L'invention vise des mutants de la gpl20 et leurs applications.

On sait que les interactions entre le CD4 de cellules cibles et la gpl20 de VIH impliquent des régions conservées de la gpl20, en particulier un tryptophane (W) en position 427 selon la numérotation des acides aminés de Kwong et al (réf 1 dans la liste bibliographique en fin de description).

Dans l'article de Misse et al (2), dont certains des co-auteurs sont co-inventeurs de la présente demande, il a été démontré qu'une structure stable, dite conservée de la gpl20, contenue dans la zone C1, à savoir l'hélice al amphipatique, est impliquée dans les interactions avec le récepteur CD4. De plus la construction d'une gpl20 sans l'hélice a-1 a permis de démontrer qu'une interaction est toujours possible avec la cellule cible, en particulier avec le récepteur CXCR4, récepteur aux chimiokines sur les lymphocytes.

En induisant des mutations ponctuelles spécifiques dans les structures conservées de la gpl20, et tout particulièrement de l'hélice a2, les inventeurs ont mis en évidence le rôle essentiel joué par ces structures dans les interactions avec les cellules cibles, que ce soit directement ou indirectement. En effet, la trans-conformation de ces structures du fait d'une mutation donnée a permis, comme illustré dans les exemples, de démasquer des régions normalement cachées qui sont impliquées dans ces interactions, et de disposer ainsi de molécules capables de servir de cibles vaccinales.

L'invention vise donc des mutants de la gpl20, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins une mutation dans une région riche en acides aminés aromatiques tout spécialement de l'hélice a2 de la gpl20, et le cas échéant de l'hélice al.

Des mutants selon l'invention comprennent au moins une mutation, cette mutation étant située dans la région de la gpl20 correspondant à la cavité d'interaction avec le CD4.

L'invention vise plus spécialement les mutants de la gp120 dans lesquels W en position 112 est remplacé par un acide aminé non aromatique tel qu'une serine S.

Une telle mutation induit une absence totale de fusion cellulaire. Les tests de fusion cellulaire, qui sont rapportés ci-après dans la partie exemple, montrent

ainsi que la substitution W112S abolit la formation de syncytia entre des cellules HeLa-Tat (exprimant une gpl60 contenant cette mutation) et des cellules HeLa P4. De plus, un virus contenant cette mme mutation est incapable d'infecter des lymphocytes humains. Une substitution de ce mme W (résidu aromatique bicycle) par un résidu aromatique (monocyclique) diminue ces fonctions mais ne les supprime pas.

De plus, chez de tels mutants, la reconnaissance par des anticorps spécifiques du site de liaison à CD4 défini par Cordonnier et al (3) est fortement diminuée.

Ces résultats montrent donc le rôle capital de la structure conservée de l'hélice al pour la fixation au CD4.

En plus de la mutation en position 112, de tels mutants peuvent également comporter une mutation de F en position 383 en alanine et, le cas échéant, du tryptophane en position 427 remplacé par une glycine et/ou du tryptophane en position 479 remplacé par un acide aminé non aromatique, tel que la serine ou l'isoleucine.

Les données cristallographiques publiées dans (1) ont permis de visualiser d'une part la position de l'hélice alpha 1 de la gpl20 dans cette structure tridimensionnelle et d'autre part des résidus tryptophane.

Ces données ont confirmé les résultats des expériences biologiques évoquées ci-dessus.

En particulier, le W 112 se trouve dans la poche hydrophobe décrite comme poche d'interaction de la gpl20 au CD4 ; cette poche est constituée d'un"cluster" de résidus aromatiques, qui interagirait avec un autre résidu aromatique la F43 du CD4. En outre, il ressort de cette étude que les résidus tryptophane ont une position stratégique dans cette poche. Ainsi toute mutation de l'un d'entre eux déstabiliserait cette"cavité"et empcherait toute liaison avec la F43 du CD4.

