Die Erfindung betrifft einen Hefestarara der Art Yarrowla lipoly- tica und ein Verfahren zur Produktion von Lycopin mit diesem Stamm . Das Interesse an biotechnologisch hergestellten Carotinoiden als Lebensmittelzusatzstoff oder als Wirkstoff in der pharmazeutischen oder kosmetischen Industrie steigt stetig. Carotinoide besitzen komplexe chemische Strukturen, die sich auf synthetischem Weg nur schwer herstellen lassen. Die Isolation aus pflanzlichem Material ist kompliziert und zeitaufwendig.

Lycopin repräsentiert ein zentrales Carotinoid in der Carotino- id-Biosynthese . Ausgehend von Lycopin können verschiedenartige Carotinoide gebildet werden. Es wird in natürlicher Form in Pflanzen, Algen und anderen photosynthetisch aktiven Organismen gefunden. Lycopin besitzt eine hohe Quenchingrate für Singu- lett-Sauerstoff . Dadurch werden Lycopin vorbeugende Eigenschaften gegen Krebs nachgesagt. Des Weiteren besitzt Lycopin anti- fungale Eigenschaften gegen die humanpathogene Hefe Candida al ^¬ bicans. Aus diesem Grund ist die mikrobiologische Produktion von Lycopin besonders herausfordernd.

Die Carotinoid-Biosynthese zweigt sich vom Isoprenoid- Stoffwechsel ab durch die Kondensation von zwei GGPP-Molekülen zu Phytoen. Dies wird durch das Enzym Phytoensynthase (crtBp) durchgeführt. Phytoen wird danach durch die sukzessive Einfüh- rung von Doppelbindungen über Phytofluen, Zeta-Carotin, Neurosporen zu Lycopin umgewandelt. Hierfür ist das Enzym Phytoende- saturase (crtlp) verantwortlich (Fig. 1) .

In verschiedenen nicht- lycopinbildenden Hefen wurden bereits die Lycopin-Biosynthese-Gene eingebracht: · Saccharomyces cerevisiae (Verwaal, R., J. Wang, et al .

(2007), Appl Environ Microbiol 73(13): 4342-4350; Lange, N. and A. Steinbüchel (2011) , Appl Microbiol Biotechnol 91(6) : 1611-1622; Ukibe , K. , . Hashida, et al . (2009), Appl Environ Microbiol 75(22) : 7205-7211; Yamano, S., T. Ishii, et al. (1994), Biosci Biotechnol Blochem 58(6) : 1112-1114)

• Candida utilis (Misawa, N. and H. Shimada (1998) , J

Biotechnol 59(3) : 169-181; Miura, Y. , K. Kondo, et al . (1998), Appl Environ Microbiol 64(4) : 1226-1229; Shimada,

H., K. Kondo, et al . (1998), Appl Environ Microbiol 64(7) : 2676-2680)

• Pichia pastoris (Bhataya, A. , C. Schmidt-Dannert , et al .

(2009), Process Biochemistry 44(10) : 1095-1102;) und · Mucor circlnelloides (Papp, T. , A. Velayos, et al . (2006),

Appl Microbiol Biotechnol 69(5) : 526-531;).

Des Weiteren wurde bereits beschrieben, wie Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica) zur Lycopinbildung gebracht werden kann (Ye, R. W., P. L. Sharpe, et al . (2012), Methods Mol Biol 898: 153-

159) . In den Veröffentlichungen wurden maximal 7,8 mg Lycopin pro Gramm Biotrockenmasse beschrieben.

Y. lipolytica bildet natürlicherweise keine Carotinoide. Sie bildet aber Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat , ein wichtiges Inter- mediat der Lycopinbiosynthese .

US201110021843A1 offenbart, dass ein Y. lipolytica Stamm mit den Genen für ATP-Citrat Lyase, AMP Deaminase und cytosolischer Malat-Dehydrogenase in die Lage versetzt wurde größere Mengen an Fetten zu akkumulieren. Durch Überexpression der Gene HMG1 (kodiert eine HMG-CoA Reduktase) und GGS1 (kodiert eine Ge- ranyl-Geranyl Synthase) aus Y. lipolytica , sowie einer Überexpression der Gene crtB (kodiert eine Phytoensynthase) und crtl (codiert eine Phytoendesaturase) aus Erwinia uredovora konnte Lycopin produziert werden. US7851199B2 offenbart die Verwendung von Y. lipolytica zur Produktion von Carotinoiden.

