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Title:
ANDROGRAPHOLIDE DERIVATIVE FOR USE IN THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES ASSOCIATED WITH A CYTOKINE STORM
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2022/090605
Kind Code:
A1
Abstract:
AG5 andrographolide derivative for use in the treatment of the inflammatory reaction caused by a cytokine storm, particularly produced by CoViD-19, bacteria with superantigens or by CAR-T, TIL or BiTE cell therapies.

Inventors:
RIVERO BUCETA EVA MARÍA (ES)
BOTELLA ASUNCIÓN PABLO (ES)
VIDAURRE AGUT CARLA (ES)
BENLLOCH BAVIERA JOSE MARÍA (ES)
NOVOA GARCÍA BEATRIZ (ES)
FIGUERAS HUERTA ANTONIO (ES)
GONZÁLEZ ASEGUINOLAZA GLORIA (ES)
SMERDOU PICAZO CRISTIAN (ES)
PINEDA LUCENA ANTONIO A (ES)
PRÓSPER CARDOSO FELIPE LUIS (ES)
ARGEMÍ BALLBÉ JOSEPMARÍA (ES)
Application Number:
PCT/ES2021/070786
Publication Date:
May 05, 2022
Filing Date:
October 29, 2021
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION (ES)
UNIV VALENCIA POLITECNICA (ES)
UNIV NAVARRA (ES)
FUNDACION PARA LA INVESTIG MEDICA APLICADA (ES)
International Classes:
A61K31/365; A61K36/19; A61P29/00; A61P31/14
Foreign References:
CN101371832A2009-02-25
Other References:
CAI WENTAO; CHEN SUNRUI; LI YONGTAO; ZHANG ANDING; ZHOU HONGBO; CHEN HUANCHUN; JIN MEILIN: "14-Deoxy-11,12-didehydroandrographolide attenuates excessive inflammatory responses and protects mice lethally challenged with highly pathogenic A(H5N1) influenza viruses", ANTIVIRAL RESEARCH, ELSEVIER BV, NL, vol. 133, 28 July 2016 (2016-07-28), NL , pages 95 - 105, XP029727969, ISSN: 0166-3542, DOI: 10.1016/j.antiviral.2016.07.020
PARICHATIKANOND, W. ; SUTHISISANG, C. ; DHEPAKSON, P. ; HERUNSALEE, A.: "Study of anti-inflammatory activities of the pure compounds from Andrographis paniculata (burm.f.) Nees and their effects on gene expression", INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 10, no. 11, 1 November 2010 (2010-11-01), NL , pages 1361 - 1373, XP027430059, ISSN: 1567-5769, DOI: 10.1016/j.intimp.2010.08.002
LIU WEN; FAN TING; LI MANRU; ZHANG GUOHUI; GUO WENJIE; YANG XIAOLING; JIANG CHUNHONG; LI XIANG; XU XIANGYU; TANG ANSHU; LIU KEQIN;: "Andrographolide potentiates PD-1 blockade immunotherapy by inhibiting COX2-mediated PGE2 release", INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 81, 1 February 2020 (2020-02-01), NL , XP086095251, ISSN: 1567-5769, DOI: 10.1016/j.intimp.2020.106206
REHAN MOHD, AHMED FIROZ, HOWLADAR SAAD M., REFAI MOHAMMED Y., BAEISSA HANADI M., ZUGHAIBI TORKI A., KEDWA KHALID MOHAMMED, JAMAL M: "A Computational Approach Identified Andrographolide as a Potential Drug for Suppressing COVID-19-Induced Cytokine Storm", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 11, 24 June 2021 (2021-06-24), XP055938757, DOI: 10.3389/fimmu.2021.648250
D. ZHANG ET AL.: "The clinical benefits of Chinese patent medicines against CoViD-19 based on current evidence", PHARM. RES., vol. 157, 2020, pages 104882, XP086154227, DOI: 10.1016/j.phrs.2020.104882
Q. LI ET AL.: "Xiyanping plus azithromycin chemotherapy in pediatric patients with mycoplasma pneumoniae pneumonia: a systematic review and meta-analysis of efficacy and safety", EVID.-BASED COMPL. ALT., vol. 2019, 2019, pages 2346583
Q.W. YANG ET AL.: "Crystal structure and anti-inflammatory and anaphylactic effects of andrographlide sulphonate E in Xiyanping, a traditional Chinese medicine injection", J. PHARM. PHARMACOL, vol. 71, no. 2, 2019, pages 251 - 259
N. CAI ET AL.: "Theoretical basis and effect characteristics of andrographolide against CoViD-19", CHIN. TRADIT. HERB. DRUGS, vol. 51, no. 5, 2020, pages 1159 - 1166
W. GUO ET AL.: "Water-soluble andrographolide sulfonate exerts anti-sepsis action in mice through down-regulating p38 MAPK, STAT3 and NF- B pathways", INT. IMMUNOPHARMACOL., vol. 14, no. 4, 2012, pages 613 - 619
S. ALAGU LAKSHMI ET AL.: "Ethnomedicines of Indian origin for combating CoViD-19 infection by hampering the viral replication: using structure-based drug discovery approach", J. BIOMOL. STRUCT. DYN., 2020
ENMOZHI ET AL.: "Andrographolide as a potential inhibitor of SARS-CoV-2 main protease: an in silico approach", J. BIOMOL. STRUCT. DYN., 2020
N.A. MURUGAN ET AL.: "Computational investigation on Andrographis paniculata phytochemicals to evaluate their potency against SARS-CoV-2 in comparison to known antiviral compounds in drug trials", J. BIOMOL. STRUCT. DYN., 2020
K.F. AZIM ET AL.: "Screening and druggability analysis of some plant metabolites against SARS-CoV-2: An integrative computational approach", INFORMATICS IN MEDICINE UNLOCKED, vol. 20, 2020, pages 100367, XP055975549, DOI: 10.1016/j.imu.2020.100367
P. CHEN ET AL., ESTABLISHMENT AND VALIDATION OF A DRUG-TARGET MICROARRAY FOR SARS-COV-2, DOI: 10.1080/07391102.2020.1777901
A. BANERJEE ET AL.: "Crosstalk between endoplasmic reticulum stress and anti-viral activities: A novel therapeutic target for CoViD-19", LIFE SCIENCES, vol. 255, 2020, pages 117842, XP086182022, DOI: 10.1016/j.lfs.2020.117842
VARELA ET AL., J. VIROL., vol. 88, 2016, pages 12026
AMES ET AL., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, vol. 70, 1973, pages 783
Attorney, Agent or Firm:
PONS ARIÑO, Ángel (ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. El compuesto AG5:

AG5 para su uso en el tratamiento de una patología en la que se produce una reacción inflamatoria asociada a una tormenta de citoquinas.

2. El compuesto AG5 para el uso según la reivindicación 1 , donde la tormenta de citoquinas está causada por infección vírica, infección bacteriana o inmunoterapia.

3. El compuesto AG5 para el uso según la reivindicación 2, donde la infección vírica es CoViD-19.

4. El compuesto AG5 para el uso según la reivindicación 2, donde la infección bacteriana es por bacterias con superantígenos.

5. El compuesto AG5 para el uso según la reivindicación 2, donde la inmunoterapia se lleva a cabo por células CAR-T, por iinfocitos infiltrantes tumorales (TIL) o por anticuerpos biespecíficos (BiTE).

6. El compuesto AG5 para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se puede administrar por vía parenteral o por vía oral.

7. El compuesto AG5 para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto de fórmula I se administra a una concentración de entre 0,0001 mg/(kg h) y 10 mg/(kg h) durante un tiempo de entre 1 h a 2000 h.

Description:
DESCRIPCIÓN

Derivado de andrografólido para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias asociadas a una tormenta de citoquinas

La presente invención se refiere a un derivado de andrografólido (AG5) para su uso en el tratamiento de la reacción inflamatoria causada por una tormenta de citoquinas, particularmente producida por CoViD-19, bacterias con superantígenos o por terapias de células CAR-T, TIL o BiTE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rápida expansión de la pandemia mundial CoViD-19 ha supuesto una grave amenaza para los sistemas de salud de todos los países debido a su alta tasa de hospitalización y mortalidad. Un porcentaje importante de los enfermos de CoViD-19 fallecen a causa de la tormenta de citoquinas, generada por una respuesta inflamatoria exagerada del organismo humano, frente a una infección sobre la que no posee inmunidad previa. Por otro lado, muchos de los pacientes que sobreviven a la enfermedad después de su estancia de mayor o menor duración en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), quedan con secuelas pulmonares graves debido a la tormenta de citoquinas.

La industria farmacéutica ha desarrollado varios anticuerpos monoclonales dirigidos a inhibir citoquinas inflamatorias. Así, Tocilizumab (Roche), Sarilumab (Sanofi), Siltuximab (Eusa Pharma) son inhibidores de lnterleucina-6 (IL-6); Anakinra (Amgen) es un inhibidor de lnterleucina-1 (IL-1 ) y Canakinumab (Novartis) es un inhibidor de I L-1 β. La I L-1 beta I L-1 β controla el inflamasoma y, por lo tanto, su inhibición resulta importante en el manejo de la inflamación.

Por otro lado, la industria farmacéutica ha desarrollado además fármacos capaces de inhibir vías moleculares intracelulares que tienen también un efecto en el control de la inflamación. Así, por ejemplo, Baricitinib (Olumiant) es un inhibidor de la vía JAK1/JAK2.