D'autres mutants selon l'invention, comprennent, le cas échéant en plus des susdites mutations dans la structure de l'hélice al, au moins une mutation, qui est située dans la région de la gpl20 correspondant à la structure de l'hélice a2, en aval de la boule V3 de la gpl20.

L'invention vise tout spécialement le mutant dans lequel W en position 338 est remplacé par une serine.

Cette mutation unique est capable d'induire une absence totale de fusion cellulaire lorsqu'on met en présence des cellules cibles CD4+, CXCR4+ et des cellules qui expriment la gpl20 mutée W338S.

Le virus complément par une enveloppe comportant la mutation W338S au niveau de la gpl20 n'est plus capable d'infecter les cellules (voir figure 1).

Comme noté plus haut, W faisant partie de la structure a2 conservée, cet acide aminé se trouve donc dans la deuxième poche contenant des résidus aromatiques et des résidus hydrophobes.

Cette mutation suggère alors que cette structure est impliquée dans l'interaction avec les co- récepteurs, par exemple CXCR4, compte tenu des résultats biologiques.

Les mutants selon l'invention, en permettant d'étudier le rôle des structures conservées constituent une nouvelle façon d'aborder les interactions agents infectieux-cellules cibles. Le fait de mieux appréhender la fonctionnalité des différentes structures conservées impliquées dans les interactions agents pathogènes- cellules cibles permet en effet la conception de molécules thérapeutiques ou immunisantes contre le VIH.

L'invention, mettant à profit la mise en évidence de ces poches d'interaction, vise des composés capables de mimer le CD4, et dotés ainsi de propriétés inhibitrices vis-à vis de la gpl20.

Elle vise également des peptides mimant les boucles extracellulaires des co-récepteurs, capables de se loger dans lesdites poches hydrophobes.

L'invention concerne également des peptides capables de mimer les régions constantes de la gpl20 évoquées ci-dessus, et susceptibles de constituer des candidats comme vaccins. L'invention fournit ainsi des modèles pour l'élaboration de tels candidats.

En outre, en effectuant des mutations sur la première cavité, il est possible d'induire des transformations de la gpl20 permettant une meilleure exposition de la deuxième cavité, et par là de la gpl20 en tant qu'antigène. De manière avantageuse, on obtient alors une réponse immune adaptée contre ces régions constantes habituellement cachées.

Par de telles transformations, il est également possible d'induire des dissociations entre la gpl20 et la gp41. Comme montré dans les exemples donnés ci-après, on n'observe aucune fusion lorsqu'on utilise des virus complmentés par une gpl60 comportant une mutation au niveau de la gpl20, alors que la glycoprotéine responsable de la fusion est la gp41. La mutation sur la gpl20 constitue donc une cible pour empcher la fusion du virus. On dispose ainsi d'épitopes clés pour éviter l'infection par HIV.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, dans lequels il et fait référence aux figures 1 à 8, qui représentent, respectivement,

-la figure 1, les résultats de tests d'infectivité de pseudovirus HIV-1 complémentés par une enveloppe comportant des mutations selon l'invention au niveau de la gpl20, -la figure 2, la structure cristalline de la gpl20, -la figure 3, les résultats de test d'activité biologique de rgpl20, avec un anticorps polyclonal de lapin anti-gpl20, -la figure 4, la réactivité de rgpl20 avec l'AcM CG10, -la figure 5, la réactivité de rgpl20 complexées au CD4 avec l'AcM CG10, -La figure 6, la réactivité de rgpl20 avec l'AcM 4.8d, -la figure 7, la réactivité de rgpl20 complexées au CD4 avec l'AcM 4.8d, et -la figure 8, la réactivité de rgpl20 avec l'AcM 17b.

Exemple : obtention et étude de mutants de la gpl20 Ces mutants de gpl20 ont été testés dans plusieurs systèmes biologiques :

(i) la fusion cellulaire (enveloppes mutées à la surface des cellules), (ii) les infections virales (pseudo-virus complémentés par des gpl20 mutées), (iii) l'analyse de la topologie de ces gpl20 mutées faite par différents anticorps monoclonaux reconnaissant différents épitopes de la gpl20 dans le"CD4 binding site", et (iv) l'analyse de la gpl20 à travers les données cristallographiques.

