CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A invenção refere-se a um kit denominado X-PEI para transfecção celular e método utilizando o kit.

[2] Adicionalmente, a tecnologia possui aplicação nas áreas de biotecnologia, especificamente na área de biologia celular e molecular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA

[3] A técnica de transfecção celular compreende o processo de introdução intencional de ácidos nucleicos em células, procedimento importante em investigações fundamentais na área de biologia celular e molecular, além de aplicações no contexto farmacêutico, como na terapia gênica e vacinas de DNA. A técnica permite estudar os efeitos ocasionados pela intensificação ou repressão da expressão de genes específicos em pesquisas básicas e aplicações biotecnológicas .

[4] Atualmente, estão disponíveis no mercado diferentes métodos de transferência de ácidos nucleicos para células baseados em sistemas virais ou não-virais. De maneira geral os sistemas virais apresentam alta eficiência, entretanto, seu uso pode apresentar restrições, como a capacidade de acionar respostas de caráter imunológico, bem como alterações indesejadas no perfil de expressão gênica e metabólico das células-alvo inerentes da ação do vírus. Outras limitações incluem: necessidade de laboratório de segurança biológica compatível à manipulação virai, elevado custo, necessidade de qualificação do manipulador e incompatibilidade com alguns tipos celulares.

[5] As técnicas envolvendo transfecções celulares não- virais apresentam menor toxicidade e imunogenicidade [Davis, M. E. Non-viral gene delivery systems. Curr. Opin. Biotechnol. (2002) 13, 128-131] . Destacam-se o uso de sistemas baseados em compostos lipídicos catiônicos, formando lipossomos, que envolvem o ácido nucleico e são combinados com a membrana celular para posterior incorporação à célula-alvo. Alternativamente, polímeros catiônicos de polietilenoimina (PEI) atuam formando complexos com ácidos nucleicos antes de serem internalizados pelas células-alvo pelo mecanismo de endocitose. De fato, o complexo formado protege o ácido nucléico da degradação lisossomal em função da neutralização de suas cargas positivas [Boussif O, LezoualCh F, Zanta MA, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995; 92 (16) : 7297-7301] .

[6] Os reagentes de transfecção celular baseados em lipídios apresentam elevado custo, o que pode afetar experimentações em larga escala. Até o momento, dentre os diferentes agentes utilizados para transfecção, os derivados de PEI são menos onerosos, entretanto, em muitas situações observa-se que sua eficiência é inferior. Para melhorar a eficiência do processo de transfecção por um agente comercial baseado em PEI (jetPEI - 101- ION Polyplus Transfection, Illkirch, França) , o mesmo foi combinado com o ciclopirox olamina (CPX) . O CPX possui propriedades anticâncer [Minden MD1, Hogge DE, Weir SJ, Kasper J, et al. Ο ^χ -al ciclopirox olamine displays biological activity in a phase I study in patients with advanced hematologic malignancies. Am J Hematol. (2014) Apr; 89 (4) : 363-8 ; Sen SI, Hassane DC, Corbett C, et al. Novel mTOR inhibitory activity of ciclopirox enhances parthenolide antileukemia activity. Exp Hematol. (2013) ;Sep;41 (9) :799-807] e anti-HIV [Hanauske- Abel HM, Saxena D, Palumbo PE, Hanauske AR, et al. Drug- induced reactivation of apoptosis abrogates HIV-1 infection. PloS One (2013); 8(9): e74414] . Entretanto, não há registro da utilização combinada de ambos compostos visando a intensificação da transferência celular de ácidos nucleicos, o que confirma a originalidade da presente invenção.

[7] O documento de patente US8785200 refere-se a compostos de lipídios catiónicos e composições de agregados lipidicos que permitem a transferência de macromoléculas e outros compostos para o interior celular, podendo ser utilizado para culturas celulares em suspensão não-aderentes e sistemas in vivo. A tecnologia tem desvantagem por apresentar custo superior quando comparado à utilização de PEI e também se limitar à utilização em células que o agente não cause toxicidade significativa. Diferentemente, a presente tecnologia refere-se a um kit composto pela combinação de PEI e CPX que tem a vantagem de mediar a transfecção celular por um processo que não envolve agregados lipidicos. Desta forma, não apresenta as desvantagens dos compostos lipidicos.