WO 2010/004141 offenbart, dass durch eine Deletion des Genes GUT2 in Kombination mit den Deletionen der Gene POX1 , POX2 , POX3, POX4, POX5 und POX6 vergrößerte Fettkörperchen gebildet werden, die für die Produktion von Lipiden genutzt werden können. Darauf aufbauend offenbart WO 2012/001144A1 , dass eine zusätzliche Überexpression des Gens GPDl in Y. lipolytica zu wei- ter vergrößerten Fettkörperchen führt .

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Hefestamms der Art Y. lipolytica der zur mikrobiellen Produktion von Lycopin, in größeren Mengen als bisher bekannt, geeignet ist . Die Aufgabe wird gelöst durch einen Hefestamm der Art Y. lipolytica der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Phytoensynthase und eine Phytoendesaturase enthält, eine Verringerung der Aktivität der Proteine Poxlp, Pox2p, Pox3p, Pox4p, Pox5p Ροχβρ und Gut2p aufweist, und eine erhöhte Aktivität der Proteine Ggslp und Hmglp aufweist.

Bei der Phytoensynthase handelt es sich bevorzugt um eine Phytoensynthase aus Bakterien, besonders bevorzugt aus Pantoea ananatis (P. ananatis) . Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Phytoensynthase um das Protein crtBp (NCBI Refe- rence Sequence : YP_003522457.1) .

Bei der Phytoendesaturase handelt es sich bevorzugt um eine Phytoendesaturase aus Bakterien, besonders bevorzugt aus P.

ananatis . Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Phytoendesaturase um das Protein crtlp (UniProtKB/Swiss-Prot :

P21685.1) .

Unter einer erhöhten Aktivität der Proteine Ggslp und Hmglp ist vorzugsweise zu verstehen, dass die Aktivität pro Zelle erhöht ist, was durch die Steigerung der Proteinmenge oder durch die Steigerung der proteineigenen Aktivität erzielt werden kann. Die Steigerung der Proteinmenge ist dadurch gekennzeichnet, dass mehr Protein gebildet wird, als bei einem unveränderten Stamm unter gleichen Bedingungen. Die Steigerung der proteineigenen Aktivität ist dadurch gekennzeichnet, dass die gleiche Menge an Protein in einem veränderten Stamm eine höhere Aktivi- tät aufweist als der unveränderte Stamm. Unter einer Verringerung der Aktivität eines Proteins ist vorzugsweise zu verstehen, dass die Aktivität des Proteins pro Zelle verringert wird. Besonders bevorzugt ist darunter das Fehlen der Aktivität des Proteins zu verstehen. Eine erhöhte Aktivität der Proteine kann auf verschiedene Weise erzeugt werden:

(i) durch Einbringen des relevanten Gens in mehrfacher, vorzugsweise 8 bis 12facher, Kopie in das Genom des Organismus (Gen-Dosis-Effekt)

(ii) durch Austausch des natürlichen Promoters des relevanten Gens durch einen stärkeren als den natürlichen Promotor, vorzugsweise einen Promoter, der mindestens 50% der Aktivität des Promoters des TiJFl-Gens (Translationselonga- tionsfaktor 1 alpha Genolevures: YALI0C09141g) besitzt, höchstvorzugsweise die Aktivität des TEF1- Promoters besitzt. Dabei können Promotoren gewählt werden, die entweder während der gesamten Kultivierung aktiv sind oder nur in einer gewünschten Wachstumsphase aktiv sind (Gen- Regulations-Effekt)

Bei der Aktivitätserhöhung wird das zusätzliche Einbringen des relevanten Gens unter Kontrolle eines starken Promotors besonders bevorzugt, insbesondere bevorzugt unter Kontrolle des TEF1- Promoters aus Yarrowia lipolytica.

Die Verringerung der Aktivität von Proteinen kann durch ver- schiedene Verfahren erlangt werden:

(i) durch die Inhibierung oder Verminderung der Expression der Gene

(ii) durch partielle oder komplette Deletion der codierenden Gene

(iü) durch Expression von nicht-funktionalen Genen

(iv) durch Inhibierung oder Verminderung der Aktivität der exprimierten Gene .

Die Proteine Poxlp, Pox2p, Pox3p, Pox4p, Pox5p Ροχδρ und Gut2p werden vorzugsweise durch die Gene POXl , POX2 , P0X3 , POX4 , POX5 und POX6 (Genolevures.- YALI0E32835g, YALI0F10857g,

YALI0D2475Og, YALI0E27654g, YALI0C23859g, YALI0E06567g) und GUT2 (Genolevures: YALI0B13970g) kodiert. Das Protein Ggslp wird vorzugsweise kodiert durch das Gen GGS1 (Genolevures : YALI0D17050p) .

