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Title:
AGENT FOR PROMOTING CELL PROLIFERATION USING ANTIMICROBIAL PEPTIDE AND METHOD FOR PROMOTING CELL PROLIFERATION USING SERUM-FREE MEDIUM CONTAINING THE SAME
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2008/099561
Kind Code:
A1
Abstract:
In order to perform large-scale proliferation of synoviocytes and amnion-derived cells which are superior to stem cells in terms of differentiation into chondrocytes or neurons, it is intended to provide a peptide which has much fewer side effects or inhibitory effects on the living body and has a useful activity. The invention relates to an agent for promoting proliferation of amnion-derived cells or synoviocytes, comprising a peptide consisting of the following amino acid sequence: (1) the following amino acid sequence: Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 1), or (2) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and which has substantially the same activity of promoting cell proliferation as a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

Inventors:
NIKAWA HIROKI (JP)
NISHIMURA MASAHIRO (JP)
TSUJI KOICHIRO (JP)
HIROMOTO NOBUE (JP)
Application Number:
PCT/JP2007/073912
Publication Date:
August 21, 2008
Filing Date:
December 12, 2007
Export Citation:
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Assignee:
JAPAN SCIENCE & TECH AGENCY (JP)
UNIV HIROSHIMA (JP)
TWO CELLS CO LTD (JP)
NIKAWA HIROKI (JP)
NISHIMURA MASAHIRO (JP)
TSUJI KOICHIRO (JP)
HIROMOTO NOBUE (JP)
International Classes:
C07K7/08; A61K38/00; C12N5/10
Foreign References:
JP2007037426A2007-02-15
JP2005154338A2005-06-16
JP2002179698A2002-06-26
JP2006000059A2006-01-05
JP2003231639A2003-08-19
JP2006511201A2006-04-06
JP2006034118A2006-02-09
Attorney, Agent or Firm:
ABE, Masahiro (14-1 Maebara-nishi 2-chom, Funabashi-shi Chiba 25, JP)
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Claims:
以下のアミノ酸配列から成るペプチドから成る羊膜由来細胞又は滑膜細胞増殖促進剤:
(1)以下のアミノ酸配列:
Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Tyr(配列番号1)、又は
(2)上記配列番号1のアミノ酸配列において、1~数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加し、配列番号1のアミノ酸配列から成るペプチドと実質的に同等の細胞増殖促進活性を有するアミノ酸配列。
羊膜由来細胞が羊膜間質細胞である、請求項1記載の細胞増殖促進剤。
滑膜細胞が線維芽細胞様滑膜細胞である、請求項1記載の細胞増殖促進剤。
線維芽細胞様滑膜細胞が骨変形性関節炎又はリウマチ性関節炎由来である、請求項3記載の細胞増殖促進剤。
羊膜由来細胞又は滑膜細胞がヒト由来である、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞増殖促進剤。
請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞増殖促進剤を有効量含有する無血清培地中で、羊膜由来細胞又は滑膜細胞を培養又は増殖する方法。
無血清培地が基本培地Iscove’s Modified Dulbecco’s Media (IMDM)である、請求項6記載の方法。
無血清培地が細胞接着因子及び/または細胞外基質を含有する、請求項6記載の方法。
無血清培地がインシュリン、トランスフェリン及びセレナイトを含有する、請求項6記載の方法。
無血清培地がplatelet-derived growth factor及び/又は成長因子を含有する、請求項6記載の方法。
無血清培地が合成ステロイド及び/又はホルモン類を含有する、請求項6記載の方法。
無血清培地がビタミン類を含有する、請求項6記載の方法。
無血清培地が白血病阻害因子を含有する、請求項6記載の方法。
無血清培地がメルカプトエタノール、ソディウムボロハイドライド、ポリフェノール及び/又はセレンを含有する、請求項6記載の方法。
Description:
抗菌性ペプチドを用いた細胞増 促進剤及び該細胞増殖促進剤を含有する無 清培地を用いる細胞増殖促進方法

本発明は、羊膜由来細胞および滑膜細胞に 対して顕著な増殖作用及び殺菌作用を併せ持 つペプチドから成る細胞増殖促進剤、及び該 細胞増殖促進剤を含有する無血清培地を用い る細胞増殖促進方法等に関する。