Ces expériences ont été réalisées en utilisant les matériels méthodes suivants : . Plasmides, anticorps et pseudovirus Le plasmide pHXB2ENV (code pour l'enveloppe gpl60 du VIH-IIIB), le plasmide pCMV-rev (code pour la protéine Rev sous le contrôle du promoteur CMV), et l'anticorps monoclonal 902 (dirigé contre la boucle V3 de la gpl20), ont été obtenus du NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (EU). Le pseudovirus pNL4-3env-GFP a été fourni par le Dana-Farber Cancer Institute, Boston, EU. Ce plasmide contient le génome du VIH-1 NL4-3 délété du gène Env, ainsi qu'une substitution du gène Nef par le gène codant pour la protéine GFP (Green Fluorescent Protein).

. Mutagenèse dirigée dans l'helice alpha 1 de la gpl20

Dans le but d'étudier les résidus W présents dans la structure hélice alpha 1 de la gpl20, la région NdeI-HincII du gène codant pour la gpl20 a été reconstitué. A cet effet on a utilisé un oligonuclotide dans lequel ont été introduits deux sites de restriction (HpaI et HindIII) entourant l'hélice a 1 (2). L'hélice a 1 de la gpl20 possède deux résidus tryptophane (W96 et W112) (4). Les sites HpaI et Hind III ont permis d'échanger pour chaque construction un fragment HPaI-Hind III sauvage par un fragment HpaI-Hind III muté. Les mutations ont été effectuées soit simultanément sur les deux W, soit sur un seul tryptophane. La mutagénèse dirigée a été effectuée par la méthode des oligonucléotides chevauchants compris entre le site Hpal et Hind III du plasmide pBS. Dans le tableau 1 ci-dessous ne figurent que les oligonucléotides qui comportent la mutation souhaitée.

Tableau 1 Mutants OligonucleQtides 96W/S'AAC GTG ACA GAA AAT TTT AAC ATG AGT AAA AAT G' 112W/S'GAT ATA ATC AGT TTA TCT GAT CAA AGCJ 96W/I'AAC GTG ACA GAA AAT AAC ATG ATC AAA AAT G 112W/I'GAT ATA ATC AGT TTA ATC GAT CAA AGCJ 96W AAC GTG ACA GAA AAT TTT AAC ATG TGG AAA AAT G' 112W'GAT ATA ATC AGT TTA TGG GAT CAA AGT

. Fusion cellule-cellule Les vecteurs d'expression contenant les différentes enveloppes gpl60 (pHXB2ENV, 500ng) ont été co-transfectés avec 500 ng de pCMV-rev dans des cellules HeLa-Tat. La méthode de transfection utilisée a été la lipofection (lipofectamine, GIBCO) comme décrit dans (2).

Le pCMV-rev est indispensable pour activer 1'expression du gène ENV présent dans le plasmide pHXB2 ENV. Les cellules transfectes ont ensuite été mises en coculture avec les cellules HeLaP4 (CD4-LTR LacZ) comme décrit sans (2).

. Expression à la surface cellulaire des gp120 mutées La technique de transfection utilisée a été la mme que celle employée dans le cas de la fusion cellule- cellule.

Vingt-quatre heures avant la co-transfection, les cellules HeLa-Tat ont été placées dans des puits de 3,5 cm de diamètre recouverts de lamelles de verre (12 mm de diamètre). Les cellules ont été incubées 48 heures après la co-transfection avec l'Acm 902 (dirigé contre la boucle V3 de la gpl20) à la concentration de 10 yg/ml.