Muchos de los compuestos anteriores se han utilizado en ensayos clínicos durante la pandemia CoViD-19 para intentar reducir la respuesta inflamatoria frente al virus SARS- CoV-2. Sin embargo, dichos fármacos adolecen de varias limitaciones en la práctica: muchas veces los anticuerpos monoclonales presentan una toxicidad elevada que se refleja en la aparición de efectos secundarios importantes: inhiben solamente un componente de la inflamación sin abordar la tormenta de citoquinas en conjunto; se dirigen exclusivamente a inhibir la respuesta inflamatoria en lugar de modularla.

Desde hace siglos en el Ayurveda (medicina tradicional de la India) se utiliza el principio activo andrografólido, presente en la planta de origen en India Andrographis paniculata, para el tratamiento de enfermedades respiratorias agudas.

La industria farmacéutica china ha desarrollado en el pasado un fármaco inyectable denominado Xiyanping. Aunque en el artículo D. Zhang et ai., The clinical benefits of Chinese patent medicines against CoViD~19 based on current evidence, Pharm. Res. 157 (2020) 104882, se menciona que dicho fármaco consiste principalmente en sulfonato de andrografólido, aunque en realidad se trata de un preparado semisintético que contiene una mezcla de dos derivados de andrografólido, 9-dehidro-17-hidro- andrografólido, y 9-dehidro-17-hidro- andrografólido -19-il sulfato, derivados estructurales del andrografólido diferentes a los presentados en esta invención.

El Xiyanping también se ha utilizado como alternativa eficaz a los antibióticos en la práctica clínica (Q. Li, et ai., Xiyanping plus azithromycin chemotherapy in pediatric patients with mycoplasma pneumoniae pneumonia: a systematic review and metaanalysis of efficacy and safety, Evid. -Based Compl. Alt. 2019 (2019) 2346583).

El Xiyanping también resulta eficaz como antipirético y antiinflamatorio (Q.W. Yang, et al., Crystal structure and anti-inflammatory and anaphylactic effects of andrographlide sulphonate E in Xiyanping, a traditional Chinese medicine injection, J. Pharm. Pharmacol. 71 (2) (2019) 251-259).

Igualmente, el Xiyanping mejora los síntomas respiratorios, inhibe las infecciones bacterianas oportunistas, y regula la función inmune, con menor riesgo clínico, especialmente mediante cierta protección hepática, sugiriendo que puede aliviar el daño producido en el hígado por ciertos fármacos durante el tratamiento del CoVÍD-19 en casos agudos (N. Cai, et al., Theoretical basis and effect characteristics of andrographolide against CoViD-19, Chin. Tradit. Herb. Drugs 51 (5) (2020) 1159-1166). Además, se ha reportado la actividad del Xiyanping sobre la mejora en casos de sepsis en ratones mediante la supresión de las vías de señalización MAPK, STAT3 and NF~kB, que juegan un papel importante en las enfermedades pulmonares (W. Guo, etal., Water- soluble andrographolide sulfonate exerts anti-sepsis action in mice through down- regulating p38 MAPK, STAT3 and NF~kB pathways, Int. Immunopharmacol. 14 (4) (2012) 613-619).

Por otro lado, se ha estudiado la posibilidad de utilizar el andrografólido y otros compuestos fitoquímicos naturalmente presentes en Andrographis paniculata como antivirales mediante métodos computacionales. Así, muy recientemente se ha explorado la interacción del andrografólido mediante modelización computational del acoplamiento molecular (docking) con componentes específicos del SARS-CoV-2 para el tratamiento del síndrome respiratorio agudo asociado a la CoViD-19. En este contexto, S. Alagu Lakshmi etal., Ethnomedicines of Indian origin for combating CoViD- 19 infection by hampering the viral replication: using structure-based drug discovery approach. J. Biomol. Struct. Dyn. (2020), doi: 10.1080/07391102.2020.1778537) indican la afinidad del bis-andrografólido por la proteasa principal 3CLpro del SARS-CoV-2, Io que potencialmente le permitiría inhibir esta enzima.

La afinidad andrografólido-proteasa principal 3CLpro del SARS-CoV-2 es igualmente descrita por S.K. Enmozhi etal., Andrographolide as a potential inhibitor of SARS-CoV- 2 main protease: an in silico approach, J. Biomol. Struct. Dyn. (2020), doi: 10. 1080/07391102.2020. 1760136) .

Por su parte, D. Sivaraman and P.S. Pradeep, Scope of phytotherapeutics in targeting ACE2 mediated host-viral interface of SARS-CoV2 that causes CoViD-19, doi: 10.26434/chemrxiv.12089730. v1) describen el bloqueo del receptor celular ACE2 por andrografólido.