再生医療において、幹細胞といわれる多分 化能を有した細胞を患者より採取し、インビ トロにおいて、この幹細胞を増殖させること がおこなわれているが、幹細胞以外にもある 組織に分化させるにはより有利な細胞が存在 している。例えば、滑膜細胞は軟骨分化とい う点で幹細胞よりも優れている。また、間葉 系幹細胞から神経細胞に分化させることは容 易ではないが、羊膜由来細胞は神経細胞への 分化という点で非常に優れている。更に、こ のような幹細胞以外の細胞は生体から比較的 容易に採取できるという利点を有する。

発明者らは、既に、間葉系幹細胞に対する抗 菌性ペプチドの細胞増殖促進効果を見出して いる(特許文献1)。

特開2005-154338号公報

従来の方法を用いて細胞を大量に得るため に、採取後、インビトロで連続的に継代培養 する必要性があり、現段階では抗生物質及び /又は抗真菌剤に加えて自己血清もしくはウ 胎仔血清を組成として含む培地が不可欠で る。しかし、抗生物質および抗真菌剤はそ 細胞毒性故に副作用を生ずることが知られ いる。また、自己血清は、採取量に限界が り、また他人の血清やウシ胎仔血清を使用 る場合、BSEや未知のウイルスの感染など非 に危険性が高い。

 従って、本発明が解決しようとする課題 、軟骨細胞への分化や神経細胞への分化と う点で、幹細胞よりも優れている滑膜細胞 は羊膜由来細胞を大量に増殖させるために 生体に対しての副作用や阻害作用がきわめ 小さく、かつ、有用な活性を有するペプチ を提供すること、及び、該ペプチドの細胞 殖促進剤を含有する無血清培地を用いて、 れら細胞を増殖培養する方法を提供するこ にある。

本発明者は、上記課題を解決すべく、新規 抗菌ペプチドについて鋭意探索する中で、上 記特許文献1に記載のペプチドが、滑膜細胞 よび羊膜由来細胞に対して優れた増殖促進 用があることを見出し、本発明を完成した

即ち、本発明は以下の態様に係るものである 。
[1] 以下のアミノ酸配列から成るペプチドか 成る羊膜由来細胞又は滑膜細胞増殖促進剤:
(1)以下のアミノ酸配列:
Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Tyr(配 番号1)、又は
(2)上記配列番号1のアミノ酸配列において、1~ 数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加し、 配列番号1のアミノ酸配列から成るペプチド 実質的に同等の細胞増殖促進活性を有する ミノ酸配列。
 [2] 上記細胞増殖促進剤を有効量含有する 血清培地中で、羊膜由来細胞又は滑膜細胞 培養又は増殖する方法。

 本発明の細胞増殖促進剤を使用すること よって、無血清培地中で羊膜由来細胞又は 膜細胞の増殖を顕著に促進させることが可 となる。

本発明ペプチドである(peptide 8194)を含 する無血清培地での細胞増殖促進作用を示 グラフである。

 本発明において、「羊膜由来細胞」の代 例として、羊膜間質細胞及び羊膜上皮細胞 挙げることができる。又、「滑膜細胞」の 表例としては、骨変形性関節炎又はリウマ 性関節炎由来の線維芽細胞様滑膜細胞を挙 ることができる。これらの細胞の好適例と ては、哺乳類等の動物細胞、特にヒト由来 細胞である。

本発明のペプチドは、配列番号1に示され 14個のアミノ酸配列(以下、「peptide 8194」と 表す)、又は、該アミノ酸配列において、1~ 個のアミノ酸を欠失、置換、又は付加し、 列番号1のアミノ酸配列から成るペプチドと 実質的に同等の細胞増殖活性を有するアミノ 酸配列から成るペプチドである。ここで、「 細胞増殖活性」とは、本願明細書の実施例に 具体的に示されている活性を意味する。

本発明のペプチドに関して、配列番号1に されるアミノ酸配列において、欠失、置換 は付加されるアミノ酸は、好ましくは、同 アミノ酸(極性・非極性アミノ酸、疎水性・ 水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、 香族アミノ酸など)同士が置換されるか、又 は、アミノ酸の欠失若しくは付加によって、 ペプチドの三次元構造及び/又は局所的電荷 態に大きな変化が生じない、又は、実質的 それらが影響を受けないようなものが好ま い。