Das Protein Hmglp wird vorzugsweise kodiert durch das Gen HMGl (Genolevures: YALI0D17050p) . Die Inhibierung oder Verminderung der Expression kann beispielsweise durch Inhibierung oder Verminderung der Transkription des codierenden Gens oder der Translation der gebildeten mRNA erfolgen. Die Deletion der codierenden Gene kann beispielsweise durch einen Ausbau der Gene mittels Deletionskas- setten durchgeführt werden. Die Expression eines dysfunktiona- len oder aktivitätsreduzierten Genproduktes kann beispielsweise durch Insertion, Substitution oder Punktmutation in dem codierenden Gen bewerkstelligt werden.

Bei der Aktivitätsverringerung wird die Deletion eines codie- renden Gens bevorzugt .

Vorzugsweise trägt der erfindungsgemäße Stamm somit die Gene crtB, crtl, GGS1 und HMGl dessen Genprodukte in ihrer Aktivität erhöht vorliegen und weist eine Deletion der Gene P0X1 , POX2 , POX3 _r POX4, POX5, P0X6 und GUT2 auf. Die Deletion der Gene POX1 , POX2, POX3, POX4 , POX5 und P0X6 unterbindet die Beta-Oxidation, verhindert somit den Abbau der intrazellulären Fettreserven und führt somit wiederum zu vergrößerten Fettkörperchen .

Die Deletion des Gens GUT2, dessen Genprodukt für die Umwand- lung von G3P zu DHAP verantwortlich ist, lässt sich die TAG-

Synthese Rate erhöhen was zu vergrößerten Fettkörperchen führt .

Das Einbringen der Gene crtB und crtl aus P. ananatis , bewirkt die Bildung von Lycopin.

Die Aktivitätssteigerung Geneprodukte von GGS1 und HMGl führt zu einer vermehrten Bildung der Carotinoidvorstufen .

Überraschenderweise wurde gefunden, dass große Fettkörperchen per se keine verstärkte Akkumulation von hydrophoben Substraten in den Hefezellen bewirkt. Unter geeigneten Bedingungen, wie Wachstum in Anwesenheit von Fettsäuren, bildet Y. lipolytica sehr große Fettkörperchen aus. Diese führen jedoch in Lycopin- bildenden Yarrowia lipolytica- Stämmen nicht zu einer verstärkten Akkumulation von Lycopin. Erst die erfindungsgemäßen gen- technischen Veränderungen, nämlich eine Verringerung der Aktivität der durch die Gene POX1 , POX2-, POX3, POX4 , POX5 und POX6 (Genolevures: YALI0E32835g, YALI0F10857g, YALI0D24750g,

YALI0E27654g, YALI0C23859g, YALI0E06567g) und GUT2 (Genolevures: YALI0B13970g) kodierten Proteine in an sich bereits im Stand der Technik beschriebenen modifizierten Y. lipolytica-

Stämmen, welche die Lycopin-bildenen Proteine crtBp (NCBI Refe- rence Sequence: YP_003522457.1) und crtlp (UniProtKB/Swiss- Prot: P21685.1) enthalten und welche eine Erhöhung der Aktivität der Proteine Ggslp und Hmglp, vorzugsweise durch die Ver- knüpfung mit dem starken Promoter des TEF1 -Gens, aufweisen und Desweiteren in geeigneten Limitationsbedingungen kultiviert werden, führen zu einer verstärkten Akkumulation von Lycopin in den Fettkörperchen der Hefe.

Als Ausgangsstamm für die Konstruktion eines erfindungsgemäßen Stammes kann ein ildtypisolat der Hefe Y. lipolytica verwendet werden, vorzugsweise der Stamm H222. Der Stamm H222 wurde am 29.04.2013 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, D-38124 Braunschweig) unter der Nummer DSM 27185 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt. Zur Verwendung eines Stammes für die weitere gentechnische Bearbeitung, ist ein Selektionsmarker notwendig. Dieser Selekti- onsmarker kann z.B. in Form der Uracilauxotrophie in an sich bekannter Weise in den Stamm eingebracht werden. Alternativ kann auf bereits bekannte uracilauxotrophe Stämme zurückgegrif- fen, vorzugsweise auf den Stamm H222-S4 (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102-5109) .

Eingebracht werden die Gene vorzugsweise mittels üblicher Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.