Asimismo, usando métodos computacionales de docking y de dinámica molecular, se ha valorado la utilización del andrografólido y tres derivados estructurales (14-deoxi- 11 ,12-didehidro andrografólido, neoandrografólido y 14-deoxi andrografólido) frente a cuatro dianas del virus SARS-CoV-2, incluyendo tres proteínas no estructurales (proteasa principal 3CLpro, PLpro y polimerasa RNA dirigida a RNA RdRp) y una proteína estructural (spike protein (S)), que son responsables de la replicación, el mejor inhibidor (N.A. Murugan et al., Computational investigation on Andrographis paniculate phytochemicals to evaluate their potency against SARS-CoV-2 in comparison to known antiviral compounds in drug trials, J. Biomol. Struct. Dyn. (2020), doi: 10.1080/07391102.2020.1777901).

Finalmente, en un estudio por docking sobre 27 metabolites de origen vegetal, analizando el acoplamiento de los mismos con diversas dianas del virus (proteasa principal, proteína Nsp9, dominio del receptor spike, ectodominio del receptor spike y dominio HR2), no se seleccionó al andrografólido como significativo frente al SARS- CoV-2 comparado con otros compuestos (K.F. Azim et al., Screening and druggability analysis of some plant metabolites against SARS-CoV-2: An integrative computational approach, Informatics in Medicine Unlocked 20 (2020) 100367).

Además, se ha testado el andrografólido como antiviral en un dispositivo microarray que contenían algunos de las proteínas principales del virus SARS-CoV-2, obteniendo resultados positivos (P. Chen et ai., Establishment and validation of a drug-target microarray for SARS-CoV-2, doi: 10.1080/07391102.2020.1777901).

Por otro lado, se ha sugerido la utilización del andrografólido en combinación con melatonina como tratamiento potencialmente eficaz contra CoV¡D-19. (A. Banerjee et al., Crosstalk between endoplasmic reticulum stress and anti-viral activities: A novel therapeutic target for CoViD-19, Life Sciences 255 (2020) 117842)

Por todo ello, resulta crítico desarrollar nuevos fármacos que controlen la respuesta inflamatoria en todas sus vertientes, que presenten una baja toxicidad y que además tenga una alta biodisponibilidad en el tracto respiratorio.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere al compuesto AG5:

AG5, para su uso en el tratamiento de una patología en la que se produce una reacción inflamatoria asociada a una tormenta de citoquinas.

La presente invención también se refiere a las sales y los solvatos de compuesto AG5.

El compuesto AG5 posee centros quirales, los cuales pueden dar lugar a diversos estereoisómeros. La presente invención se refiere a cada uno de los estereoisómeros individuales, así como a sus mezclas.

A lo largo de la descripción, el término “tormenta de citoquinas” se refiere a la liberación masiva de sustancias mediadoras de la inflamación, especialmente citoquinas, como consecuencia de una disrupción en el sistema inmune producida por una infección o por inmunoterapia. Esta tormenta de citoquinas puede estar causada, entre otros, por una infección vírica, como la enfermedad CoViD-19, una infección bacteriana, particularmente por bacterias con superantígenos tales como Staphylococcus aureus y Strepcoccus pyogenes, o por inmunoterapia, como inmunoterapia por células CAR-T empleada en tratamientos de cáncer, inmunoterapia por linfocitos tumorales (TIL) o por anticuerpos biespecíficos (BiTE). Así, ejemplos de manifestaciones clínicas consecuencia de la tormenta de citoquinas incluyen, entre otros, el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y el síndrome de disfunción multiorgánica, que conllevan, entre otros síntomas, shock, fiebre, erupciones, descamación de palmas y plantas, hipotensión, diarrea, vómitos, mialgia severa, disfunción renal, problemas hepáticos, insuficiencia respiratoria, hemorragia incontrolada y desorientación.

Otro aspecto de la invención se refiere al compuesto AG5 para el uso definido anteriormente, donde la tormenta de citoquinas está causada por infección vírica, En otra realización la invención se refiere al compuesto AG5 para el uso definido anteriormente, donde la infección vírica es CoViD-19.

En otra realización la invención se refiere al compuesto AG5 para el uso definido anteriormente, donde la infección bacteriana es por bacterias con superantígenos, y preferiblemente donde la infección bacteriana es por Staphylococcus aureus y Strepcoccus pyogenes.

En otra realización la invención se refiere al compuesto AG5 para el uso definido anteriormente, donde la inmunoterapia se lleva a cabo por células CAR-T, por linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) o por anticuerpos biespecíficos (BiTE), y preferiblemente donde la inmunoterapia se lleva a cabo por células CAR-T.

En otra realización la invención se refiere al compuesto AG5 para el uso definido anteriormente, caracterizado porque se puede administrar por vía parenteral o por vía oral.