Cette incubation a été réalisée en présence de 0,1 % d'azide de sodium (NaN3) et en tampon PBS. Après 2 lavages en PBS 0,3 % BSA/0,1 NaN3, les cellules ont

ensuite été incubées avec un anticorps anti-IgG de souris marqué au Texas-red (Molecular probes). Après 3 lavages extensifs, les cellules ont été fixées pendant 2 minutes avec un mélange thanol-actone (1 : 2). Après montage des lamelles sur des lames avec du Mowiol, les cellules ont été observées en microscopie confocale.

. Dosage de la p24 par ELFA (Enzyme linked fluorescent assay) Le dosage de la p24 est effectué avec le système automatisé VIDAS VIH DUO (BioMérieux). Ce test repose sur une détection simultanée de l'antigénémie p24 et des anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2. Le principe du test associe deux réactions immuno-enzymatiques à une détection en fluorescence. Ce test est muni d'un cône à usage unique qui sert à la fois de phase solide et de système de pipetage. Dans la partie basse du cône, sont fixés trois peptides de synthèse (gp41, gp36 et un peptide spécifique du type O) conjugués à des Acms de souris anti-IgG humaines marqués à la phosphatase alcaline. Dans la partie haute du cône, sont fixés des Acms anti-p24. Lors de la réalisation du test, un anticorps de lapin anti-p24 biotinylé (conjugué à la streptavidine-phosphatase alcaline) est ajouté en mme temps que l'échantillon. Le substrat, 4-méthyl- ombelliferyl-phosphate, permet de mesurer la fluorescence qui est proportionnelle à la quantité d'Ac anti-VIH et/ou

d'Ag p24 présents dans l'échantillon. La réaction est réalisée en 90 minutes et une lecture de la fluorescence est faite avec le lecteur spécifique du test VIDAS (longueur d'onde de 450 nm).

Infections des lymphocytes humains par des pseudo-virus mutes obtenus par complementation.

Des cellules 293 ont été co-transfectes avec 10 jug de pseudovirus pNL4-3 GFP, 2 yg du plasmide pHXB2 ENV (contenant ou non les différentes mutations dans la SU gpl20) et 1,5 yg du plasmide pCMV-rev. Pour cela, la méthode de transfection au phosphate de calcium a été utilisée. Quarante-huit heures après la transfection, les surnageants des cellules ont été prélevés, filtrés et conservés à-80°C jusqu'à l'utilisation. Une mesure de la p24 a ensuite été effectuée sur ces différents surnageants. Des lymphocytes humains stimulés prlablement pendant 3 jours par 10 yg/ml de PHA (Phytohémaglutinine), 50 U d'IL-2 dans un milieu de culture RPMI 1640-10 % SVF (Sérum de Veau Foetal), ont été incubés avec les différents surnageants de cellules 293 transfectees (contenant une concentration identique de p24).

Les capacités infectieuses des différents surnageants ont été visualisées par microscopie à fluorescence (expression de la protéine GFP dans les lymphocytes) et déterminées par un dosage de la p24

(suivi périodique tous les 3 jours) dans les surnageants de culture de lymphocytes infectés.

. Analyses Structurales La structure du complexe constituée par le coeur de la gpl20, les deux premiers domaines du CD4 et le fragment Fab de l'anticorps neutralisant 17b a été récemment déterminée par cristallographie aux rayons X (1). Cette structure a été déposée dans protéine data base (pdb) sous le code d'accès"Igcl". Les coordonnées structurales de ce complexe ont été analysées avec le logiciel Insight I (MSI pour Molecular Simulations) sur la station graphique Oxygène (Silicon grafic 02). La visualisation et la modélisation des domaines de la gpl20 et du CD4 ont été effectués à l'aide du programme Discover (MSI) sous l'environnnement Insigth II.

.Résultats . Capacités fusiogènes des enveloppes gpl60 Afin d'évaluer les capacités fusiogènes des différentes enveloppes gpl60 exprimées à la surface des cellules HeLa-Tat transfectées, ces cellules ont été mises en co-culture avec des cellules HeLa P4 (CD4 LTR LacZ).

Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 2 suivant

Mutations dans la gp120 Pourcentage de foyers de fusion Type sauvage 100 % (environ 1500 foyers de fusion/puit) 96W/S et 112W/S 0% 96W/I et 112W/I 0% 96W/F et 112W/F 60 % 96W/F 100 % 112W/F 60 % I 96WIS Non determine 112W/S 0 % 427W/S 0 %- 338W/S I 0% ntrole On constate à l'examen de ces résultats que des mutations simultanées sur les deux résidus tryptophane de l'hélice alpha 1 (W96 et W112) en serine ou en isoleucine rendent l'enveloppe gp 160 incapable d'induire des syncytia entre les cellules. Le mme phénomène est observé avec l'enveloppe gp 160 contenant la mutation ponctuelle 112 W/S et/ou 338 W/S. En revanche, la substitution d'un résidu tryptophane (W) par un résidu aromatique phénylalanine (F), d'indice hydrophobicit proche, réduit d'environ 50 % les capacités fusiogènes des enveloppes mutées. On peut constater que, quelle que

soit la construction, ce phénomène est observé uniquement lorsque le résidu W112 et/ou le résidu W338 est (sont) impliqué (s), ce qui dénote l'importance biologique de ce ou ces résidus, par rapport au groupement W96 (dans le cadre de ces expériences). Tous ces résultats ont été comparés avec ceux obtenus avec l'enveloppe gpl60 sauvage (dans laquelle onobserve environ 1500 foyers de fusion).

Le contrôle négatif était la mise en co-culture de cellules HeLa-Tat non transfectes avec des cellules HeLa P4 (aucun foyer de fusion n'a été observé).

Ces résultats indiquent que le résidu W112 et/ou le résidu W338 est (sont) impliqué (s) dans les interactions gpl20-cellules cibles, qui précèdent le phénomène de fusion cellulaire.

Expression à la surface cellulaire des protéines gpl20 La gpl20 a été détectée par l'Acm 902, dirigé contre la boucle V3 de la gpl20. Ce dernier a ensuite été révélé par un anti-IgG de souris couplé au Texas red. On constate qu'aussi bien la gpl20 sauvage que la gpl20 112W/S, sont exprimées à la surface des cellules.

L'incubation de l'anticorps 902 avec des cellules HeLa- Tat non transfectes ne donne aucun signal.

Capacités infectieuses des peudo-virus complémentés La figure 1 montre l'évolution du taux de p24 dans les surnageants de lymphocytes (préalablement activées par 10 yg/ml de PHA et 50 U/ml d'IL2) mis en contact avec : -le pseudovirus complément par la gpl20 de type sauvage (courbe--) -le pseudovirus complément par la gpl20 mutée (gpl20 112W/S) (-O-) -le pseudovirus complément par la gpl20 mutée (gpl20 338W/S). (--) Dans le premier cas, le taux de p24 diminue d'abord pour augmenter considérablement (à partir du lOème jour après l'infection), ce qui prouve la présence d'une p24 synthétisée de novo, produit d'une infection virale.

Dans le deuxième cas, le taux de p24 diminue progressivement pour disparaître complètement au 20ème jour (après la mise en contact). Il n'y a donc pas eu infection des cellules grâce à la mutation 112 W/S dans la gpl20. Ce fait a été confirmé par l'absence d'expression de la protéine GFP dans les cellules incubées avec le virus muté 112 W/S et/ou 338 W/S (visualisation en microscopie à fluorescence).

L'absence d'infection des cellules observée dans ce dernier cas, peut-tre expliqué par l'absence de formation de syncytia visualisée précédemment avec des cellules exprimant à leur surface la gpl20 112 W/S et/ou la gpl20 338 W/S.

Analyse tridimensionnelle et localisation structurale des mutations effectuées.

La structure cristallographique du complexe gpl20-CD4-17b Fab a récemment été déterminée (3) avec une résolution de 2,5 A (Figure 2).