Um eine effiziente Translation der eingebrachten Gene zu ge- währleisten, ist es bevorzugt, die Sequenz der Gene crtB und crtl an die Codon-Verwendung von Y. lipolytica anzupassen. Besonders bevorzugt werden crtB und crtl Gene eingesetzt, deren Codon-Verwendung mit dem Program GeneOptimizer ¹⁵ (http://de- de . invitrogen . com/site/de/de/home/Products-and- Services/Applications/Cloning/gene- synthesis/GeneArt-Gene-

Synthesis/GeneOptimizer .html) angepasst wurde. Insbesondere bevorzugt hat das crtB Gen die Sequenz SEQ ID NO: 34. Insbesondere bevorzugt hat das crtl Gen die Sequenz SEQ ID NO: 35.

Weiterhin ist es bevorzugt für den Organismus funktionierende Promotoren mit dem offenen Leserahmen der Gene zu verknüpfen. Hierbei können sowohl konstitutive Promotoren als auch von den Kultivierungsbedingungen abhängige Promotoren der Hefe Y. lipolytica genutzt werden.

Vorzugsweise werden konstitutive Promotoren genutzt. Besonders bevorzugt wird der Promoter des Translationselongationsfaktors 1 alpha (pTEFl) verwendet.

Ebenso ist es bevorzugt, den offenen Leserahmen der Gene mit einem Terminator zu versehen. Vorzugsweise wird der Terminator des Gens der Isocitratlyase (ICLlt) verwendet. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Lycopin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus in an sich bekannter Art und Weise in einem Fermenter fermentiert wird.

Bei der Kulivierung eines erfindungsgemäßen Stammes führt ein verbessertes Wachstum in Medium mit Ölsäure zu einer Verringerung der spezifischen Lycopin-Bildung . Daher ist es bevorzugt neben den erfindungsgemäßen gentechnischen Veränderungen von Y. lipolytica zur Erhöhung der Kapazität der Fettkörperchen durch Erhöhung des Fettgehalts, das Wachstum zu limitieren. Die vergrößerten Fettkörperchen bilden zwar eine erhöhte Kapazität für die Akkumulation von Lycopin, jedoch ist dies nur relevant, wenn auch zytotoxische Mengen an Lycopin gebildet werden. Aufgrund der konstitutiven Expression der an der Carotino- id-Biosynthese beteiligten Gene, führt eine Wachstumslimitation zu einer erhöhten spezifischen Lycopin-Bildung . Diese Limitation kann auf verschiedene Weise realisiert werden.

Die Deletion des GUT2-Gens führt nicht nur zur Vergrößerung der Fettkörperchen durch den verminderten Abfluss des G3P in die Glycolyse, sondern auch zu einer verringerten Verwertung von Glycerol . Für das Wachstum auf Glycerol als einzige Kohlenstoffquelle ist die Bildung von Glucose über die Gluconeogenese essentiell. Das Genprodukt des GUT2-Gens stellt hierbei ein wichtiges Enzym dar, weil es die Umsetzung von G3P zu DHAP ka- talysiert, welches dann in die Gluconeogenese einfließt. Die Deletion des GUT2-Gens führt bei Kultivierung in Glycerol - haltigem Medium zu limitiertem Wachstum und zu einer erhöhten spezifischen Lycopin-Bildung. Dementsprechend ist die Deletion des GUT2-Gens in zweierlei Hinsicht entscheidend für die Bil- dung und Akkumulation von Lycopin verantwortlich.

Eine weitere Form der Limitierung ist die Stickstofflimitierung. Diese Limitierung führt in der Hefe Y. lipolytica zu einem Wachstumsstopp nach Aufbrauchen der Stickstoffquelle und zur Bildung von Citronensäure und Iso-Citronensäure .

Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung im Fermenter unter kontrollierten Prozessparametern, wobei besonders bevorzugt der pH-Wert im Medium konstant gehalten wird. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Fermentation unter Limitationsbedingungen .

Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Lycopinkonzent- ration in den Zellen durch Wachstum unter Limitationsbedingungen erhöht ist. Die Wachstumslimitation kann durch vielerlei Mittel erzeugt werden. Vorzugsweise sollte der Stickstoffgehalt im Medium während der Produktionsphase kleiner als 2 g l ^"1 , vorzugsweise kleiner als 1 g l ^"1 , hoch vorzugswiese kleiner 0,5 g l ^"1 , höchst vorzugsweise Null sein. Die Produktionsphase ist dadurch gekennzeichnet, dass sie sich einer Phase starken

Wachstums (Wachstumsphase) anschließt und nur noch im Vergleich zur Wachstumsrate geringes Wachstum, jedoch erhöhte Produktbildung aufweist. Im Falle der Stickstofflimitation sollte der pH-Wert im Medium kleiner sein als der physiologisch bevorzugte von 5,5, vorzugsweise sollte der pH-Wert zwischen 1 und 5,5 liegen, besonders bevorzugt zwischen 2 und 4, insbesondere bevorzugt bei 3,5. Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren die genannten Limitationsbedingungen miteinander kombiniert .