En otra realización la invención se refiere al compuesto AG5 para el uso definido anteriormente, caracterizado porque se administra a una concentración de entre 0,0001 mg/(kg h) y 10 mg/(kg h) durante un tiempo de entre 1 h a 2000 h, y preferiblemente a una concentración de entre 0,01 mg/(Kg h) y 0,25 mg/(Kg h) durante un tiempo de entre 24 h y 480 h.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1 muestra la actividad antiinflamatoria del andrografólido (AG1), el extracto original de Andrographis paniculata (EAp), y sus derivados estructurales (tratamiento por inflamatoria en larvas de Danio rerio tras la infección por microinyección de SVCV (simultánea a la administración de fármacos), respecto de los grupos control que no recibieron tratamiento. Ctr MEM: control que recibió una inyección de MEM. Ctr: control que recibió una inyección de SVCV. *=diferencias estadísticas con respecto al grupo control infectado, hpi: horas post inyección.

FIG. 2 muestra micrografías de fluorescencia de larvas transgénicas de Danio rerio (LYZ:Red) que presentan neutrófilos fluorescentes tras infección por microinyección de SVCV y tratamiento simultáneo con andrografólido (AG1), el extracto original de Andrographis panicu/ata (EAp) y sus derivados estructurales. Ctr MEM: control que recibió una inyección de MEM. SVCV: control que recibió una inyección de SVCV.

FIG. 3 muestra la actividad antiinflamatoria del andrografólido (AG1), el extracto original de Andrographis paniculata (EAp) y sus derivados estructurales (tratamiento por baño) medida en función del recuento de neutrófilos migrantes ante un estímulo inflamatorio agudo (corte de cola) en larvas de Danio rerio, con respecto a un grupo control que no recibió tratamiento. *=díferencias estadísticas con respecto al grupo control.

FIG. 4 muestra la actividad antiinflamatoria del andrografólido (AG1), el extracto original de Andrographis paniculata (EAp) y sus derivados estructurales (tratamiento en baño) medida en función de la expresión génica de citoquína I L-6 en larvas de Danio rerío tras la infección por microinyección de SVCV, respecto del grupo control. Ctr MEM: control que recibió una inyección de MEM. Ctr: control que recibió una inyección de SVCV. *=diferencias estadísticas con respecto al grupo control infectado.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad y ausencia de toxicidad del producto de la invención.

EJEMPLO 1 : Obtención de andrografólido (3-[2-[decahidro-6-hidroxi-5-(hidroxi-metil)- 5,8a-dimetil-2-metileno- 1 -naftalenil]etilideno]dihidro-4-hidroxi-2(3H)-furanona) a partir del extracto de Andrographis paniculata

Se suspende 5 g del extracto crudo de A. paniculata en 50 mi de agua Milli-Q® en un y se deja decantar durante 1 hora. Se separa la fase orgánica y se repite el proceso dos veces, descartando las fracciones de n-hexano. A continuación, se añade 500 mi de cloroformo. La mezcla se agita vigorosamente y se deja decantar durante 1 hora. Se separa la fase orgánica cuidadosamente y se repite el proceso dos veces, juntando todas las fracciones de cloroformo. El disolvente se elimina bajo presión reducida y el aceite obtenido se diluye con 200 mi de metanol. Esta disolución se calienta hasta ebullición, se filtra y se introduce en baño de hielo durante 1 h. A continuación, la disolución fría se guarda en nevera a 4 °C hasta evaporación casi completa del disolvente. Los cristales incoloros de andrografólido se lavan con metanol frió y se secan a temperatura ambiente. Se obtiene un rendimiento del 3% en andrografólido (compuesto AG1) de pureza superior al 99%.

1 H NMR (400 MHz, DMSO) 6,62 (t, J = 6,4 Hz, 1 H); 5,67 (d, J = 5,7 Hz, 1 H); 5,01 (s, 1 H); 4,91 (s, 1 H), 4,81 (s, 1H); 4,62 (s, 1 H); 4,39 (dd, J = 8,7, 6,4 Hz, 1 H); 4,11 (d, J=6,5 Hz, 1 H); 4,03 (d, J= 9,9 Hz, 1 H); 3,85 (d, J= 10,6 Hz, 1 H); 3,28 - 3,14 (m, 2H); 2,45 (s, 1 H); 2,32 (d, J= 12,6 Hz, 1 H); 2,03 - 1 ,82 (m, 2H); 1 ,70 (dd, J = 29,9, 14,3 Hz, 4H); 1 ,35 (dd, J = 23,1, 12,7 Hz, 1 H); 1 ,20 (d, J = 11 8 Hz, 2H), 1 ,09 (s, 3H); 0,66 (s, 3H).

13 C NMR (75 MHz, DMSO) 5 169,89; 147,57; 146,22; 128,95; 108,18; 78,43; 74,27; 64,50; 62,61 ; 55,47; 54,37; 42,26; 38,56; 37,48; 36,50; 27,87; 23,93; 23,03; 14,71. HR-MS (ESI, m/z) [M+H] + calculada para C 20 H 29 O 5 351 ,4628; encontrada 351 ,4633.

