료에따른상처부위의이미지 (A)및상처부위의크기를정량화한 결과 (B)를보여주고있다.

발명의실시를위한최선의형태

[46] 이하본발명꾀바람직한실시예를상세히설명하 기로한다.그러나본발명은 여기서설명되는실시예에한정되지않고다른형 태로구체화될수도있다. 오히려,여기서：소개되는내용이철저하고완� �해지고，당업자에게본발명의 사상을충분히전달하기위해제공하는것이다 . ^:

[47] <실시예 1.울다비오시드 A화합물의분리 >

[48] 유근피 ( m davidiana Planch)는농가에서:건조한것을구입하여사용하� ��다. 건조된유근피 10g에정제수 를첨가한후반연속식저온진공추출기로

25°C에서 12시간동안처리하는것을 3회반복하여유근피추출물을추출하였고， 여과지를이용하여불순물을제거하여유근피열 수추출물을얻었다.유근피 열수추출물을 30%메탄올， 50%메탄올， 70%메탄을， 100%메탄올순으로 극성을높여가며등용매용출조건으로하여디아 이온 HP-20컬럼

크로마토그래피 (Diaion HP-20 column chromatography)를수행하여 3개의 분획물을얻었다 (Fr. E-1-E-3).이중 Fr. E-1을 70%메탄올등용매로등용매용출 조건에따른세파덱스 LH-20컬럼크로마토그래피 (sephadex LH-20 column chromatography)을수행하여울다비오시드 A화합물 (9mg)을분리하였다.

<실시예 2.울다비오시드 A화합물의물리화학적구조확인>

Uldavioside A;

연갈색분말;

Ή NMR및 ^l3 C NMR데이터는하기표 1참조;

ESI-MS [M+H] ⁺ m/z 423.1, C ₂₀ H ₂₂ O ₁₀ .

[표 1]

^! C NMR (150 MHz in C1 0D) spectroscopy data'

'Ή NiVIR (600 MHz in CD ₃ OD) spectroscopy data <실험예 1.동물세포의배양 >

본발명의울다비오시드 A화합물의활성을확인하기위해동물세포를 배양하였다.이때동물세포는근세포주 (myoblast)인 C2C12세포및

섬유아세포주 (fibroblast)안 NIH3T3와 HDF(human diploid fibroblast)세포를 이용하였다.각각의세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100U/m£의 페니실린 (penicillin)및 100 zg/m의스트랩토마이신 (streptomycin)이포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지를넣고 37°C, 5% C0 ₂ 배양기에서배양하였다.

[57] <실험예 2.울다비오시드 A화합물의세포독성확인 >

[58] 본발명의울다비오시드 A화합물에의한세포독성여부를

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)어세이방법을 이용해확인하였다.

[59] 상기실험예 1에서배양한 C2C12및 NIH3T3세포를 48웰플레이트에웰당 lxlO ⁵ 개세포가되도록분주하여 24시간동안배양한후， 0.5% FBS, IOOU/I 의 페니실린및 100 g/ 의스트렙토마이신이포함되어있는 DMEM배지를넣고 18시간동안배양하였다. 18시간배양후,울다비오시드 A화합물을 ΙμΜ및 ΙΟμΜ로처리하고， 24시간동안배양하였다.이때아무것도처리하지 않은 C2C12및 ΝΙΗ3Τ3세포를대조군으로이용하였다. 24시간후에세포에 .

10( g/i 의농도로 MTT용액을처리하고 37 ⁰ C에서 3시간반응시킨후배양액을 제거하고형성된포마잔 (formazan)침전물을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 로 녹이고 570nm에서흡광도를측정하였고，그결과를도 2에나타내었다.

[60] 도 2에서：보여주듯이，을다비오시드 A화합물을처리한 C2C12(2A)및

NIH3T3(2B)세포의생존율이아무것도처리하지않� �대조군에비해

증가하였다.

[61] 이를통해,본발명의을다비오시드 A화합물이세포：독성을나타내지않음을 알수있었다.

[62] <실험예 3.울다비오시드 A화합물의상처치료효과확인 >

[63] 본발명의울다비오시드 A화합물의처리에따른상처치료효과를확인하� � 위해상처치료어세이 (Wound healing assay)를수행하였다.

