Título de la invención :

Cepas de levadura capaces de fermentar rápidamente azúcares con producción rápida de dióxido de carbono y etanoi: obtención y utilización de estas cepas.

Clasificación internacional : C12N-15

Indicación del estado de la técnica

Cepas de levadura pertenecientes a diversos géneros, como por ejemplo Saccharomyces , son capaces de fermentar azúcares produciendo en el proceso dióxido de carbono y etanol. La producción de dióxido de carbono es la que permite a lajevadura de panadería levantar la masa mientras que la producción de etanol se encuentra en el origen de la obtención de vinos y cervezas por las levaduras vínicas y las cerveceras respectivamente. Las levaduras también se utilizan para producir etanol para usos industriales o alimentarios a partir de melazas y otros productos de bajo valor. Todas estas aplicaciones hacen que resulte de un gran interés industrial obtener levaduras capaces de fermentar azúcares rápidamente con una producción acelerada de dióxido de carbono y etanol. Se han descrito algunos procedimientos para incrementar la producción de dióxido de carbono por levaduras que están basados en una modificación del balance energético de la levadura (patente US85110885796551) o en la introducción en la levadura de genes que codifican proteínas implicadas en los pasos iniciales de la utilización de un azúcar como la maltosa (patentes EP 87201670 y EP 88200453). En ninguno de los casos se proporcionan datos sobre velocidad de producción de etanol por las levaduras modificadas.

Breve descripción de la invención La presente invención consiste en la obtención de cepas de levadura que fermentan azúcares mas rápidamente con producción más rápida de dióxido de carbono y etanol. Para ello se han introducido en las levaduras genes de

enzimas que normalmente no se expresan en presencia de azúcares, bajo el control de promotores que permiten su expresión en estas condiciones.

Descripción detallada de la invención Para fermentar azúcares a dióxido de carbono y etanol, las levaduras requieren una serie de enzimas que catalizan los pasos sucesivos de la vía metabólica conocida como vía glicolítíca. La actividad de estas enzimas se encuentra estrechamente regulada de forma que incluso incrementando artificialmente los niveles de estas enzimas no resulta aumentado el flujo glícolítico (Schaaff.l., Heinisch.j. & Zimmermann.F.K. Yeast 5285-290 (1989)).

Un procedimiento alternativo para acelerar el flujo glicolítico consistiría en alterar los balances metabólicos intracelulares, introduciendo en la célula genes que normalmente no se expresan en presencia de azúcares, pero que han sido modificados de forma que se encuentren bajo el control de promotores no reprimibles por azúcares.

Los azúcares utilizados por las levaduras son capaces de reprimir en mayor o menor grado la síntesis de una variedad de enzimas por un proceso que se conoce como represión catabólica (Gancedo.J.M. Eur.J.Biochem. (en prensa, 1992)). Entre estas enzimas se pueden destacar las enzimas gluconeogénicas, fructosa 1,6 bisfosfatasa y fosfoenolpiruvato carboxikinasa codificadas por los genes FBP1 y PCK1 y que catalizan reacciones antagónicas a las que catalizan dos de las enzimas irreversibles de la vía glícolítica.

Genes sometidos a represión catabólica, como FBP1 o PCK1, pueden expresarse en presencia de azúcares si se sustituye su promotor por otro insensible al efecto represor de los azúcares. Estos promotores son muy numerosos, entre ellos podemos citar los de genes que codifican enzimas asociadas con la vía glicolítica o los de genes relacionados con proteínas ribosomaies. Por otra parte, se encuentran perfectamente puestos a punto métodos para colocar cualquier gen bajo el control de alguno de estos promotores (Guide to Yeast Genetícs and Molecular Biofogy (Guthrie y Fink eds) Methods in Enzymology vol 194 Academic Press 1991).