 本発明のペプチドは、当業者に周知の任 のぺプチド合成法で取得することができる 例えば、本発明のペプチドは、液相法及び 相法のいずれの方法も使用することができ 。ここで、一般に、液相法は反応を溶液状 で行い反応混合物から生成物を単離精製し この生成物を中間体として次のペプチド伸 反応に用いる方法である。又、固相法は、 応溶媒に不溶の固相担体にアミノ酸を結合 せ、このアミノ酸に準じ縮合反応を行いペ チド鎖を伸長させていく方法である。

 ペプチドの化学合成は、カルボキシル基 保護したアミノ酸にアミノ基を保護したア ノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成 せ、次にアミノ保護基を除去後、遊離した ミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸を順次 C末端からN末端に向かって一つずつ延長し いく方法が基本である。脱水縮合反応では カルボキシル基を活性化して、結合させよ とするアミノ基と反応させる。この活性化 は、ジシクロへキシカルボジイミド(DCC)法、 活性エステル法、酸無水物法、アジド法等が あるがその反応性の高さとラセミ化その他の 副反応を考慮して選ばれる。縮合反応時の副 反応を防止するためにアミノ酸のアミノ基、 カルボキシル基、側鎖(R)の官能基には保護基 が導入される。これらの保護基は、縮合反応 の条件で安定であり、必要なときには速やか に除去されるものが好ましい。また、アミノ 基の保護基とカルボキシル基の保護基とは互 いに選択的に除去されることが好ましい。

 アミノ基の保護基としては、例えばベン ルオキシカルボニル(Bz)、t-ブチルオキシカ ボニル(Boc)、p-ビフェニルイソプロピロオキ シカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシ ルボニル(Fmoc)等が挙げられる。カルボキシ の保護基としては、たとえばアルキルエス ル、ベンジルエステル等を形成し得る基が げられる。但し、固相法の場合は、C末端の カルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロ ルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、P-アルコ シベンジルアルコール樹脂等の担体に結合 ている。縮合反応は、カルボジイミド等の 合剤の存在下、あるいはN-保護アミノ酸活 エステル又はペプチド活性エステルを用い 実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、 固相の場合はさらにペプチドのC末端と樹脂 の結合を切断する。さらに、本発明のペプ ドは通常の方法に従い精製される。たとえ 、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液 クロマトグラフィー、アフィニティークロ トグラフィー等が挙げられる。こうして合 したペプチドは、エドマン分解法でC-末端か らアミノ酸配列を読み取るプロティンシーク エンサー、GC-MS等でそのアミノ酸配列を分析 確認することができる。

本発明のペプチドは、遺伝子工学的手法を 用いて調製することもできる。遺伝子工学的 手法としては、例えば、本発明の新規ペプチ ドをコードするDNA配列を合成し、該DNA配列か らなる遺伝子が挿入された発現ベクターによ り形質転換又は形質導入された宿主細胞を用 いて遺伝子を発現し、新規ペプチドを生産す る。該遺伝子工学的手法に用いられる宿主細 胞としては、宿主細胞としては、真核細胞及 び原核細胞のいずれをも用いることができる 。真核細胞としては動物、植物、昆虫、酵母 等の細胞が、また原核細胞としては大腸菌、 枯草菌、放線菌等適宜の宿主細胞を用いるこ とができる。また、該遺伝子工学的手法に用 いられるベクターとしては、公知の宿主細胞 に適合した適宜のベクターを用いることがで きる。

 更に、本発明は、上記細胞増殖促進剤を 効量含有する無血清培地中で、羊膜由来細 又は滑膜細胞を培養又は増殖する方法に係 。

 上記無血清培地を調製する際の基本培地 しては、IMDM、DMEM及びMEM等の当業者に公知 任意の培地を使用することが出来る。更に 該無血清培地には、例えば、タイプIまたはI Vコラーゲン及びフィブロネクチン等の当業 に公知の任意の細胞接着因子及び/または細 外基質;インシュリン(Insulin)、トランスフェ リン(Transferrine)及びセレナイト(Selenite)(これ 三種類をまとめて「ITS」と略す);FGF及びEGF等 の当業者に公知の任意の成長因子;デキサメ ゾン(dexamethasone)等の合成ステロイド及び/又 ホルモン類;アスコルビン酸及びNEAA(Non Essen tial Amino Acid)等の当業者に公知の任意のビタ ミン類及びアミノ酸;白血病阻害因子;並びに ルカプトエタノール、ソディウムボロハイ ライド、ポリフェノール及び/又はセレン等 から選択された各種物質を適当量添加するこ とによって、細胞増殖促進効果をより一層高 めることが出来る。又、培養プレート等の培 養装置としては、表面をコラーゲン又はフィ ブロネクチン等の当業者に公知の任意の細胞 接着因子でコーティングしたものを使用する ことが好ましい。

