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Title:
YEAST STRAINS HAVING A MODIFIED ALCOHOLIC SUGAR FERMENTATION BALANCE, USES THEREOF, AND VECTORS FOR PRODUCING SAID STRAINS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1996/041888
Kind Code:
A1
Abstract:
Yeast strains having a modified alcoholic sugar fermentation balance, in particular as far as the production of glycerol and ethanol is concerned, and vectors or sequences for producing said strains, are disclosed. Said yeast strains are selected from Saccharomyces strains and contain at least one fragment of a gene coding for an NADH-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH), said fragment being modified by regulating sequences active in yeast comprising a strong promoter, for increasing the production of glycerol and reducing that of ethanol, in a sugar-rich medium during alcoholic fermentation.

Inventors:
Dequin
Sylvie, Barre
Pierre
Application Number:
PCT/FR1996/000854
Publication Date:
December 27, 1996
Filing Date:
June 06, 1996
Export Citation:
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Assignee:
INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE - INRA DEQUIN
Sylvie, Barre
Pierre
International Classes:
C12G3/08; C12N1/19; C12N9/02; C12P7/20; (IPC1-7): C12N15/81; A21D8/04; C12G3/08; C12N1/18; C12N9/02; C12P7/20
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Claims:
REVENDICATIONS
1. Souches de levures, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées parmi des souches de Saccharomyces, en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'un gène codant pour une glycerol 3 phosphate deshydrogenase NADHdépendante (GPDH) , lequel fragment est modifié par des séquences de régulation actives dans la levure comportant un promoteur fort, pour augmenter la production de glycerol et réduire la production d'éthanol, dans un milieu riche en sucres pendant la fermentation alcoolique.
2. Souches de levures selon la revendication1 caractérisées en ce qu'elles sélectionnées parmi des souches de Saccharomyces industrielles, notamment des souches oenologiques, de distillerie, de brasserie, de boulangerie ou de cidrerie.
3. Souches de levures selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles appartiennent à l'espèce Saccharomyces cerevisiae .
4. Souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins deux copies du gène codant pour une GPDH NADHdépendante.
5. Cassette d'expression, caractérisée en ce qu' elle comprend un gène codant pour une GPDH NADH dépendante de levure associé à des séquences de régulation actives dans la levure.
6. Vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5, et utili sables pour l'obtention des souches de levures transfor¬ mées selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7. Vecteurs selon la revendication 6, carac¬ térisés en ce qu'il s'agit de vecteurs navette, possédant également une origine de réplication bactérienne et un marqueur de sélection dans une bactérie.
8. Boissons fermentées à teneur allégée en ethanol, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fermentation alcoolique, en présence de souches de levures selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 9.
9. Utilisation d'une souche de levure selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la préparation de pain.
10. Procédé de fermentation alcoolique à bilan de fermentation des sucres modifié, caractérisé en ce que pour augmenter la production de glycerol et réduire la production d'éthanol, ledit procédé comprend : (1) la transformation d'une souche de levure Saccharomyces par un vecteur surexprimant la protéine GPDH ; et (2) l'ensemencement du milieu de fermentation, contenant au moins 30 g/1 de sucres, avec la souche de levure transformée (transformant) , obtenue en (1) .
Description:
SOUCHES DE LEVURES PRESENTANT UN BILAN DE FERMENTATION ALCOOLIQUE DES SUCRES MODIFIE ET LEURS APPLICATIONS, VECTEURS UTILISABLES POUR L'OBTENTION DESDITES SOUCHES.

La présente invention est relative à des souches de levures présentant un bilan de fermentation alcoolique des sucres modifié, notamment en ce gui concerne la production de glycerol et d'éthanol.

La présente invention est également relative à des vecteurs ou des séquences, utilisables pour l'obtention desdites souches.

Le glycerol est un composé extrêmement impor¬ tant dans les fermentations alcooliques industrielles réalisées par des levures, notamment parce qu'il s'agit du principal sous-prpduit de fermentation après l'ethanol et le CO2 •

La production de glycerol, réalisée dans le cytoplasme, commence par la réduction du dihydroxyacétone phosphate (DHAP) en glycérol-3-phosphate, par une glyce¬ rol 3 phosphate déshydrogénase NADH-dépendante (GPDH, EC 1.1.1.8) . L'enzyme est fortement inhibée par des concen¬ trations élevées en ethanol (NAGODA ITHANA et al. J. Am. Soc. Brew. Chem. 39, p. 179-183, 1977), des solutions de force ionique importante ainsi que par différents métabo- lites et cofacteurs [NADER et al., Biochem. Biophys. Acta, 571, p. 177-185, (1979)] . Elle est vraisemblable¬ ment activée par un ou des effecteurs [GANCEDO et al., European Biocem. , 5, p. 165-172, (1968)] . Son poids molé¬ culaire est de 42 kDa [NILSSON et ADLER, Biochem. Biophys. Acta, 1034, p. 180-185, (1990)] ; la forme active présente par contre un poids moléculaire de 68 kDa, ce qui semblerait montrer que l'enzyme est active sous la forme d'un di ère [ALBERTYN et al., FEBS, 308, p. 130-132, (1992)] . Un gène, dénommé GPD1, responsable de la synthèse de l'enzyme a été récemment clone et caracté- risé [LARSSON et al., Mol. Microbiol. 10, p. 1101-1111, (1993) ; ALBERTYN et al., Mol. Cell. Biol. 14, p. 4135-

4144, (1994)], mais sa disruption n'entraîne pas une perte totale d'activité GPDH, ce gui entraîne un maintien de la production de glycerol, y compris en anaérobiose, ce qui suppose l'existence d'un deuxième gène, GPD2, codant pour une isoenzyme.

La deuxième étape consiste en la déphosphory- lation du glycérol-3-phosphate en glycerol par l'α-glycé- rophosphatase (glycerol 3-phosphatase ou G3Pase, EC

3.1.3.21), stéréospécifique du L-glycérol-3-phosphate. Cette étape n'est pas considérée comme limitante.

Alors que le glycerol est produit dans le cytoplasme, les enzymes impliquées dans son assimilation sont, par contre, localisées dans la itochondrie : gly¬ cerol kinase codée par GUT1 et une GPDH flavine adénine dinucléotide (FAD)-dépendante codée par GUT2.

Le gène GPD1 [LARSSON et al., 1993 et ALBERTYN et al., 1994, précités], obtenu à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae comprend 1176 pb et code pour la GPDH précitée (ou GPDlp) , protéine de 391 amino-acides. Le glycerol est synthétisé dans la levure en réponse à deux conditions environnementales différentes :

- Le choc osmotique :

La production de glycerol est augmentée en réponse à ce stress . Le glycerol sert de soluté permet- tant d'ajuster la pression osmotique intracellulaire en fonction de celle du milieu. Lors du stress osmotique, la synthèse de GPDlp (GPDH exprimée par le gène GPD1) est augmentée de façon importante.