Para introducir los genes modificados en una cepa de levadura de forma que se mantengan en ella de forma estable existe una gran variedad de técnicas. Se pueden aplicar una o varias de las siguientes: transformar la levadura por cualquiera de los métodos usuales (incubación de protoplastos con DNA, tratamiento de la levadura con iones caotrópicos, electroporación) con plásmidos multicopia, centroméricos o integrativos que contengan el gen modificado que se desee introducir junto con un marcador de selección.

A su vez como marcador de selección es posible utilizar un gen que codifique alguna enzima de una vía biosintética que se encuentre ausente en la cepa de levadura receptora (como URA3, LEU2, HIS3, TRP1 etc.), un gen que proporcione resistencia a antibióticos (como G418, higromicina B, fleomicina, cloranfenicol, cicloheximida etc.) o un gen que proporcione resistencia a alguna sustancia tóxica (como metotrexato, sulfometurón, cobre, etc.).

En el caso de levaduras industriales para uso en biotecnología alimentaria el método de elección consiste en integrar en una región dispensable de un cromosoma de levadura el gen de interés junto con un marcador de selección. Si el marcador de selección es un gen de levadura, como ocurre en el caso de la resistencia a sulfometuron (Xiao,W. y Rank,G.H. Gene 3.99-107 (1989)) o a cicloheximida (del Pozo,L, Abarca.D., Claros.M.G. y Jimenez,A. Curr.Genet. IR 353-358 (1991)) es posible conseguir de esta forma una levadura modificada que carece totalmente de DNA bacteriano o, en general, ajeno a la levadura. La transformación , por otra parte puede facilitarse con la utilización de una cepa karl (Navas,L. Esteban,M. y Delgado,M.A. J.InstBrew. 9Z 115-118 (1991)). Se ha comprobado que cepas de levadura transformadas con plásmidos que permiten la expresión constitutiva de algunos genes , normalmente reprimidos por glucosa, muestran una producción acelerada de dióxido de carbono y etanol. Descripción del contenido de los dibujos La fig.1 describe la construcción del plásmido pAN5. Los plásmidos están representados esquemáticamente y no a escala. Abreviaturas: B, BamH1; Bg, Bglll; E, EcoR1; H, Hindlll; AmpP, resistencia a ampicilina.

La fig.2 describe la construcción del plásmido pAN11. Los plásmidos están representados esquemáticamente y no a escala. Abreviaturas como en fig.1, además N, Ndel; X, Xbal.

La fig.3 muestra ¡a velocidad de utilización de la glucosa por la cepa CJM 186 (-) y su parental CJM152 (o).

La fig.4 muestra la velocidad de formación de etanol por la cepa CJM186 ( ^• ) y su parental CJM152 (o).

La fig.5 muestra la velocidad de formación de dióxido de carbono por la cepa CJM186 ( ^• ) y su parental CJM152 (o). Un modo de realizar la invención

Los genes FBP1 y PCK1 de Saccharomyces cerevisiae han sido clonados y se conoce su secuencia . Por otra parte se dispone de un plásmido multicopia pAAH5 capaz de multiplicarse tanto en Escherichia coli como en Saccharomyces cerevisiae y de seleccionarse en estos organismos gracias a los marcadores Am T y LEU2 respectivamente. Este plásmido contiene el promotor y eíterminador del gen ADC1 que codifica la alcohol deshidrogenasa I de levadura.

Construcción de los plásmidos pAN5 ypAN11.

Como se indica en la fig.1 un fragmento Hindlll-BamH1 del gen PCK1 se tomó del plásmido pMV4 y se introdujo en M13mp18 para realizar allí una mutagénesis dirigida que permitiera crear un nuevo sitio Hindlll. La mutagénesis se realizó con el sistema que comercializa la firma Amersham, utilizando un olígonucleótido sintético de secuencia 5' AAACCAAGCTTACGCAA 3'. Una vez llevada a cabo la mutagénesis en el promotor se reconstruyó el gen PCK1 introduciendo en el plásmfdo pMV7 el fragmento Bglll-Bglll que contiene el promotor modificado obteniéndose así el plásmido pAN4. En este plásmido se sustituyó el sitio único EcoR1 por un sitio Hindlfl, digiriendo con EcoR1, tratando con enzima de Klenow, ligando engarces Hindlll y religando el plásmido. Por fin se insertó la región codificante del gen PCK1 (fragmento Hindlll-Hindlll) en pAAHS entre el promotor y el terminador de ADC1. Se obtuvo así el plásmido pAN5 en el que PCK1 se encuentra bajo el control del promotor de ADC1 y en el que los genes de resistencia a ampicilína y LEU2 pueden actuar como