Fig. 1 zeigt schematisch die Lycopin-Biosynthese in nicht- carotinoidbildenden Organismen.

Fig. 2 zeigt schematisch die Erhöhung der Fettsynthese und - akkumulation . Proteinbezeichnungen an den Reaktionswegen entsprechen denen aus Saccharomyces cerevisiae, durchgestrichene Proteine kennzeichnen die Aktivität der Proteine, die verringert werden soll.

Fig. 3 zeigt Integrative Vektoren für die Lycopin-Biosynthese Fig. 4 zeigt integrative Vektoren zur vermehrten Bildung der Isoprenoid-Vorstufen

Fig. 5 zeigt wie in Bsp. 3 beschrieben, den spezifischen Lyco- pingehalt des Wildtypstammes H222, der Abkömmlinge transformiert mit den Codon-Usage-optimierten Genen crtB und crti aus P. ananatis (BI) und der zusätzlichen Überexpression der Gene GGS1 (G) und HMG1 (H) nach 96 h in YPD-Medium . In allen Abkömmlingen sind die Gene P0X1 , P0X2, P0X3, POX4, POX5, P0X6 und GUT2 deletiert.

Fig. 6 zeigt wie in Bsp. 4 beschrieben, spezifische Lycopin- Konzentrationen nach 168 h Kultivierung von H222 BI GH (Stamm ohne Deletionen der Gene POX1 , POX2, POX3, POX4 , POX5, POX6 und GUT2) in Komplex- (YP) und Minimalmedium (M) mit je 3 % Glucose (G) bzw. 3% Dextrose (D) , 3 % Glycerol (Y) oder 3 % Ölsäure (O) . Fig. 7 zeigt wie in Bsp. 4 beschreiben, die mikroskopische

Überlagerung aus Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahmen von Nilrot- gefärbten Zellen nach 168 h Kultivierung von H222 BI GH. Fig. 8 zeigt, wie in Bsp. 5 beschreiben, den spezifischen Lyco- pingehalt und die Biotrockenmasse der Stämme H222 Δ BI GH (erfindungsgemäß) und H222 BI GH (Vergleichsbeispiel) .

Fig. 9 zeigt, wie in Bsp. 6 beschreiben, Kultivierungen des Stammes H222 Δ BI GH bei verschiedenen pH-Werten.

Fig. 10 zeigt die Codon Usage Tabelle von Y. lipolytica .

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung .

Beispiel 1 : Blockierung der Beta-Oxidation und der Glycerol- basierten Gluconeogenese

Für die Konstruktion der Deletionskassetten der POX-Gene und des GUT2-Gens wurde eine Restriktionsschnittstelle (Tabelle 1: RS) zwischen Promoter und Terminator des eweiligen Gens, welche per PCR aus genomischer DNA des Stammes H222 mit den in Ta- belle 1 aufgeführten Primern gewonnen wurden, durch PCR eingebracht. Das PCR-Produkt wurde in pJETl .2 (Fermentas, Germany) ligiert und mit BamEI linearisiert . Das URA3-Fragment (2868 bp) wurde durch Restriktion mit BamEI und Bglll aus dem Vektor pU- CLys2-DK2 (SEQ ID NO: 1) isoliert und in den mit BamUI lineari- sierten Vektor mit den entsprechenden Promoter-Terminator- Fragment ligiert. Die Deletionskassetten wurden letztendlich mittels natürlich vorkommenden oder an den Primern angehängten Schnittstellen gewonnen und in Y. lipolytica H222-S4, der aus Y. lipolytica H222 hergestellt werden kann (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al . (2001), J Bacteriol 183(17) : 5102-5109), nach Barth und Gaillardin (1996) transformiert. Vor einer erneuten Transformation, wurde der Marker per FOA- Selektion zurückgewonnen. Der Stamm, der sowohl Deletionen der Gene POXl, POX2, POX3, POX4, POX5, P0X6 und GUT2 trägt wurde H222 Δ ge- nannt .

