以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明� ��る。
 なお、分析法や評価法は、下記の通りであ� ��。
<酵母菌体中のグルタミン酸、グルタミン� �定量法>
 酵母菌体中の遊離のグルタミン酸とグルタ� ��ンの定量は以下の様に行った。
 洗浄した菌体を、沸騰水中で4分加熱し、流 水中で冷却後、遠心分離した。得られる上清 を適宜希釈し、グルタミン酸用とグルタミン 用の酵素電極を各々装備したバイオセンサー BF‐5(王子計測機器)にてグルタミン酸とグル� ��ミンを定量した。
<酵母菌体中のRNAの定量法>
 酵母菌体中のRNAの定量については、シュミ� ��ト・タンホイザー・シュナイダー法(J. Biol.  Chem. Vol.164,P747 (1946))により行った。
 菌体乾燥重量は、洗浄した酵母懸濁液 10ml� �を秤量瓶に採取し、105℃、20時間の加熱によ り水分を飛ばした後、デシケーター内で室温 まで放冷し、加熱前後の重量差を精密電子天 秤で測定することで求めた。この酵母菌体乾 燥重量を基に、菌体中の各種成分の含有量(� �量%)を算出した。

<粉末酵母エキス中の遊離グルタミン酸、� �の他のアミノ酸の定量法>
 乾燥粉末状の酵母エキス中の遊離グルタミ� ��酸とその他の遊離アミノ酸、および総アミ� ��酸濃度は、常法に従いアミノ酸分析計L8800(H ITACHI製)により測定した。
<粉末酵母エキス中の5'-ヌクレオチドの定� �法>
 乾燥粉末状の酵母エキス中の5'-ヌクレオチ� ��は、特公平7-93871号公報記載の条件で、高速 液体クロマトグラフィーにより定量した。

<官能評価>
 エキスの官能評価は以下のように行った。
 粉末エキスを1%、食塩を喫飲時の濃度が0.3%� ��なるようにお湯に溶解したものをサンプル� ��した。0.05g/dl 濃度のMSGのうま味を認識可能 なパネルにより、「先味の強度」と「持続性 」、および「うま味強度」について、対照区 との差をそれぞれ7段階で採点し、評価結果� �平均値で示した。なお、先味と持続性、う� �味の7段階評価の基準は、「+3点:非常に強い� ��+2点:かなり強い、+1点:やや強い、0 点:対象 区と差がない、-1点:やや弱い、-2点:かなり弱 い、-3点:非常に弱い」とした。

実施例1 <変異株の取得>
 キャンディダ・ウチリスATCC9950株を YPD 培� ��(酵母エキス1%、ポリペプトン2%、グルコー� �2%)を含む試験管で対数増殖期まで培養した� �この菌体を回収し、洗浄後、Adelberg 等の方� ��に準じニトロソグアニジンによる変異処理� ��行った(Biochem. Biophys. Res. Comm. Vol.18,P788(196 5))。変異処理した菌体を二回洗浄後、YPD培地 で30℃、一晩培養したものを変異処理菌体と� ��た。
 この菌体を合成培地(グルコース2重量%、リ� ��酸1カリウム2重量%、硫酸アンモニウム0.1重� ��%、硫酸マグネシウム0.05重量%、尿素0.2重量% 、硫酸第二鉄8.6ppm、硫酸亜鉛14.6ppm、硫酸銅0. 7ppm、硫酸マンガン3.3ppm、寒天2重量%)にブロ� �ピルビン酸エチル(BPE)40~45ppm、またはさらに2 ‐オキソグルタル酸(2OG) 100~200 ppmを添加し� �選択培地を用い、30℃、3~7日間培養した。そ の結果親株で生育できない選択培地上に生育 するコロニーを単離した。これらを、前記合 成液体培地で培養し、菌体生産性が良く、か つ遊離のグルタミン酸とグルタミンの蓄積量 の高い株を選別した。具体的には、まず、BPE  40ppm 耐性を有するBPE0128株を取得し、次い� �この株に対して上記操作を繰り返し、BPE 40p pmと2OG 100ppm の二重耐性を有する2OG3D4株を、 同様にさらに変異操作を繰り返し、本発明の 酵母変異株であるBPE 45ppmと2OG 200ppm の二重� ��性を有する 36D61株をそれぞれ取得した。