marcadores para la selección de transformantes en E.coli y en levadura respectivamente.

Como se indica en la fig.2 se eliminó el sitio de corte con Hindlll del vector YEp352 y en el sitio BamH1 se insertó el fragmento BamH1 -BamH1 de pAAH5 que contiene el promotor y el terminador de ADC1. Por otra parte la región codificante del gen FBP1 se extrajo del plásmido pRG6 por digestión con NdelyXbal. El fragmento Ndel-Xbal correspondiente se trató con la enzima de Klenow y se ligó con engarces Hindlll; el fragmento Hindlll-Hindlll así formado se insertó en el plásmido pANW obteniéndose así finalmente el plásmido pAN11 en el que el gen FBP1 se encuentra bajo el control del promotor de ADC1 y en el que los genes de resistencia a ampicilina y URA3 pueden actuar como marcadores para la selección de transformantes en E.coli y en levadura respectivamente.

La levadura CJM152 (Saccharomyces cerevisiae, mat a, ura3, Ieu2) se transformó con pAN5 y pAN11 por el método del sulfato de litio (lto,H., Fukuda,Y., Murata,K. y Kimura,A. J.Bacteriol. ü¡__l_163-168 (1983)) seleccionándose los transformantes en medio mínimo. El transformante conteniendo los dos plásmidos multicopia se denominó CJM 186 y se encuentra depositado con fecha 13 de Febrero de 1992 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes del Instituí Pasteur con el número 1-1175.

Se han medido los niveles de las enzimas gluconeogénicas fructosa 1,6 bisfosfatasa y fosfoenolpiruvato carboxikinasa en la cepa CJM186 crecida en medio mínimo (YNB,Difco) con 2% glucosa y recogida en la fase logarítmica del crecimiento. Los resultados, que se muestran en la tabla 1, indican que los niveles son elevados, muy superiores incluso a los que se encuentran presentes en la cepa parental crecida en condiciones gluconeogénicas.

Tabla 1

Actividad de las enzimas gluconeogénicas en distintas cepas de levadura

Fructosa 1,6 Fosfoenolpiruvato biofosfatasa carboxikinasa miliunidades/mg proteína

CJM 152 glucosa etanol CJM 186 glucosa

En la cepa CJM 186 s ha medido también la velocidad de utilización de la glucosa comparándola con la de la cepa parental no transformada. Las levaduras se crecieron en medio mínimo con 2% glucosa hasta la fase logarítmica del crecimiento y se resuspendieron en tampón fosfato potásico 50mM, pH6 a una concentración de 20 mg levadura (peso húmedo)/ml. La levadura se incubó con agitación a 30°C y se tomaron muestras a tiempos que se centrifugaron inmediatamente. En los sobrenadantes se valoró glucosa enzimátícamente con hexokinasa y glucosa-6P deshidrogenasa . Como se ve en la fig.3 la velocidad de utilización de la cepa transformada aumenta en un 50% con respecto a la cepa parental. En las mismas muestras utilizadas para medir consumo de glucosa se midió la concentración de etanol enzímáticamente utilizando alcohol deshidrogenasa . Se comprobó que la velocidad de formación de etanol aumenta en un -44% como se muestra en la fig.4. Utilizando suspensiones de levadura como las descritas mas arriba se midió la velocidad de formación de dióxido de carbono utilizando un aparato de Warburg termostatizado a 30°C. Se comprobó que aumenta en un 35% como se muestra en la fig.5.