[64] 실험예 3-1.염증스트레스께의한상처치료효과확인

[65] 상기실험예 1에서배양한 C2C12및 NIH3T3세포를 12웰플레이트에웰당 1><10 ^& 개세포가되도록분주하여 24시간동안배양하여안정화시킨후， 0.5% FBS, 100U/m의페니실린및 100/ig/ 의스트렙토마아신이포함되어있는 DMEM배지를넣고 18시간동안배양하였다. 18시간배양후，세포가자라고 있는웰의중앙에 0.9醒정도의상처 (scratch)를내고 10μΜ의울다비오시드 A 화합물을처리하며 1시간동안전반응시켰다. 1시간후에염증스트레스자극을 주기위해 lO/ g/mg의 LPS(lipopoIysaccharide)를처리하고배양하면서세포� �� 이동을관찰하였다.이때， 0， 12및 24시간마다세포를고정액 (2%

formaldehyde와 0.2% gkitaraldehyde)으로고정하고, 0.3%크리스탈

바이올렛 (crystal violet)으로염색한후현미경을이용하여세포의� �동을 확인하고，상처를낸부위로의세포이동에따른 면적감소를분석하여，그 결과를도 3에나타내었다.이때,울다비오시드 A화합물을전반응시키지않고, LPS로염증스트레스자극을준것을대조군으로이 용하였다.

[66] 도 3에서보여주듯이,본발명의울다비오시드 A화합물을처리한경우에

대조군에비해염증스트레스에대한세포이동이 C2C12(3A, 3B)및 NIH3T3(3C, 3D)세포에서모두증가하였고，특히나 NIH3T3세포이동활성이더높게 나타났다,

[67] 실험예 3-2.당산화적스트레스에의한상처치료효과확� �

[68] 당뇨병은혈액내당이분해되는과정에서산화스 트레스로인해합병증이가장 많이발생하는질환이다.세포내에서당이분해� �는과정에서글루코스 산화효소 (glucose oxidase)는과산화수소 (H ₂ 0 ₂ )를생성하여당산화적스트레스를 유발한다. 따라서，본발명의울다비오시드 A화합물이당산화적스트레스에 의한상처치료효과를확인하였다.

[69] 상기실험예 3-1과동일한방법으로실험을진행하였고,당산� �적스트레스 자극을주기위해 LPS대신 7mU/m£의글루코스산화효소를처리하였고，그 결과를도 4에나타내었다.

[70] 도 4에서보여주듯이，본발명의:울다비오시드 A화합물을처리한경우，

대조군에비해당산화적스트레스에대한세:포� �동이 C2C12(4A, 4B)및

NIH3T3(4C, 4D)세포에서모두증가하였고，특히나 NIH3T3세포이동활성이더 높게나타났다. ：

[71] 상기도 3및 4의결과를통해，본발명꾀울다비오시드 A화합물이염증

스트레스및당산화적스트레스등에의한상처의 치료효과가우수함을알수 있었다.

[72] <실험예 4.울다비오시드 A화합물의창상치료효과확인 >

[73] 실험예 4-1.육안관찰을통한창상치료효과확인

[74] 본발명의울다비오시드 A화합물에의한창상치료효과를확인하기위해

동물실험을진행하였다.

[75] 7~8주령의 Sprague-Dawley흰쥐의뒷다리를제모하고， 70%알코올로소독한 후에직경 3cm원형의전층창상을만들었다.전층창상을만� �후에무작위 배정하여본발명의울다비오시드 A화합물을처리하지않은대조군과 처리군으로나누었다.처리군은창상을유발한� �일에을다비오시드 A화합물 0.025중량 ^< ¾가포함되어있는연고 (하기제제예 1-2)를처리하고멸균한한지로 상처를감싸고습윤환경이유지되도록밴드와반 창고를이용하여상처를 고정하였으며 ,대조군은을다비오시드 A화합물이포함되자않은연고를 처리하였다.이후,창상유발 3일， 7일, 1:0일 14일째에상처부위를관찰하고， 상처부위의크기를정량화하여，그결과를도 5에나타내었다ᅳ

[76] 도 5의상처부위이미지 (5A)및상처부위를정량화한그래프 (5B)에서

보여주듯이，대조군과대비하여：울다비오시 드 A화합물을처리한군에서는 7일째부터상처부위가회복되는현상이나타났� �며， 14일째에는상처가거의 치료된것을확인하였다. [77] 이를통해,본발명의을다비오시드 A화합물이창상에의한상처치료효과가 우수함을알수있었다.

[78] 실험예 4-2.창상치료에따른조직학적변화관찰

[79] 본발명의울다비오시드 A화합물에의한창상치료효과를확인하기위해 _: 창상유도동물의조직을이용하여조직학적변화 를관찰하였다.