 次いで、親株と得られた変異株を30L発酵� ��スケールで培養し、生産性を確認した。供� ��菌株を予めYPD培地を含む 三角フラスコで� �母培養し、これを30L容発酵槽に0.5~1.5%植菌し た。この時の培地組成は、グルコース6重量%� ��リン酸1カリウム2重量%、硫酸アンモニウム1 .4重量%、硫酸マグネシウム0.06重量%、硫酸第� ��鉄10ppm、硫酸亜鉛18ppm、硫酸銅1ppm、硫酸マ� �ガン8ppmである。培養条件は、槽内液量15L、p H4.3(アンモニアによる自動コントロール)、培 養温度30℃、通気1vvm、撹拌 400rpmで行った。� ��られた菌体について分析した結果を表1に示 した。

 変異株の遊離グルタミン酸とグルタミンの� ��積量の総和を親株と比べると、ブロモピル� ��ン酸エチル耐性株(BPE0128)では3割の増加に対 し、ブロモピルビン酸エチルと2‐オキソグ� �タル酸の高濃度耐性株(36D61)では驚くべき事� ��約4倍に増加した。また、この時の36D61株のR NA含量は9.7%であった。
 酵母キャンディダ・ウチリス36D61株は、薬� �耐性以外は親株 ATCC9950と全く同一の菌学的� ��質を有している。また、グリセロール、エ� ��ノールを炭素源とする培地上でも旺盛な生� ��を示した。
 キャンディダ・ウチリス36D61株は、平成20年 3月18日付で、独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センターに、受託番号FERM BP� ��11103として寄託されている。

実施例2 <酵母エキスの取得>
 酵母エキスの試作には、キャンディダ・ウ� ��リス変異株36D61株の連続培養液を用いた。� �試菌株を予めYPD培地を含む 三角フラスコで 種母培養し、これを5L容発酵槽に0.5~1.5%植菌� �た。培地組成は、30Lバッチ培養と同様であ� �。培養条件は、槽内液量2L、pH4.3(アンモニア による自動コントロール)、培養温度30℃、通 気1vvm、撹拌 600rpmで行った。この時の比増殖 速度は0.24~0.25hr ^-1 であった。得られた菌体について分析した結 果、遊離のグルタミン酸とグルタミンの総和 は13.9重量%(グルタミン酸 4.7重量%、グルタミ ン9.2重量%)、対糖菌体収率は56.8%であった。

 連続培養液を氷冷しながら回収し、遠心分� ��により集菌し、湿潤酵母菌体を得た。これ� ��水に再懸濁して、遠心分離し、乾燥重量と� ��て約160gの菌体を得た。この酵母菌体を水に 懸濁して、全量を1.6Lとし、次いで湯浴中で� �熱し、70℃に逹温後、10分間撹拌しながら70� �に保持してエキスを抽出した。この後直ち� �流水中で冷却し、遠心分離により不溶性固� �分を除去しエキスを得た。液温を50℃とした 後、グルタミナーゼ ダイワC100S(大和化成製) の4.4gを少量の水に溶解後添加し、40~60℃で5� �間、撹拌しながら反応させた。このエキス� �90~95℃で30分加熱し、冷却した後、遠心分離� ��よりエキス中の不溶性固形分を再度除去し� ��。次いでロータリーエバポレーターで濃縮� ��、凍結乾燥を行い、粉末酵母エキス約49gを� ��た。この時のエキス抽出率は約25%で、この� ��キス中の遊離グルタミン酸含量はナトリウ� ��塩換算で 54.5重量%であった。また、この時 の遊離アミノ酸含量は64.2重量%、総アミノ酸� ��量は72.3重量%であり、これから次式で求め� �れるペプチド含量は8.1重量%であった。
  ペプチド含量(%)=総アミノ酸含量(%)-遊離ア ミノ酸含量(%)
 得られる酵母エキスの水溶液は、MSG様のう� ��味、先味がかなり強く、従来の酵母エキス� ��はないインパクトのある味であった。また� ��酵母臭も少なく、程よい厚みもあるが、後� ��がすっきりとしており、好ましい呈味性で� ��った。