[8] O documento de patente US20060228406 descreve um reagente lipossomal para transfecção celular e um método para preparação e utilização do reagente. A tecnologia tem desvantagem por apresentar custo superior quando comparado à utilização de PEI e também se limitar à utilização em células que o agente não cause toxicidade significativa. Diferentemente, a presente tecnologia refere-se a um kit composto pela combinação de PEI e CPX que tem a vantagem de mediar a transfecção celular por um processo que não envolve agregados lipidicos. Desta forma, não apresenta as desvantagens dos compostos lipidicos. [9] O documento de patente US8507270 refere-se a um método alternativo para transfecção celular utilizando PEI . Trata- se de PEI acidificado visando redução da toxicidade e aumento da eficiência de transfecção. Por outro lado, a presente invenção se refere a um kit que compreende a associação de CPX ao agente PEI e um método para transfecção celular. A vantagem da presente invenção em relação ao estado da técnica é proporcionar um ensaio de transfeccão com maior eficiência quando comparado ao uso convencional e sem aumentar os níveis de toxicidade, como pode ser observado nos ensaios de citometria de fluxo.

[10] Desta forma, o aumento na eficiência de transfecção celular por PEI ou de qualquer outro agente transfectante juntamente com o composto CPX não é descrito em nenhum documento de patente ou científico.

[11] A polietilenoimina (PEI) é um polímero orgânico muito eficaz na ligação ao DNA mediando a transfecção celular. O protocolo à base de PEI é utilizado com sucesso para transfecção, embora em muitas situações experimentais a lipofecção tenha produzido maior eficiência na transferência de ácidos nucleicos. O desenvolvimento do kit X-PEI representa uma melhoria na efetividade da transfecção celular com o PEI utilizando CPX, ou seja, o kit intensifica a transferência de ácidos nucleicos para células-alvo de forma significativa, como evidenciado pela intensificação na produção de proteínas heterólogas in vitro, quando comparado com protocolo realizado apenas com PEI.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[12] A invenção se refere a um Kit de transfecção celular (X-PEI) que compreende os seguintes itens: - Polietilenoimina (PEI) de 22 kDa solubilizada em água ultrapura na concentração expressa em resíduos de nitrogénio de 7,5 mM;

- Ciclopirox olamina (CPX) em pó, fracionada em quantidade suficiente para posterior solubilizacão em PBS (1 mM CPX) ;

NaCl solubilizada em água ultrapura na concentração de 150 mM; e

- Tampão fosfato salino (PBS) .

[13] Também é objeto da presente invenção o método de transfecção que utiliza o kit X-PEI e compreender as seguintes etapas:

1. Misturar solução PEI com solução 150 mM NaCl (TUBO D ;

2. Misturar DNA com solução contendo 150 mM NaCl (TUBO 2) ;

3. Transferir o conteúdo do TUBO 1 para o TUBO 2 ;

4. Agitar o TUBO 2 por 15 segundos e mantê-lo a temperatura ambiente por 15 minutos;

5. Solubilizar o CPX em tampão fosfato salino (PBS) para concentração final de 1 mM (TUBO 3) ;

6. Remover o meio de cultura das células-alvo crescidas;

7. Lavar as células com PBS;

8. Adicionar meio de cultura sem soro;

9. Tratar as células com o conteúdo do TUBO 2 (mistura PEI/DNA) e homogeneizar;

10. Tratar as células com 1 mM CPX;

11. Manter em estufa contendo 5% C0 ₂ , 37°C por 6 horas;

12. Substituir o meio de transfecção por meio de cultura enriquecido de soro; e

13. Incubar em estufa 5% C0 ₂ , 37°C de 1-3 dias.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Fluxograma do método proposto na presente invenção em sua modalidade construtiva.

Figura 2: Detecção da proteína eIF5Al-FLAG em células HeLa. Ensaio de Immunoblotting com extratos proteicos de células HeLa transfectadas com o plasmídeo pEIF5Al-FLAG. Utilização do agente PEI em combinação ou não com CPX. A, B e C mostram os resultados de três experimentos independentes. A detecção da proteína tubulina foi utilizada para normalização.

Figura 3: Detecção da proteína eIF5Al-FLAG e YFP em células HeLa. Ensaio de Immunoblotting com extratos proteicos de células HeLa transfectadas com os plasmídeos pEYFP-Nl e pEIF5Al-FLAG. Utilização do agente PEI em combinação ou não com CPX. A detecção da proteína tubulina foi utilizada para normalização.

Figura 4: Detecção da proteína YFP em células HeLa. Ensaio de imunofluorescência de células HeLa transfectadas com o plasmídeo pEYFP-Nl. Utilização do agente PEI em combinação ou não com CPX.

Figura 5: Análise por citometria de fluxo. Gráficos em dot plot representando as variáveis FSC (dispersão frontal, tamanho celular) e SSC (dispersão lateral, complexidade) de células HeLa transfectadas com o plasmídeo pEYFP-Nl. Utilização do agente PEI em combinação ou não com CPX.

Figura 6: Análise por citometria de fluxo. Gráficos em dot plot mostrando a avaliação fluorométrica de células HeLa transfectadas com o plasmídeo pEYFP-Nl. Utilização do agente PEI em combinação ou não com CPX.