- L'anaérobiose et en particulier l'état redox de la cellule :

La formation du glycerol pendant la fermenta¬ tion alcoolique est un moyen pour la cellule d'équilibrer sa balance d' oxydoréduction (balance déséquilibrée notam¬ ment au cours de la croissance cellulaire) , en fournis- sant un système accepteur d'électrons complémentaire (figure 1) .

L'étude de mutants osmosensibles osgl-1, (LARSSON et al., 1993, précité), montre qu'ils sont incapables de croître dans un milieu à faible poten¬ tiel en eau et présentent à la fois une diminution signi- ficative de la production du glycerol et de l'activité de la GPDH.

ALBERTYN et al., 1994, précité, ont également séquence le même gène GDPl et ont plus particulièrement étudié la régulation de l'expression de la GDPlp chez S. cerevisiae par la voie métabolique HOG (= High-Osmolari ty Glycerol response) . L'effet physiologique prééminent, dans les levures ayant subi un choc osmotique, est l'aug¬ mentation intracellulaire de la production de solutés compatibles pour contrebalancer la pression osmotique (essentiellement production de glycerol) . Le gène GDPl et un taux de production élevé de glycerol sont essentiels à la croissance des levures, en présence d'un choc osmoti¬ que.

Pour étudier la régulation de la production de glycerol, ces Auteurs ont réalisé des études de surex¬ pression et de délétion du gène GPDl. La surexpression est réalisée en sous-clonant le gène GPDl dans un plas- mide multicopies YEpIaclδl (= YEpGPDl) . Les transformants (levures de laboratoire) portant le plasmide multicopies YEpGPDl, présentent une activité enzymatique GPDH-NADH dépendante, supérieure d'un facteur 5 à 7, par rapport à l'activité enzymatique des cellules non transformées ; toutefois, de tels transformants, bien qu'ils surprodui¬ sent l'enzyme ( GPDlp) , ne présentent pas de taux plus élevés en glycerol, dans un milieu de culture contenant du glucose, alors que lorsque du galactose est utilisé à la place du glucose, les mêmes transformants produisent environ 3 à 5 fois plus de glycerol que les cellules non- transformées. Toutefois, l'étude du choc osmotique sur ces cellules transformées, a conduit les Auteurs de cet article à préciser que les cellules surproduisant la GPDH

n'apparaissent pas comme étant plus résistantes au choc osmotique que les cellules sauvages, ceci étant sans doute lié au fait qu'elles ne produisent pas plus de gly¬ cerol, lors d'une fermentation alcoolique. La modulation de la production de glycerol

(augmentation ou diminution) et du rapport glycé- rol/éthanol, pendant la fermentation alcoolique, présente un intérêt dans l'industrie agro-alimentaire : oenologie, brasserie, distillerie, boulangerie, cidrerie. En oenologie, le glycerol est un composé important en ce qui concerne les qualités organoleptiques du vin. Il apporte notamment une propriété de "moelleux", et un léger goût sucré. La concentration moyenne de glycerol dans les vins est de 5 à 12 g/1 ; la variabilité observée dépend de différents paramètres, tels que la composition du milieu et les conditions de croissance, et aussi la nature de la souche utilisée.

L'obtention de teneurs plus élevées en glyce¬ rol a deux intérêts majeurs : 1) une amélioration des qualités organolepti¬ ques du produit, et

2) une diminution de la teneur en ethanol . En effet, le glycerol produit normalement au cours de la fermentation alcoolique est la résultante du fonctionne- ment d'un système accepteur d'électrons complémentaire, destiné à équilibrer la balance générale d' oxydoréduction de la glycolyse. Le rôle prépondérant du glycerol en anaérobiose est donc la réoxydation du NADH (figure 1) .

L'amplification de la production de glycerol va d'une part limiter le flux de carbone normalement uti¬ lisé vers la production de pyruvate puis d'éthanol, et d'autre part, provoquer un déséquilibre de la balance d 1 oxydoréduction, par utilisation accrue du pool de NADH. Ce déséquilibre pourra être compensé par une limitation de la principale voie impliquée dans la régénération du

NAD (voie de synthèse de l' ethanol) au niveau de la con¬ version acétaldéhyde vers l' ethanol.

C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à des souches de levures transfor- mées qui répondent mieux aux besoins de la pratique que les souches transformées de l'Art antérieur, notamment en ce qu'elles permettent effectivement l'amplification de la production de glycerol avec une modification concomi¬ tante du rapport glycerol/ethanol. La présente invention a pour objet des souches de levures, caractérisées en ce qu'elles sont sélection¬ nées parmi des souches de Saccharomyces, en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'un gène codant pour une glycerol 3 phosphate déshydrogénase NADH-dépendante (GPDH) , lequel fragment est modifié par des séquences de régulation actives dans la levure comportant un promoteur fort, pour augmenter la production de glycerol et réduire la production d'éthanol, dans un milieu riche en sucres pendant la fermentation alcoolique. On entend, au sens de la présente invention, par milieu riche en sucres, un milieu contenant au moins 30 g/1 de sucres (3 %) (glucose, fructose, mélasses, par exemple) , de préférence entre 60 g/1 (6 %) et 250 g/1 (25 %) . Conformément à l'invention, lesdites souches de levures produisent, lorsqu'elles sont ensemencées dans un milieu de fermentation comprenant plus de 30 g/1 de sucres, environ 2 à 5 fois plus de glycerol avec une réduction concomitante du taux d'éthanol d'au moins 4 g/1, par rapport à des cellules de levures non trans¬ formées et cultivées dans un milieu de fermentation comprenant moins de 30 g/1 de sucres.

En outre, le rapport glycerol produit/glucose initial est significativement différent pour les souches transformées (entre 0,07 et 0,15) selon l'invention par rapport aux souches non transformées (0,03-0,04) .

Conformément à l'invention, ledit gène codant pour une GPDH est sélectionné dans le groupe constitué par le gène GPDl, le gène GPD2 ou tout gène homologue, apte à coder pour une GPDH. Lesdites souches de Saccharomyces sont, de préférence, des souches industrielles, notamment des souches oenologiques, de distillerie, de brasserie, de boulangerie ou de cidrerie.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites levures appartiennent à l'espèce Saccharomyces cerevisiae.

A titre d'exemple, on peut citer la souche ScV5M, dérivée d'une souche industrielle oenologique.

De manière avantageuse, l'invention prévoit, pour l'obtention de souches aptes à une production accrue de glycerol et une réduction de la production d'éthanol, sur un milieu riche en sucres, la construction suivante :

Lesdites souches de Saccharomyces sont carac¬ térisées en ce qu'elles contiennent au moins deux copies du gène codant pour une GPDH NADH-dépendante (GPDl ou GPD2), sous contrôle de séquences régulant l'expression dudit gène dans la levure.

