本明細書において、「選択的アンドロゲ� ��受容体調節剤」における「選択的」とは、� ��体内アンドロゲンが有する作用のうちのい� ��つかの好ましい作用を有し且ついくつかの� ��ましくない作用を有さないことを言う。し� ��して、本発明の選択的アンドロゲン受容体� ��節剤において、好ましい作用としては、例� ��ば、脂肪細胞における脱共役蛋白質-1のmRNA� ��発現レベル又は脱共役蛋白質-1の産生レベ� �を高める作用、筋肉の重量を増加させる作� �、骨密度を増加させる作用、インスリン感� �性状態を高める作用、血漿中トリグリセリ� �レベルを低下させる作用、肝臓及び/又は内� ��脂肪におけるカルニチンパルミトイルトラ� ��スフェラーゼ-1のmRNAの発現レベルを上昇さ� ��る作用、前立腺の重量を減少させる作用等� ��挙げられ、好ましい作用を複数有すること� ��できる。また、本発明の選択的アンドロゲ� ��受容体調節剤における好ましくない作用と� ��ては、例えば、前立腺癌細胞における前立� ��特異抗原のmRNAの発現レベル又は前立腺特異 抗原の産生レベルを高める作用、前立腺組織 における前立腺特異抗原のmRNAの発現レベル� �は前立腺特異抗原の産生レベルを高める作� �、前立腺の重量を増加させる作用、血漿中� �ナドトロピンレベルを増加させる作用、血� �中及び/又は血清中インスリンレベルを増加� ��せる作用、肝臓及び/又は内臓脂肪における ステロール制御要素結合タンパク質-1cのmRNA� �発現レベルを上昇させる作用、肝臓及び/又� ��内臓脂肪における脂肪酸合成酵素のmRNAの発 現レベルを上昇させる作用、体重を増加させ る作用、内臓脂肪を増加させる作用、血清中 グルコース濃度を上昇させる作用等が挙げら れる。ここで、本発明の選択的アンドロゲン 受容体調節剤において、好ましくない作用を いくつか有していてもかまわないが、少なく とも前立腺癌細胞における前立腺特異抗原の mRNAの発現レベル又は前立腺特異抗原の産生� �ベルを高める作用を有さないことが好まし� �。さらに、「選択的アンドロゲン受容体調� �剤」における「調節」とは、アゴニスト作� �、アンタゴニスト作用に加えて、何ら作用� �及ぼさない場合をも包含する。

 生活習慣病は、「食習慣、運動習慣、休� ��、喫煙、飲酒等の生活習慣が、その発症・� ��行に関与する疾患群」と定義され、その中� ��は、例えば、肥満、インスリン抵抗性(2型)� ��尿病、高脂血症(家族性を除く)、高血圧症� �高尿酸血症、循環器疾患(先天性を除く)、大 腸癌(家族性を除く)、肺扁平上皮癌、慢性気� ��支炎、肺気腫、アルコール性肝障害、骨粗� ��症、歯周病等の疾患が含まれる。これらの� ��患のうち、本発明の選択的アンドロゲン受� ��体調節剤は、肥満、インスリン抵抗性(2型)� ��尿病、高脂血症、高血圧症の予防又は治療� ��対して特に有効である。

 前記式(Ia)の化合物は、例えば、Journal of Ch emical Research,  7 , 417-419(2006)等に記載されており、当該文献� �記載されている製造方法等に従い、前記式(I )の化合物を容易に製造することが出来る。� �た、前記式(IIa)の化合物は、例えば、Journal  of Medicinal Chemistry,  28 , 233-239(1985)等に記載されており、当該文献� �記載されている製造方法等に従い、前記式(I I)の化合物を容易に製造することが出来る。� ��記式(IIIa)の化合物は新規な化合物であるが� ��例えば、以下の方法(a)に述べるような方法� ��すなわち、下記式(IIIb)の化合物における水� ��基をメチル化することにより容易に製造す� ��ことができる。反応条件等の詳細について� ��、後記実施例1を参照されたい。なお、下記 方法(a)における出発物質である式(IIIb)の化合 物は、例えば、国際公開WO 92/17489号公報の製 造例29等に記載されており、当該文献に記載� ��れている製造方法等に従い、前記式(III)の� �合物を容易に製造することが出来る。

方法(a):