Les coordonnées de cette structure ont été analysées à l'aide du logiciel Insight II, permettant de situer les acides aminés dans un contexte tridimensionnel beaucoup plus résolutif que les modèles prédictifs qui ont été à l'origine de notre démarche.

L'analyse de la structure cristallographique du complexe gpl20-CD4 met en évidence un nombre de résidus réduits formant l'interface entre les deux protéines.

L'interaction majoritaire entre la gpl20 et le CD4 est localisée au niveau d'une poche hydrophobe, impliquant l'acide aminé W427 de la gpl20 et le résidu F43 du CD4 (Wyatt et Coll., 1998).

De plus, comme le montre la Figure 3, le W112 est stratégiquement localisé dans cette cavité riche en résidus aromatiques et interagit directement avec la F43

du CD4. Le résidu F43 se logerait au milieu de cette poche et interagirait directement avec W112.

L'interaction du W112 avec la F43 et le W427 permettrait de stabiliser l'ensemble de la poche hydrophobe. On peut noter que le W112 et le W427 sont situés à une distance inférieure ou égale à 5 A l'un de l'autre, ce qui nous indique que ces deux résidus tryptophane sont susceptibles d'interagir fortement.

Cette interaction pourrait tre réalisée par effet d'empilement des noyaux aromatiques entre ces deux résidus ou par liaison dipôle-dipôle. De plus, ces distances peuvent s'avérer en réalité tre beaucoup plus réduites en tenant compte de l'aspect dynamique des interactions moléculaire in vivo.

L'analyse cristalline a permis en outre de découvrir que W 338 de l'hélice a2 est susceptible de jouer un rôle majeur dans la stabilité de la deuxième cavité (sur un total de 2 cavités incluses à l'intérieur de la gpl20), constituée des résidus hydrophobes et aromatiques. Dans ces conditions, cette cavité peut tre considérée comme capitale dans les interactions avec la gpl20 et les co-récepteurs, par exemple CXCR4.

. Expériences de mise en évidence de l'implication de la mutation W386S sur la gpl20 de VIH-1 du clone HXB2 de HIV-1 IIIB en termes de sa structure et de sa fonction

FONCTION : capacités fusiogènes de gpl20 exprimées à la surface de cellules transfectes et capacités infectieuses de virus ayant des enveloppes avec des gpl20 mutées ou non.

On n'observe . aucun foyer de fusion dans les tests de fusion entre les cellules HeLa-P4 (CD4+/CXCR4+) et les cellules HeLa A20 (Tat) transfectes avec l'enveloppe du clone pHXB2 de la souche VIH-1 IIIB (voir tableau 2). Le contrôle positif avec l'enveloppe sauvage donne 1800 à 2000 foyers. Le contôle négatif a été effectué avec une enveloppe du rétrovirus MoMuLV, qui ne donne pas de foyer de fusion dans ces conditions.

. pas d'infection de cellules lymphocytaires activées à la PHA (phytohémaglutinine) et avec l'interleukine 2 (IL- 2) avec des pseudotypes viraux obtenus après complémentation du génome de HXB2 ENV- (pNL4.3AENV) et l'enveloppe (pHXB2 ENV) avec la gpl20 W338S, et l'enveloppe à l'intérieur de cellules 293T transfectes avec les 2 vecteurs d'expresion. Le contrôle positif est constitué par pNL4.3 AENV et pHXB2 ENV (type sauvage). Le contrôle négatif est constitué par un surnageant des cellules transfectes seulement par les vecteurs d'expression pHXB2 ENV.