Par "séquence régulant l'expression d'un gène", on entend des séquences de type promoteur et terminateur actives dans la levure. Les promoteurs et terminateurs de différents gènes peuvent être utilisés, associés à des combinaisons différentes. On utilisera, de préférence, des promoteurs et terminateurs d'un autre gène que le gène GPDl. On citera, à titre d'exemple non limitatif, les promoteurs et terminateurs, connus en eux- mêmes, des gènes alcool-déshydrogénase I (ADHI) , phospho- glycérate kinase (PGK) et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) .

L'invention comprend également la cassette d'expression obtenue en associant lesdites séquences de régulation et le gène codant pour une GPDH NADH-

dépendante (GPDl par exemple) ; cette cassette peut être portée par un plasmide, ou intégrée dans l'ADN chromo¬ somique de la levure hôte.

L'invention englobe également des vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, et utilisables pour l'obtention des souches de levures transformées conformes à l'inven¬ tion.

Ces vecteurs pourront être sélectionnés sur la base de la nature et de la force des éléments régulateurs qui entrent dans la cassette d'expression. On peut choi¬ sir les promoteurs et terminateurs décrits plus haut, ou tout autre séquence permettant de contrôler l'expression d'un gène dans la levure. Un autre critère du choix des vecteurs réside dans le nombre de copies de ceux-ci, qui est conditionné par le choix de l'origine de réplication.

Conformément à l'invention, le gène GPDl, associé à des séquences de contrôle, est porté par un plasmide replicatif à haut nombre de copies, possédant comme origine de réplication dans la levure : une partie du plasmide 2μ endogène, une séquence ARS chromosomique ou des séquences télomériques.

Préférentiellement, les vecteurs conformes à 1'invention comportent également des marqueurs de sélec¬ tion dans la levure, tels que des marqueurs d'auxo- trophie : URA3, LEU2, HIS3, TRP^, ADE etc.... et/ou des marqueurs de résistance aux antibiotiques (G318, hygro- mycine B, chloramphénicol, pléomycine) , à des herbicides (sulfométuron méthyle) , au cuivre...

Avantageusement, les vecteurs conformes à l'invention sont des vecteurs navettes, possédant égale¬ ment une origine de réplication bactérienne et un mar¬ queur de sélection dans une bactérie (par exemple, gène de résistance à un antibiotique) .

Les plasmides conformes à l'invention, portant le gène codant pour la GPDH-NADH dépendante de levure peuvent être introduits dans toutes souches de levure, par différentes techniques de transformation. Parmi les techniques de transformation les plus courantes, on citera la technique des protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels de lithium et l'électroporation.

De manière surprenante, les levures Saccharo- myces, transformées par un plasmide à haut nombre de copies, dans lequel le gène codant pour une GPDH (gène GPDl ou gène GPD2) est associé à des séquences régulatrices dudit gène, ont une production accrue en glycerol et une réduction de la production d'éthanol sur un milieu riche en sucres, c'est-à-dire comportant au moins 30 g de sucres/l ; à titre d'exemple, des levures transformées conformes à 1 ' invention permettent l'expression multicopies du gène GPDl codant pour une GPDH, sous contrôle du promoteur fort ADHI (clone SIM7, par exemple) et ainsi une production significativement accrue de glycerol pendant la fermentation alcoolique dans un milieu contenant 30 g/1 de sucres ou plus, alors que l'expression multicopies de ce gène, dans un milieu ne contenant que 20 g/1 de sucres, comme décrit dans ALBERTYN et al. (1994), c'est-à-dire sous contrôle de son propre promoteur, dans une levure de laboratoire n'avait jusqu'alors pas permis d'observer une augmentation de la production de glycerol.

Le procédé de construction des souches confor- mes à 1 ' invention surexprimant la GPDH et en conséquence surproduisant du glycerol, sur un milieu riche en sucres (fermentation alcoolique) comprend les étapes suivantes : construction d'une cassette d'expression comprenant le gène codant pour une GPDH (gène GPDl ou gène GPD2) et des éléments régulateurs forts ;

- introduction de cette cassette en multi¬ copies dans une levure.

Les souches de levures surproductrices de glycerol, conformes à l'invention trouvent de nombreuses applications dans l'agro-alimentaire. Elles sont utili¬ sables partout où une fermentation alcoolique doit s'accompagner à la fois d'une diminution du taux en etha¬ nol et d'une diminution du taux de sucres. Ceci est par¬ ticulièrement intéressant dans le domaine de l'élabora- tion de boissons fermentées à teneur allégée en ethanol, que ce soit des vins ou des produits plus récents comme les "cocktails à base de vin". Dans cette dernière caté¬ gorie, par exemple, la teneur en sucre ne doit pas dépas¬ ser 80 g/1, et le degré final d'alcool 4°C, ce qui suppose l'utilisation de moûts ayant une richesse en sucre de 150 g/1 au maximum, ce qui est rarement le cas. D'autres modèles tels que les pétillants de raisin sont également concernés.

De façon plus générale, on constate, depuis quelques années, une tendance affirmée de la consommation pour des produits moins riches en sucre mais aussi en ethanol, tout en conservant le goût sucré.

Or, les procédés physiques susceptibles d'être mis en oeuvre dans ce but : osmose inverse, évaporation sous vide, présentent dans ce contexte, des limites, dans la mesure où ces techniques, en cours de développement, sont coûteuses et altèrent souvent la qualité des pro¬ duits. Pour ces raisons, les souches de levure, conformes à l'invention, susceptibles de dégrader plus de sucre en produisant moins d'alcool au profit du glycerol (saveur sucrée) présentent des avantages incontestables. De plus, les levures surproductrices de glycerol, conformes à l'invention, présentent, au niveau de leur mise en oeu¬ vre, l'avantage de ne pas nécessiter d'investissement particulier. En s'affranchissant des métabolismes tradi-

tionnels, on peut obtenir des produits originaux au sein du secteur des boissons fermentées.

Le secteur de la boulangerie est également concerné ; mais dans ce cas, c'est l'augmentation de la production intracellulaire en glycerol qui est recher¬ chée ; de telles levures présentent, en effet, une plus grande osmotolérance et une résistance accrue à la congé¬ lation et au séchage.