 本発明のスクリーニング方法によって得� ��れる選択的アンドロゲン受容体調節作用を� ��する化合物、特に前記式(Ia)~(IIIa)の化合物� �有する、LNCaP細胞に対する作用及びNIH-3T3-L1� �胞に対する作用、並びに種々の組織に対す� �作用は、以下に述べる実験によって示すこ� �ができる。

(1)転写活性の測定:
1)プラスミドの構築
 プラスミドpCMV-hARを、本発明者らが先に報� �した方法(J. Biol. Chem.,  282 , 7329-7338)に基づき構築した。また、レポー� �ープラスミドであるPGL3-PSA(ヒト)及びPGL3-UCP-1 (マウス)も、本発明者らが先に報告した方法( Diabetes,  54 , 1000-1008)に基づき構築した。なお、pRL-SV40は 商業的に入手した。

2)細胞の培養
 NIH-3T3-L1マウス前駆脂肪細胞を、10%ウシ胎児 血清を加えたDulbeccoの改良型Eagle培地(Sera Labo ratories社製)で培養した。また、ヒト前立腺癌 細胞株LNCapを、10%ウシ胎児血清を加えたRPMI 1 640培地(Sigma社製)で培養した。なお、この二� �類の細胞株は、American Type Culture Collection(Ma nassas社)から得た。

3)トランスフェクション
 Effecteneトランスフェクションキット(Qiagen社 製)及びFugene HDキット(Roche Diagnostics社製)を� �いて、上記2)のNIH-3T3-L1細胞に対し、24ウェル プレート中でpCMV-hAR、pRL-SV40及びPGL3-UCP-1(マウ ス)を共トランスフェクションした。また、� �記2)のLNCaP細胞に対し、同様にpCMV-hAR、pRL-SV40 及び PGL3-PSA(ヒト)を共トランスフェクション した。

4)LNCaP細胞におけるPSAプロモーター-ルシフェ� ��ーゼ活性に対する作用の測定
 上記3)で共トランスフェクションしたLNCaP細 胞を、トランスフェクションの24時間後、さ� ��に、デキストランチャーコールで処理した1 0%ウシ胎児血清及び被験化合物(少量のDMSOに� �解したもの)を含むDMEM又はRPMI 1640中で24時間 培養した。その後、ホタルルシフェラーゼ及 びRenillaルシフェラーゼの活性を、Dual-Luciferas eレポーターアッセイシステム(Promega社製)を� �いて、Minilumat LB9507(Berthold Technologies社)の手 順書に従って24ウェルプレートにおいてアッ� ��イした。各被験化合物についてのPSAプロモ� ��ター-ルシフェラーゼ活性に対する値を下記 表1に示す。なお、ホタルルシフェラーゼ活� �の値はRenillaの内部標準に沿って標準化し、� ��対ルシフェラーゼ活性として示した。
 上記表1に示すように、PSAプロモーター活性 は、10 ^-7 M又は10 ^-8 Mのジヒドロテストステロンによってほぼ9倍� ��激されるが、式(Ia)~(IIIa)の化合物はPSAプロ� �ーター活性をほとんど上昇させなかった。

(2)細胞内mRNA発現レベルの測定:
1)トータルRNAの抽出
 上記(1)-3)で共トランスフェクションしたLNCa P細胞及びNIH-3T3-L1細胞をそれぞれ6ウェルプレ ートで培養した後、デキストランチャーコー ルで処理した10%ウシ胎児血清及び被験化合物 (少量のDMSOに溶解したもの)を含むEMEM又はRPMI� �1640中で24時間培養した。その後、ISOGEN(和光� ��薬製)を使ってそれぞれトータルRNAを抽出し た。

2)リアルタイムPCR
 上記1)で得たそれぞれのトータルRNAについ� �、各5μgを、SuperScript IIIキット(Invitrogen社製) を用いて第1鎖cDNAに逆転写し、最終容積を20μ Lとした。LNCaP細胞におけるPSA mRNA及びNIH-3T3-L 1細胞におけるUCP-1 mRNAの発現を定量化するた めに、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostic社製)を用いてリアルタイムPCR� �実施した。PCRは、20μLの反応混合液中で、次 の条件で実施した:95℃、3秒間の変性、60℃、 10秒間のアニーリング、そして72℃、25秒間の 延伸を50サイクル。同時に内部標準として、� �-アクチンのmRNAも増幅した。各標的転写物の ためのフォワード/リバースプライマーの配� �を、下記表2に示す。各転写物に関するリア� ��タイムPCRの値は、β-アクチンに対する相対� ��として計算した。

