Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf alkalische Bacillus-Lipasen und hierfür codierende DNA-Sequenzen, auf die Verwendung und ein Verfahren zur Herstellung dieser Lipasen, sowie auf Bacillus-Stämme, die die Fähigkeit be¬ sitzen, diese Lipasen zu bilden.

Enzymatisehe- Zusammensetzungen für Wasch-,- Reini- gungs- und Bleichanwendungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Zwar wurden für diese Anwendungen bereits viel¬ fältige Arten von Enzymen vorgeschlagen, doch richtete sich das Hauptinteresse hierbei im wesentlichen auf Pro- teasen und A ylasen. Die im Stand der Technik für Wasch-, Reinigungs- und Bleichzus-ammensetzungen bisher vorgeschla¬ genen Lipasen wurden durch Kultivierung von Mikroorganis¬ men wie Pseudomonas-, Rhizopus-, Chromobaσter und Humi- cola-Arten (inklusive Ther omyces-Spezies) erhalten.

Obwohl solche Lipasen als mögliche Enzyme für die ge¬ nannten Anwendungen in Erwägung gezogen wurden, haben sich Lipasen in Wasch-, Reinigungs- und Bleichzusammensetzungen bisher kaum durchgesetzt, da sich verschiedene Inhalts¬ stoffe dieser Zusammensetzungen negativ auf die Aktivität der Lipasen auswirken. Beispielsweise ist es bekannt, daß insbesondere anionische synthetische Tenside die Lipase- aktivität negativ beeinflussen. Von der Vielzahl der En¬ zyme des Standes der Technik, die zur Klasse der Lipasen gehören, hat zwar jedes einzelne Enzym auch spezielle vor-

teilhafte Eigenschaften, dennoch sind die Anwendungsmög- liσhkeiten für diese Enzyme aufgrund ihrer nachteiligen Eigenschaften nur begrenzt.

Ferner unterliegen die Lipasen, da sie selbst auch Proteine sind, dem proteolytischen .Abbau durch Wasch- mittelproteasen, sofern sie in Kombination mit diesen Pro- teasen als waschaktive Bestandteile von Wasch-, Reini¬ gungs- und Bleichmittelzusammensetzungen eingesetzt werden. Hierdurch besteht die Gefahr, daß bei gemeinsamer Verwen¬ dung von Protease und Lipase in diesen Zusammensetzungen die lipolytische Aktivität aufgrund von Aktivitätsverlusten ganz oder teilweise nicht genutzt werden kann.

Andererseits werden aber gerade bei niedrigen Wasch- und Reinigungstemperaturen, beispielsweise bei Tempera¬ turen bis 40 °C, Fette und Öle durch Wasch- und Reini¬ gungszusammensetzungen des Standes der Technik nur schlecht und unvollständig, von den zu reinigenden Geweben und/oder Gegenständen entfernt, sofern der Wasch- und Reinigungsvor¬ gang nicht durch lipolytisch wirks-ame Enzyme unterstützt wird.

Es bestand daher die Aufgabe, solche Lipasen bereitzu¬ stellen, die als Additiv für Waschmittel-, Reinigungsmittel- und Bleichmittelzusammensetzungen nützlich sind, die eine hohe Aktivität bei Temperaturen bis 40 °C besitzen und viel¬ seitige Verwendbarkeit in Gegenwart von Proteasen und in einem weiten, insbesondere neutralen bis alkalischen, pH-Be¬ reich gestatten.

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß Lipa¬ sen, die von Bacillus-Arten ausgeschieden werden, mit einem pH-Optimum im alkalischen pH-Bereich und einem Temperatur- Optimum im Bereich von etwa 30 bis 40 °C, die gewünschten Eigenschaften aufweisen. In zweckmäßigen Ausgestaltungen der

Erfindung handelt es sich insbesondere um alkalische Bacil- lus-Lipasen, die durch Kultivierung von Bacillus pumilus erhältlich sind.

In bevorzugten Ausgestaltungen der"Erfindung liegen insbesondere solche alkalischen Bacillus-Lipasen der vor¬ stehend angegebenen Art vor, die eine Aminosäurensequenz besitzen, die wenigstens 70 %, vorzugsweise wenigstens 80 %, insbesondere -aber wenigstens 90 %, Homologie zu der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz aufweist. Unter Ho¬ mologie wird hier der Grad der Verwandtschaft der betref¬ fenden Aminosäurensequenz einer Bacillus-Lipase zu den Ami¬ nosäurensequenzen der Lipasen aus den Bacillus-Naturisolaten DSM 5776, DSM 5777 oder DSM 5778, insbesondere zu 'der Amino¬ säurensequenz der Lipase aus dem Bacillus-Naturisolat DSM 5776 wie sie in Fig. 1 angegeben ist, verstanden. Zur Bestimmung der Homologie werden jeweils die einander ent¬ sprechenden Abschnitte der Aminosäurensequenz der Lipasen aus den Bacillus-Naturisolaten, insbesondere die Abschnitte der Aminosäurensequenz der Fig. 1, und einer damit zu ver¬ gleichenden Aminosäurensequenz einer Bacillus-Lipase so zur Deckung miteinander gebracht, daß maximale Übereinstimmung zwischen den Aminosäurensequenzen besteht, wobei durch Dele- tion oder Insertion einzelner Aminosäuren verursachte Unter¬ schiede berücksichtigt und durch entsprechende Verschiebun¬ gen von Sequenzabschnitten ausgeglichen werden. Die Zahl der nunmehr in den Sequenzen miteinander übereinstimmenden Ami¬ nosäuren ("homologe Positionen") , bezogen auf die Gesamtzahl der in der Sequenz einer der Lipasen aus den genannten Ba¬ cillus-Naturisolaten enthaltenen Aminosäuren, ergibt dabei die Homologie in %. Abweichungen in den Sequenzen können sowohl durch Variation, Insertion als auch Deletion von Ami¬ nosäuren bedingt sein.

In einer sehr bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Lipasen insbesondere alkalische Bacillus-Lipasen, die durch Kultivierung von Bacillus pumi-

lus der Spezies DSM 5776, DSM 5777 oder DSM 5778 erhältlich sind und beispielsweise wie weiter unten beschrieben iso¬ liert werden können.

Die durch die Erfindung vorgeschlagenen neuen alkali¬ schen Bacillus-Lipasen weisen insbesondere die folgenden weiteren Eigenschaften auf:

(1) Wirkung: Abbau von Triacylglyceriden und von FettSäureestern;

(2) pH-Optimum: etwa bei pH-Werten von 9 bis 10;

(3) pH-Stabilität: bei pH-Werten von 6,5 bis 11 er¬ weisen sich die Enzyme als völlig stabil; nach Inkubation bei pH 11 und 4 °C für 21 h beträgt .die Restaktivität der Enzyme wenigstens 90 %;. -• ^'

(4) Temperatur-Optimum: etwa 30 bis 40 °C;

(5) Temperatur-Stabilität: durch Inkubation der Enzyme bei Temperaturen bis 40 °C für 30 Minuten werden die Enzyme nicht wesentlich in ihrer Aktivität be¬ einträchtigt; nach 30 Minuten Inkubation bei 40 °C beträgt die Restaktivität der Enzyme wenigstens

90 %.

Die erfindungsgemäßen Bacillus-Lipasen eignen sich vorteilhaft als Additive für Waschmittel- und Reinigungs- mittelzusammensetzungen etc. , die neutrale bis alkalische pH-Werte besitzen und bei niedrigen Temperaturen, insbeson¬ dere bei Temperaturen bis 40 °C angewendet werden sollen. Die Erfindung betri ft daher auch die Verwendung der erfin¬ dungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen in Waschmittel-, Reinigungsmittel-, Bleichmittel- oder Geschirrspülmittel- zusammensetzungen. Sie können hierbei auch vorteilhaft in Gegenwart von anderen üblichen Enzymen, insbesondere auch in Gegenwart von Proteasen, eingesetzt werden. Eine ganz bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen betrifft deren Verwendung in Waschmittel-, Reinigungsmittel-, Bleichmittel- oder Geschirrspülmittelzu¬ sammensetzungen für niedrige Anwendungstemperaturen, vor-

zugsweise für Anwendungstemperaturen von etwa 30 bis 40 °C. Für diese Anwendungen stellt die Erfindung eine Gruppe neuer alkalischer Lipasen aus Bacillus-Arten mit verbesserten Eigenschaften zur Verfügung, deren Verwendung auch zu vor¬ teilhaften Waschmittel-, Reinigungsmittel-, Geschirrspül¬ mittel- und Bleichmittelzusammensetzungen führt. Die Erfin¬ dung umfaßt daher weiterhin diese vorteilhaften Zusammenset¬ zungen zum Waschen, Reinigen, Bleichen oder Geschirrspülen, die eine der erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen enthalten. Ausgestaltungen dieser Zusammensetzungen enthal¬ ten die erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen in Gegenwart von Protease. Bevorzugte Ausgestaltungen der vor¬ stehenden Zusammensetzungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie die alkalischen Bacillus-Lipasen in einer Formulierung für niedrige Anwendungstemperaturen, vorzugsweise für Anwen¬ dungstemperaturen von etwa 30 bis 40 °C, enthalten.