La présente invention a également pour objet un procédé de fermentation alcoolique à bilan de fermen¬ tation des sucres modifié, caractérisé en ce que pour augmenter la production de glycerol et réduire la produc¬ tion d'éthanol, ledit procédé comprend :

(1) la transformation d'une souche de levure Saccharomyces par un vecteur surexprimant la protéine

GPDH ; et

(2) l'ensemencement du milieu de fermentation, contenant au moins 30 g/1 de sucres, avec la souche de levure transformée (transformant) , obtenue en (1) . Outre les dispositions qui précèdent, l'inven¬ tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : la figure 1 représente la balance dOxydoréduction pendant la fermentation alcoolique, la figure 2 représente la séquence des oligonucléotides 01 et 02 et leurs positions respectives dans le gène GPDl,

- la figure 3 illustre le clonage du gène GPDl dans le plasmide pGEM-T,

- la figure 4 représente le clonage du gène GPDl dans le plasmide pVTlOO-U, - la figure 5 représente l'évolution de la population cellulaire en fonction de l'avancement de

réaction chez V5p (souche contrôle ScV5M transformée par le plasmide pVTlOO-U) (O) et SIM7 (souche ScV5M transfor¬ mée par le plasmide pVTlOO-U-GPDl) (•) ,

- la figure 6 représente la production de glycerol en fonction de l'avancement de réaction chez V5p

(O) et SIM7 (•) , la figure 7 représente l'évolution de l'activité spécifique GPDH chez V5p (O) et SIM7 (•) en fonction de l'avancement de réaction, - la figure 8 représente l'immunodétection de la protéine GPDlp chez SIM7. Les fractions protéiques sont obtenues à différents moments d'avancement de réac¬ tion. Chaque dépôt protéique contient la même quantité de protéine (10 μg) , - la figure 9 représente l'évolution de la population cellulaire chez V5p (O) et SIM7 (•) , en fonc¬ tion du temps (μ(V5p)=μ(SIM7)=0, 54 gén./h),

- la figure 10 représente l'évolution de la concentration en glucose restante dans le milieu chez V5p (O) et SIM7 (•) , en fonction du temps (fermentation sur YNB + 5 g/1 de casaminoacides pH 3,4, 28°C avec [glucose]=100 g/1) ,

- la figure 11 représente l'évolution de la production d'acetaldehyde en fonction de l'avancement de réaction chez V5p (O) et SIM7 (•) ,

- la figure 12 représente les oligonucléotides utilisés pour isoler la cassette promoteur TEFl-gène ZEO- terminateur CYC1, à partir du vecteur pVT332,

- la figure 13 représente le plasmide recombi- nant pVTlOOU-ZEO-GPDl,

- la figure 14 illustre l'évolution de produc¬ tion des métabolites produits respectivement par les souches K^pVTlOOU-ZEO (souches contrôles, également dénommées ci-après K^pVTU) (S) et les souches transfor-

mées ./PVT100U-ZEO-GPD1 (également dénommées ci-après K x - GPD1) (O) .

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : CLONAGE DE GPDl.

Le clonage de GPDl a été réalisé par amplifi¬ cation PCR, à partir d'ADN total de la souche ScV5M, à l'aide des deux oligonucléotides 01 et 02 (figure 2), choisis à partir de la séquence de GPDl [LARSSON et al., (1993)] . Cette souche a été déposée le 18 Juin 1992 auprès de la Collection Nationale de Cultures de ' Micro¬ organismes, tenue par l' INSTITUT PASTEUR, sous le numéro 1-2222. Il s'agit d'une souche haploïde, ura-, MAT a, dérivée d'une souche oenologique

1) Extraction de l'ADN énomicrue de ScV5M La souche ScV5M a été cultivée dans le milieu YEPD, dont la composition est la suivante : extrait de levure 10 g/1, peptone 20 g/1, glucose 20 g/1. 10 ml de milieu YEPD sont ensemencés par ScV5M et incubés pendant une nuit à 28°C. 50 ml de même milieu sont ensemencés à une DO (660 nm) de 0,05, et incubés à 28°C, jusqu'à atteindre une DO (660 nm) de 4 à 6. Les cellules sont récupérées par centrifuga- tion pendant 10 minutes à 1000 g et l'ADN extrait selon la méthode décrite par VAN SOLIGEN et VAN DER PLAAT, J. Bacteriol., 130, p. 946-947, (1977) , avec quelques modi¬ fications : Le culot cellulaire est repris dans un tampon

SCE pH 7 (sorbitol 1,2 M, Na3 citrate 0,1M, EDTA 60 mM) , avec 5 μl/ml de β-mercaptoéthanol, et incubé 15 minutes à température ambiante.

- 5 mg/ml de zymolyase 20000 sont ajoutés à la suspension cellulaire, que l'on place à 37°C pendant 45

minutes, jusqu'à obtention d'un taux de protoplaste supé¬ rieur à 90%.

- Les protoplastes sont récupérés par centri- fugation 5 minutes à 350 g, puis repris dans 1 ml de tampon de lyse (Tris-HCl 0,2M pH 8, EDTA 0,1M, sarkosyl 1,5%) additionné de 100 μl de protéinase K (20 mg/ml) . La solution est incubée 1 h à 50°C.

- La suspension est centrifugée 30 minutes à 15000 g, et le lysat récupéré. L'ADN est précipité par 0,05 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2 volumes d'éthanol. Le précipité est récupéré à l'aide d'une baguette de verre et dissous dans 500 μl de tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). La concentration de l'ADN en solution est déterminée par mesure de la DO à 260 nm. 2) Amplification de GPDl par PCR

A partir de la séguence de GPDl [LARSSON et al., Mol. Microbiol., 10, p. 1101-1111, (1993)] deux oligonucléotides 01 et 02 ont été synthétisés. 01 est choisi en amont du codon d'initiation de la traduction. 02 est situé après le codon stop. Aux extrémités 5' de chaque oligonucléotide, ont été rajoutées des base supplémentaires, de façon à introduire un site de res¬ triction Xhol pour 01 et BamHl pour 02. La séquence des oligonucléotides est indiquée sur la figure 2. Les deux amorces ont été utilisées pour ampli¬ fier GPDl, à partir de l'ADN total isolé de ScV5M, dans les conditions suivantes :

Amorce 01 5 μl (20 pmoles)

Amorce 02 5 μl (20 pmoles) Tampon TaQ 10X (PROMEGA) 10 μl

TaQ (PROMEGA, 5 U/μl) 0,5 μl dNTP (2 mM) 10 μl (100 ng)

MgCl. (25 mM) 6 μl

H 2 0 qsp 100 μl

Conditions d'amplification : 30 secondes 94°C, 30 secondes 39°C, 1 minute 72°C pendant 30 cycles, sur amplification Perkin-Elmer Cetus modèle 9600.

Le produit d'amplification est analysé sur gel d'agarose 0,8%. Une seule bande de 1300 paires de bases environ est observée, en accord avec la taille théorique de 1260 pb.

3) Identification du fragment amplifié

Afin de vérifier que le fragment clone corres- pond à GPDl, le produit PCR a été sous-cloné dans le vec¬ teur PGEM-T (PROMEGA) , afin de déterminer partiellement sa séquence. Pour cela, le produit amplifié a été préci¬ pité en ajoutant au mélange d'amplification 0,25 volumes d'acétate d'ammonium ION et 2,5 volumes d'éthanol. Après 15 minutes à -20°C, la suspension est centrifugée 15 minutes à 15000g. Le surnageant est éliminé et le culot lavé dans les mêmes conditions par de 1 ' ethanol 70%.

Après séchage, l'ADN est repris dans 50 μl de tampon TE.