 この試作において、グルタミナーゼ反応前� ��のエキスについて官能評価を行った。グル� ��ミナーゼ反応前後のエキスを一部採取し、� ��形分換算で1%となるようにお湯に溶解し、� �れに食塩を喫飲時の濃度が0.3%となるように� ��加した。グルタミナーゼ反応前を対照区と� ��、グルタミナーゼ反応後のエキスの「先味� ��強度」、「持続性」、「うま味強度」につ� ��て、パネル5名で評価した。なお、BF‐5で測 定したグルタミン酸濃度はナトリウム塩換算 で、グルタミナーゼ反応前が20%、反応後が51% であった。
 結果、グルタミナーゼ反応後のサンプルは� ��先味、持続性、うま味が、それぞれ+2.6、+1. 8、+2.2であり、うまみと先味が著しく増強さ� ��ていることを確認できた。また、反応後の� ��ンプルでは全体的に味が強く、味の厚みも� ��じられた。

実施例3
 実施例2と同様の方法でキャンディダ・ウチ リス変異株36D61株の乾燥重量として約21gの菌� ��を得た。得られた菌体について分析した結� ��、グルタミン酸とグルタミンの総和は14.3重 量%(グルタミン酸5.0重量%、グルタミン9.3重量 %)、対糖菌体収率は56.1%であった。
 ここに得られた酵母に水を加え、全量を200m lとし、次いで,湯浴中で加熱し、90℃に逹温� �てから、90℃で2分間加熱した。この後直ち� �流水中で冷却し、液温を50℃とした後、ツニ カーゼ(天野エンザイム製細胞壁溶解酵素)の0 .2gを少量の水に溶解後添加し、50℃で1hr撹拌� ��ながら反応させた。反応後の液を遠心分離� ��より不溶性固形分を除去しエキスを得た。� ��のエキスに対して、グルタミナーゼC100S 0.5 6gを添加し、実施例2と同様に反応、濃縮、乾 燥させ、粉末酵母エキス約11gを得た。エキス 抽出率は約51%で、このエキス中の遊離グルタ ミン酸含量はナトリウム塩換算で31.9重量%で� ��った。また、この時の遊離アミノ酸含量は3 9.0 重量%、総アミノ酸含量は53.1重量%であり� ��ペプチド含量は14.1重量%であった。
 この水溶液は、強度が少し劣るものの、実� ��例2と同様の呈味性であった。