3)各mRNAの発現レベル
 LNCaP細胞におけるPSA mRNA及びNIH-3T3-L1細胞に� ��けるUCP-1 mRNAの発現レベルを、下記表3に示� ��。
 上記表3より、式(Ia)~(IIIa)の化合物は、PSA mR NAレベルに影響を与えることなく、エネルギ� ��消費に関係するUCP-1 mRNAレベルを上昇させ� �ことがわかる。

(3)GFP-ARの核内局在化の検討:
 本発明者らによるこれまでの研究から、リ� ��ンドが誘導する核内(subnuclear)のフォーサイ( ドット)形成は、核内レセプターの転写活性� �機能と密接に関連していることがわかって� �る(Diabetes,  54 , 1000-1008、J. Med. Chem., 49, 7596-7599、J. Biol.� �Chem.,  276 , 28395-28401、Mol. Endocrinol.,  16 , 694-706、Mol. Endocrinol.,  18 , 127-141)。ジヒドロテストステロンは250~400個 の微細で明瞭に分離している核内ARフォーサ� ��(ドット)形成を誘導し、このプロセスに伴� �てステロイドレセプターコアクチベータ-1(SR C-1)、TIF-2及びCBP(CREB-結合タンパク質)のよう� �コアクチベーターが動員される。ARはヒドロ キシフルタミドのような抗アンドロゲンと結 合するが、これらとはフォーサイ(ドット)を� ��成しないことから、核内における、アゴニ� ��トが結合したステロイドホルモン受容体の� ��瞭なフォーサイ(ドット)形成が、転写活性� �態の指標となる。式(Ia)の化合物について、G FP(green fluorescence protein:緑色蛍光タンパク質) -ARの核内局在化を検討した。

 NIH-3T3-L1細胞およびLNCaP細胞を35-mmのガラス� �に培養し(2×10 ⁵ 細胞/皿;旭テクノグラス社製)、Fugene HDキッ� �(Roche Diagnostics社製)を用いて、hAR-GFPプラス� �ドを2μg/皿の割合でトランスフェクションし た。24時間培養した後、細胞をジヒドロテス� ��ステロン又は式(Ia)の化合物で処理し、3時� �後にLSM 510 META顕微鏡(Carl Zeiss社製)を使っ� �観察した。

 LNCaP細胞内にGFP-ARをトランスフェクション� �ると、GFP-ARは細胞質内に拡散して分布して� �たが、ジヒドロテストステロン(10 ^-7 M)で処理すると、急速に核内に移行し、フォ� ��サイ(ドット)を形成した(図1)。一方、これ� �式(Ia)の化合物(10 ^-5 M)で処理すると、この場合もGFP-ARは核内に移� ��したが、明瞭なフォーサイ(ドット)を形成� �ることはなく、核内で拡散した分布パター� �を示した(図2)。

 さらに、同じ実験をGFP-ARをトランスフェク� ��ョンしたNIH-3T3-L1細胞についても行った。こ の場合、ジヒドロテストステロン(10 ^-7 M)も式(Ia)の化合物(10 ^-5 M)も共にGFP-ARを核へ移行させ、核内でフォー� ��イ(ドット)を形成させた(図3及び4)。

 この実験より、ジヒドロテストステロン� ��式(Ia)の化合物はともにARにリガンド結合し� ��LNCaP細胞では異なる働きをするが、NIH-3T3-L1� ��駆脂肪細胞では同様に働いており、PSAまた� ��UCP-1の発現に対するこれらARリガンドの作用 が同じでないことがわかる。

 なお、シングル蛍光タンパク質イメージ� ��グを行うために、空冷ファイバーカップル� ��アルゴンレーザーからの波長488nmのレーザ� �を使って、GFP蛍光を励起した。論理的な細� �内相互作用を観察するためには、トランス� �ェクションしたタンパク質の発現レベルを� �ッチングさせる必要があるところ、共トラ� �スフェクションを行うと、各AR-GFPプラスミ� �の量はモルベースで等しかった。目的タン� �ク質の発現レベルが適切である細胞を顕微� �下で選択した。LSM画像をTIFファイルとして� �クスポートし、Adobe Illustrator及びAdobe Photosh op(Adobe Systems社製)を用いて最終画像を作成し た。