100 ng d'ADN amplifié sont ligués à 50 ng de vecteur pGEM-T dans un mélange reactionnel final de

10 μl, en présence de 2 μl de tampon 5X (GIBCO BRL) et de 1 unité de T4 ADN ligase (GIBCO BRL) , pendant une nuit à 14°C. La souche de E. coli DH5α (GIBCO BRL) de génotype :

F- ; endAl ; hsdR17 (K-, m_K-) ; supE44 ; Thi-1 ; λ- ; recAl ; gyrA96 ; relAl, a été utilisée. Les protocoles utilisés pour la préparation des bactéries compétentes et ceux pour la transformation sont décrits par HANAHAN, DNA cloning, vol. 1, DM Glover (ed) IRL Press, p. 109-135, (1985) . Le mélange de ligation a été utilisé pour trans- former les bactéries compétentes DH5α. Les colonies obte¬ nues ont été sélectionnées sur boîtes LB (bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/1) plus ampi- cilline (50 μg/ml) . L'ADN des clones obtenus est ensuite extrait et analysé par digestion enzymatique [SAMBROOK et al., Molecular Cloning : A laboratory manuel Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor HN.Y. , (1989)] . Un clone possédant 1 ' insert de 1260 pb a été sélectionné. Le plasmide obtenu, appelé pGEMT-GPDl est représenté sur la figure 3. L' insert a été séquence par la méthode enzyma¬ tique de terminaison de chaîne [SANGER et al,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, p. 5463-5467, (1977)] à l'aide du séquenceur automatique A370 piloté par le logiciel A373 (APPLIED BIOSYSTEMS) . Les amorces couplées aux ddNTP fluorescents qui ont été utilisées sont le T7 et M13 reverse. Les réactions de séquence ont été réalisées à l'aide du kit "PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing kit" (APPLIED BIOSYSTEMS) sur l'appareil thermocycleur Perkin-Elmer Cetus modèle 9600, conformé- ment aux indications du fournisseur.

- Les séquences obtenues ont été analysées à l'aide du logiciel DNA Strider 1,0 [MARCK, (1988)], et les recherches d'homologie ont été effectuées sur le pro¬ gramme FASTA avec la banque de données EMBL de Heidelberg et GENE BANK. La séquence d'au moins 300 bases de chaque brin du fragment clone a été ainsi réalisé. Une identité de 100% a été trouvée avec la séquence de GPDl publiée [LARSSON et al., Mol. Microbiol. 10, p. 1101-1111, (1993)], ce qui confirme que le fragment amplifié corres- pond bien au gène GPDl.

EXEMPLE 2 : SUREXPRESSION DE GPDl DANS LA LEVURE S. CEREVISIAE SCV5M.

Afin d'obtenir une expression forte et consti¬ tutive de GPDl dans la levure, la région codante de GPDl a été placée sous le contrôle d'éléments régulateurs (promoteur et terminateur) de levure, dans un vecteur navette levure/ E. coli .

1) Introduction de GPDl sur le plasmide multi- copie PVTIOO-U Le plasmide d'expression pVTlOO-U a été uti¬ lisé (figure 4) . Ce plasmide contient l'origine de repli-

cation de levure 2 μ, le marqueur de sélection URA3 et les éléments régulateurs forts ADH (promoteur et termina- teur de l'alcool déshydrogénase I) , ainsi que les élé¬ ments bactériens (origine de réplication et gène de résistance à 1 'ampicilline) . Ce plasmide a été décrit par [VERNET et al., Gène, 52, p. 225-233, (1987)] .

Le produit d'amplification obtenu comme décrit à l'exemple 1, 2) , a été digéré par Xhol et BamHI. 100 ng de ce fragment digéré ont été ligués à 50 ng de vecteur pVTlOO-U digéré par Xhol et BamHI et déphosphorylé. Après transformation de bactéries et sélection des clones recombinants comme décrit à l'exemple 1, 3) , plusieurs clones recombinants ont été obtenus . La carte du plasmide recombinant obtenu, appelé pVTlOO-U-GPDl, est représenté à la figure 4.

2) Transformation de la levure

La souches de levure Saccharomyces cerevisiae

ScV5M a été transformée par le vecteur pVTlOO-U-GPDl et par le vecteur pVTlOO-U (contrôle) . La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par ITO et al. (J.

Bacteriol., 1983, 153, 163-168)) .

Le milieu sélectif utilisé est du YNB (Yeast nitrogen base 7 g/1 DIFCO, glucose 20 g/1) . L'absence d'uracile permet de conserver une pression de sélection pour les plasmides. Plusieurs clones recombinants ont été obtenus . Le clone SIM7 a été étudié par la suite.

3) Conséquences de la surexpression de GPDl a) Obtention d'anticorps polyclonaux anti- GPDlo

Des anticorps polyclonaux anti-GPDlp ont été utilisés comme outil lors de cette étude. Ils ont été produits par injection à un lapin d'une préparation puri¬ fiée de la protéine GPDlp . La purification de cette pro- téine a été réalisée à partir de la souche oenologique S267 : levure I.C.V. (88. 117.0), comme décrit ci-après :

- Préparation de l'extrait brut

10 litres de milieu YEPD sont ensemencés avec S267, à partir d'une préculture de 12 heures sur le même milieu. La culture est recueillie en fin de phase expo- nentielle et les cellules sont récupérées par centrifuga- tion, 5 minutes à 4000g. Le culot est ensuite lavé avec du NaCl 0,9% et les cellules sont reprises dans un volume (v/w) de tampon A pH 7,0 (Tris-H 2 S0 4 10 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaN 3 0,02%, PMSF 1 mM, sulfate de protamine 0,7%) . On ajoute à 30 ml de suspension cellulaire,

15 g de billes de verre (diamètre 0,5 mm) et on effectue un broyage à l'aide d'un appareil de type B. BRAUN pen¬ dant 4 minutes à 4°C. Le surnageant est récupéré après centrifugation à 20000 g, 20 minutes et conservé à 4°C. - Précipitation fractionnée par le sulfate d'ammonium

L'extrait brut est soumis à une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium (40% de saturation) . Le surnageant obtenu est soumis à une précipitation à 60% de saturation. Le culot contenant la protéine active est resuspendu dans 50 ml de tampon A.

- Chromatoσraphie échanσeuse d'anions L'extrait brut est dialyse 48 h contre du tam¬ pon A, puis déposé à 4°C et à raison de 20 ml/h sur une colonne (1=10 cm, diamètre = 1,6 cm) de DEAE-Sépharose CL6B (PHARMACIA) , préalablement équilibrée avec du tampon B (Tampon A sans PMSF ni sulfate de potassium) . Après élimination des protéines non retenues par passage de trois volumes de tampon d'équilibrage, un gradient linéaire de ris-H2SÛ4 pH 7, 0 compris entre 0 et IM a été appliqué. L'enzyme est éluée pour une concentration en Tris-H Sθ4 de 300 mM.