Die erfindungsgemäßen Lipasen können in Wasch- und Reinigungsmittelformulierungen, beispielsweise in Pulver¬ waschmittelformulierungen, einzeln oder gewünschtenfalls auch in Kombination miteinander, gegebenenfalls auch in Kombination mit Wasch- und Reinigungsmittelproteasen des Standes der Technik oder anderen in solchen Zusammenset¬ zungen üblichen Enzymen, wie z.B. Amylasen, Lipasen, Pek- tinasen, Nukleasen, Oxidoreduktasen etc., eingesetzt wer¬ den. Die erfindungsgemäßen Lipasen werden in "den Wasch- und Reinigungsmittelfo-rmulierungen in an sich für Wasch¬ mittelenzyme üblichen Mengen (geeignet sind bspw. bereits Mengen ab etwa 0,1 Gew.-%), insbesondere in einer Menge bis zu 3 Gew.-% (bezogen auf die Trockensubstanz der Gesamtzu¬ sammensetzung), vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 1,5 Gew.-%, verwendet.

Außer den bereits erwähnten Waschmittelenzymen können die Wasch- und Reinigungsmittel der Erfindung alle an sich im Stand der Technik üblichen Waschmittelinhaltsstoffe wie Tenside, Bleichmittel oder GerüstStoffe (Builder) , sowie weitere übliche Hilfsstoffe für die Formulierung von Wasch-

mittein in an sich üblichen Mengen enthalten. Zu den Hilfs¬ stoffen gehören z.B. Verstärker, Enzymstabilisatoren, Schmutzträger und/oder Kompatibilisierungsmittel, Komplex- und Chelatbildner, Seifenschaumregulatoren und Zusatzstoffe wie optische Aufheller, Opazifizierungsmittel, Korrosionsin¬ hibitoren, Antielektrostatika, Farbstoffe, Bakterizide, Bleichmittelaktivatoren, Persäurebleichmittelvorstufen.

So enthalten erfindungsgemäße Waschmittelformulierun¬ gen in typischer beispielhafter Zusammensetzung bezogen auf Trockensubstanz

a) wenigstens 5 Gew.-%, z.B. 10 bis 50 Gew.-%, eines Tensids oder Tensidgemisches b) bis zu 40 Gew.-% eines Builders oder eines Builder-Ge- misch.es, c) bis zu 40 Gew.-% eines Bleichmittels oder Bleichmittel¬ gemisches, vorzugsweise ein Perborat wie Natriumperbo¬ rat-Tetrahydrat oder Natriumperborat-Monohydrat, d) 0,1 bis '3 Gew.-%, vorzugsweise 0,2 bis 1,5 Gew.-% wenig¬ stens einer erfindungsgemäßen Lipase und ggf. 0,1 bis

3 Gew.-% einer Protease e) weitere Bestandteile wie Hilfsstoffe etc. ad 100 Gew.-%

Solche Waschmittelfo.rmulierungen können in an sich üb¬ licher Weise formuliert werden. Die erfindungsgemäßen Li¬ pasen können dazu z.B. in Form von Granulaten, Prills oder Pellets, gegebenenfalls auch mit Oberflächenüberzügen ver¬ sehen, mit den anderen Komponenten der Waschmittelformulie¬ rung in an sich bekannter Weise vermischt werden.

Die erfindungsgemäßen Bacillus-Lipasen eignen sich darüber hinaus sehr gut für den Einsatz in an sich üb¬ lichen flüssigen Reinigungsformulierungen, z.B. in Ge¬ schirrspülmitteln oder in Flüssigwaschmittelformulierungen. In diese Formulierungen können die erfindungsgemäßen Lipasen auch in Form von Flüssigenzymformulierungen eingebracht werden.

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Die alkalischen Bacillus-Lipasen der Erfindung können erhalten werden, indem man ein Bakterium, welches zum Genus Bacillus gehört und welches zur Bildung der alka¬ lischen Lipase fähig ist, in an sich üblicher Weise zu¬ nächst kultiviert und man danach die Zellen z.B. durch Filtration oder durch Zentrifugation abtrennt, das Enzym durch Membranfiltration oder Fällung konzentriert, auf- reinigt, ggf. auch isoliert und einer gewünschten Verwendung zuführt.

Für die Herstellung und Gewinnung der erfindungsge¬ mäßen Lipasen erweisen sich z.B. einerseits die Naturiso- late von Bacillus-Stämmen, die die erfindungsgemäßeh Lipasen produzieren, selbst als geeignet. Solche Bacilli lassen sich aus der Natur isolieren, indem man beispiels¬ weise tierisches oder pflanzliches Fett enthaltendes Material zunächst einige Zeit unter für Lipase ausschei¬ dende Bacillus-Spezies günstigen Bedingungen lagert, danach gegebenenfalls pasteurisiert und anschließend mit der so erhaltenen Probe ein für das Wachstum von Lipase ausscheidenden Bacillus-Spezies geeignetes Medium beimpft. Nach einer ausreichenden Inkubationszeit werden vegetative Zellen durch Hitzebehandlung der Kultur abgetötet und die so behandelte Kultur, gegebenenfalls nach Einstellung einer geeigneten Verdünnung, beispielsweise auf Lipase- Screeningplatten ausgespatelt und die Platten nachfolgend inkubiert. Nach einer ausreichenden Inkubationsdauer wer¬ den die Lipase-Screeningplatten dann in an sich bekannter Weise auf Lipase-bildende Kolonien untersucht und diese Kolonien in an sich bekannter Weise isoliert. In dieser Weise können geeignete, eine alkalische Bacillus-Lipase bildende Bacillus-Naturisolate erhalten werden. Beispiele sind Spezies von Bacillus pumilus, insbesondere die eben¬ falls einen Erfindungsgegenstand darstellenden Bacillus- Naturisolate, die am 07.02.1990 unter den Nummern DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778 bei der Deutschen S-ammlung von Mikro¬ organismen, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt wurden.

Andererseits können in vorteilhafter Weise, insbeson¬ dere aus Gründen der Produktionsvereinfachung und -Opti¬ mierung sowie zur Ausbeutesteigerung, auch andere Bacillus-Stämme, in die zuvor durch Transformation die notwendige genetische Information über die erfindungsge¬ mäßen Lipasen und deren Expression eingebracht wurde, zur Herstellung und Gewinnung der erfindungsgemäßen Bacillus- Lipasen eingesetzt werden.

Die Erfindung umfaßt daher auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen alkalischen Lipasen mit transformierten Mikroorganismen, vorzugsweise mit transfor¬ mierten Bacilli, welche einen Vektor mit einer solchen DNA-Sequenz enthalten, welche für eine Aminosäurehsequenz einer der weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen, alka¬ lischen Bacillus-Lipasen codiert. Der erfindungsgemäß trans¬ formierte Mikroorganismus wird wie oben angegeben kultiviert und aus dem Kulturmedium die alkalische Bacillus-Lipase iso¬ liert. Bevorzugte transformierte Mikroorganismen für die Herstellung und Gewinnung der erfindungsgemäßen Bacillus-Li¬ pasen sind Bacillus-Spezies wie Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus licheniformis oder Bacillus amylo- liquefaciens. Die zur Expression von Bacillus-Lipasen geeig¬ neten, erfindungsgemäß transformierten Mikroorganismen zeichnen sich dadurch aus, daß sie mit einem "Vektor trans¬ formiert sind, der die genetische Information für eine der erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen enthält. Die genetische Information für diese erfindungsgemäßen Bacillus- Lipasen wird hierbei jeweils durch eine DNA-Sequenz gegeben, die für eine alkalische Bacillus-Lipase mit einer Aminosäu¬ ren-Sequenz codiert, die wenigstens 70 %, vorzugsweise wenigstens 80 %, insbesondere aber wenigstens 90 %, Homolo¬ gie zu der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz auf¬ weist. Diese neuen DNA-Sequenzen, die zur Transformation von Mikroorganismen geeigneten Vektoren, vorzugsweise Expres¬ sionsvektoren, die diese neuen DNA-Sequenzen enthalten sowie die mit diesen Vektoren transformierten Mikroorganismen,

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vorzugsweise derart transformierte Bacilli wie insbesondere der oben angegebenen Art, sind ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung.