[80] 상기실험예 4-1에서창상치료효과를관찰한후，쥐를희생하 여창상부위의 근육조직을생검하여조직을채취하였다.채취� �조직을 10%

포르말린 (formalin)에 24시간처리하여고정화시켰다.고정된조직을

파라핀 (paraffin)으로포매하고， 5β 두께로절편화하여조직절편을만들었다. 조직절편을탈파라핀,함수，수세과정을거친� �， H&E염색 (hematoxylin & eosin stain)또는트리크롬염색 (Masson's trichrome stain)을하고광학현미경을 이용하여상처회복에관련된조직학적변화를분 석하였고,：그결과를도 6에 나타내었다.

[81] 도: 6(A)의 H&E염색결과에서:보여주듯이,을다비오시드 A화합물을투여한 군에서는창상유발 3일차에면역세포와유입이줄어들고, 7일차부터는 신생혈관생성과육아조직의형성이활발하게진 행되고, 10일차부터

섬유아세포의증식이활발하게나타났다.반면� �대조군의경우에는창상유발

3일차에을다비오시드 A화합물처리군에비해면역세포의유입이많았� �이는

7일차까지지속되었다. 10일차에육아조직의형성이나타났고,섬유아세 포의 증식은관찰되지않았다.

[82] 트리크름염색의경우에는조직내콜라겐을확인 하기위한것으로，콜라겐의 생성은진피내의상처가회복되어피부조직의기 능이회복되었음을의미한다.

[83] 도: 6(B)의트리크름염색결과에서보여주듯이，울� �비오시드 A화합물을

투여한군에서는창상유발 7일차에염색된콜라겐의양이대조군에비해 ^: 현저히증가한것을관찰하였고， 14일차에는조직대부분에서콜라겐이생성된 것을확인하였다.

[84] 이를통해,본발명의울다비오시드 A화합물이창상에의한상차치료효과가 뛰어나다는것을알수있었다.

[85] 실험예 4-3.창상치료에따른혈관생성및조직재생관련� �백질의변화확인

[86] 본발명의을다비오시드 A화합물에의한창상치료효과를확인하기위해� � 상처치료과정에서나타나는혈관생정및조직재 생에관련된단백질들의발현 변화를관찰하였다.

[87] 상기실험예 4-2에서제작한 10일차의조직절편을탈과라핀，함수，

수세과정을거찬후，조직내혈관생성관련단백 질인 VEGF(vascular endothelial growth factor)와 CD31,조직재생관련단백질인 bFGF(basic fibroblast growth factor)와 β-카테닌 (β-catenin)의항체를이용하여

면역조직화학염색 (immunohistochemistry, IHC)을수행하였고,각각의단백질의 발현을분석하여,그결과를도 7에나타내었다. . [88] 도 7의면역조직화학염색결과에서보여주듯이，� �다비오시드 A화합물을 투여한군의경우，혈관생성관련단백질인 VEGF와 CD31(7A)및조직재생 관련단백질인 bFGF와 β-카테닌 (7B)의발현량이대조군에비해증가된것을 확인하였다.

[89] 이를통해，본발명와울다비오시드 Α화합물이상처：치료과정에서나타나는 혈관형성과조직재생을촉진함으로써우수한상 처치료효과를나타낸다는 것을알수있었다.

[90] <실험예 5.울다비오시드 A화합물의당뇨병상궤양치료효과확인 >

[91] 실험예 5-1.울다비오시드 A화합물의당산화적스트레스에대한세포보호 활성확인

[92] 본발명의울다비오시드 A화합물의당산화적스트레스에대한세포보호 활성을확인하였다.

[93] 실험예 1에서배양한 C2C12및 HDF세포를 48웰플레이트에웰당 lxlO ⁵ 개 세포가되도록각각분주하여 24시간동안배양한후， 50mM의

D-글루코스 (D-glucose)를처리하여고당 (high glucose)상태의환경을

만들어주었다.이후에울다비오시드 A화합물을 ΙΟμΜ및 20μΜ로처리하였고, 1시간후에 7mU/n^의글루：코스산화효소를처라하고 24시간동안배양하였다. 이때，아무것도처리하지않은 C2C12또는 HDF세포를대조군 1로，고당상태의 세포를대조군 2로，고당상태에서글루코스산화효소를처리� �세포를대조군 3으로이용하였다. 24시간후에각각의세포에 lOO/ g/i 의농도로 MTT용액을 처리하고 37°C에서 3시간반웅시킨후배양 ^: 액을제거하고형성된포마잔 침전물올 DMSO 200 로녹이고 570nm에서흡광도를측정하였고:,그결과를도 8에나타내었다.