EJEMPLO 2: Síntesis de 14-deox¡-12(R)-sulfo-andrografólido

1 ,0 g de andrografólido (AG1 , 2,9 mmol) se disuelven en 15 ml de etanol al 95%, calentando dicha disolución a 50 °C (disolución 1). A 4 ml de disolución de Na 2 SO 3 1M, se añaden 4,8 ml de H 2 SO 4 al 2% (M/M) y 8 mi de agua (disolución 2). La disolución 1 se añade sobre la disolución 2 y la mezcla de reacción se mantiene en agitación a reflujo durante 30 minutos. Una vez completada la reacción, se ajusta el pH de la reacción a pH 6 -7 añadiendo disolución de ácido sulfúrico ( H 2 SO 4 ) al 2% y se evapora el disolvente a sequedad. El residuo se disuelve en agua (20 ml) y se extrae con cloroformo (20 mi x 3). Se evapora el disolvente de la fase orgánica bajo presión reducida. El residuo de la fase acuosa se disuelve en metanol (10 ml) y se filtra. En la fracción que contiene el producto se evapora el disolvente a presión reducida y se obtienen 0,6 g del compuesto AG5 (51 %). ! H-RMN (600 MHz, CD 3 OD) 7,65 ppm (t, J= 1,8 Hz, 1H); 4,95 (o, 2H); 4,87 (o, 2H); 4,66 (s a , 1H); 4,16 (dd, J=10,2 y 6,1 Hz, 1H); 4,05 (d, 11,4 Hz, 1H); 3,92 (dd, 12,2 y

1,8 Hz, 1H); 3,30 (t, J= 9,8 Hz, 1H); 3,27 (d, J= 11,4 Hz, 1H); 2,36 (m, H); 2,31 (dd, J =12,6 y 11,4 Hz, 1H); 2,08 (t, J = 12,6 Hz, 1H); 1,86 (m, H); 1,83 (m, H); 1,80 (m, H); 1,71 (m, 2H); 1,38 (d a , J= 11,8 Hz, 1H); 1,28 (qd, J =12,6 y 4,2 Hz, 1H); 1,12 (s, 3H); 1,10 (dd, J=12,6y2,4 Hz, 1H); 1,02 (m, H); 0,68 (s, 3H);

13 C-RMN (150 MHz, CD3OD) 177,2; 152,1; 149,1; 132,5; 109,2; 81,7; 73,3; 65,8; 57,2; 56,8; 55,3; 44,5; 40,8; 40,1; 38,9; 29,8; 28,0; 26,1; 24,2; 16,4.

HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- calculada para C 20 H 29 O 7 S, 413,1639; encontrada 413,1634.

EJEMPLO 3: Validación de la actividad antiinflamatoria del andrografólido y sus derivados en larvas de pez cebra (Danio rerio)

Los estudios de actividad antiinflamatoria de los compuestos se realizaron en peces de la línea salvaje (wild type), determinando los niveles de expresión de las citoquinas proinflamatorias IL-1β e IL-6. También se emplearon larvas transgénicas con neutrófilos fluorescentes (Tg(Mpx:GFP)i114) o células mieloides fluorescentes (Tg(LYZ:Red)) marcadas para evaluar cómo afectan los distintos tratamientos a la respuesta inflamatoria de estas células. El estímulo inflamatorio empleado fue tanto el propio virus que produce una activación del inflamasoma y muerte de macrófagos por piroptosis (Varela et al. J. Virol. 2016, 88, 12026), como un estímulo agudo de inflamación generado por una herida en la cola. La migración de los leucocitos fluorescentes de estas líneas transgénicas se estudió mediante microscopía y análisis de imagen En un primer ensayo se cuantificó la respuesta celular a la inflamación en larvas transgénicas de Danio rerío (LYZ:Red) después de una infección con SVCV tratadas o no (control) con los compuestos AG1 (28 μM), AG3 (10 μM), AG4 (10 μM), AG5 (10 μM) y EAp (10 μg/ml). Los tratamientos se realizaron mediante micro-inyección (2 nl en ducto de Cuvier) de los fármacos sobre peces de 3 días post fertilización (5-10 peces/pocillo) administrándose de forma simultánea el virus y los distintos compuestos. El experimento se llevó a cabo analizando las células de cada pez de forma individual empleando 8 réplicas por tratamiento (n = 8). A las 2 h post inyección (2 hpi) se determinó el número de células implicadas en la respuesta inflamatoria. En la Figura 1 se observa que los compuestos AG1 , AG3, AG4 y AGS reducen significativamente la respuesta inflamatoria celular inducida por la infección viral con respecto a los grupos control. En la Figura 2 se muestran imágenes representativas de peces con cada uno de los tratamientos.