Zur Erzeugung der im vorstehenden Verfahren eingesetz¬ ten, transformierten Mikroorganismen kann so vorgegangen werden, daß man

a) zunächst aus einem geeigneten Bacillus-Stamm, der eine alkalische Lipase mit einer Aminosäurensequenz mit wenigstens 70 %, vorzugsweise wenigstens 80 %, insbe¬ sondere aber wenigstens 90 %, Homologie zu der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz produziert, die für die Lipase codierende DNA-Sequenz (d.h. das Struktü gen der Lipase) isoliert, b) ggf. die Nukleotidabfolge dieser DNA-Sequenz zur wei¬ teren Identifizierung der Lipase bestimmt, c) nachfolgend mit Hilfe der isolierten DNA-Sequenz einen Expressionsvektor herstellt und d) den erhaltenen Expressionsvektor in einen geeigneten Mikroorganismus, welcher schließlich zur Produktion der alkalischen Lipase eingesetzt werden kann, trans¬ formiert.

Die Verfahrensschritte zur Isolierung und Gewinnung der erfindungsgemäßen alkalischen Lipasen nach dem vorstehenden Verfahren, sowie die hierbei erhaltenen, zum Teil ebenfalls einen Erfindungsgegenstand darstellenden Zwischenprodukte in Form von DNA-Sequenzen bzw. DNA-Inserts mit dem Lipase-Gen, Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, und transfor¬ mierten Mikroorganismen werden nachfolgend im einzelnen näher beschrieben.

Die Strukturgene, die für Aminosäurensequenzen der alkalischen Bacillus-Lipasen codieren, können nach an sich bekannten, allgemeinen Methoden erhalten werden. Hierzu wird z.B. aus einem Bacillus ("Donor-Bacillus ") , der eine alka-

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lische Lipase produziert, insbesondere aus einem Bacillus aus der Gruppe DSM 5776, DSM 5777 oder DSM 5778, die chromo- somale DNA nach an sich bekannten Methoden isoliert und mit geeigneten Restriktionsendonukleasen partiell hydrolysiert. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die substratsspezi¬ fisch doppelsträngige DNA dadurch in Fragmente zerlegen, daß sie Phosphodiesterbindungen zwischen einzelnen Nukleotidbau- steinen der DNA spalten. Alle Restriktionsendonukleasen ver¬ mögen bestimmte Basensequenzen der DNA zu erkennen, welche für die Aktivität der betreffenden Restriktionsendonukleasen spezifische Wirkungsorte (Schnittstellen) markieren. Beim Schneiden (Restriktion) doppelsträngiger DNA, wie hier, ent¬ stehen bei einigen Restriktionsendonukleasen spezifische, sogenannte "überstehende Enden", die unter bestimmten Rena- turierungsbedingungen wieder miteinander oder mit. entspre¬ chenden (komplementären) überstehenden Enden anderweitig ge¬ wonnener DNA-Fragmente verbunden (ligiert) werden können (Rekombination) . Beim Schneiden mit anderen Restriktions¬ endonukleasen entstehen DNA-Doppelstränge mit glatten Enden. Diese DNA-Doppelstränge mit glatten Enden können mit belie¬ bigen DNA-Doppelsträngen, die ebenfalls glatte Enden besit¬ zen, rekombiniert werden.

Die erhaltenen Restriktionsfragmente der Donor-DNA können durch Gelelektrophorese oder Zentrifugation durch einen Saccharose-Dichte-Gradienten nach Größe" aufgetrennt und die Fragmente gewünschter Größe dann mit einer geeig¬ neten, doppelsträngigen Vektor-DNA rekombiniert werden. Vektoren sind DNA-Moleküle, die sich als Transportmoleküle

(Vehikel) zur Einschleusung (Transformation) von Fremd-DNA in Wirtszellen eignen, dort ggf. autonom replizierbar sind und gegebenenfalls noch sogenannte Marker besitzen. Marker sind DNA-Fragmente, die für bestimmte, beobachtbare Eigen¬ schaften (z.B. Antibiotika-Resistenz) codieren und der nachfolgenden Selektion der transformierten Mikroorganismen

(Transformanten) dienen. Häufig verwendete Vektoren sind die sogenannten Plasmide, d.h. extrachromosomale, ringförmige,

doppelsträngige Bakterien-DNA, die sich durch geeignete Methoden in andere Mikroorganismen einbringen läßt und dort vermehrbar ist. Ein hier verwendetes Plasmid mit der Be¬ zeichnung pUBHO kann, wie in den Beispielen näher beschrie¬ ben, aus dem kommerziell erhältlichen Bacillus subtilis BD366 isoliert werden.

Die vorstehend erhaltene, in vitro rekombinierte DNA kann nun in geeignete Wirtszellen, z.B. in den hier ver¬ wendeten, kommerziell erhältlichen Stamm Bacillus subtilis PSL 1 eingebracht werden. Transformanten können mit Hilfe von bekannten Markern auf der Vektor-DNA (z.B. Neomycin- Resistenz) selektiert werden. Unter diesen antibiotikare- sistenten Transformanten kann nach Lipase-ausscheidenden . Klonen, d.h. genetisch identischen Transformanten, .gesucht werden. Aus einem 'Klon mit Lipaseaktivität wiird schließlich die in diese Transformante eingeführte Plasmid-DNA isoliert und durch erneute Transformation eines Bakteriums, insbeson¬ dere einer Bacillus-Spezies, überprüft, ob die Lipaseaktivi¬ tät Plasmid-gebunden und mit der Markereigenschaft gekoppelt ist.

Das so isolierte Plasmid enthält neben der Vektor-DNA (hier insbesondere aus dem Plasmid pUBHO) mit bekannten Restriktionsstellen das gewünschte Strukturgen für die ge¬ suchte alkalische Bacillus-Lipase und gegebenenfalls wei¬ tere, hier aber nicht benötigte DNA-Sequenzen aus dem Donor- Bacillus. Beispiele für diese Vektoren mit Lipasegen-halti- gen Fragmenten (Inserts) sind die Plasmide mit den Bezeich¬ nungen pL2-22-ll, pL4-23-14 und pLll-8-20. Die für die je¬ weiligen Bacillus-Lipasen codierenden DNA-Sequenzen und die zugehörigen Aminosäurensequenzen in diesen Plasmiden können mit Hilfe an sich bekannter Methoden des Standes der Technik sequenziert werden. Man erhält so z.B. die in Fig. 1 angege¬ bene DNA-Sequenz bzw. die zugehörige Aminosäurensequenz.

Die Fähigkeit dieser Plasmide, beispielsweise der Plasmide pL2-22-ll, pL4-23-14 und pLll-8-20 zur Expression

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der alkalischen Bacillus-Lipase kann überprüft werden, indem man ein Bakterium, insbesondere eine Bacillus-Spezies mit einem dieser Plasmide transformiert und die so erhaltenen Transformanten kultiviert und auf Lipaseaktivität überprüft. Die erhaltenen Transformanten können darüber hinaus auch zur Herstellung und Gewinnung der erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen kultiviert werden, wobei dann die weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus- Lipasen erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Bacillus-Lipasen zeichnen sich durch vorteilhafte Eigenschaften aus. Sie besitzen eine günstige pH-Stabilität in einem weiten Bereich von pH 5 bis 11 und sind insbesondere im pH-Bereich von 6,5 bis 11 völlig stabil. Das pH-Optimum der erfindungsgemäßen Bacillus-Lipasen liegt in einem für die Anwendung in Wasch- und Reinigungsmittelzusammensetzungen günstigen Be¬ reich von pH 9 bis 10. Ferner besitzen die erfindungsge¬ mäßen Lipasen ein Temperatur-Optimum im Bereich von 30 bis 40 °C- Ferner zeigen sie hervorragende Stabilitäten auch in Waschlauge, sowie auch in Gegenwart von Wasch- mittelproteasen. Aufgrund ihrer günstigen Aktivität bei Temperaturen bis zu 40 °C eignen sich die erfindungsge¬ mäßen Bacillus-Lipasen insbesondere für die Anwendung in Reinigungs- und Waschmittelzusammensetzungen, die bei niedrigen Temperaturen, insbesondere bis 40 °C angewendet werden sollen. Solche Wasch- und Reinigungsmittelzusammen¬ setzungen, die eine erfindungsgemäße Lipase enthalten, zeigen eine ausgezeichnete Waschwirksamkeit hinsichtlich zu entfernender Öle und/oder Fette.

Erläuterunqen zu den Figuren:

Figur 1:

DNA-Sequenzprotokoll und zugehörige Aminosäurensequenz der

Lipase aus Bacillus pumilus DSM 5776

Figur 2 bis Figur 4:

Kurven für die Temperatur-Optima der Lipasen aus Bacillus pumilus DSM 5776 (Fig. 2) , aus Bacillus pumilus DSM 5777 (Fig. 3) und aus Bacillus pumilus DSM 5778 (Fig. 4) .