- Chromatoσraphie d'exclusion moléculaire Après concentration, la fraction enzymatique obtenue a été déposée sur colonne (1=40 cm, diamètre = 1,6 cm) de Sephadex-GlOO (domaine de fractionnement 10000

à 120000 Da) . L'élution est effectuée avec du tampon B, à raison de 5 ml/h. Les fractions (5ml) sont récupérées et l'activité de l'enzyme mesurée. L'enzyme est éluée entre 35 et 50 ml de tampon. Les fractions comprises entre 36 et 48 ml de volume d'élution sont conservées.

- Chromatoσraphie d'affinité

La fraction enzymatique obtenue a été déposée sur une colonne contenant une résine de Blue Sépharose CL-6B sur laquelle est fixé un analogue du NAD+, le bleu Cibacron F3G-A. La colonne (1=5 cm, diamètre = 1,6 cm) est équilibrée à 4°C avec le tampon B et l'échantillon est déposé à raison de 6 ml/h. La colonne est ensuite lavée avec 10 volumes de colonne (tampon B) . L'élution de l'enzyme fixée a été obtenue par utilisation d'un gra- dient mixte linéaire de Tris-H2S04 (0 à 1,5 M) et de NADH (0 à 3 mM) . Des fractions de 1 ml sont récupérées et l'activité de l'enzyme mesurée. L'enzyme est décrochée à 1 M de ris-H2S04 et 2 mM de NADH.

- Electrophorèse en conditions dénaturantes L'extrait purifié a été soumis à une electro¬ phorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) , et la bande protéique (43 kDa) correspondant à GPDlp a été découpée et réduite en poudre. Les anticorps ont été pro¬ duits par la société APPLIGENE, par injection à un lapin. Le sérum est récolté au bout de deux mois. La spécificité des anticorps a été testée par Western Blot. Les membra¬ nes de nylon-nitrocellulose obtenues après transfert des protéines à partir du gel sont révélées comme décrit par SAMBROOK et al. [Molecular Cloning : A laboratory manuel Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., (1989)], à l'aide d' immunoglobulines de chèvre anti-lapin couplées à la phosphatase alcaline comme réactif secon¬ daire et le complexe 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phos- phate/nitro blue tetrazolium comme substrat chromogène.

b) Conditions de culture et de dosaσe :

Milieu

Y B [ Yeast Ni trogen Base wi thout amino-acid (DIFCO) 6,7 g/1, glucose 100 g/1, casamino-acid (DIFCO) 5 g/1, pH 3,4]. Le milieu utilisé ne contient pas d'ura¬ cile, ce qui assure une pression de sélection pour les plasmides.

Conditions de culture

10 ml de milieu sont ensemencés par les sou- ches de levure. La croissance est réalisée en Erlenmeyer à 28°C, sans agitation. Les cultures sont réalisées en anaérobiose, en fermenteurs de 250 ml remplis avec 200 ml de milieu, placés à 28°C. Les fermenteurs sont ensemencés à partir de la préculture, à raison de 10^ cellules/ml. La croissance est suivie par prélèvement d'une fraction aliquote de milieu de culture et estimation du nombre de cellules sur un appareil de type Coulter counter (ZBI) .

Les métabolites sont dosés dans le surnageant, après centrifugation à 2000 g pendant 3 minutes, des pré¬ lèvements sont réalisés.

Dosaσe des métabolites :

Glucose

Le glucose a été dosé par la méthode de dosage des sucres réducteurs (DNS) . Le dosage est réalisé en ajoutant, à un volume de la solution à doser, un volume de réactif (300 g de tartrate de sodium et de potassium, 16 g de NaOH et 10 g d'acide dinitro 3,5 salicylique) . Le mélange est placé à 100°C pendant 5 minutes. La réaction est arrêtée dans un bain à 4°C. 10 volumes d'eau sont ajoutés. La densité optique est déterminée à 540 nm et la concentration en glucose est déterminée par comparaison des valeurs déterminées pour une gamme étalon de 0 à 2 g de glucose ou par HPLC comme précisé ci-dessous.

Glucose. Glvcérol, ethanol, Acétaldéhyde : Le glycerol et l'acétaldéhyde ont été dosés par voie enzymatique à l'aide des kits de dosage correspondants, commercialisés par BOEHRINGER. Tous ces métabolites, excepté 1 'acétaldéhyde ont également été dosés en parallèle par HPLC selon les conditions suivantes : colonne Aminex HPX 87H Biorad, phase mobile acide sulfurique 8 mN, débit 0,6 ml/mn, à 45°C, détection réfractomètre. Mesure des activités enzymatique

Les cellules ont été récupérées à partir de culture, par centrifugation 3 minutes à 2000 g, et lavées avec un tampon H2PO4 50 mM, pH 6,5. 100 mg de levure

(poids humide) sont alors broyées par addition de 1 g de billes de verre (diamètre = 0,5 mm) et 0,5 ml de tampon imidazole 20 mM pH 7,0 contenant 1 mM DTT. Le tube est agité 1 minute au vortex et placé 1 minute dans la glace.

L'opération est répétée 5 fois. Après centrifugation 1 minute à 5000 g, le surnageant est récupéré et constitue l'extrait acellulaire. Les protéines sont dosées à l'aide d'un kit BCA Protein Assay Reagent (PIERCE) . L'activité glycérol-3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.8) est déterminée par la méthode décrite par GANCEDO (Eur. J.

Biochem., 1968, 5 , 165-172) . c) Résultats

- Des fermentations en milieu YNB, décrit ci- dessus, ont été réalisées avec les deux souches transfor¬ mées par pVTlOO-U et pVTlOO-U-GPDl (SIM7) .

La souche ScV5M transformée par pVTlOO-U (témoin) et SIM7 ont été testées pour leur capacité à produire du glycerol au cours de fermentations en condi¬ tions proches des conditions oenologiques.

La croissance et la production de glycerol dans le milieu de culture ont été suivies au cours de la fermentation (figures 5 et 6) . La quantité de glycerol produite est exprimée en fonction de l'avancement de

réaction (1-S/SO) ou S représente la concentration en glucose à l'instant, t et SO la concentration initiale. La souche SIM7 surexprimée pour le gène GPDl produit une quantité de glycerol largement supérieure à la souche témoin transformée par le plasmide seul pVTlOO-U. La pro¬ duction finale atteint 14 g/1 pour la souche SIM7 contre 4 g/1 pour la souche témoin (figure 6) .