En un segundo ensayo, se analizó el efecto de los distintos compuestos en una respuesta inflamatoria aguda producida por una herida. Para ello, se emplearon peces transgénicos con neutrófilos fluorescentes (Tg(Mpx:GFP)i114) en los que se analizó su migración a la zona afectada. Los compuestos AG1 (5 μM), AG3 (5 μM), AG4 (10 μM), AG5 (10 μM) y EAp (10 μg/ml) se administraron por baño y a las 24 horas se realizó la herida mediante el corte de la zona final de la cola. A las 24 horas, se realizó un recuento de los neutrófilos que migraron a la zona de la herida. Se observó que los compuestos AG4 y AG5 disminuían de forma significativa la respuesta inflamatoria generada por la migración de los neutrófilos a la herida contribuyendo a la resolución de la inflamación. Figura 3.

En un tercer y último ensayo, se determinó la expresión génica de cítoquinas proinflamatorias en larvas de Danio rerío (wild type) tratadas con los compuestos AG1 (5 μM), AG3 (5 μM), AG4 (10 μM), AG5 (10 μM) y EAp (10 μg/ml), y posteriormente infectadas con SVCV. Los tratamientos se realizaron en baño durante 24 h sobre peces de 1 día post fertilización (10 peces/pocillo). El experimento se llevó a cabo por cuadruplicado (n = 4). Al segundo día post fertilización se inyectó a cada pez (2 ni en ducto de Cuvier) 5x10 4 TCID50/ml de SVCV. A las 24 h se determinó la expresión de IL- 6 mediante qPCR. Los resultados obtenidos en la Figura 4 indican que los compuestos AG4 y AG5 reducen significativamente la producción de I L-6 en la infección por SVCV con respecto a los grupos control no tratados EJEMPLO 4: Validación de la ausencia de toxicidad del AG-5 en un estudio a dosis repetida en rata Wistar

Como parte de la evaluación preclínica de la toxicidad, el propósito de este estudio fue definir la dosis máxima repetida (DMR) de AG-5, formulado como solución en PBS (3 mg/ml), en una especie de mamífero roedor bajo buenas prácticas de laboratorio (BPL) y proporcionar datos de interés toxicológico. Para ello se diseñó un estudio en dos fases: i) en la Fase I se administró vía intravenosa el producto a dosis única y siguiendo la directriz OCDE 425 (OECD Guidelines for the testing of chemicals. Guidelines 425: Acute oral toxicity: up and down procedure. Adopted 3 October 2008), a un total de 12 ratas Wistar hembra de 8 semanas de edad, mediante un proceso de incremento de dosis (factor incremental 3,2), se determinó provisionalmente la dosis máxima tolerada (DMT); ii) en la Fase II, los animales (total de 30 ratas Wistarde 8 semanas de edad, 15 machos y 15 hembras) fueron administrados vía intravenosa diariamente durante 7 días y se confirmó la DMR.

La dosis inicial a utilizar en la Fase I se seleccionó de entre la sucesión de dosis incluida en la directriz OECD 425 -5,5; 17,5 y 30 mg/kg de peso corporal-. Las dosis a ensayar en la Fase II fueron determinadas en base a los resultados obtenidos en la Fase I, seleccionando 3 dosis del intervalo de dosis inferior a aquella en la que se hubieran observado efectos tóxicos graves -15, 20 y 30 mg/kg/día-, siendo 30 mg/kg la dosis máxima factible (DMF), en aplicación de la directriz ICH M3(R2) (JCH Harmonised Tripartite Guideline. Non- Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals M3 (R2). Current Step 5 version dated 11 June 2009). En el estudio se consideraron fundamentales la valoración completa de la sintomatología -intensidad, tiempo de aparición y reversibilidad-, el estudio de parámetros analíticos (hematológicos y bioquímicos) y la determinación del peso de órganos diana de toxicidad.

Las conclusiones de este estudio son las siguientes:

» En relación a la administración intravenosa de AG-5 en PBS (3 mg/ml) a dosis única:

1.- No produjo letalidad en ninguno de los animales, por lo que la DL 50 estimada en rata es superior a 30 mg/kg de peso corporal. Esta dosis debe ser considerada 2 - Ninguna de las dosis ensayadas en la Fase I comprometió la vida del animal, ni produjo signos de toxicidad relacionados con la administración de AG-5. A tenor de estos resultados, se consideró la dosis de 30 mg/kg como dosis de referencia para la realización de la Fase II.

° En relación a la administración intravenosa de AG-5 en PBS (3 mg/ml) a dosis repetidas -7 días-:

3.- La administración diaria, durante 7 días, a dosis de 15, 20 y 30 mg/kg, por vía intravenosa en rata no produjo mortalidad ni alteraciones en la sintomatología general. No se observaron cambios con relevancia toxicológica en los parámetros analíticos ni alteraciones macroscópicas en órganos abdominales y torácicos ni en el peso absoluto o relativo de los órganos.

4.- A la vista de estos resultados, se identifica la dosis de 30 mg/kg como la DMR en esta especie animal.