Figur 5 bis Figur 7 :

Kurven für die Temperatur-Stabilität der Lipasen .aus ^' Bacillus pumilus DSM 5776 (Fig. 5) , aus Bacillus' pumilus DSM 5777 (Fig. 6) und aus Bacillus pumilus DSM 5778 (Fig. 7) .

Figur 8 bis Figur 10:

Kurven für -die pH-Optima der Lipasen aus Bacillus pumilus DSM 5776 (Fig. 8), aus Bacillus pumilus DSM 5777 (Fig. 9) und aus Bacillus pumilus DSM 5778 (Fig. 10) .

Figur 11 bis Figur 13:

Kurven für die pH-Stabilität der Lipasen aus Bacillus DSM 5776 (Fig. 11), aus Bacillus DSM 5777 (Fig. 12) und aus Bacillus DSM 5778 (Fig. 13) . Zur pH-Wert-Einstellung wurden benutzt Posphatpuffer ( ^• ) , Tris-HCl-Puffer (+) bzw. Glycin-NaOH-Puffer (*) .

Figur 14 bis Figur 16:

Graphische Darstellung der Waschwirksamkeit von Bacillus- Lipasen in einer IEC-Standardwaschmittelformulierung, sowie in Gegenwart von alkalischer Protease; Waschwirksamkeit der Lipase aus Bacillus pumilus DSM 5776 (Fig. 14) , aus Bacillus pumilus DSM 5777 (Fig. 15) und aus Bacillus pumilus DSM 5778 (Fig. 16) .

Beispiele Die nachfolgende Offenbarung gibt zur weiteren Erläu¬ terung der Erfindung typische beispielhafte Ausgestaltun¬ gen der Erfindung wieder, ohne jedoch die Erfindung in ihrem Umfange zu beschränken.

Um die Beispiele zu vereinfachen werden einige häufig wiederkehrende Methoden und Begriffe im folgenden näher erläutert und dann in den einzelnen Beispielen nur noch durch eine Kurzbezeichnung referiert. Sofern nicht anders angegeben, wurde generell nach Methoden gearbeitet, wie sie in Maniatis et al. (Maniatis et al. = T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) bes-chrieben sind.

Die verschiedenen benutzten Restriktionsendonukleasen gehören zum Stand der Technik und sind kommerziell verfüg¬ bar. Die bei Verwendung dieser bekannten Restriktionsendo¬ nukleasen jeweils erforderlichen Reaktions-, Kofaktor- und übrigen Bedinungen sind ebenfalls bekannt. Z.B. kann für eine Menge von etwa 1 μg DNA eine Einheit (= 1 U = unit) der Restriktionsendonuklease in etwa 20 μl einer Pufferlösung eingesetzt werden. Ausreichende Inkubationszeiten von etwa einer Stunde bei 37 °C wurden gewöhnlich eingehalten, die Inkubationsbedingungen können aber den gegebenen Erforder¬ nissen angepaßt werden. Nach Inkubation mit einer Restrik¬ tionsendonuklease wurde das Protein durch Extraktion (z.B. mit Phenol und Chloroform) entfernt und die geschnittene DNA (z.B. aus der wäßrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol) isoliert und der weiteren Verwendung zugeführt.

An das Schneiden von DNA oder Vektoren mit Restrik¬ tionsendonukleasen kann sich gegebenenfalls eine Hydro¬ lyse des terminalen 5' -Phosphatrestes mit einer alkalischen Phosphatase (Dephosphorylierung) anschließen. Dadurch kann verhindert werden, daß die beim Schneiden entstandenen Enden des restringierten Vektors mit sich selbst rekombinieren und

somit die gewünschte Insertion eines Fremd-DNA-Fragmentes in die Restriktionsstelle verhindert würde. Sofern in den Bei¬ spielen eine Dephosphorylierung des 5'-Endes vorgenommen wurde, geschah dieses in an sich bekannter Weise. Weitere Angaben zur Durchführung einer Dephosphorylierung und zu dafür benötigten Reagentien können Maniatis et al. (S. 133 - 134) entnommen werden.

Partielle Hydrolyse bedeutet unvollständige Verdauung von DNA durch eine Restriktionsendonuklease. Die Reaktions¬ bedingungen werden dabei so gewählt, daß in einem DNA-Sub¬ strat zwar an einigen, nicht aber an allen Erkennungsstellen für die eingesetzte Restriktionsendonuklease geschnitten wird.

Zur Gewinnung und Isolierung von bestimmten DNA-Frag¬ menten, z.B. nach Behandlung von DNA mit Restriktionsendo¬ nukleasen, wurden die angefallenen DNA-Fragemente in an sich bekannter Weise durch Gelelektrophorese (z.B. auf Agarosegel) getrennt, nachfolgend über das Molekularge¬ wicht (Bestimmung durch Vergleich mit Referenz-DNA-Frag¬ menten mit bekanntem Molekulargewicht) identifiziert und das gewünschte DNA-Fragment aus der entsprechenden Gelzone abgetrennt.

Ligation (ligieren) bedeutet ein Verfahren zur Bil¬ dung von Phosphodiesterbindungen zwischen DNA-Fragmenten (siehe z.B. Maniatis et al., S. 146) . Ligationen können unter an sich bekannten Bedingungen, z.B. in einem Puffer mit etwa 10 Units T4-DNA-Ligase pro 0,5 μg der zu ligie- renden DNA-Fragmente, ausgeführt werden.

Unter Transformation wird die Einschleusung von DNA in einen Mikroorganismus verstanden, so daß die DNA in diesem repliziert bzw. exprimiert werden kann. Für die Transformation von E. coli ist z.B. die Calciumchlorid- ethode nach Mandel et al. (1970, J. Mol. Biol. 53: 159) oder nach Maniatis et al. (S. 250 bis 251) geeignet. Für

Bacillus-Spezies ist z.B. die Methode Anagnostopoulos et al. (1961, J. Bact. 81: 741 - 746) geeignet.

Bei der Angabe von Enzymstabilitäten in den folgenden Beispielen bedeuten: "völlig stabil" eine Restaktivität von mindestens 90 %; "stabil" eine Restaktivität von wenigstens 80 %.

Die im Beispiel 1 isolierten Bacillus-Stämme sind bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zell¬ kulturen GmbH (DSM) , Bundesrepublik Deutschland (Anschrift: Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig) , unter den DSM-Nummern 5776, 5777 bzw. 5778 am 07.02.1990 hinterlegt • worden.

Beispiel 1 - Isolierung von Lipase ausscheidenden Bacilli.

A) MMII-Medium (2 % Olivenöl, 0,05 % Hefeextrakt, 0,1 % NaCl, 0,5 % (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , MgS0 ₄ x2H ₂ 0, 0,2 % Harnstoff, 10 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9) wurde mit einer Lebensmittel- probe (Frischkäse, eine Woche bei Raumtemperatur gelagert) beimpft und für 72 Stunden bei 37 °C unter Schütteln in¬ kubiert. Vegetative Zellen wurde durch 30 minütige Behand¬ lung bei 80 °C abgetötet. Verschiedene Verdünnungen der so behandelten Kultur wurden auf Lipase-Screeningplatten, die 2,5 % Olivenöl, 0,8 % Nutrient Broth, 0,4 % NaCl, 2 % Agar, 0,001 % Rhodamin B und 10 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9) enthielten (modifiziert nach Kouker und Jäger, 1987, Appl. Environ. Microbiol. 53, Seiten 211 - 213), ausgespatelt. Die Platten wurden bei 37 °C inkubiert. Nach einer Inkubationsdauer von 2 Tagen wurden um einige Kolo¬ nien unter UV-Licht orangefarbige Höfe sichtbar. Eine dieser Kolonien wurde isoliert und der isolierte Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 5776 hinterlegt.

B) Eine Woche bei Raumtemperatur gelagerte Butter wurde pasteurisiert (30 min, 80 °C) . Mit einer Probe hiervon wurde VMI-Medium (1 % Tween 80, 1 % Trypton, 0,5 % Hefe¬ extrakt, 0,5 % NaCl, 10 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9) beimpft und für 48 Stunden bei 37 °C unter Schütteln inku¬ biert. Verschiedene Verdünnungen der Kultur wurden auf Lipase-Screeningplatten ausgespatelt. Nach einer Inkuba¬ tionsdauer von 2 Tagen wurde um eine Kolonie unter UV- Licht ein orangefarbiger Hof sichtbar. Diese Kolonie wurde isoliert und der isolierte _. Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 5777 hinterlegt.

C) Vier Tage bei Raumtemperatur gelagertes Schweineschmalz wurde pasteurisiert (30 min, 80 °C) . Mit einer Probe hiervon wurde VMII-Medium (1 % Tween 80, 1 % Olivenöl, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, 10 mM Natriumcar¬ bonatpuffer pH 9) beimpft und für 48 Stunden bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Verschiedene Verdünnungen der Kultur wurden auf Lipase-Screeningplatten ausgespatelt. Nach einer Inkubationsdauer von 2 Tagen wurden um einige Kolonien unter UV-Licht orangefarbige Höfe sichtbar. Eine dieser Kolonien wurde isoliert und der isolierte Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 5778 hinterlegt.

