BIBIKOVA MARGARITA VASILEVNA (RU)
SU1395146A3 | 1988-05-07 | |||
DE3503568A1 | 1986-08-07 | |||
JPS63218681A | 1988-09-12 |
1. | ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм Strерtотусеs virgiпiае 325 А продуцент олигомицина SCII. ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26). |
Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, а именно к области фармакологии макролидных соединений и касается создания штамма, продуцирующего олигомицин SC-II.
Предшествующий уровень техники.
Известны близкие по структуре антибиотики олигомицинового ряда, которые включают природные олигомицины А, В, С. (Smith R.M., Реtеrsоп W.Н. and McCoy E.: «Oligomycin, а пеw апtifшigаl antibiotic.» //Апtibiоtiсs апd Сhетоthеrару, 1954, v.4, p.962). Комплекс олигомицинов А, В, С и отдельно его компоненты широко используются в исследовательских работах в качестве высокоспецифичных ингибиторов активности F 0 Fi - АТФазы. Установлена высокая противоопухолевая активность этих антибиотиков, однако высокая токсичность ограничивает их использование в клинике.
Известен олигомицин SC-II, продуцируемый грамотрицательной энтеробактерией Рапtоtеа аglотеrапs. (патент Японии No09-208587, кл. A61K 31/35, 1997г.), который проявляет противоопухолевую активность в отношении линий клеток P388.
Сущность изобретения.
Целью изобретения является создание штамма Strерtотусеs virgiпiае 325 А, продуцирующего олигомицин SC-II с более широкими биологическими свойствами. Штамм Strерtотусеs virgiпiае 325 А выделен из почвенного образца Тебердинского заповедника и депонирован в Коллекцию культур микроорганизмов ГТЩА под номером 325 А. Пол у ченный штамм характеризуется следующими культурально- морфологическими признаками:
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
± - рост скудный; + - рост удовлетворительный; ++ - рост хороший;
Ассимиляция углеводов штаммом 325 А
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
- - отсутствие роста.
± - рост очень слабый, видим только при микроскопировании,
+ - рост присутствует, но развитие воздушного мицелия слабое,
Биохимические характеристики штамма 325 А.
Штамм Меланоидная Гидролиз Разжижение Пептонизация Коагуляция продукция крахмала желатины молока молока ISP6 ISP7
162 - + ± + +
При исследовании методом световой микроскопии мицелия как нативного, так и в окрашенном по Романовскому-Гимзе препарате наблюдается разветвленный субстратный мицелий и воздушный мицелий, на котором формируются спороносцы в виде крючков RF (RA, RF). Спорангии, склероции, подвижные споры не наблюдаются. Гидролизат целых клеток содержит только LL-диаминопимелиновую кислоту.
Уточнение видовой принадлежности проведено по анализу 16S рибосомальной PHK. Штамм 325A имеет полное сходство с соответствующими последовательностями S. virgiпiае (штаммы - D85118, D85122), а также различие лишь в одной нуклеотидной позиции с S. lаvепdиlае (штаммы - D85111, D85115, D85116). При применении полиморфного определения видовой принадлежности, т.е. учитывая данные молекулярного анализа и морфологических характеристик штамма
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
(отличие характера роста и цвета мицелия йа органической среде Гаузе 2 и овсяной среде, а также форма цепочек спор), штамм может быть отнесён к Strерtотусеs virgiпiае 325 А.
Штамм Strерtотусеs virgiпiае 325 А при культивировании в жидкой питательной среде в колбах и на качалках или в ферментерах образует антигрибной антибиотик олигомицин SC-II в количестве 100 - 150 мкл/мл.
Методом 13 C и 1 H ЯМР были определены брутто формула и молекулярная масса заявленного антибиотика олигомицина SC-II: брутто формула - C 44 H 74 O 11
F w =779.0 усреднённая молекулярная масса - 778.
Структурная формула заявленного олигомицина SC-II приведена на рис.l
Рис.l
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
.
положение 10 7
олигомицин A -CH 3 =O олигомицин SC-II H ОН
Из приведённой формулы видно, что заявленный олигомицин SC-II антибиотик отличается от олигомицина А заместителями в положениях 7 и 10.
Как видно из формулы, полученный антибиотик является более гидрофильным, чем олигомицин A 5 и по этой причине в условиях хроматографии он имеет более низкое значение времени выхода с колонки.
Сравнительные данные антимикробной активности олигомицинов А и В и олигомицина SC-II, определённые методом диффузии в агар, приведены в таблице.