EJEMPLO 5: Validación de la ausencia de toxicidad del AG-5 en un estudio a dosis repetida en conejo New Zealand

Como parte de la evaluación preclínica de la toxicidad, el propósito de este estudio fue definir la DMR de AG-5 formulado como solución en PBS (3 mg/ml), en una especie de mamífero no roedora -conejo™, bajo BPL y proporcionar datos de interés toxicológico.

Para ello se diseñó un estudio en dos fases: i) en la Fase I se administró vía intravenosa el producto a dosis única y siguiendo la directriz OCDE 425, a un total de 4 conejos New Zealand (2 machos y 2 hembra), de aproximadamente 2,5 kg y 12-13 semanas de edad, y se determinó provisionalmente el rango de la dosis máxima tolerada (DMT); ii) en la Fase II, los animales (total de 4 conejos New Zealand de aproximadamente 2,5 kg y 12-13 semanas de edad) fueron administrados vía intravenosa diariamente durante 7 días y se confirmó la DMR que servirá de referencia (dosis más alta a utilizar).

La dosis inicial a utilizar en la Fase I se seleccionó atendiendo a los datos obtenidos por el laboratorio tras la administración de AG-5 en rata a dosis repetida de hasta 30 mg/kg, posteriores estudios de toxicidad general. Por ello, se seleccionó la dosis de 15 mg/kg; coincidente con: i) la extrapolación a conejo de los 30 mg/kg ensayados en rata, en aplicación del factor de área de superficie corporal; y, ¡i) la DMF, en base a la solubilidad del producto en PBS (3 mg/mL), y al volumen máximo de administración en conejo (0,5 mL/100 g de peso corporal). La dosis a ensayar en la Fase II fue determinada en base a los resultados obtenidos en la Fase I, seleccionando una dosis del intervalo de dosis inferior a aquella en la que se hubieran observado efectos tóxicos graves, con un máximo de 15 mg/kg/día como DFM, en aplicación de la directriz ICH M3(R2). En el estudio se consideraron fundamentales la valoración completa de la sintomatología -intensidad, tiempo de aparición y reversibilidad-, el estudio de parámetros analíticos (hematológicos y bioquímicos) y la determinación del peso de órganos diana de toxicidad.

Las conclusiones de este estudio son las siguientes:

° En relación a la administración intravenosa de AG-5 en PBS (3 mg/ml) a dosis única:

1.- No produjo letalidad en ninguno de los animales, por lo que la DL 50 estimada en conejo es superior a 15 mg/kg de peso corporal. Esta dosis debe ser considerada como el nivel de DMT en conejo a dosis única.

2 - No se observaron signos de toxicidad asociados. En consecuencia, y atendiendo a su condición de dosis máxima posible según solubilidad, se consideró la dosis de 15 mg/kg/día como dosis de referencia para la realización de la Fase II..

° En relación a la administración intravenosa de AG-5 en PBS (3 mg/ml) a dosis repetidas -7 días-:

3.- La administración diaria, durante 7 días a dosis de 15 mg/kg, por vía intravenosa en conejo no produjo mortalidad ni alteraciones en la sintomatología general. No se observaron cambios con relevancia toxicológica en los parámetros analíticos ni alteraciones macroscópicas en órganos abdominales y torácicos ni en el peso absoluto o relativo de los órganos.

4.- A la vista de estos resultados, se identifica la dosis de 15 mg/kg como la DMR en esta especie animal. EJEMPLO 6: Validación de la ausencia de genotoxicidad del AG-5 mediante el test de Ames

El objetivo del estudio ha sido caracterizar el posible efecto genotóxico del producto de ensayo AG-5 mediante test de Ames (Ames et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1973, 70, 783). Para ello, se determinó en un estudio llevado a cabo en BPL si el AG-5 posee la capacidad de producir mutaciones génicas, bien por sustitución o por desfase, en bacterias Salmonella typhimurium auxotrofas para la histidina (His-).

El estudio fue realizado con las estirpes TA98, TA100, TA102, TA1535 y TA1537 en presencia y en ausencia de activación metabólica (mezcla de S9). Se ensayaron las dosis recomendadas por la guía OECD: 100 mg/ml -equivalente a 5000 pg/placa- y otras 5 concentraciones inferiores (33,3; 11 ,1 ; 3,7 y 1 ,2 mg/ml). No se observó precipitación del producto ni toxicidad. A la vista de estos resultados, el test de mutagenicidad se realizó partiendo de la dosis máxima recomendada para productos solubles y no tóxicos (100 mg/mL, correspondiente a 5000 pg/placa) y 4 dosis inferiores en diluciones 1/3. Los resultados han sido negativos en las 5 estirpes bacterianas (TA98, TA100, TA102, TA1535 y TA1537) tanto en presencia como en ausencia de activación metabólica.

La conclusión del estudio es que el producto de ensayo AG-5 no ha inducido mutaciones génicas en las condiciones de este ensayo ni en presencia ni en ausencia de activación metabólica.