Beispiel 2 Identifizierung der gemäß Beispiel 1 isolierten Bacilli

Es handelt sich bei den in Beispiel 1 isolierten Stämmen mit den DSM-Nummern 5776, 5777 und 5778 um grampositive, sporen¬ bildende aerobe Mikroorganismen, die der Gattung Bacillus zugeordnet werden können. Die zell- und koloniemorpholo¬ gische Beschreibung wird im folgenden gegeben, biochemiche Reaktionen und Reaktionen auf bestimmte Wuchsbedingungen sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Bacillus-Spezies DSM 5776:

Stäbchenförmiges Bakterium mit abgerundeten Ecken. Die Gram¬ reaktion (Gramfärbung, KOH-Test) ist positiv. Auf TY-Agar (siehe unten) haben die Kolonien nach 2 Tagen bei 37 °C einen Durchmesser von 3,5 bis 4 mm, sind beigefarben und haben einen glatten bis wellenförmigen Rand. Gelegentlich ist auf den Kolonien auch Tropfchenbildung zu beobachten; die Kolonien können glänzend oder eingetrocknet-runzlig sein. Die Zellen haben auf TY-Agar eine Größe von 0,7 bis 0,9 um * 1,2 bis 2,8 μm und liegen in der Regel als einzelne Zellen oder in Zweier- oder Dreierketten vor. Die Sporen sind oval und zentral bis subterminal gelegen. Der St-aanm sporuliert bereitwillig.

Bacillus-Spezies DSM 5777:

Stäbchenförmiges Bakterium mit abgerundeten Ecken. Die Gram¬ reaktion (Gramfärbung, KOH-Test) ist positiv. Auf TY-Agar (siehe unten) haben die Kolonien nach 2 Tagen bei 37 °C einen Durchmesser von 3,2 bis 4,2 mm, sind beigefarben und haben einen glatten bis wellenförmigen Rand. Gelegentlich ist auf den Kolonien auch Trop chenbildung zu beobachten; die Kolonien können glänzend oder eingetrocknet-runzlig sein. Die Zellen haben auf TY-Agar eine Größe von 0,8 bis 0,9 μm * 1,2 bis 2,8 μm und liegen in der Regel als einzelne Zellen oder in Zweier- oder Dreierketten vor. Die Sporen sind oval und zentral bis subterminal gelegen. Der Stamm sporuliert bereitwillig.

Bacillus-Spezies DSM 5778:

Stäbchenförmiges Bakterium mit abgerundeten Ecken. Die Gram¬ reaktion (Gramfärbung, KOH-Test) ist positiv. Auf TY-Agar (siehe unten) haben die Kolonien nach 2 Tagen bei 37 °C einen Durchmesser von 2,2 bis 3 mm, sind beigefarben und haben einen glatten bis wellenförmigen Rand. Gelegentlich ist auf den Kolonien auch Tropfchenbildung zu beobachten; die Kolonien können glänzend oder eingetrocknet-runzlig sein. Die Zellen haben auf TY-Agar eine Größe von 0,7 bis 0,9 μm * 1,3 bis 3,7 μm und liegen in der Regel als einzelne

Zellen oder in Zweier- oder Dreierketten vor. Die Sporen sind oval und zentral bis subterminal gelegen. Der Stamm sporuliert bereitwillig.

TY-Agar:

Hefeextrakt 5 g

MgCL ₂ * 6H ₂ 0 8 , 75 g

MnCl ₂ *6H ₂ 0 0 , 016 g

Agar 16 g

Aqua bidest . ad 1000 ml pH 7 , 0 ± 0 , 3

Aufgrund der nach Durchführung der in der Tabelle 1 ge¬ nannten Tests (nach Bergeys Manual of Determinative Bac- ^' teriology, Vol.2, 1121-1125, P.H.A. Sneath (e .) illiams und Wilins, Baltimore-London-Los Angeles-Sydney, .1986) ge¬ fundenen Resultate kann eine Zuordnung zu der Art Bacillus pumilus vorgenommen werden. Die isolierten St-ämme weichen lediglich in wenigen Merkmalen (Voges-Proskauer Test, pH der V-P Nährlösung und Bildung von Eigelb-Lecithinase, sowie Stamm DSM 5777 hinsichtlich des Wachstums bei 7 % NaCl) von den dort für Bacillus pumilus aufgeführten Kennzeichen ab.

Bacillus pumilus ist ein ubiquitar vorkommender Organismus, der auf Nährböden Kolonien mit variablem Aussehen bildet. Die gemäß Beispiel 1 isolierten Stämme sind-demzufolge:

Bacillus pumilus DSM 5776 (Beispiel 1A) , Bacillus pumilus DSM 5777 (Beispiel 1B) und Bacillus pumilus DSM 5778 (Beispiel IC) .

Tabelle 1*

Fortsetzung Tabelle 1

* Angaben von B. pumilus nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 2, S. 1123, P.H.A. Sneath, ed., Williams u. Wilkins, Baltimore-London- Los Angeles-Sydney, 1986. +, 90 % oder mehr positiv -, 90 % oder mehr negativ d, 11-89 % positiv n.b., nicht bestimmt NB, Nährbouillon

Beispiel 3 Lipasebildung mit den Bacillus-Naturisolaten des Bei¬ spiels 1.

Die im Beispiel 1 isolierten und nach Beispiel 2 näher identifizierten Bacillus-Stämme DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778 wurden bei pH 9,0 und 30 °C bei 300 Upm in einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung inkubiert.

Zusammensetzung des Mediums: 20 g Sojamehl, 10 g Pepton; 10 g lösliche Stärke; 2 g Dikaliumhydrogenphosphat; 1 g Magnesiumsulfat-heptahydrat; 5,88 g Natriumhydrogencar- bonat; 3,18 g Natriumcarbonat; 10 g Tween 80; Aqua bidest. ad 1.000 ml; der pH des komletten Mediums betrug. -9,0 + 0,1.

Nach einer Inkubationsdauer von 22 h für die Bacillus- Stämme DSM 5777 und 5778 bzw. von 41,5 h für den Bacillus- Sta m DSM 5776 wurden die Kulturen durch 15-minütige Zentri- fugation -von Zellmaterial befreit und die Aktivität der in den Kulturüberständen enthaltenen Lipase gemäß Beispiel 8 ermittelt. Hierbei wurden die nachfolgenden Aktivitäten ge¬ messen, die zeigen, daß die gemäß Beispiel 1 isolierten Bacilli Lipasen ausscheiden.

Lipase aus Bacillus Aktivität

DSM 5776 8,5 U/ml

DSM 5777 10,3 U/ml

DSM 5778 12,8 U/ml

Beispiel 4 Herstellung genomischer DNA-Bibliotheken aus Bacillus-Natur¬ isolaten und Isolierung von Genen alkalischer Bacillus- Lipasen.

Aus den Naturisolaten Bacillus DSM 5776, Bacillus DSM 5777 und Bacillus DSM 5778 des Beispiels 1 wurde nach der Methode von Saito et al. (1963, Biochim. Biophys. Acta. 72, Seiten 619 - 629) jeweils die chromosomale DNA isoliert und mit der Restriktionsendonuklease Sau3A partiell hydrolisiert. Die Restrik ionsfrag ente wurden durch Elektrophorese auf einem Agarosegel aufgetrennt, und die Fragmente mit einer Größe von 3 bis 8 Kilobasen (KB) wurden isoliert.

Die isolierten und größenselektierten DNA-Fragmente aus den Bacilli DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778 wurden jeweils mit. Vektor-DNA des Plasmids pUBllO (Herstellung wie in Beispiel 7 beschrieben) in vitro neukombiniert. -

Hierzu wurde das ^' Plasmid pUBllO zunächst -mit .der Restrik¬ tionsendonuklease BamHI restringiert und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Anschließend wurden je 4 μg der restringierten und dephos- phorylierten Vektor-DNA mit je 20 μg der DNA-Fragmente aus den Bacilli DSM 5776, DSM 5777 oder DSM 5778 in einem Ge¬ samtvolumen von 200 μl mit T4-DNA Ligase 24 h bei 16 °C inkubiert.

Mit der jeweils erhaltenen in vitro neukombinierten DNA wurden Protoplasten des Stammes Bacillus subtilis .PSL 1 (Bacillus Genetic Stock Center 1 A 510) nach der von S. Chang und N. Cohen (1979, Mol. Gen. Genet. 168, Sei¬ ten 111 - 115) beschriebenen Methode transformiert. Die Transformanten wurden auf Platten mit Neomycin selektiert und anschließend auf Lipase-Screeningplatten (ohne Natrium- carbonat-Puffer) überführt. Unter ca. 100.000 erhaltenen Transformanten wurden einige gefunden, die aufgrund fluo¬ reszierender Höfe um die jeweilige Kolonie als Lipaseaus- scheider identifiziert werden konnten.