実施例4
 実施例2と同様の方法でキャンディダ・ウチ リス変異株36D61株の乾燥重量として約20gの菌� ��を得た。得られた菌体について分析した結� ��、グルタミン酸とグルタミンの総和は12.5重 量%(グルタミン酸4.7重量%、グルタミン7.8重量 %)、RNA9.0重量%、対糖菌体収率は56.2%であった� ��
 ここに得られた酵母に水を加え、全量を200m lとし、次いで,湯浴中で加熱し、90℃で5分間� ��熱した。この後直ちに流水中で冷却し、液� ��を50℃とした後、ツニカーゼ(天野エンザイ� ��製細胞壁溶解酵素)の0.2gを少量の水に溶解� �添加し、50℃で6hr撹拌しながら反応させた。 反応後の液を遠心分離により不溶性固形分を 除去しエキスを得た。このエキスに対して、 グルタミナーゼC100S 0.47gを添加し、実施例2� �同様に反応後、65℃に加温し、リボヌクレア ーゼP (天野エンザイム製5'‐フォスフォジエ ステラーゼ)の30mgを少量の水に溶解して加え� ��同温度で撹拌しながら3hr反応させた。次い� ��、液温を45℃として、デアミザイム(天野エ� ��ザイム製デアミナーゼ)の20mgを少量の水に� �解して加え、この温度下で2時間撹拌しなが� ��保持した。この後、90~95℃で30分加熱し、放 置冷却の後、遠心分離により不溶性固形分を 除去し、濃縮、乾燥させ、粉末酵母エキス約 12gを得た。エキス抽出率は約60%で、このエキ ス中の遊離グルタミン酸含量はナトリウム塩 換算で23.2重量%、5'‐IG含量は3.3重量%であっ� �。また、この時の遊離アミノ酸含量は32.1重� ��%、総アミノ酸含量は44.8重量%であり、ペプ� ��ド含量は12.7重量%であった。
 得られる酵母エキスの水溶液は、酵母臭も� ��なく、インパクトがありうま味が強く、さ� ��には味の持続性や厚みもあり、非常にバラ� ��スの良い呈味性であった。

実施例5
 実施例2と同様の方法でキャンディダ・ウチ リス変異株36D61株の乾燥重量として約20gの菌� ��を得た。得られた菌体について分析した結� ��、グルタミン酸とグルタミンの総和は12.1重 量%(グルタミン酸4.8重量%、グルタミン7.3重量 %)、RNA 8.8重量%、対糖菌体収率は56.6%であっ� �。
 ここに得られた酵母に水を加え、全量を200m lとし、湯浴中で加熱し、次いで、実施例4と� ��じく加熱処理を行った後、流水中で冷却し� ��液温を50℃とした後、6Nの水酸化ナトリウム を添加しpHを10とし、3時間撹拌した。反応後� ��液を遠心分離により不溶性固形分を除去し� ��キスを得た。このエキスに対して、実施例4 と同様に、グルタミナーゼ、5'-フォスフォジ エステラーゼ、デアミナーゼ反応を行った。 この後、90~95℃で30分加熱し、放置冷却の後� �遠心分離により不溶性固形分を除去し、濃� �、乾燥させ、粉末酵母エキス約10gを得た。� �キス抽出率は約43%で、このエキス中の遊離� �ルタミン酸含量はナトリウム塩換算で28.1重� ��%、5'‐IG含量は5.4重量%であった。また、こ� ��エキスの遊離アミノ酸、総アミノ酸、ペプ� ��ドの含量は、各々36.6、42.6、6.0重量%であっ� ��。
 得られる酵母エキスの水溶液は、グルタミ� ��酸含量は実施例3と同程度であるが、5'‐IG� �効果により、かなり強い先味やうま味を感� �、さらには味の持続性も感じられた。実施� �4よりも雑味が少なくクリアーな味わいであ� ��た。

 本発明の酵母エキスの官能評価を行った。
 2OG3D4株から、グルタミナーゼ反応を除いた� ��外は実施例2と同様の方法で酵母エキスを試 作し、グルタミン酸をナトリウム塩換算で12. 0重量%含有する粉末酵母エキスを対照区とし� ��各製法により得られた粉末エキスの「うま� ��強度」と「先味の強度」、「持続性」につ� ��て、パネル7名により、評価した。

 表2から分かる様に、本発明により得られ た酵母変異株から得られる酵母エキスは、ど の抽出法を用いたものでも、対照区の2OG3D4株 と比べると、遊離のグルタミン酸の含量が明 らかに高く、またはさらに5'‐IG含有量が高� �。そして、そのような特徴をもつ本発明の� �母エキスは、先味の強い旨味を呈すること� �わかる。