[94] 도: 8에서보여주듯이，고당환경에서글루코스산� �효소에의한당산화

스트레스 (대조군 3)에의해 HDF(8A)및 C2C12(8B)세포모두세포생존율이 감소한반면에，본발명의을다비오시드 A화합물을처리한경우에는농도 의존적으로당산화스트레스에의한세포생존율 감소가억제되는것을 확인하였다：

[95] 이를통해，울다비오시드 A화합물이높은당수치의환경에서당산화적

스트레스에대한세포보호효과가있음을알수있 었고，이는상처치료속도가 느린당뇨병환자에서본발명의을다비오시드 A화합물이효과적으로상처를 치료할수있음을예측할수있다.

[96] 실험예 5-2.울다비오시드 A화합물의당뇨병성궤양치료효과확인

[97] 본발명의울다비오시드 A화합물에의한당뇨병성궤양의치료를확인하� � 위해동물실험을진행하였다. ：

[98] 7주령의체중이약 300g인수컷 Sprague-Dawley흰쥐에

스트렙토조토신 (streptozotocin)을 60mg/kg이되도록복강주사하여당뇨병을 유발하였다ᅳ 3일후에꼬리정맥으로부터정맥혈을채취하여� �당측정기로 혈당을측정하여,혈당이 300mg/d£이상인흰쥐만선정하였다ᅳ선정한흰쥐 의 등부위를제모한후，귀로부터 4~5cm정도떨어진등부위를펀치를이용하여 직경이 1cm또는 1.5cm가되도록원형절상을만들었다.원형절상을 만든후에흰 쥐를무작위배정하여본발명의울다비오시드 A화합물을처리하지않은 ： 대조군과처리군으로나누었다.처리군은원형� �상을유발한당일에

울다비오시드 A화합물 0.025중량%가포함되어있는연고 (하기제제예 1-2)를 처리하고멸균한:한지로상처를감싸고습윤환� �아유지되도록밴드와 반창고를이용하여상처를고정하였으며，대조 군은을다비오시드 A화합물이 포함되지않은연고를처리하였다.이후，원형� �상유발후 2일간격으로 8일 동안상처부위를관찰하고，상처부위의크기를 정량화하여，그결과를:도 9에 나타내었다.

[99] 도 9의당뇨방유발동물모델에서의원형절상상처� �위이미지 (9A)및상처 부위크기를정량화한그래프 (9B)에서보여주듯이,대조군과대비하여 울다비오시드 A화합물을처리한군에서는 4일째부터상처부위가회복되면서 상처의크기가현저히감소되는것을확인하였다 .

[100] 이를통해,본발명의울다비오시드 A화합물이당뇨병의합병증인당뇨병성 궤양의치료효과가있음을알수있었다.

[101] <제제예 1.약학적제제 >

[102] 제제예 1 겔제형약학적제제

[103] 조제용기에플루로닉 F-127(BASF Co.제품) 15중량 <¾를 pH 6.0완충액에넣은 후천천히교반한다음 4°C에서 20시간방치하여맑은점조성의액체를얻었다. 별도의용기에 pH 6.0완층액에본발명의울다비오시드 A화합물

0.0025중량 ^< ¾를넣은후교반하여용해시킨다음조제용� ��에투입하고 교반하였다.또다른별도와용기에에탄올 4중량

파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1중량 %및파라옥시안식향산프로필에스테르 0.1중량 %를투입한후교반하고용해시킨다음조제용기� �투입하였다.투입된 흔합물을 20분동안교반한다음냉장고에서 4~5시간동안방치함으로써 미황색의점조성액을얻었다.얻어진점조성액� �서겔이얻어질때까지서서히 가온하였다.

[104] 제제예 1-2.연고제형의 약학적제제

[105] 조제용기에백색바셀린 15중량 ^« ¾,세토스테아릴알콜 10중량 %,

경질유동파라핀 7중량 %및세토마크로골 1.5중량 %를약 65 ⁰ C로가온하여 용융시킨다음용융된액을 100메쉬체로여과하였다.별도의용기에정제수� � 붓고본발명의울다비오시드 A화합물 0.025중량 %를넣어교반하고용해시킨 다음조제용기에투입하였다.또다른별도의용� �에 95°C의열탕정제수에 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.12중량 %，파라옥시안식향산프로필에스테르

0.08중량 %를용해시켜조제용기에투입한다음약 20분동안교반시킨후 호모게나이저로약 20분동안 2500rpm의속도로유화시킨다음유화가완료되면 천천히교반하면서냉각하였다.

[106] 제제예 1-3.정제의제조

[107] 본발명의을다비오시드 A화합물 200g을락토즈 175.9g,감자전분 180g및 콜로이드성규산 32g과흔합하였다.이흔합물에 10%젤라틴용액을첨가시킨 후，분쇄하여 14메쉬체를통과시켰다.이것을건조시키고여기 에감자전분 160g，활성 50g및스테아린산마그네슘 5g을첨가해서얻은흔합물을정제로 만들었다.