(4)化合物の男性化作用の検討:
 ORXラットへの化合物投与における前立腺重� ��の変化を指標として、化合物の男性化作用� ��検討した。

1)ラットの処理
 11週齢の雄性SD(Sprague-Dawley)ラット(320~340g、Ch arles River Japan社より購入)を、12時間の明暗� �期が維持され、温度および湿度が管理され� �状態の室内で、市販の標準的な齧歯類用飼� �及び水を自由に摂取させて1週間飼育した。
 飼育後、エーテル麻酔をかけて、両側の睾� ��を摘出(orchiectomized:ORX)又はシャム処理した� �麻酔から覚めた後、動物をそれぞれ3-5匹の� �験群に割り付けた。手術翌日から被験化合� �注射液(被験化合物を少量のDMSOに溶解し、動 物実験用のオリーブオイルで希釈して(オリ� �ブオイル95%及びDMSO5%)被験化合物注射液とし� ��もの)を1日1回、0.1ml /100g体重の割合で皮下� ��射した。21日後、ラットを腹部動脈から全� �血して安楽死させ、腹側の前立腺および肛� �挙筋を切り出し、重量測定後、RNA抽出のた� �にRNAlater(ナカライテスク社製)に浸した。ま� ��、右大腿骨から柔組織を取り除き、75%エタ� ��ールに浸してから骨塩密度測定向けに保存� ��た。さらに、肝臓および内臓脂肪組織も集� ��、RNA抽出に備えてRNAlaterに浸した。

2)前立腺重量の変化
 上記で測定した前立腺重量を、下記表4に示 す。
 シャム処理群に比べると、精巣除去により� ��立腺の重量は劇的に減少したが、ジヒドロ� ��ストステロンの投与で用量に依存して増加� ��た。しかし、式(Ia)の化合物を投与したラッ トの前立腺重量は1~10mg/kg体重の用量では増加 せず、式(Ia)の化合物がジヒドロテストステ� �ンのような男性化作用を有していないこと� �示している。
 さらに、以下のように、化合物投与におけ� ��ORXラット前立腺中のPSA mRNA発現レベルも測� ��した。

3)組織mRNA測定のためのリアルタイムPCR
 ORXラットの各組織内のトータルRNAを、RNeasy� �Mini KitまたはRNeasy Fiberous Tissue Mini Kit(Qiage n社製)を用いて単離した。このうち、1μgのト ータルRNAをQuantiaTect Reverse Transcription Kit(Qiag en社製)を用いて逆転写にかけた。次にcDNAを� �LightCycler(Roche Diagnostics社製)を用いてリアル� ��イムPCR分析にかけ、各種転写物を定量化し� ��。なお、PCRは、SYBR Premix Ex Taq(タカラバイ オテクノロジー社製)を用い、次の条件で、20 μlの反応混合液中で行った:95℃、5秒間の変� �、60℃、20秒間のアニーリング、そして72℃25 秒間の延伸を50サイクル。また、内部標準と� ��て、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロ� ��ナーゼ(GAPDH)mRNAも同時に増幅し、各転写物� �リアルタイムPCRの値をGAPDHに対する相対比と して計算した。各標的転写物についてのフォ ワード/リバースプライマーの配列を、下記� �5に示す。

4)ORXラット前立腺中のPSA mRNA発現レベル
 前記(4)-1)で得たORXラット前立腺中のPSA mRNA� ��現レベルを、上記(4)-3)の方法により測定し� ��。その結果を、下記表6に示す。
 PSA mRNAレベルは、精巣除去によってシャム� ��理群に比べ劇的に減少したが、ジヒドロテ� ��トステロンの投与によってシャム処理ラッ� ��に比べて約1.8倍増加した。一方、式(Ia)の化 合物で処理した群では、PSA mRNAレベルに変化 は見られなかった。

 上記の結果及び前記(4)-2)の結果より、天� ��のARリガンドであるジヒドロテストステロ� �とは対照的に、式(Ia)の化合物は、前立腺重� ��およびPSA発現の刺激に関して男性化の作用� ��ほとんど有していないことがわかる。なお� ��各化合物処理群の間に体重に違いは見られ� ��かった。また、全てのラットで、体重は3週 間の試験期間中に徐々に増加した。

(5)化合物の同化作用の検討:
 前記(4)-1)で処理したORXラットにおける肛門� ��筋の重量並びに大腿骨及び椎骨の骨密度(bon e mineral density:BMD)の変化を指標として、化合 物の同化作用を検討した。