STRUCTURE : Etude ELISA : Fixation de la gp120 seulement sur le CD4 soluble On rapporte sur les figures 4 à 8 les résultats de la réactivité des rgpl20 sauvage gpl20A (xHX1 et gpl20a3 W338S avec l'AcM CG10 (figure 4), l'AcM 4.8d (figure 6) et l'AcM 17b (figure 8) : dans ces essais, les rgpl20 ont été déposés à la concentration de 1 yg/ml. L'AcM a été déposé aux concentrations indiquées en abscisse. Les figures 5 et 7 donnent les réactivités de ces rgpl20 complexées au CD4 avec l'AcM CG10 (figure 5) et l'AcM 4.8d (figure 7) : dans ces essais, les rgpl20 ont été déposées à la concentration de 1 yg/ml. La concentration de CD4 est de 20 yg/ml et l'AcM a été déposé aux concentrations indiquées en abscisse.

Cette mutation induit une trans-conformation qui permet une meilleure exposition aux anticorps monoclonaux 17b, 4.8d et G10 dirigés contre les épitopes CD4i (CD4 induit) (Fig. 4,5,6,7 et 8) qui sont des épitopes démasqués après la fixation de la gpl20 sur le CD4. Cette trans- conformation a pu tre détectée dans un système ELISA qui a été effectué comme suit : l. Le fond des puits est revtu avec du CD4 soluble (référence NIH) ou avec l'anticorps Aalto D7324 (qui est un anticorps de chèvre) dirigé contre un peptide linéaire de la Région C-terminale de la gpl20 (cet

anticorps n'induit pas la trans-conformation pour obtenir le démasquage des épitopes CD4i).

2. Après saturation avec la BSA 3 %, la gpl20 est incubée avec le CD4 ou avec l'anticorps D7324 à 37°C pendant lhr.

3. Suite à 2 lavages, l'un des AcM anti-CD4i (17b ou 4.8d ou CG10) est incubé avec la gpl20 préalablement accrochée (type sauvage ou mutante) pendant lhr à 37°C.

4. Les anticorps CD4i sont révélés avec un anticorps anti- IgG conjugué à la peroxydase (POD) 5. L'intensité de la réaction est lue dans le lecteur ELISA après arrt de la réaction.

Le bruit de fond représenté par les contrôles (cellules sans gpl20) es retiré des résultats de points expérimentaux.

Remarque : un contrôle a été fait avec des gpl20 détectées par un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la gpl20 (fig. 3).

Ces expériences faites en ELISA ont permis de vérifier qu'en effet, les AcM anti-CD4i 17b et 4.8d reconnaissent mieux la gpl20 sauvage et la gpl20 mutée lorsqu'elle est associée au CD4 soluble, permettant le démasquage de ces épitopes. Alors que l'AcM CG10 ne reconnaît pas du tout la gpl20 sauvage non-complexée au CD4, cet AcM reconnaît la gpl20 mutée sans qu'elle soit complexée au CD4.

Interprétation: La mutation W 338S sur la gpl20 induit le démasquage des épitopes CD4i, en particulier les pitopes reconnus par l'AcM CG10.

Ce résultat est important, car cette mutation fait de ce mutant un bon candidat vaccinal exposant des pitopes masqués chez les virus infectieux.

Etude FACS : Fixation simultanée des gp120 sur au moins 2 récepteurs présents à la surface des cellules de la lignée lymphocytaires CEM, le CD4 et le CXCR4.

Afin de vérifier que les gpl20 se fixent sur le CD4 et le CXCR4 respectivement l'expérience suivante a été réalisée : les cellules CEM sont d'abord incubées avec les gpl20, puis incubées avec des anticorps monoclonaux contre le récepteur CD4 (AcM OKT4a FITC de chez ORTHO Diagnostic) et contre le récepteur CXCR4 (AcM 12G5 de chez Pharmingen) et ensuite avec les anticorps appropriés anti-IgG de souris.

On rapporte dans le tableau 3 la moyenne de l'intensité de fluorescence de gpl20 fixée sur des cellules CEM CD4+/CXCR4+ et reconnues par des AcM anti-CD4.