Антимикробная активность олигомицинов А и В и олигомицина SC-II
Тест-микроорганизм МИК препаратов (мкг)
Олигомицины Олигомицин SC-II А В
Аsреrgillиs пigеr 137A 0,5 1 0,5 Тriсhоdеrта аlbа F-32 0.5 0,5 -
Репiсilliит brеviсотрасtит 234 >100 >100 Сапdidа аlЫсапs ATCC 885-653 10 - - на среде с глюкозой
Сапdidа аlbiсапs ATCC 885-653 од 1 на среде без глюкозы
Васйlиs sиbtilиs ATCC 663 - - 50
Васillиs сеrеиs var.тiсrососсиs lиtеиs 537 - - 50
Васillиs сеrеиs vаr. тусоidеs HB - - 50
Васillиs ритilis ШТС 8341
Васillиs sиbtilиs Vаr. JI2 _ 50
Мусоbасtеriиm рhlеi 1 н/а од
Мусоbасtеriиm sр. 1 н/а од
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Заявленный олигомицин SC-II в отличие от олигомицинов А, В проявляет небольшую активность в отношении спорообразующих грамположительных бактерий и проявляет высокую активность в отношении микобактерий.
Заявленный олигомицин SC-II проявляет выраженные иммуносупрессивные свойства. В концентрациях 100-1 нг/мл он на 98-77% ингибирует пролиферацию лимфоцитов, стимулированных ФГА. При этом, не индуцируя апоптоз покоящихся лимфоцитов, значительно усиливает апоптоз лимфоцитов, стимулированных ФГА (с 4,4% до 15,3%). Заявленный олигомицин SC-II значительно усиливает ранний апоптоз мононуклеаров крови больных лимфобластным миелолейкозом (с 1,5% до 23,3%) и в меньшей степени поздний апоптоз этих клеток (с 13,8% до 17,2%).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения. Пример 1.
Культуру выращивают на среде Гаузе - 1, содержащей (г/л): крахмал - 20; K 2 HPO 4 - 0,5; MgSO 4 - 0,5; KNO 3 _ 1; NaCI - 0,5; FeSO 4 -0,01; агар - 20; вода водопроводная до lл, рН 7,2-7,4 при 28 0 C в течение 10-14 суток. Агаризованный блок с культурой Strерtотусеs virgiпiае 325 А засевают в посевную среду следующего состава (%): гороховая мука - 2,0; сахароза - 2,1, крахмал - 0,85, NaNO 3 -0,5, CaCO 3 - 0,5, NaCI - 0,5, рН - естественный. Культивирование проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл указанной среды, на круговых качалках со скоростью вращения 200-220 об/мин в течение 48 часов при 28 0 C. По истечении времени культивирования культуральной жидкостью из посевных колб в количестве 10% засевают ферментационную среду того же состава.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды. Культивирование осуществляют при 28° С в течение 6-7 суток. Содержание олигомицина SC-II в культуральной жидкости составляет 100 - 150 мкг/мл.
От одного литра культуральной жидкости, содержащей 100 мкг/мл олигомицина SC-II, отделяют мицелий центрифугированием или фильтрованием. Комплекс антибиотиков из влажного мицелия экстрагируют при перемешивании в течение часа сначала трехкратным объемом ацетона, затем, после отделения мицелия центрифугированием, еще двумя объемами ацетона. Экстракты объединяют и концентрируют на роторном испарителе до состояния масляного концентрата.
Первичную очистку антибиотика проводят с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (Кiеsеlgеl, Меrсk), загруженном в петролейном эфире в колонку размером (высота к диаметру) 30 см : 1 см. После пропускания экстракта колонну промывают петролейным эфиром. Жировые примеси вымываются с вытекающим раствором, а комплекс олигомицинов элюируют системой растворителей петролейный эфир - ацетон в градиенте (от 10:1 до 2:1). Анализ фракций на содержание олигомицина SC-II проводят методом TCX на пластинках силуфол (ЧССР Каvаliеr) в системе растворителей петролейный эфир - ацетон (2:1). Антибиотик обнаруживают на пластинках силуфол в парах йода с закреплением окраски пятен в 0,01% водном растворе перманганата калия. Фракции, содержащие олигомицин SC-II, объединяют, концентрируют в вакууме. Полученный концентрат подвергают дальнейшей очистке методом препаративной ВЭЖХ с использованием хроматографической колонки Аlltimа С 18, 250 х 4,6; 5 мкм; при температуре 40 0 C, в качестве элюента используют 85% метанол при скорости потока 0,8 мл/мин, детектирование осуществляют при 225 нм, объем пробы составляет 20 мкл
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
(c=0 5 24 мг/мл). Выход олигомицина SC-II составляет 30% от содержания в культуральной жидкости. Пример 2.
Получение спорового и вегетативного посевного материала проводят как в Примере 1. Ферментацию проводят на среде следующего состава, (%): овсяная мука - 2,5, глюкоза - 2,5, меласса - 1, азотнокислый аммоний - 0,5, мел - 0,5, вода водопроводная, рН 6,8-7,2. Содержание олигомицина SC-II в культуральной жидкости составляет 130 - 150 мкг/мл. Выделение олигомицина SC-II из мицелия из одного литра культуральной жидкости с активностью 150 мг/кг проводят в условиях, аналогичных Примеру 1.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Next Patent: FLUORESCENT NANOSCOPY METHOD