 尚、かかる無血清培地に含有される上記 プチドから成る細胞増殖促進剤の有効量は 基本培地、培養の対象となる細胞の種類、 記各種の添加物の種類・添加量等に応じて 当業者が適宜選択することが出来るが、通 、1nM~100μM、好ましくは、0.1~10μMである。

 以下、実施例に則して本発明を更に詳し 説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれ の記載によって何等制限されるものではな 。尚、本明細書中で引用される技術文献の 容は、本明細書の開示内容の一部と見なさ る。

[無血清培地による様々な細胞の増殖能の検 ]
使用細胞:
(1)ヒト歯肉線維芽細胞(GFB):広島大学病院にて 患者の智歯抜歯時に余剰となった歯肉より患 者の同意を得て採取(歯学部倫理委員会承認 み)

(2)ヒト皮膚線維芽細胞(DFB):健全皮膚線維芽 細胞(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersv ille, MDより購入)

(3)ヒト腸骨由来骨髄間葉系幹細胞(MSC):ヒト 腸骨由来骨髄間葉系幹細胞(Cambrex Bio Science  Walkersville, Inc., Walkersville, MDより購入)(Product  Code: PT-2501. Lot Number:4F0218)はCD29、44、105、1 66 がポジティブで、CD14、34、45がネガティブ であること、および骨、軟骨、脂肪への分化 能をもつことが確認されている:以下MSCと略 る。 

(4)ヒト成人皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC):倉 紡績株式会社より購入。至適培地としてCamb rex Bio Scienceより購入した血管内皮細胞用増 培地(EBM-2にEGM-2を添加したもの:ウシ胎児血 を2%含有)を用いた。

(5)ヒト臍帯静脈由来内皮細胞(HUVEC):Cambrex B io Scienceより購入。至適培地としてCambrex Bio Scienceより購入した血管内皮細胞用増殖培地( EBM-2にEGM-2を添加したもの:ウシ胎児血清を2% 有)を用いた。

(6)ヒト線維芽細胞様滑膜細胞(骨変形性関 炎由来)(SCOA):Cell Applications, INC., 5820 Oberlin Drive, Suite 101, San Diego, CAより購入。至適 地として同社が提供しているヒト滑膜細胞 殖促進培地を用いた。

(7)ヒト線維芽細胞様滑膜細胞(リウマチ性 節炎由来)(SCRA):Cell Applications, INC.より購入 至適培地として同社が提供しているヒト滑 細胞増殖促進培地を用いた。

(8)ヒト羊膜由来間質細胞 (AmMSC01およびAmMSC 02):広島大学病院にて予定帝王切開患者の出 後に不要となった羊膜を患者の同意を得て 取し、酵素処理により羊膜上皮及び間質を 離し、間質部分をさらに酵素処理して間質 胞を単離した(広島大学病院倫理委員会承認 み)。01と02は異なる2名の患者から採取した 胞である。

(9)ヒト羊膜由来上皮細胞 (AmEC01):上記と同 に患者の羊膜から上皮及び間質を分離し、 皮部分をさらに酵素処理して上皮由来細胞 単離した(広島大学病院倫理委員会承認済み )。至適培地としてCambrex Bio Scienceより購入 た表皮角化細胞用増殖培地(KBM-2にKGM-2を添加 したもの:無血清培地)を用いた。

培養皿:
BIOCOAT(登録商標) (Mouse collagen Type IV) Multiwel l TM  plates (BD Biosciences、 Bedford, MA )、及び、Ti ssue culture plates (BD Biosciences, Bedford,  MA ) (以下TC-plate)を用いた。

使用培養液と培養法:
培地A :Dulbecco’s Modified Eagle Media(Sigma Co. St. Louis , Mo)(以下DMEM)(最終濃度100 unit/mLのペニシリ G、最終濃度100μg/mLの硫酸ストレプトマイシ 、最終濃度0. 0085%のアンホテリシンB(以下 生物質液:GIBCO社)および10%牛胎児血清(FBS)を む)。

無血清培地 :Iscove’s Modified Dulbecco’s Media (以下IMDM, Pr oduct Code:I3390) (Sigma Co. St. Louis, Mo)に、以 の表1に示す添加物を最終濃度となるように 加したものを実験に用いた。