Tabelle 1 : Primer zur Herstellung der Deletionskassetten

Name DNA-Sequenz <5' >3' ) RS SEQ ID NO pPO 2_fw TCCAGAAGCGCTACAAAGAG EcoRI 6 pPOXl__rv ggatccTGAAGGTTGCAGTCGTAGTC BamEI 7

POXl t_fw ggatccTGCGATCTCGATGAGTGATG BamEI 8

POXl t_rv GCCCAGAAGATTGGAATGAC H ndiII 9 pPOX2_fw atataccgcggGATTCCGCCAAGTGAGACTG Cfr42I 10 pPOX2_rv ggatccCGTCGÄGGAAGTAGGTCÄTC : BamEI li

POX2t_fw ggatccGCGAGCTTGATGAGGÄATAG BamE 12

POX2tjcv atataccgcggCCTGACGCCAATTTGAAGAG Ofr42I 13 pPOX3_fw atataccgcggCTGGGCTGTTCGGTCGATAG Cfr42I 14 pPOX3_rv ggatccAGGACGCACAACGCCATCAC BamEI 15

POX3t__fw ggatccCGCTCCCATTGGAAACTA BamEI 16

POX3t_rv atataccgcggTCTCTTCGCTGTGGTCTAGG Cfr 2I 17 pPOX4__fw atataccgcggTCCACCGTTCTCCTTCATAC CftAZl 18 pPOX4_rv ggatccATGTCTCTAGGGTCGAAGTC BamEI 19

POX4 t Ew ggatccTGGCAAGCCTCACTAGTACG BamEI 20

POX4t ^' cv atätaccgeggTGGGGCGGAACTACTGTATC CfrVZZ 21 pPOX5_fw atataccgcggGGGATTCTCCGGGTTATTTG Cfr 2I 22 pPOX5_rv ggatccACGTCTCGGACCTTGAATTG BamEI 23

POX5t_fw ggatccCCTTCAACCTGTCCGACTTC BamEI 24

POX5t_rv atataccgcggGAAGCGGTCCTCGTTGTATG Cfr42I 25 pPOX6_fw GTGTAGCÄACTCGGÄTACAG Mlul 26 pPOX6_rv ggatcGGGTCCATÄAGCAGÄGTGTTC BamEI 27

POX6t_£w ggatccAGCCTCGACCTCCTTATTAC BamEI 28

POX6t_rv CTGTTCTTGACTGGCATAGC EcoRV 29 pGÜT2__fw CGCAGATCtACTGTCAAGCCGAGTC SglII 30 pGUT2_rv atatagga tccGGGTGGTGGGTAGGAA BamEI 31 tGUT2~fw atatagga tccGCGTATAGCCAATAAGATAATCAC BamEI 32 tGUT2-rv CCCTCCAACTCGAGGGTTGATGTAG SglII 33 Beispiel 2 : Herstellung der Vektoren

Als Ausgangsplasmid diente pUCBM21 (Boehringer Ingelheim) (SEQ ID NO: 2) . Aus diesem Vektor wurde durch Restriktion mit EcoRV und EcoICRI und Religation die Spnl-Schnittstelle entfernt. Das URA3- Fragment (2868 bp) wurde durch Restriktion mit BamUI und Bglll aus dem Vektor pUCLys2-DK2 (SEQ ID NO : 1) isoliert und in den mit BamHI linearisierten pUCBM21 ohne Sphl-Schnittstelle ligiert . Der pTEFl-Promoter und der tICLI-Terminator wurden aus dem Vektor p64-TEF-T (SEQ ID NO: 3) durch Restriktion mit BamEI und Kpnl (1262 bp) isoliert und in den mit BamHI/ Kpnl geschnittenen pUCBM21 ligiert.

Es wurden Expressionskassetten konstruiert, die neben dem Se- lektionsmarker URA3 den Promoter des Translationselongations - faktors 1 alpha (pTEFl) fusioniert mit den offenen Leserahmen (open reading frames) der Gene GGS1, HMGl , crtB und crtl tragen. Als Terminator für die Translation fungiert der Terminator des Isocitratlyasegens (tICLl) . Der Selektionsmarker URA3 ist mit zwei homologen Fragmenten des Tetracyclinresistenzgens aus Escherichia coli versehen, um durch homologe Rekombination (Ausloopen) den Selektionsmarker für weiterführende Arbeiten zurückgewinnen zu können.