Aus diesen Klonen wurde die jeweilige Plasmid-DNA nach Maniatis et al. isoliert. Das in diesen Plasmiden jeweils

enthaltene klonierte Fragment aus Bacillus DSM 5776, Bacillus DSM 5777 oder Bacillus DSM 5778 enthielt (wie durch Beispiel 5 nachgewiesen wurde) die vollständige korrekte DNA-Sequenz für die jeweilige alkalische Bacillus-Lipase. Die Plasmide erhielten die Bezeichnungen pL2-22-ll für das Plasmid mit einem Insert aus der DNA des Bacillus-Stammes DSM 5776; pL4-22-14 für das Plasmid mit einem Insert aus der DNA des Bacillus-Stammes DSM 5777; pLll-8-20 für das Plasmid mit einem Insert aus der DNA des Bacillus-Stammes DSM 5778.

Die Plasmide wurden jeweils mit verschiedenen Restriktions¬ endonukleasen geschnitten, die erhaltenen restringierten DNA's durch Elektrophorese auf einem Agarosegel aufgetrennt und anhand des Bandenmusters vorläufige Restriktidnskarten . für die Lipasegen-tragenden Inserts in den vorstehend- be¬ schriebenen Plasmiden erstellt. Es wurde die jeweils nach¬ folgend angegebene vorläufige Abfolge von Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen für die Lipasegen-tragenden Inserts in den oben genannten Plasmiden ermittelt; für das Insert in pL2-22-ll mit einer Größe von etwa 3,5 KB: Clal, PvuII, Ncol, Xbal, Xbal, Acyl, PvuII, Mlul, EcoRV, Bell, EcoRV; für das Insert in pL4-23-14 mit einer Größe von etwa

2.6 KB: EcoRV, Clal, Ncol, Xbal, Avall, Clal, Bglll, Xbal, EcoRV; für das Insert in pLll-8-20 mit einer Größe von etwa

1.7 KB: Ncol, Avall, Clal, Xbal, EcoRV.

Beispiel 5 Expression der Lipasegene sowie Überprüfung und Nachweis der lipolytischen Aktivität der exprimierten Bacillus-Lipasen.

Die Plasmide pL2-22-ll, pL4-23-14 und pLll-8-20 wurden je¬ weils erneut in den Stamm B. subtilis PSL 1 eingebracht und die erhaltenen Transformanten kultiviert. Ferner wurde das Plasmid pL2-22-ll in den Bacillus-Stamm DSM 5776, das Plas¬ mid pL4-23-14 in den Bacillus-Stamm DSM 5777 und das Plasmid pLll-8-20 in den Bacillus-Stamm DSM 5778 eingebracht und ebenfalls kultiviert. .Als Kontrollstämme wurden ein nicht- transformierter B. subtilis PLS 1, ein mit dem Plasmid

pUBHO transformierter B. subtilis PSL 1, die A sgangsstamme für die Isolierung der Lipasegene, die d.h. Bacilli DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778, sowie Transformanten dieser Ausgangs¬ stämme mit dem Plasmid pUB 110 ebenfalls kultiviert. Die Transformation erfolgte jeweils nach der im Beispiel 4 ange¬ gebenen Methode von S. Chang und N. Cohen. Zur Kultivierung wurden die mit den Plasmiden pL2-22-ll, pL4-23-14 oder pLll-8-20 transformierten Bacillus-Stämme und die Kontroll¬ stämme in Schüttelkolben mit 50 ml Vorkultur-Medium (1,5 % Trypton, 1 % Hefeextrakt, 2 % Stärke) 18 Stunden bei 37 °C und 280 Upm inkubiert. Mit 1,5 ml von dieser Kultur wurden Schüttelkolben mit 50 ml Hauptkultur-Medium (1 % Tween 80, 1 % Trypton, 1 % Hefeextrakt, 4 % Stärke, 2 % Sojamehl) be¬ impft und bei 37 °C und 350 Upm inkubiert. Die Medien für ^• alle plasmidhaltigen Stämme enthielten zusätzlic 10 μg Neomycin/ml. Die Medien für die Bacillus-ätämme DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778 sowie deren plasmidhalt ^' ige Abkömmlinge enthielten zusätzlich 10 ml Natriumcarbonat Puffer (1 molar-, pH 9,75) pro Liter Medium.

Nach 48 h wurden Proben aus den Kulturen entnommen, zentri- fugiert und die lipolytischen Aktivitäten in den Überstän¬ den, wie in Beispiel 8 beschrieben, bestimmt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse dieser Aktivitätsbestimmung.

Aktivität (U/ml)

Beispiel 6 Sequenzierung der Strukturgene für die Bacillus-Lipasen aus den Bacilli mit den DSM-Nummern 5776, 5777 und 5778

Plasmide mit den jeweiligen Lipasegen tragenden Inserts aus der DNA der Bacilli DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778 wurden jeweils mit diversen Restriktionsendonukleasen restringiert. Für jedes der drei Lipase-tragenden Inserts wurde so eine Gruppe von Fragmenten erhalten, aus welcher das jeweils kleinste, noch Lipaseaktivität aufweisende Fragment in an sich im Stand der Technik üblicher Weise mit Hilfe von Bacillus subtilis PSL 1 als Wirt subkloniert wurde. Die er¬ haltenen Plasmide enthielten hierbei jeweils Lipasegen-tr ^' a- gende Insert-Fragmente mit etwa folgender Größenordnung: bei Bacillus DSM 5776 ein etwa 1,45 KB großes DNA-Fragment; bei Bacillus DSM 5777 ein etwa 1,38 KB großes DNA-Fragment; bei Bacillus DSM 5778 ein etwa 1,09 KB großes DNA-Fragment:

Die oben erhaltenen Plasmide mit den Lipasegen-tragenden Fragmenten wurden für die nachfolgend beschriebene Sequen¬ zierung der Strukturgene verwendet. Hierzu wurden aus den jeweiligen Plasmiden durch Schneiden mit Restriktionsendo¬ nukleasen die Lipasegen-tragenden Fragmente herausgeschnit¬ ten und zur Herstellung von Einzelstrang-DNA in den Phage- iden pBS (+) oder pBS (-) eingebracht; die Phagemide pBS (+/-) wurden von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) bezogen. Die Nukleotidsequenzen der in den jeweils isolierten Einzel- strang-Phagemiden enthaltenen Lipasengene wurden nach an sich im Stand der Technik bekannten Methoden, z.B. nach der Dideoxy-Kettenterminator-Methode von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463) oder der Methode der basenspezifischen chemischen Spaltung des DNA-Einzelstran¬ ges nach Maxam et al. (1980, in Methods in Enzymology, Grossmann L., Modave K., eds., Academic Press Inc., New York und London, Vol. 65, 499) bestimmt. Die für das DNA-Fragment

_^_

aus Bacillus DSM 5776 ermittelte Nukleotidsequenz und die zugeordnete Aminosäurensequenz der Lipase ist in Fig. 1 wiedergegeben. Der Start für die Aminosäurensequenz der rei¬ fen Lipase wurde durch Aminosäurensequenzierung des N-termi- nalen Endes der Lipase bestimmt. Die DNA-Sequenzen und die angehörigen Aminosäurensequenzen für die Lipasegene aus Bacillus DSM 5777 und DSM 5778 wurden analog bestimmt.

Die Aminosäurensequenz der Lipase aus Bacillus DSM 5777 unterscheidet sich hierbei von der Aminosäurensequenz der Fig. 1 lediglich in Position 149, in der statt Ile die Aminosäure Val steht, und besitzt somit eine Homologie >99 % zur Aminosäurensequenz der Fig. 1.

Die Aminosäurensequenz der Lipase aus Bacillus DSM 5778 unterscheidet sich von der Aminosäurenseqsuenz der Fig. 1 lediglich in 7 Positionen wie folgt: in Postiton 20 steht statt Phe die Aminosäure Tyr; in den Positionen 27-28 stehen statt Ala-Thr die Aminosäuren Val-Gly; in Position 57 und 147 steht, statt Arg jeweils die Aminosäure Lys; in den Posi¬ tionen 149-150 stehen statt Ile-Leu die Aminosäuren Val-Gln. Die Aminosäurensequenz der Lipase aus Bacillus DSM 5778 besitzt somit eine Homologie >96 % zur Aminosäuren¬ sequenz der Fig. 1.

Beispiel 7 Isolierung und Reinigung des Plasmids pUBllO.