培養法:
細胞(1)~(3)及び(8)については培地Aで培養し、 の後培地A中のDMEMをIMDMに変更して血清濃度 約半日ごとに5%、 2%、 0.5%へ減少させた培 で培養した。その後培地Aあるいは無血清培 地へそれぞれ培地を交換し、0.2% Trypsin/EDTA処 理により細胞を剥離、計測して1.5 x10 4  個/wellとなるよう細胞を培養皿から剥離し め、培地Aで培養する細胞はTC-plateで、無血 培地で培養する細胞はBIOCOAT(登録商標)(collage n Type IV)上で培養した。なお、無血清培地に て培養した細胞は、Trypsin Inhibitor をTrypsin/ED TAの5倍量加えて同様に280xgで遠心することでT rypsin/EDTAの処理を終了させ、無血清IMDMで再度 洗浄して細胞懸濁液を洗浄した。その後2あ いは3日ごとにそれぞれの培地を交換し、7日 後に培養皿上の細胞を0.2% Trypsin/EDTAで処理し て剥離し集めParticle Counter (Z1 Coulter, Beckman Coulter, Inc., Fullerton,CA)にて一定溶液中の細 数を計測し、全細胞数を算出した。

細胞(4)~(7)及び(9)についてはそれぞれ上記の 適培地で培養し、その後専用培地と無血清 地の比率を約半日ごとに1:1、 2:8、 5:95、 0 :100 へと減少させた培地で培養した。その後 、専用培地あるいは無血清培地へ培地を交換 し、0.2% Trypsin/EDTA処理により細胞を剥離、計 測して1。5 x10 4  個/wellとなるよう細胞を培養皿から剥離し め、専用培地で培養する細胞はTC-plateで、無 血清培地で培養する細胞はBIOCOAT(登録商標) ( collagen Type IV)上で培養した。なお、無血清 地にて培養した細胞は、Trypsin Inhibitor をTry psin/EDTAの5倍量加えて同様に280xgで遠心するこ とでTrypsin/EDTAの処理を終了させ、無血清IMDM 再度洗浄して細胞懸濁液を洗浄した。その 2あるいは3日ごとにそれぞれの培地を交換し 、7日後に培養皿上の細胞を0.2% Trypsin/EDTAで 理して剥離し集めParticle Counter (Z1 Coulter, B eckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)にて一定溶液 の細胞数を計測し、全細胞数を算出した。

結果:
本実験では9種類の細胞についてそれぞれの 適培地の割合を少しずつ減少させ、最終的 は全て無血清培地となる状態から細胞をBIOCO AT(登録商標) (collagen Type IV)上へ播種し直し 7日後の細胞数を計測した。その結果、図1 ように歯肉由来線維芽細胞(GFB)および2種類 血管内被細胞(HMVEC、 HUVEC)ではそれぞれ従来 の至適培地で培養した方が多くの細胞数を得 ることができた。一方で、皮膚由来線維芽細 胞(DFB)、間葉系幹細胞(MSC)、2病態由来の滑膜 胞(SCOA、 SCRA)、さらにはヒト羊膜由来間質 胞(AmMSC)はそれぞれの至適培地に比べて無血 清培地でより多くの細胞数を得ることができ た。特に羊膜由来間質細胞は従来の培地で培 養を行った細胞と比較して、無血清培地で培 養を行った細胞はAmMSC01で約3倍、AmMSC02で約12 の増殖を示した。またデータには示してい いが、DFB、 MSC、 SCOA、 SCRA、 AmMSCでは今 のように徐々に培地の割合を減少せずに、 胞播種時に突然培地を無血清培地に変換し もその至適培地よりも多くの細胞を得るこ ができた(データ示さず)。このように、本 明の細胞増殖促進剤を含有する無血清培地 培養することによって、ヒト皮膚線維芽細 、ヒト腸骨由来骨髄間葉系幹細胞、ヒト線 芽細胞様滑膜細胞、ヒト羊膜由来間質細胞 4種の細胞において高い増殖能力を示した。

 本発明の細胞増殖促進剤を使用すること よって、無血清培地中で羊膜由来細胞又は 膜細胞の増殖を顕著に促進させることが可 となる。その結果、この方法を用いて、生 から比較的容易に採取できる細胞、即ち、 膜細胞から軟骨分化させたり、羊膜由来細 を神経細胞へ分化させたりすることが可能 なる。