TABLEAU 3 Anticorps INTENSITE MOYENNE DE FLUORESCENCE DE GP120 FIXEES AUX CELLULES CEM CD4+/CXCR4+ AcM anti-CD4i sans gpl20 gpl20 sauvage gpl20 W338S 4.8d 5,65 76,775 208,78 17b 5,21 70,48 175,575 CG10 5,14 7,15 8,49

Aucun marquage n'a pu tre observé, ce qui signifie que la gpl20 est effectivement fixée sur le CD4 et sur le CXCR4.

Les cellules CEM cultivées dans RPMI 10% SVF, ont été lavées avec un tampon de lavage PBS/0,3%/BSA/0,02% Na- azide (TL) et mis dans un tampon d'incubation PBS/3%/BSA/0,02% Na-azide (TI) afin de les mettre en contact avec les gpl20 sauvage et mutante pendant 1 heure à 37°C.

Les cellules ont été lavées 2 fois avec du TL, puis incubées dans du TI avec l'un des anticorps anti-CD4I (le 17b, le 4.8d ou le CG10) concentré à 10 yg/ml pendant 1 heure à 25°C. Les cellules ont été ensuite lavées 2 fois avec du TL, puis incubées pendant 45 minutes à 25°C dans

du TI avec un anticorps anti-IgG approprié conjugué au FITC ou à la PE. Après 3 lavages avec du TL, les cellules sont remises en suspension dans du TI et passées au cytofluorimètre de flux (FACSort). 10 000 cellules sont ainsi analysées une à une.

Les résultats sont reportés sur la figure 5. L'anticorps 17b et 4.8d reconnaissent bien la gpl20 mutée et très peu la gpl20 sauvage. En revanche, l'AcM CG10 n'a plus accès à son site de reconnaissance ni sur la gpl20 sauvage, ni sur la gpl20 mutée.

Interprétation Si l'AcM CG10 n'a plus accès à son site et qu'en revanche les AcM 17b et 4.8d ont accès à ce site, ceci signifie que l'épitope de la gpl20 impliqué fortement dans la fixation de la gpl20 au co-récepteur CXCR4 est surtout celui qui est reconnu par le CG10.

Conclusion La mutation W338S sur la gpl20 induit une trans- conformation qui empche la fusion et l'infection. En effet, cette mutation empche la fusion, lorsque l'enveloppe est exprimée à la surface de cellules transfectées et empche l'infection lorsque cette enveloppe est située sur le virus complémenté. De plus,

cette trans-conformation permet un démasquage de sites masqués sur la gpl20 sauvage du fait, essentiellement, que la gpl20 mutée est reconnue par l'AcM CG10 sans que cette gpl20 soit complexée au CD4. Le fait que ce mme AcM CG10 n'ait plus accès à son épitope lorsque cette protéine est associée au CD4 et au CXCR4, et que les anticorps anti-CD4i n'interfèrent pas avec le CD4, implique que c'est l'épitope reconnu par l'AcM CG10 sur la gpl20 qui est impliqué dans la fixation au CXCR4. Un tel mutant constitue un candidat pour effectuer des immunisations à des fins de protection contre l'infection VIH.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Kwong PD., Wyatt R., Robinson J., Sweet R W., Sodroski J. and Hendrickson W A. 1998. Structure of an VIH gpl20 enveloppe glycoprotein in complex with the CD4 receptor and neutralizing antibody. Nature. 393 : 648.

2. Misse D., Cerruti M., Schmidt I., Jansen A., Devauchelle G., Jansen F. and Véas F. 1998. Dissociation of the CD4 and CXCR4 binding properties of human immunodeficiency virus type 1 gpl20 by deletion of the first putative alpha-helical conserved structure. J.

Virol 72 : 7280.

3. Cordonnier A., Montagnier L., and Emmerman M. 1989. Single amino-acid changes in VIH envelope affect viral tropism and receptor binding. Nature 340 : 571.

4. Hansen J E., Lund O., Nielsen JO., Brunak S. and Hansen JES. 1996. Prediction of the secondary structure of HIV-1 gp 120. Proteins 25 : 1.