Figura 7s Análise por citometria de fluxo. Representação gráfica da intensidade da fluorescência de células HeLa transfectadas com o plasmídeo pEYFP-Nl. Utilização do agente PEI em combinação ou não com CPX.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [14] A presente invenção refere-se a um kit de transfecção (X-PEI) compreendendo os seguintes itens:

- Polietilenoimina (PEI) de 22 kDa solubilizada em água ultrapura na concentração expressa em resíduos de nitrogénio de 7,5 mM;

- Ciclopirox olamina (CPX) em pó, fracionada em quantidade suficiente para posterior solubilização em PBS (l mM CPX) ;

NaCl solubilizada em água ultrapura na concentração de 150 mM; e

- Tampão fosfato salino (PBS) .

[15] Também é objeto da presente invenção o método de transfecção aplicado para este kit e compreende as seguintes etapas para cada amostra (Figura 1) :

1. Misturar 6 μΙ> de solução 7,5 mM PEI (22 kDa e concentração expressa em resíduos de nitrogénio) com solução contendo 150 mM NaCl em quantidade suficiente para 100 μΐι (TUBO 1) ;

2. Misturar 3 μg de DNA com solução contendo 150 mM NaCl em quantidade suficiente para 100 μΐι (TUBO 2) ,·

3. Transferir o conteúdo do tubo 1 para o TUBO 2;

4. Agitar o TUBO 2 por 15 segundos e mantê-lo a temperatura ambiente por 15 minutos;

5. Solubilizar o CPX em tampão fosfato salino (PBS) para concentração final de 1 mM (TUBO 3) ;

6. Remover o meio de cultura das cêlulas-alvo cultivadas em poço com superfície de 9,6 cm ² ;

7. Lavar as células com 1 mL de PBS;

8. Adicionar 800 μΐι de meio de cultura sem soro;

9. Tratar as células com o conteúdo do TUBO 2 (mistura PEI/DNA) e homogeneizar cuidadosamente; 10. Tratar as células com solução 1 mM CPX em volume suficiente para obter a concentração de uso (2,5 μΜ a 10 μΜ) .

11. Manter a placa em estufa contendo 5% C0 ₂ , 37°c por 6 horas ;

12. Substituir o meio de transfecção por meio de cultura enriquecido de soro; e

13. Incubar a placa em estufa 5% CO _a , 37°C de 1-3 dias.

[16] Sendo que:

- Na etapa 5, não se pode armazenar a solução de CPX após a solubilização, pois afetária sua efetividade

[17] Para conferencia dos resultados pode ser realizado os ensaios de immunoblotfcing, imunofluorescência, citometria de fluxo, RT-PCR em tempo real.

[18] Na tabela 1 consta as quantidades celulares e de cada elemento para o uso do presente método quando utilizado placas de 6 poços (9,6 cm ² /poço) , placa de 6 cm de diâmetro e placa de 10 cm de diâmetro.

TABELA 1: Quantidade de células e preparo dos complexos para transfecção em diferentes placas de cultura celular. Volumes representativos da solução 1 mM CPX requeridos para obtenção de 2,5 μΜ.

[19] É objeto da presente invenção, o uso do kit para transfecção celular na área de saúde, biotecnologia, biologia celular e molecular.

[20] O método da presente invenção, prevê, como pré- requisito para funcionamento pleno do kit, que as células sejam cultivadas por pelo menos 12 horas antes da transfecção; que no dia da transfecção as células estejam com confluência de 50% a 70%; que os complexos (PEI/DNA+CPX) sejam adicionados em meio de cultura sem soro (consultar tabela de volumes recomendados para diferentes placas) ; e que a solução 1 mM CPX seja preparada no dia de sua utilização.

Exemplo de concretização

[21] Como exemplo de concretização da presente invenção, células HeLa (células derivadas de carcinoma cervical humana) foram cultivadas por 24 horas antes da transfecção a uma densidade inicial de 3 x 10 ^s células por poço de 9,6 cm*. No cultivo foram utilizados meio Dulbecco's Modífied Eagle Médium (DMEM) contendo 10% soro fetal bovino, 100 u/mL de penicilina, 100 //g/mL estreptomicina e suplementado com 2 mM de L-glutamina e atmosfera umidifiçada com 5% CO; a 37°c.