1)肛門挙筋重量の変化
 肛門挙筋は、ラットの直腸を囲んで局在し� ��いる典型的な骨格筋であり、男性ステロイ� ��ホルモンに感受性であると考えられている� ��肛門挙筋は、正常雄ラットに比べ精巣除去� ��ットで相当小型化するが、アンドロゲンを� ��与することによって正常重量まで回復させ� ��ことができることは、よく知られている(J.� �Pharmacol. Exp. Ther.,  91 , 38-44)。前記(4)-1)で得たORXラットの肛門挙筋 重量の測定結果を下記表7に示す。
 また、肛門挙筋におけるペルオキシゾーム� ��殖(peroxisome proliferator)活性化因子レセプタ� �-デルタ(PPARδ)mRNAの発現レベルの測定も行っ� ��。これは、この核レセプターが骨格筋での� ��肪酸のβ-酸化およびエネルギー消費に関係� ��ていることが示されているからである(Proc.� �Natl. Acad. Sci. USA,  100 , 15924-15929)。この結果も併せて下記表7に示� �。なお、測定は前記と同様の方法により行� �た。
 予想どおり、精巣除去により、シャム処理� ��に比べて肛門挙筋の重量は減少した。この� ��少は1及び10mg/kgのジヒドロテストステロン� �投与によって回復し、さらにシャム処理ラ� �トの場合の重量を超えて増加した。一方、� �(Ia)の化合物では、10mg/kgの用量において、シ ャム処理群で観察されたものと同程度まで肛 門挙筋の重量を有意に増加させた。この結果 は、式(Ia)の化合物が、ORXラットではジヒド� �テストステロンと同様に、筋肉に対して同� �活性を有していることを示している。
 また、精巣除去によって肛門挙筋中のPPARδm RNAの発現は増加したが、ジヒドロテストステ ロンはこの発現を用量に依存して抑制した。 しかし、興味深いことに、式(Ia)の化合物は� �10mg/kgの用量でこの発現を高めた。

2)大腿骨及び椎骨の骨密度
 前記(4)-1)で処理したORXラットの大腿骨及び� ��骨の骨端海綿骨のBMDを、Scan Xmate-A100S(コム� ��キャンテクノ社製)を用いて測定した。その 結果を下記表8に示す。
 局所での精巣テストステロンからエストロ� ��ンへの変換が骨量の維持に寄与することは� ��く知られている。しかし、ジヒドロテスト� ��テロン-アンドロゲン受容体系の骨に対する 直接作用もまた、ARKOマウスでは骨吸収が増� �して骨消失を示すものの雌はこれを示さな� �という事実からも、明らかにされている(Proc . Natl. Acad. Sci.,  100 , 9416-9421)。

 大腿骨BMDは、精巣除去により517.1mg/cm ³ (シャム)から465.3mg/cm ³ へと若干減少した。ジヒドロテストステロン は、精巣除去によって低下したこの値を、10m g/kgの用量で473.6mg/cm ³ にまで増加させたが、シャム群のレベルまで 回復させるには至らなかった。式(Ia)の化合� �もまた、BMDの値を用量に依存して上昇させ� �30mg/kgの用量で475.9mg/cm ³ まで増加させた。ただし、この数値は統計的 に有意ではなかった。

 椎骨BMDは、精巣除去によって770.8mg/cm ³ (シャム)から762.7mg/cm ³ まで僅かに減少した。ジヒドロテストステロ ンは椎骨BMDには影響を及ぼさなかったが、式 (Ia)の化合物はBMDを用量に依存して増加させ� �傾向を示し、30mg/kgの用量でBMDは775.1mg/cm ³ まで増加した。ただし、この値も統計的に有 意なものではなかった。

 上記の結果及び前記(5)-1)の結果より、式( Ia)の化合物は、ORXラットにおいて、ジヒドロ テストステロンと同様に、いくつかの同化活 性傾向を有することが示された。

(6)血漿中ゴナドトロピンレベルの 測定:
 前記(4)-1)で処理したORXラットの血漿中のLH� �びFSHの濃度を測定して、脳下垂体に対する� �合物の作用の特徴を調べた。測定結果を下� �表9に示す。

 精巣除去は、シャム処理群に比べ、LHお� �びFSHのレベルを大きく上昇させた。ジヒド� �テストステロンは、視床下部-脳下垂体-生殖 腺について十分に解明されているフィードバ ックメカニズムによって、脳下垂体からのゴ ナドトロピン分泌を抑制し、LHレベルを抑制� ��たが、これに対し、式(Ia)の化合物は抑制せ ず、むしろLHレベルを用量に依存して増加さ� ��た。