Aus dem Stamm Bacillus subtilis BD366 (Bacillus Genetic Stock Center 1 E 6) wurde nach der Methode von T.J. Gryczan et al. (1978, J.Bacteriol. 134:318-329) das Plasmid pUBllO isoliert und anschließend nach Maniatis et al. (S. 93) über Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Der Vektor pUBllO enthält eine nur einmal vorkommende Restrik¬ tionsstelle für die Restriktionsendonuklease BamHI und als Marker eine DNA-Sequenz, die für Antibiotikaresistenz gegen-

über Neomycin codiert, sowie für die Replikation in Bacil¬ lus-Spezies benötigte DNA-Sequenzen ("origin of replica- tion") .

Beispiel 8 Aktivitätsbestimmung von Bacillus-Lipasen.

Lipasen sind Triacylgl cerol-acyl-Hydrolasen der Klasse E.C.3.1. (Klasse nach Enzyme Commission) , die emulgierte Triglyceride langkettiger Fettsäuren hydroly- sieren. Ort der Lipasewirkung ist die Grenzfläche zwischen Oltröpfchen und der wäßrigen Phase. Hierdurch sind Lipasen eindeutig von Esterasen, die wasserlösliche Substrate um- ^■ setzen, unterscheidbar. Zwar können auch Lipasen wasser¬ lösliche Substrate spalten, der Einfluß der Grenzschicht¬ flächen emulgierter Triglyceride auf die Reaktion ist je¬ doch deutlich. Demzufolge wird die Substratkonzentration für Lipasen statt in mol/1 in m ² /l angegeben. Der Emul- gierungsgrad des Substrates sowie das reproduzierbare Her¬ stellen der Substratemulsion ist von ausschlaggebender Be¬ deutung für den Lipase-Aktivitätstest. Als Emulgatoren finden beispielsweise insbesondere Gummi arabicum, Poly- vinylalkohol oder Natriumdesoxycholat Verwendung.

Das Reaktionsprodukt der Hydrolyse, die freie Fett¬ säure, wird in der Regel titrimetrisch erfaßt. Aus der Fülle der bekannten titrimetrischen Methoden wurde hier eine direkte kontinuierliche Titration unter pH-Statbedin- gungen während der Reaktion durchgeführt. Bei der Durch¬ führung dieses kontinuierlichen titrimetrischen Tests ist zu beachten, daß beim Einsatz langkettiger Triglyceride als Substrat die apparente Protolysenkonstante pK _a lang¬ kettiger Triglyceride etwa bei pH - 9 liegt. Werden Messun¬ gen bei kleineren pH-Werten durchgeführt, so wird nur ein geringer Teil des gebildeten Produkts titrimetrisch er¬ faßt. Der apparente pK _a -Wert kann durch Zugabe von Na¬ triumchlorid beeinflußt werden.

Beschreibung des Aktivitätstests:

- Substratemulsion: Triolein 10 g; Gummi arabicum 10 g; aqua bidest. 100 ml. Die Emulsion wurde mit einem Labormixer 15 min. bei hoher Drehzahl emul- giert.

- Puffer: Natriumchlorid 100 mM; Calciumchlorid-di- hydrat 20 mM.

- Lauge: Natronlauge 10 mM.

- Temperatur: 30 °C.

- pH-Statapparat: bestehend aus pH-Meter, Steuergerät, Dosierpumpe und Aufzeichnungsgerät für den Laugen¬ verbrauch.

Durchführung:

20 ml der Pufferlösung und 10 ml der Substratemulsion wurden zusammengegeben, auf 30 °C erwärmt und der pH-Wert dieses Gemisches auf 9,5 eingestellt. Anschließend wurden 0,2 bis 0,5 ml der Probe bzw. der Blindwertlösung (Zu¬ sammensetzung wie die Probe, aber ohne aktive Lipase; Probe vor der Aktivitätsbestimmung thermisch inaktiviert) hinzugegeben und der pH-Wert durch Titration mit Natron¬ lauge konstant bei 9,5 gehalten. Der Laugenverbrauch wurde über die gesamte Versuchsdauer durch ein AufZeichnungsge- rät protokolliert. Eine Unit (U) Lipaseaktivität bewirkt unter den angegebenen Bedingungen die Freisetzung von 1 μmol Fettsäure pro Minute.

Beispiel 9 Bestimmung der Enzymcharakteristika von Bacillus-Lipasen.

Zur Bestimmung der Enzymcharakteristika wie Tempera¬ tur-Optimum, Temperatur-Stabilität, pH-Optimum und pH-Sta¬ bilität wurden die im Beispiel 5 durch Kultivierung von Bacilli erhaltenen Kulturüberstände für 30 Minuten bei 100.000-facher Erdbeschleunigung zentrifugiert, um im

Kulturüberstand vorhandene Zellen der Bacilli abzuschei¬ den. Die durch Zentrifugation erhaltene, klare überstehende Lösung wurde für die nachfolgenden, unter A) bis D) be¬ schriebenen Messungen eingesetzt.

A) Das Temperatur-Optimum der in den Kulturüberständen enthaltenen Lipasen wurde mit Hilfe des in Beispiel 8 beschriebenen Aktivitätstest bestimmt. Dazu wurde die Temperatur im Bereich von 20 bis 50 °C variiert. Die Er¬ gebnisse sind in Tabelle 3 sowie in den Figuren 2, 3 bzw. 4 dargestellt.

Das Temperatur-Optimum der Lipase aus Bacillus DSM 5776 liegt bei 30 °C (Fig. 2) .

Das Temperatur-Optimum der Lipase aus Bacillus. ^' . ^" DSM 5777 liegt bei etwa 40 °C (Fig. 3) .

Das Temperatur-Optimum der Lipase aus Bacillus DSM 5778 liegt bei 30 °C (Fig. 4) .

Tabelle 3

alkalische Lipase Lipaseaktivität in % in Abhängigkeit aus Bacillus

DSM 5776 3 DSM 5777 9 DSM 5778 2

B) Zur Bestimmung der Temperatur-Stabilität wurden die Lipase-haltigen Überstände für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen inkubiert und anschließend die Restaktivität nach der in Beispiel 8 angegebenen Methode zur Aktivitätsbe¬ stimmung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 so¬ wie in den Figuren 5, 6 und 7 dargestellt.

-31-

Die Lipase aus Bacillus DSM 5776 ist bis 40 °C stabil und zeigt nach 30 minütiger Inkubation bei 50 °C noch eine Restaktivität von 16,1 % (Fig. 5) .

Es zeigte sich, daß die Lipase aus Bacillus DSM 5777 bis 40 °C stabil ist und bei 50 °C noch eine Restaktivität von 21,3 % besitzt (Fig. 6) .

Die Lipase aus Bacillus DSM 5778 ist bis 40 °C stabil und zeigt nach 30 minütiger Inkubation bei 50 °C noch eine

Restaktivität von 22,5 % (Fig. 7) .

Tabelle 4

C) Zur Bestimmung der pH-Optima der Bacillus-Lipasen wurde die in Beispiel 8 angegebene Aktivitätsbestimmung bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Aufgrund der bei pH-Werten < 9 schwierigen Erfassung des Produktes der enzymatischen Umsetzung, wurde hier allerdings nicht kon¬ tinuierlich, sondern erst nach Ablauf der Reaktionszeit auf pH = 9,5 titriert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 sowie in den Figuren 8, 9 und 10 dargestellt.

Das pH-Optimum der alkalischen Lipase aus Bacillus

DSM 5776 liegt bei pH = 9,5. Bei pH = 10 ist die Aktivität noch > 90 % (Fig. 8) .

Das pH-Optimum der alkalischen Lipase aus Bacillus DSM 5777 liegt bei etwa pH = 10 (Fig. 10) .

Das pH-Optimum der alkalischen Lipase aus Bacillus

DSM 5778 liegt bei pH = 9, aber auch bei pH = 10 sind noch etwa 80 % der maximalen Aktivität vorhanden (Fig. 10) .

Tabelle 5

alkalische Lipase Lipaseaktivität in % in Abhängigkeit aus Bacillus vom pH-Wert 5 I 6 | 7 |7,8 | 8 | 9 | 9,5 I 10 10,5

DSM 5776 53 65 76 95 100 95 55 DSM 5777 30 56,8 76 88 92,2 99,8 100 78 DSM 5778 25 53 73 88 100 93,5 80 40

D) Zur Untersuchung der pH-Stabilität wurden die 'Lipasen für 21 h in Puffern verschiedenen pH-Wertes bei 4 °C .inkubiert. ^• Anschließend wurde die Restaktivität der Lipase'n, wie. unter Beispiel 8 beschrieben, bestimmt. Für den pH-Bereich von 5 bis 7 wurde Phosphat-Puffer, für den pH-Bereich von 7 bis 9 Tris-HCl-Puffer (= Tris (hydroxymethyl) aminomethan-Puffer) und für den pH-Bereich von 9 bis 12,8 Glycin/Natriumhydro- xid-Puffer verwendet. Die Ergebnisse sind in den Figuren 11, 12 und 13 dargestellt.