Des Weiteren ist in der Expressionskassette eine Sequenz eingebracht, die homolog ist zu einem nichtcodierenden Bereich im Genom des Expressionsorganismus , in der eine zentrale Notl- Restriktionsschnittstelle vorliegt. Mit dieser Schnittstelle kann die Expressionskassette für die homologe Integration in den Expressionsorganismus linearisiert werden. Der Vektor wird entsprechend der Integrationsstelle plntB genannt.

Der homologe Bereich für die Integration in das Wirtsgenom wur- de per PCR mit Primern, die eine Kpnl -Schnittstelle im Überhang tragen (intb_KpnI_fw atataggtaccCCCACAGTTCTCACTCAG mit SEQ ID NO: 4; intb_KpnI_rv atataggtaccCÄTAÄGACGCCTCGTTGC mit SEQ ID NO: 5), gewonnen. Diese wurden dann in den mit Kpnl linearisierten Vektor ligiert. Alle folgenden Gene wurden auf die gleiche Weise in den erhaltenen Vektor eingebracht. Als Schnittstellen für die Integration in den Expressionsvektor dienten hierbei Spei und SphI .

Die an die Codon-Verwendung der Hefe Y. lipolytica angepassten Gene crtB und crti aus P. ananatis wurden auf synthetischem Wege mit dem Promotor pTEFl erzeugt und mit den Restriktions- schnittstellen für die Vektorintegration versehen (Fig. 3) .

Die Yarrowia-eigenen Gene GGSl und HMG1 wurden durch PCR gewonnen und ebenfalls wie crtB und crti per PCR mit dem Promoter pTEFl fusioniert und in den Vektor eingebracht (Fig. 4) .

Die Notl-linearisierten Vektoren wurden mittels Lithiumacetat- Methode nach Barth und Gaillardin (1996, Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag) in die Y. lipolytica-Stämme H222 und H222 Δ transformiert. Homologe Rekombination wurde durch PCR nachgewiesen. Der Uracil-Selektionsmarker wurde durch die Selektion auf 5 * -Fluororotsäure (FOA) zurückgewonnen, sodass eine erneute Transformation mit einem weiteren Vektor möglich wird.

Beispiel 3 : Vergleichende Kultivierung der Carotinoid- Vorstufen-produzierenden Stämme

Die Gene für die Carotinoid-Biosynthese wurden sukzessive in den Stamm H222 Δ durch die Integration von pIntB crti und pIntB crtB und nachfolgender FOA-Selektion eingebracht. In den so erhaltenen uracilauxotrophen Stamm wurde GGSl unter Kontrolle des pTEFl-Promoters in das Genom integriert. Auch HMGl wurde auf dieselbe Weise in den Rezipientenstamm und den bereits mit GGSl transformierten Stamm integriert.

Alle Tran formanden und der Rezipientenstamm wurden in YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glucose) kultiviert. Lycopin wurde mit Hexan :Ethylacetat : Butylhydroxytoluol (50:50:1) während eines Glasperlenaufschlusses extrahiert und bei 472 nm photometrisch bestimmt. In Fig. 5 ist zu sehen, dass die vermehrte Bildung von Ggslp und Hmglp zu vermehrter Bildung von Lycopin führt. Auch der additive bzw. synergistische Effekt beider Enzyme ist in der weiteren Erhöhung der spezifischen Lycopinausbeute zu sehen.

Beispiel 4 : Kultivierung unter Limitationsbedingungen zur Erhöhung des spezifischen Lycopin-Gehalts

Es konnte gezeigt werden, dass Stämme und Kultivierungsbedingungen, die zu vergrößerten Fettkörperchen führen, nicht auto- matisch zu einer erhöhten biomassespezifischen Lycopin-Bildung führen (Fig. 6 und Fig. 7) .

Der Stamme H222 Δ BI GH wurde vergleichend im Schüttelkolben in Vollmedium YP (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton) mit je 3 % Dextrose (YPD) , Dextrose und Ölsäure (YPDO) , Glycerol (YPY) oder Glyce- rol und Ölsäure (YPYO) ; oder in Miniraalmedium (1 g l ^"1 KH ₂ P0 , 0,16 g l ^"1 K ₂ HP0 ₄ x 3 H ₂ 0, 3 g l ^"1 (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0,7 g l ^"1 MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,5 g/1 NaCl, 0,4 g l ^"1 Ca(N0 ₃ ) ₂ x 4 H ₂ 0, 0,5 mg l ^"1 H ₃ BO3, 0,04 mg l ^"1 CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0, 0,1 mg l ^"1 KI, 0 , mg l ^"1 MnS0 ₄ x 4 H ₂ 0, 0,2 mg l ^'1 Na ₂ Mo0 ₄ x 2 H ₂ 0, 0,4 mg 1 ^_1 ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 6 mg l ^"1 FeCl ₃ x 6 H ₂ 0, 0,3 mg l ^"1 Thiamin-Hydrochlorid) mit je 3 % Glu- cose (MG) , Glucose und Ölsäure (MGO) , Glycerol (MY) oder Glycerol und Ölsäure (MYO) kultiviert. Die Kultivierung wurde bei 28 °C und pH 5,5 durchgeführt.