 更に、ジヒドロテストステロンの1又は10m g/kg投与により、FSHレベルは非処理のコント� �ールに観察されるレベルにまで抑制された� �、式(Ia)の化合物は、1又は10mg/kg用量では、FS Hに何の影響も及ぼさなかった。

(7)血漿中アジポネクチンレベルの 測定:
 血漿テストステロンのレベルは、ORXラット� ��は低く(≦0.1ng/ml)、シャム処理群では正常(1. 275ng/ml)であり、ラットの精巣除去が成功した こと及び今回の研究結果が信頼できることを 示している。

 脂肪細胞に由来する血漿タンパク質である� ��ジポネクチンは、血漿中に豊富に存在して� ��り、最近そのインスリン感受性作用および� ��アテローム発生作用から、大きな注目を集� ��ている(Natl. Med.,  8 , 731-737、J. Biol. Chem.,  278 , 2461-2468、Biochem. Biophys. Res. Commun.,  257 , 79-83)。テストステロンは、ヒトおよびラッ トにおいて、脂肪細胞からのアジポネクチン の分泌を阻害すること、及び精巣除去が、マ ウスでは血漿中アジポネクチン濃度を上昇さ せること、特に高分子量(HMW)型のアジポネク� ��ンの濃度を上昇させることが報告されてい� ��(J. Biol. Chem.,  280 (18), 18073-18080、J. Androl.,  26 , 85-92)。

 本発明者らは、前記(4)-1)で処理したORXラッ� ��についてトータル血漿中アジポネクチンレ� ��ルを測定した。また同時に、血漿中インス� ��ンレベルも測定した。これらの結果を下記� ��10に示す。

 精巣除去は血漿アジポネクチンのレベル� ��有意に上昇させたが、この上昇は1又は10mg/k g用量のジヒドロテストステロンの投与によ� �て、シャム処理ラットのレベルにまで抑制� �れた。これに対し、式(Ia)の化合物はアジポ� ��クチンレベルにこのような抑制作用を示さ� ��かった。

 一方、ジヒドロテストステロンも式(Ia)の 化合物もインスリンレベルを上昇させたが、 この作用は式(Ia)の化合物による処理群では� �度であった。この結果より、式(Ia)の化合物� ��ジヒドロテストステロンに比べて、よりイ� ��スリン高感受性状態にする作用を有するこ� ��が示唆される。

(8)血漿中トリグリセリド及びコレ ステロールレベルの測定:
 前記(4)-1)で処理したORXラットの代謝プロフ� ��ールを特徴付けるために、血漿中トリグリ� ��リド及びコレステロールレベルを測定した� ��その結果を下記表11に示す。

 血漿トリグリセリドレベルは、通常は、肝� ��でのVLDL-トリグリセリドを含むトリグリセ� �ドに富むリポタンパク質の合成と分泌のバ� �ンス、ならびにインスリン依存的な形でト� �グリセリドを加水分解する末梢リポタンパ� �質リパーゼ(LPL)活性による血管からのクリア ランスによって決定される。そのため、イン スリン耐性およびその続発症であるインスリ ン過剰症は、高トリグリセリド血症を伴うこ とが多いが、これは、この疾患状態が、肝臓 において主にSREBP-1cの活性化を介してVLDL-ト� �グリセリドの合成を促進すること(Prog. Lipid.  Res.,  40 , 439)、及び末梢LPL活性の低下によりトリグ� �セリドに富むリポタンパク質を血中に蓄積� �せるためである。

 今回の試験において、ジヒドロテストス� ��ロンはトリグリセリドレベルを上げ、コレ� ��テロールのレベルを下げた。一方、式(Ia)の 化合物は、驚くべきことにトリグリセリドレ ベルを大幅に下げたが、コレステロールにつ いては、ジヒドロテストステロンの作用とは 対照的に、何らの作用も有していなかった。 これは、インスリン感受性に対する式(Ia)の� �合物の全体的便益作用によって部分的に説� �することができる。

(9)肝臓及び内臓脂肪におけるSREBP- 1c、FAS及びCPT-1のmRNAレベルの測定:
 肝臓および脂肪細胞での脂質形成遺伝子の� ��現は、動物の脂質ホメオスタシス制御に必� ��な役割を果たしているステロール制御要素� ��合タンパク質-1c(SREBP-1c)を含む複数の転写因 子によって制御されることが知られている。 SREBP-1cは、コレステロール、脂肪酸、トリグ� ��セリド、およびリン脂質の生合成に関わる3 0を超える遺伝子の発現を直接活性化するこ� �が示されている(J. Clin. Invest.,  109 , 1125-1131)。カルニチンパルミトイルトラン� �フェラーゼ-1(CPT-1)は、ミトコンドリア内膜� �横切るカルニチン依存的輸送の重要な酵素� �あり、その欠損は、脂肪酸のβ-酸化の速度� �下をもたらす。また、脂肪酸合成酵素(FAS)は SREBP-1cが標的とする脂肪酸合成酵素である。