[22] O método da presente invenção foi concretizado da seguinte maneira (figura 1) :

1. Misturar 6 /*L de solução 7,5 mM PEI (22 kDa e concentração expressa em resíduos de nitrogénio) com solução contendo 150 mM NaCl em quantidade suficiente para 100 μΐ, (TUBO 1) ;

2. Misturar 3 μ% de DNA com solução contendo 150 mM NaCl em quantidade suficiente para 100 μΐ» (TUBO 2) ;

3. Transferir o conteúdo do tubo 1 para o TUBO 2 ; 4. Agitar o TUBO 2 por 15 segundos e mantê-lo a temperatura ambiente por 15 minutos;

5. Solubilizar o CPX em tampão fosfato salino (PBS) para concentração final de 1 mM (TUBO 3) ;

6. Remover o meio de cultura das células-alvo crescidas em poço com superfície de 9,6 cm ² ;

7. Lavar as células com 1 mL de PBS;

8. Adicionar 800 /*L de meio de cultura sem soro;

9. Tratar as células com o conteúdo do TUBO 2 (mistura PEI/DNA) e homogeneizar cuidadosamente;

10. Tratar as células com solução 1 mM CPX em volume suficiente para obter as concentrações de 2,5 μΜ a 10 μΜ.

11. Manter a placa em estufa contendo 5% CO _s , 37°C por 6 horas ;

12. Substituir o meio de transfecção por meio de cultura enriquecido de soro; e

13. Incubar a placa em estufa 5% CO _s , 37°C por l dia.

[23] Para maior eficiência da transfecção utilizando o kit X-PEI, as células encontravam-se numa confluência de 50% a 70% no ato da transfecção e a solução 1 mM CPX foi preparada no ato da utilização pois não é recomendado seu armazenamento.

[24] As células foram transfectadas com os DNAs plasmidiais pFLAG-EIF5Al e pEYFP-Nl utilizando o agente de transfecção polietilenoimina (PEI) , de acordo com protocolo do fabricante (jetPEI código 101-10N, Polyplus Transfection, Illkirch, França) . Durante o processo de transfecção, as células foram tratadas com o composto sintético ciclopirox olamine (CPX, código C0415, Sigma-Aldrich Co.) em concentrações considerando a faixa de 2,5 μΜ a 10 μΜ. Após incubação por 6 horas, o meio de cultura das células transfectadas (com e sem CPX) foram trocados por meio de cultura enriquecido com soro. Após incubação por 18 horas, as células foram lavadas com PBS gelado e lisadas com tampão de lise (100 mM Tris/HCl, pH 7.4; 10 mM Na, ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA] , pH 8.0; 1% Triton X-100; e complete EDTA-free protease inhibitor cocktail [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany] ) .

[25] Cerca de 20 \íq de extrato proteico total foram analisadas por immunojblotfcingr utilizando anticorpos específicos visando análise do conteúdo das proteínas heterõlogas eIF5Al-FLAG e YFP. Como resultado, constatamos que as células tratadas com a combinação de PEI e CPX (5 μΜ e 10 μΤΛ) apresentaram aumento significativo no conteúdo da proteína eIF5Al-FLAG, quando comparado com os resultados obtidos a partir de células transfectadas com PEI (sem tratamento com CPX) (Figura 2) . Consistente com isto, a eficiência de transfecção foi similarmente aumentada em experimento com concentração inferior ou intermediária de CPX (2,5 μΜ e 7,5 μΜ) , visando a produção da proteína YFP

(Figura 3) .

[26] Vinte e quatro horas após transfecção com pEYFP-Nl utilizando PEI (com e sem CPX) , as células foram analisadas quanto à expressão de YFP por microscopia de fluorescência direta (Figura 4) . As células que produzem a proteína YFP aparecem fluorescentes na imagem. Na cultura transfectada com PEI em combinação com CPX, observou-se uma duplicação no número de células produtoras de YFP, evidenciando aumento na taxa de transfecção, efeito este dependente da concentração de CPX.

[27] Vinte e quatro horas após transfecção com pEYFP-Nl utilizando PEI (com e sem CPX) , as células foram analisadas quanto à expressão de YFP por por citometria de fluxo. Dados a partir de 10* células foram adquiridas. A citometria de fluxo foi então realizada para avaliar a porcentagem de células que sofreram aumento de sua fluorescência, em função da produção de YFP, bem como parâmetros de tamanho e complexidade celular. Como apresentado nos gráficos de dot plot (Figura 5) as células transfectadas com ou sem CPX, bem como células não transfectadas, apresentam perfis similares, evidenciando que o uso de ambos os reagentes não causa alterações nos parâmetros analisados. A eficiência de transfecção foi significativamente maior nas células transfectadas com PEI em combinação com CPX (em torno de 58%) quando comparadas às células transfectadas com PEI (em torno de 25%) (Figura 6) . A figura 7 mostra a sobreposição dos resultados obtidos, comprovando aumento da fluorescência celular, mediado pela expressão de YFP, nas células tratadas com a combinação PEI e CPX.

[28] Assim, os resultados de ímmunoJblotting, observação microscópica e perfis de citometria de fluxo produziram resultados consistentes demonstrando a capacidade do kit da presente invenção.