Une augmentation très importante de l'activité GPDH est observée dans la souche SIM7 par rapport à la souche témoin (figure 7, dans laquelle les valeurs repré¬ sentent la moyenne de 3 déterminations, les barres verti¬ cales illustrent les écart-types) . L'activité GPDH aug¬ mente de façon très rapide, et ce, dès le début de la croissance, pour atteindre un maximum à l'entrée en phase stationnaire (figures 5 et 7) . Ce maximum est de l'ordre de 180 mU par milligramme de protéine, soit près de 2,5 fois l'activité observée dans la souche témoin (figure 7) . Cette activité diminue ensuite, les niveaux atteints étant alors comparables à ceux de la souche témoin. Dans la souche témoin, l'activité GPDH est relativement faible en début de fermentation et atteint un maximum d'environ 75 mU/mg de protéine à un avancement de réaction de 0,6. Les cellules sont alors en phase stationnaire de crois¬ sance (figure 5) . Afin de confirmer que l'augmentation d'acti¬ vité chez SIM7 est liée à une surproduction de la pro¬ téine codée par GPDl, la production de cette protéine a été suivie dans les deux souches par immunodétection à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine GPDl . Les résultats sont montrés pour la souche SIM7 (figure 8) .

Différents prélèvements ont été réalisés au cours de la fermentation. Les protéines d'un extrait brut préparé comme décrit ci-dessus ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE et transférées sur membrane de nylon-nitrocellulose. Les anticorps polyclonaux obtenus

sont alors fixés sur la membrane et révélés par des anti¬ corps anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline [SAMBROOK et al., 1989, précité] . La protéine GPDlp est détectée pour la souche surexprimant GPDl durant la phase exponentielle de croissance et reste produite à un niveau comparable jusqu'à la fin de la fermentation (figure 8) . Par contre, la protéine GPDlp n'est pas détectée dans la souche témoin excepté pour les points situés entre 0,4 et 0,6 d'avancement de réaction, qui correspondent au pic d'activité GPDH observé (résultats non montrés) .

Une corrélation étroite est observée entre la surproduction de glycerol (figure 6) et la surproduction de GPDlp (figure 8) . Par contre, la chute d'activité GPDH observée pendant la deuxième partie de la fermentation, alors que la protéine est toujours surproduite, est en contradiction avec 1 ' importance de la production de glycerol observée également pendant cette deuxième moitié de la fermentation. Cette chute d'activité in vi tro peut refléter une inactivation partielle de l'enzyme in vivo. Cependant, on peut exclure une légère instabilité de la protéine pendant cette phase tardive, puisque dans les conditions expérimentales utilisées, la réponse immuno- logique n'est pas quantifiable de façon précise.

La croissance de la souche SIM7 et de la souche témoin a été comparée (figure 9) . Malgré une différence au niveau de la biomasse finale atteinte, le taux de croissance est exactement le même pour les deux souches. Il est de 0,54 générations par heure. D'autre part, tout le glucose présent dans le milieu de culture (100 g/1 initialement) est dégradé par les deux souches (figure 10) .

La voie de production du glycerol est donc amplifiée de façon importante, ce qui doit résulter en une utilisation accrue de NADH. Afin de voir si la cellule, pour maintenir sa balance d'oxydoréduction, corrige ce déséquilibre par une diminution de la produc-

tion d'éthanol, elle même consommatrice de NADH, la pro¬ duction d'éthanol en fin de fermentation a été mesurée dans les deux souches et les résultats sont illustrés au Tableau I . Tableau I : Production d'éthanol chez SIM7 et

ScV5M-pVT100-U pendant la fermentation alcoolique sur milieu YNB avec 100 g/1 de glucose.

Souche Ethanol g/1 glycerol/glucose

ScV5M-pVT100-U 46,8 0,04

ScV5M-pTVl00-U-GPD1 37,5 0,13

Une diminution importante (de l'ordre de 10 g/1) de la quantité d'éthanol produite par la souche SIM7 est effectivement observée.

Cette diminution de production d'éthanol, résultant de la moindre disponibilité en NADH nécessaire à la transformation de 1 'acétaldhéhyde en ethanol par intervention de l'alcool deshydrogenase I, l'évolution de la production d'acetaldehyde a été suivie, au cours de la fermentation (figure 11) . En accord avec la diminution de production d'éthanol, une accumulation d'acetaldehyde est observée dans la souche surexprimée pour GPDl. La concen- tration finale d'acetaldehyde en fin de fermentation est de l'ordre de 150 mg/1 et reste donc très modérée.

La surexpression de GPDl se traduit donc sur un milieu riche en sucres, par une augmentation très importante de la production de glycerol, contrebalancée par une diminution de la production d'éthanol.

- Fermentation sur moût synthétique La production de glycerol est proportionnelle à la quantité initiale de glucose présent dans le milieu de culture. Ceci a été montré en testant la production de glycerol par les souches ScV5M-pVTl00-U et ScV5M-pVT100- U-GPD1, sur milieu synthétique MS en présence de 2 concentrations en glucose. Le moût synthétique est un milieu mimant la composition de moûts naturels dont la

composition a été décrite par BELY M. et al. ( Journal of Fermentation and Bioengineering, 1990, 70, 246-252) . La composition en azote de ce milieu a été modifiée de la façon suivante : 80 mg/1 de NH 4 C1 et 120 mg/1 d'azote α aminé ont été utilisés. Deux concentrations en glucose 100 g/1 et 200 g/1 ont été testées. Les fermentations ont été réalisées dans des fermenteurs de 1 1. Par ailleurs, les autres conditions de culture et le suivi de fermenta¬ tion ont été réalisés comme décrit ci-dessus. Les résul- tats de production de glycerol sont résumés dans le Tableau II :

TABLEAU II : Production de glycerol chez SIM7 et ScV5M-pVTl00-U pendant la fermentation alcoolique sur milieu MS avec 100 et 200 g/1 de glucose

Souche Glycerol g/1

MS glucose 100 g/1 MS glucose 200 g/1

ScV5M-pVTl00-U non déterminé 6,6

ScV5M-pVTl00-U-GPD1 19 27,9

Dans le cas de la fermentation dans un milieu contenant 200 g/1 de glucose, le rapport glycerol produit/glucose initial est significativement différent pour la souche ScV5M-pVT100-U-GPDl (0,14) par rapport au rapport obtenu avec la souche contrôle ScV5M-pVTl00-U (0,03) .

Une augmentation très importante de la produc¬ tion de glycerol est observée en présence de 200 g/1 de glucose par rapport à une fermentation réalisée sur 100 g/1 de glucose. Afin de déterminer les conséquences de cette importante production de glycerol sur la teneur en ethanol, la production d'éthanol en fin de fermentation a été mesurée sur ce milieu et les résultats sont illustrés au Tableau III.

Tableau III : Production d'éthanol chez SIM7 et ScV5M-pVT100-U pendant la fermentation alcoolique sur milieu MS avec 200 g/1 de glucose.

Souche Ethanol g/1

ScV5M-pVT100-U 86,7

Scv5M-pVT100-U-GPDl 74

La production très importante (27,9 g/1) de glycerol sur milieu MS 200 g/1 de glucose s'accompagne d'une diminution de la production d'éthanol d'environ 13 g/1.

EXEMPLE 3 : Surexpression de GPDl dans la levure oeno- logique S. cerevisiae Kl (Languedoc) en conditions oeno¬ logiques.