 被験化合物が有するトリグリセリド低下� ��用のメカニズムを調べるため、前記(4)-1)で� ��理したORXラットの肝臓及び内臓脂肪におけ� ��SREBP-1c、FAS及びCPT-1のmRNAレベルを測定した� �これに加えて、肝臓におけるインスリンレ� �プター基質-2(IRS-2)のmRNAレベルも測定した。� ��れらの結果を下記表12~15に示す。

 上記表12~14に見られるように、肝臓と内� �脂肪の両方について似た結果が得られた。SR EBP-1cのmRNAレベルは、両組織とも式(Ia)の化合� ��で処理した群の方が低かった。FASのmRNAレベ ルもまた、式(Ia)の化合物処理によって低下� �た(表12及び13)。これによって脂肪形成が抑� �されたが、その一方で、CPT-1のmRNAレベルは� �ジヒドロテストステロンと比べて式(Ia)の化� ��物の方が高く(表14)、脂肪分解をより活性化 した。このように、SREBP-1cおよびFASの発現減� ��およびCPT-1の発現増加が、式(Ia)の化合物処� ��による血漿トリグリセリドレベル低下の一� ��である可能性がある。

 インスリンレセプター基質は、活性化され� ��インスリンレセプターによってリン酸化さ� ��る一群のタンパク質であり、IRS-2は、9つあ� ��この群のメンバーの一つである(Nature,  377 , 173-177)。マウス視床下部およびβ-細胞にお� ��るIRS-2欠損が、2型糖尿病様症状を引き起こ� ��ことが最近示された(J. Clin. Invest.,  114 , 917-927)。IRS-2はまた、β-細胞の増殖/生存を� ��進することも知られている(Nature,  391 , 900-904)。

 上記表15に示すように、肝臓でのSREBP-1c下 流遺伝子の発現、すなわちIRS-2のmRNAレベルが 式(Ia)の化合物処理によって増加したが、ジ� �ドロテストステロン処理では減少した。式(I a)の化合物が誘導したSREBP-1c発現の抑制は、� �臓でのIRS-2 mRNAの増加と密接に関連している と考えられる。また、式(Ia)の化合物は、こ� �IRS-2のアップレギュレーションメカニズムを 通して、肝臓でのインスリン感受性作用も発 揮している可能性がある。

 式(Ia)の化合物による血清トリグリセリドレ ベルの低下は、骨格筋におけるPPARδのアップ レギュレーションの点からも説明できる。PPA Rδの活性化は、骨格筋の脂肪酸酸化に関連す る遺伝子のアップレギュレーションと、ミト コンドリアの脱共役をもたらす。選択的PPARδ アゴニストは、トリグリセリドレベルを下げ 、HDLコレステロールレベル及びインスリン感 受性を上げ、食事誘導肥満を防止することが 示されている(Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.,  293 , E1256-E1264)。

 ところで、前記表3において、ジヒドロテス トステロン及び式(Ia)の化合物はNIH-3T3-L1細胞� ��おけるUCP-1の転写レベルを上げることを示� �た。したがって、ラット内蔵脂肪におけるUC P-1 mRNAレベルも確認のために測定した。測定 結果を下記表16に示す。

 式(Ia)の化合物には、UCP-1 mRNAレベルを上� ��る傾向が僅かに見られたが、それは有意で� ��なかった。また、ジヒドロテストステロン� ��UCP-1のmRNAレベルにはほとんど影響しなかっ� ��。

(10)内臓脂肪の蓄積に対する化合� �の影響:
 9週齢のB6マウスを10匹ずつ、対照群、高脂� �食群及び高脂肪食+式(Ia)の化合物群に振り分 け、16週間にわたり飼育、観察した。この間� ��式(Ia)の化合物を1日おきに10mg/Kg皮下注射し� ��また、体重を週に1回測定し、さらに、食事 摂取量を4週間に1回測定した。

 16週後、マウスの体重、骨塩量、脂肪分布� �び運動量を測定した後、採血し、最後に屠� �して各臓器を採取した。16週後の各群におけ る体重、血清中グルコース濃度及び血清中イ ンスリン濃度の平均値を下記表17に示す。