In Fig. 7 ist zu sehen, dass die Fettkörperchen in Medium mit Ölsäure vergrößert sind. Die Vergrößerung ist in Minimalmedium stärker ausgeprägt als in Komplexmedium und geht jedoch nicht mit einer erhöhten Akkumulation von Lycopin einher (Fig. 6).

Beispiel 5: Sticksto flimitierende Kultivierung der Lycopin- bildenden Stämme

Die Stämme H222 Δ crtB crtl GGS1 HMG1 (H222 Δ BI GH) und H222 crtB crtl GGS1 HMG1 (H222 BI GH) wurden vergleichend im Fermenter (Multifors, Infors, Stuttgart, Deutschland) in Minimalmedi- um (5 % Glucose, 1 g l ^"1 KH ₂ P0 ₄ , 0,16 g 1 ^_1 K ₂ HP0 ₄ x 3 H ₂ 0, 3 g ¹ (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0,7 g l ^"1 MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,5 g/1 NaCl, 0,4 g l ^"1

Ca(N0 ₃ ) ₂ x 4 H ₂ 0, 0,5 mg l ^"1 H ₃ B0 ₃ , 0,04 mg l ^"1 CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0, 0,1 mg l ^"1 KI, 0,4 mg l ^"1 MnS0 ₄ x 4 H ₂ 0, 0 , 2 mg l ^"1 Na ₂ Mo0 ₄ x 2 H ₂ 0, 0,4 mg l ^"1 ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 6 mg l ^"1 FeCl ₃ x 6 H ₂ 0, 0 , 3 mg l ^"1 Thia- min-Hydrochlorid) kultiviert. Die Kultivierung wurde bei 28 °C, pH 5,5, 1 WM Druckluft und Rührerdrehzahl zwischen 400 und 1200 Upm durchgeführt.

Aus Fig. 8 ist die verstärkte spezifische Bildung des Lycopins im erfindungsgemäßen Stamm ersichtlich (3,8fach) . Die gebildeten Mengen an Citronensäure (CA) und Isocitronensäure (ICA) sind in beiden Stämmen vergleichbar (H222 BI GH: CA = 46,6 g l ^"1 ; ICA = 6,8 g l ^"1 ; H222 Δ BI GH: CA = 43,3 g l ^"1 ; ICA = -6,0 g l ^"1 nach 7 Tagen [d] ) .

Beispiel 6: Erhöhte Lycopin-Akkvimulation durch Kultivierung bei verringertem pH-Wert

H222 Δ BI GH wurde vergleichend bei pH 5,5 und 3,5 im Fermenter (Multifors, Infors, Stuttgart, Deutschland) in Minimalmedium (5 % Glucose, 1 g l ^"1 KH ₂ P0 ₄ , 0,16 g l ^-1 K ₂ HP0 ₄ x 3H ₂ 0, 0,7 g l ^"1

MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,4 g l ^"1 Ca(N0 ₃ ) ₂ x 4 H ₂ 0, 0 , 5 mg l ^"1 H ₃ B0 ₃ , 0,04 mg l ^"1 CuS0 x 5 H ₂ 0, 0,4 mg 1 ^_1 MnS0 ₄ x 4 H ₂ 0, 0,4 mg l ^"1 ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,2 mg 1 ^_1 Na ₂ Mo0 ₄ x 2 H ₂ 0, 0,1 mg l ^"1 KI, 6 mg l ^"1 FeCL ₃ x 6 H ₂ 0, 0,3 mg l ^"1 Thiamin-Hydrochlorid) kultiviert. Die Kulti- vierung wurde bei 28 °C, 1 WM Druckluft und Rührerdrehzahl zwischen 400 und 1200 Upm durchgeführt (Fig. 9) .

Die Verringerung des pH-Wertes führt zu einem Verfahren mit dem sehr hohe Mengen an Lycopin (16 mg Lycopin pro Gramm Biotrockenmasse) produziert werden können.