1) Introduction du marqueur de sélection posi¬ tif ZEO sur le plasmide multicopie pVTlOO-U-GPDl :

Les souches industrielles oenologiques étant prototrophes, un marqueur positif dominant a été intro¬ duit sur le vecteur pVTlOO-U-GPDl, afin de pouvoir sélec¬ tionner des transformants de la souche Kl.

La cassette « promoteur TEFl-gène ZEO-termina- teur CYC1 » a été isolée à partir du vecteur pUT 332 (WENZEL T.J. et al., Yeast, 1992, 8, 667-668), par PCR à l'aide des oligonucléotides décrits à la figure 12. Ces amorces permettent d'introduire des sites Hpal aux extré¬ mités du fragment amplifié. .

L'amplification a été réalisée de la manière suivante :

Oligonucléotide (1) 5 μl (20 pmoles)

Oligonucléotide (2) 5 μl (20 pmoles)

Tampon TaQ 10X 10 μl dNTP 2 mM 10 μl MgCl 2 25 mM 6 μl pUT332 (50 ng/μl) 1 μl

TaQ 0 , 5 μl

Eau 52 , 5 μl

30 cycles (30 sec 94°C, 30 sec 45°C, 1 min

72°C) Le fragment de 1175 pb amplifié a été analysé sur gel d'agarose 0,8 %, puis digéré par Hpal, et purifié sur gel d'agarose à bas point de fusion. La bande d'agarose contenant le fragment a été découpée et utili¬ sée directement dans le mélange de ligation. Trente ng de fragment ainsi obtenu ont été ligués à 50 ng de plasmide pVTlOO-U-GPDl digéré par Hpal et déphosphorylé, pendant une nuit à 20°C, en présence de 2 unités de T4 DNA ligase. Après transformation de bactéries et sélection des clones recombinants, plusieurs clones ayant la struc- ture attendue ont été obtenus. La carte du plasmide recombinant obtenu, appelé pVTlOOU-ZEO-GPDl, est repré¬ sentée à la figure 13.

2) Transformation de la levure :

La souche de levure oenologique S. cerevisiae Kl a été transformée par le vecteur pVTlOOU-ZEO-GPDl et par le vecteur pVTlOOU-ZEO (contrôle) , par la méthode de transformation à l'acétate de lithium décrite par ITO et al. (1983) . Le milieu sélectif utilisé est du YEPD (extrait de levure 10 g/1, bacto peptone 20 g/1, glucose 20 g/1) contenant 40 μg/ml de phléomycine.

3) Conséquences de la surexpression de GPDl en conditions de fermentation oenologique :

10 ml de moût synthétique (décrit à l'exemple 2) sont ensemencés par les souches de levure. La crois- sance est réalisée en tube pendant 24 h à 28°C. Les cul¬ tures sont réalisées en anaérobiose, en fermenteurs de 220 ml, remplis avec 200 ml de même milieu et placés à 28°C sous agitation à l'aide d'un barreau aimanté. Les fermenteurs sont ensemencés à partir de la préculture à raison de 10 6 cellules/ml. La croissance est suivie par

prélèvement de fractions aliquotes de milieu de culture et estimation du nombre de cellules sur un appareil de type Coulter counter (ZBI) . Les métabolites sont dosés dans le surnageant, après centrifigation à 2 000 g pen- dant 3 minutes.

* Dosaσe des métabolites :

Glucose, glycerol, ethanol, acétate, succi- nate, pyruvate, acétoïne et butane-diol : sont dosés par HPLC conformément au protocole décrit à l'exemple 2. L'acétaldéhyde est dosé par voie enzymatique (Boehringer) . La méthode d'extraction du butane-diol utilisée est celle précédemment décrite (HAGENAUER-HENER U. et al., Dtsch. Lebensm. Rundsch. , 1990, 86, 273-276) .

* Résultats : Des fermentations sur moût synthétique ont été réalisées avec les souches Kl/pVTlOOU-ZEO (K^pVTU) et Kl/pVTlOOU-ZEO-GPDl (K.-GPD1) . Les différents métabolites ont été dosés après consommation complète du sucre. Les résultats présentés sur la figure 14 montrent une produc- tion de glycerol de 14 g/1 pour la souche surexprimée pour GPDl au lieu de 6,9 g/1 pour la souche témoin. Cette surproduction de glycerol s'accompagne d'une diminution de la production d'éthanol d'environ 8 g/1 (80 g/1 contre 88,4 g/1) . Cette déviation du flux carboné vers le glycé- roi entraîne une augmentation d'un facteur 2 environ de la concentration finale en acétaldéhyde, pyruvate et acé¬ tate. Des variations plus importantes sont observées au niveau du succinate (1,8 g/1 contre 0,5 g/1) et du 2,3 butane-diol (1,1 g/1 contre 0,25 g/1) . Dans le cas de la fermentation dans un milieu contenant 200 g/1 de glucose, le rapport glycerol produit/glucose initial est significativement différent pour la souche K^GPDl (0,07) par rapport au rapport obtenu avec la souche contrôle K.-pVTlOO-U-ZEO (0,03) . Ces résultats s'expliquent par le déséquilibre de la balance redox engendré par la surexpression de

GPDl. Le NADH, préférentiellement réduit en NAD par la voie GPDH, devient limitant pour la conversion de l'acétaldéhyde en ethanol. Il en résulte une diminution de la quantité d'éthanol formé, ainsi qu'une accumulation d'acetaldehyde, d'acétate et de pyruvate. Les variations de ces métabolites en fin de fermentation restent toute¬ fois mineures. L'accumulation de succinate et de butane- diol pourraient être un moyen de détoxification de la cellule par rapport à l'acétaldéhyde. Les voies par lesquelles ces deux composés sont accumulés n'ont pas été étudiées. Cependant, dans l'hypothèse où le succinate est formé par la voie oxydative du cycle de Krebs, sa forma¬ tion pourraient permettre à la cellule de régénérer un peu de NADH. Au contraire, la formation de 2,3 butane- diol (produit de réduction de l'acétoïne), à partir de l'acétaldéhyde, non avantageuse au niveau redox, serait plutôt un moyen de détoxification. Au niveau des inci¬ dences prévisibles des modifications métaboliques obser¬ vées, il faut noter que les concentrations de tous ces métabolites restent dans une gamme compatible avec des concentrations pouvant être observées dans les boissons fermentées et notamment dans le vin y compris pour le succinate (0,5-2 g/1, RADLER F., Wine microbiology and biotechnology; Harwood Académie Publishers, 1992, Ed G. Fleet.Chur, Suisse) et le 2,3 butane-diol (0,3-1,3 g/1, RIBEREAU-GAYON et al., Traité d'oenologie, 1972) . De plus, des quantités élevées de succinate pourraient être avantageuses dans le vin, par le biais du caractère acide qu'il pourrait apporter. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sans

s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente in¬ vention.