 まず、体重については、高脂肪食群に対し� ��高脂肪食+式(Ia)の化合物群の体重が有意に� �なかった。この結果より、式(Ia)の化合物に� ��体重増加抑制効果があることが示唆される� ��なお、各群における食事摂取量の平均値の� ��移を下記表18に示す。食事摂取量は、各群� �おいて有意差はなかった。

 次に、血清中グルコース濃度及び血清中� ��ンスリン濃度についても、高脂肪食による� ��加を式(Ia)の化合物は有意に抑制している。 これらの値の上昇を抑制することは、糖尿病 などの生活習慣病の予防及び/又は治療に効� �的である。

 また、16週間飼育後のマウスに対する血糖� �荷試験も行った。マウスを5匹/群に分け、1g/ Kgを注入し、経時的に血糖値を測定した。そ� ��結果を下記表19に示す。

 ところで、上記の体重増加抑制効果は、1 6週後の各群のマウスの外観において典型的� �現れている。図5は16週後の各群のマウスを� �べて撮影したものであるが、高脂肪食+式(Ia) の化合物群のマウス(写真右)は、高脂肪食群( 中央)よりも通常食群(写真左)に近い外観を呈 している。

 しかし驚くべきは、図6に示すように、高 脂肪食群と高脂肪食+式(Ia)の化合物群との間� ��内臓脂肪の蓄積に顕著な差が見られたこと� ��ある。すなわち、高脂肪食群(中央)では内� �脂肪が著名に増加するが、高脂肪食+式(Ia)の 化合物群(写真右)における内臓脂肪は通常食� ��(写真左)とほぼ同じであった。これにより� �式(Ia)の化合物が持つ著名な内臓脂肪増加抑� ��効果が明らかとなった。

 上記のように、本発明のSARMは、前立腺を刺 激することも、また視床下部-脳下垂体-生殖� ��を抑制することもなく、筋肉の発達を促し� ��内臓脂肪の蓄積を抑制し、肝臓、脂肪組織� ��び筋肉におけるインスリン感受性を高める� ��用を有する。糖尿病及びアテローム性動脈� ��化の治療又は予防にとってインスリン感受� ��の向上やトリグリセリドの低下が必須の標� ��である(Circulation,  100 , 475-482)ことから、本発明のSARMは、有望な生 活習慣病の予防・治療薬として期待される。
 本発明のSARMは、無毒性の添加剤と共に、固 体形態(例えば、錠剤、硬カプセル剤、軟カ� �セル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、ト� �ーチ錠など)、半固体形態(例えば、坐剤、軟 膏など)又は液体形態(例えば、注射剤、乳剤� ��懸濁液、ローション、スプレーなど)のいず れかの製剤形態に調製して用いることができ る。上記製剤に使用しうる無毒性の添加物と しては、例えば、でん粉、ゼラチン、ブドウ 糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシ ウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、 メチルセルロース、カルボキシメチルセルロ ース又はその塩、アラビアゴム、ポリエチレ ングリコール、p-ヒドロキシ安息香酸アルキ� ��エステル、シロップ、エタノール、プロピ� ��ングリコール、ワセリン、カーボワックス� ��グリセリン、塩化ナトリウム、亜硫酸ナト� ��ウム、リン酸ナトリウム、クエン酸等が挙� ��られる。該製剤は、また、治療学的に有用� ��他の薬剤を含有することもできる。

 該製剤中における選択的アンドロゲン受� ��体調節作用を有する化合物の含有量は、そ� ��剤形、投与形態等に応じて異なるが、一般� ��、固体及び半固体形態の場合には0.1~50重量% の含有率で、そして液体形態の場合には0.05~1 0重量%の濃度で含有することができる。

 また、本発明における選択的アンドロゲ� ��受容体調節作用を有する化合物の投与量は� ��対象とするヒトをはじめとする温血動物の� ��類、対象とする疾患の種類、投与経路、症� ��の軽重、医師の診断等により広範に変える� ��とができるが、一般には、1日あたり0.01~5mg/ kg、好適には0.02~2mg/kgの範囲内とすることが� �きる。しかし、上記の如く患者の症状の軽� �、医師の診断等に応じて、上記範囲の下限� �りも少ない量又は上限よりも多い量を投与� �ることはもちろん可能である。上記投与量� �1日1回又は数回に分けて投与することができ る。