Das Enzym aus Bacillus DSM 5776 ist im pH-Bereich von 5 bis 11 völlig stabil und nach 21-stündiger Inkubation bei pH = 12 ist noch eine Restaktivität von 22 % Vorhanden (Fig. 11) •

Die Lipase aus Bacillus DSM 5777 ist im pH-Bereich von 6 bis 11 stabil (Fig. 12) .

Die Lipase aus Bacillus DSM 5778 ist im pH-Bereich von 6,5 bis 11,5 völlig stabil (Fig. 13) .

Beispiel 10 Waschversuche

Die Waschwirksamkeit der Bacillus-Lipasen aus den Bacilli DSM 5776, DSM 5777 und DSM 5778 wurde ^' bei niedrigen Wasch¬ temperaturen in einer Standardwaschmittelzusammensetzung durch Waschversuche untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Bacillus-Lipasen auch bei niedrigen Waschtemperaturen, bei denen übliche Waschmittel kaum Öl- bzw. Fettverschmutzungen von der Wäsche entfernen, hervor¬ ragend für den Einsatz in Waschmitteln geeignet sind.

A) Testgewebe

Die Eignung von Enzymen für den Einsatz in Wachmitteln wird im allgemeinen durch Waschtests geprüft. -Dafür sind spe¬ zielle Testgewebe käuflich erhältlich, z.B. von der Eidge¬ nössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt in St. Gallen (Schweiz), EMPA. Die von EMPA vertriebenen Gewebe sind jedoch in erster Linie für den Test von Waschmittelpro- teasen gedacht. Für den Test von Waschmittellipasen müssen daher speziell präparierte Testgewebe eigens hergestellt werden, z.B. indem das Testgewebe teilweise mit Öl oder mit einer Mischung aus Pigmenten, Proteinen und Öl beschmutzt wird oder auch das ganze Testgewebe mit Öl, -beispielsweise Olivenöl, imprägniert wird.

Für die nachfolgenden Waschversuche wurde Baumwollgewebe in Olivenöl (extra vergine) getränkt und dann von überschüssi¬ gem Öl befreit. Anschließend wurde das Gewebe bei 30 °C ge¬ trocknet. Um das Altern der Ölverschmutzungen zu inhibieren wurde das derart erhaltene, mit Öl verschmutzte Gewebe unter eine Stickstoffatmosphäre bei 4 °C bis zum Gebrauch aufbe¬ wahrt.

B) Durchführung der Waschversuche

Zur Durchführung der Waschtests wurden die unter A) dieses Beispiels hergestellten Testgewebe in Stücke geeigneter Größe, z.B. 5 cm x 5 cm, zerschnitten. Diese Testläppchen wurden in einer Linitest-Waschmaschine mit je 100 ml Wasch¬ lauge aus Perborat-haltige IEC-Testwaschmittel (Konzentra¬ tion 6 g/1) der nachfolgenden Zusammensetzung bei einer Temperatur von 40 °C für 30 Minuten gewaschen.

Zusammensetzung des Perborat-haltigen IEC-Testwaschmittels, Type 1 (Lever Sunlicht GmbH, Mannheim) : 6,4 Gew.-% lineare Alkylsulfonate, 2,3 Gew.-% Ethoxylierte Fettalkohole mit 14 % Ethoxygruppen, 2,8 Gew.-% Natriumseife, 35. Gew.-% Na- triumtripolyphosphat, 6 Gew.-% Natriumsilikat, 1,5 Gew.-% Magnesiumsilikat, 1 Gew.-% Carboxymethylcellulose, 0,2 Gew.-% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) , 0,2 Gew.-% optische Aufheller (Stilbentyp), 16,8 Gew.-% Natriumsulfat und 7,8 Gew.-% Wasser, als sprühgetrocknetes Pulver ohne Bleichaktivator sowie mit 20 Gew.-% Natriumperborat-Tetra¬ hydrat.

Es wurde in Wasser mit 15 °dH (Grad deutscher Härte) ge¬ waschen. Anschließend wurde das Gewebe einem Spülvorgang mit Leitungswasser unterworfen. Es wurden jeweils 5 sol¬ cher Waschzyklen durchgeführt. Nach Beendigung des ge¬ samten Waschvorganges wurden die Testläppchen erneut mit Leitungswasser gespült, getrocknet und anschließend das noch anhaftende Restöl mit Chloroform extrahiert. Das auf dieses Weise gewonnene Restöl wurde gravimetrisch bestimmt. Durch dieses Methode lassen sich Unterschiede zwischen den Lipasen, d.h. ob diese nicht, nur mäßig oder gut für die Anwendung in Waschmitteln geeignet sind, hervorragend er¬ mitteln. Zu einem Teil der Waschlaugen wurde zusätzlich eine alkalische Waschmittelprotease zugegeben, um so gleichzeitig die Waschwirksamkeit und die Stabilität der Bacillus-Lipasen in Gegenwart der Protease aufzuzeigen. Die Aktivität der eingesetzten Protease in der Waschlauge betrug jeweils

5 DU/ml (DU = Delft Units) . Die jeweils eingesetzte Lipase¬ aktivität in der Waschlauge ist nachfolgend im Zusammenhang mit den Ergebnissen angegeben.

Waschversuche mit der alkalischen Bacillus-Lipase aus Bacillus DSM 5776 mit einer Lipase-Konzentration in der Waschlauge von 60 U/ml (siehe auch Fig. 14) :

Waschlauge Restöl in Gew.-% IEC-Testwaschmittel (Kontrolle) 100

IEC-Testwaschmittel + Lipase 54,5

IEC-Testwaschmittel + Lipase + alka¬ lische Protease 57,0

Waschversuche mit der alkalischen Bacillus-Lipase aus Bacillus DSM 5777 mit einer Lipase-Konzentration in der Waschlauge von 45 U/ml (siehe auch Fig. 15) :

Waschlauge Restöl in Gew.-% IEC-Testwaschmittel (Kontrolle) 100

IEC-Testwaschmittel + Lipase 44,9

IEC-Testwaschmittel + Lipase + alka¬ lische Protease 50,0

Waschversuche mit der alkalischen Bacillus-Lipase aus Bacillus DSM 5778 mit einer Lipase-Konzentration in der Waschlauge von 55 U/ml (siehe auch Fig. 16) :

Waschlauge Restöl in Gew.-%

IEC-Testwaschmittel (Kontrolle) 100

IEC-Testwaschmittel + Lipase 54,5

IEC-Testwaschmittel + Lipase + alka¬ lische Protease 57,0

Die Ergebnisse zeigen die hervorragende Eignung der erfin¬ dungsgemäßen Bacillus-Lipasen für den Einsatz in Waschmit¬ teln. Die erfindungsgemäßen Lipasen senken den Restölgehalt gegenüber der Kontrolle erheblich und werden auch in Anwe-

senheit einer alkalischen Waschmittelprotease in ihrer Waschwirksamkeit nicht negativ beeinflußt.

Beispiel 11 Stabilität der Bacillus-Lipasen in Waschlauge mit und ohne Zusatz von alkalischer Waschmittelprotease.

Zum Nachweis der Stabilität der erfindungsgemäßen Lipasen in Waschlauge mit und ohne Zusatz von alkalischen Waschmittel- proteasen wurden Waschversuche wie in Beispiel 10 durchge¬ führt. Zu Beginn des Waschprozesses (t = 0) und zum Ende des Waschprozesses (t = 30 min) wurde die Aktivität der Lipase analog zu der im Beispiel 8 angegebenen Methode bestimmt. Die relative Restaktivität der Lipasen nach Abschluß des Waschprozesses, bezogen auf die zum Zeitpunkt t = 0 einge¬ setzte Anfangsaktivität der Lipasen, wird nachfolgend ange¬ geben.

Waschlauge relative Restaktivität in %

Lipase aus Bacillus DSM 5776 50,5

Lipase aus Bacillus DSM 5776

+ alkalische Protease 47, 0

Lipase aus Bacillus DSM 5777 69,4

Lipase aus Bacillus DSM 5777

+ alkalische Protease 65,5

Lipase aus Bacillus DSM 5778 49,9

Lipase aus Bacillus DSM 5778

+ alkalische Protease 42,3

Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen alkalischen Bacillus-Lipasen in Waschlaugen, auch in Gegenwart von Pro- teasen, sehr gute Stabilitäten besitzen. Die erfindungsge¬ mäßen Lipasen eignen sich daher sehr gut für die Verwendung in Waschmittelzusammensetzungen, insbesondere auch in Prote- ase-haltigen Waschmittelzusammensetzungen.