La présente invention s’inscrit dans le domaine du traitement des infections bactériennes, notamment des infections du type causées par les bactéries de l’espèce Pseudomonas aeruginosa.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou un fragment fonctionnel de cet anticorps. L’invention concerne également une molécule d’acide nucléique codant pour cet anticorps ou fragment d’anticorps, un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique et une cellule hôte comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou un tel vecteur d’expression. L’invention concerne également un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, ainsi que l’utilisation de cet anticorps ou fragment d’anticorps en tant que médicament, notamment pour le traitement préventif ou curatif des infections à Pseudomonas aeruginosa. L’invention concerne en outre une composition pharmaceutique contenant un tel anticorps ou fragment d’anticorps. L’invention concerne également l’utilisation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention pour la détection de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu, et un kit pour une telle détection, contenant un tel anticorps ou fragment d’anticorps.

La prévention et le traitement des infections nosocomiales constituent une préoccupation majeure dans le domaine hospitalier. L’incidence de ces infections est en augmentation constante, notamment car les pathogènes responsables de ces infections sont de plus en plus résistants aux antibiotiques.

La bactérie Pseudomonas aeruginosa en particulier représente une des causes majeures des infections nosocomiales, ainsi que des pneumonies, à l’hôpital. On estime que Pseudomonas aeruginosa est responsable de 10 % des maladies nosocomiales. Le nombre de personnes atteintes par ce pathogène est très important, et le taux de mortalité associé est élevé chez les personnes dont les défenses immunitaires sont altérées. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste, qui est notamment impliquée dans les infections aigues et chroniques chez les patients ventilés artificiellement ainsi que ceux atteints de mucoviscidose, et qui est responsable de septicémies chez les patients immunocompromis, parmi lesquels les transplantés et les grands brûlés.

Les souches de Pseudomonas aeruginosa responsables des infections nosocomiales sont caractérisées par une résistance intrinsèque à un large éventail d’antibiotiques et aux traitements antibiotiques classiques. L’élimination de la bactérie est rendue difficile à cause de cette résistance aux antibiotiques ainsi que de sa capacité de former un biofilm dans les poumons des malades.

Toutefois, malgré la large diffusion de ce pathogène et le nombre croissant de souches résistantes aux antibiotiques, aucun traitement efficace contre les infections à Pseudomonas aeruginosa n’a à ce jour été rendu disponible par l’industrie pharmaceutique.

Différentes approches thérapeutiques ont été envisagées par l’art antérieur pour développer un tel traitement.

Un certain nombre de protéines immunogéniques ont été identifiées chez Pseudomonas aeruginosa, grâce aux récentes études sur les mécanismes de virulence de la bactérie (Chevalier et al., 2017, FEMS, 41 : 698-722). Ces études ont permis de mettre en évidence que ces immunogènes sont principalement localisés dans certains compartiments structuraux tels que les flagelles, les pili, les lipopolysaccharides, les protéines de la membrane externe, ou font partie de produits sécrétés tels que les exopolysaccharides mucoïdes, l’exotoxine A et les protéases. Parmi les protéines de la membrane externe, les porines OprF et Oprl ont fait l’objet de travaux importants (Chevalier et al., 2017, FEMS, 41 : 698-722). Des protéines hybrides contenant des épitopes connus de ces protéines ont été produites par fusion et testées en modèle animal (Weimer et al., 2009, Infect. Immun., 77(6): 2356-2366).

Une autre approche thérapeutique envisagée par l’art antérieur repose sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre des cibles moléculaires conservées dans toutes les souches de Pseudomonas aeruginosa. Trois anticorps sont ainsi à l’étude à l’heure actuelle : un anti-PcrV qui cible le système de sécrétion de type III (Shionogi et al., 2016, Hum Vaccin Immunother. 12(1 1 ): 2833-2846), un anticorps anti-LPS permettant de tuer la bactérie et de recruter les effecteurs du système immunitaire inné, et un anticorps bispécifique ciblant les protéines PcrV et Psi.

Toutefois, si plusieurs approches thérapeutiques sont actuellement en cours de développement et de tests, de nouvelles solutions pour le traitement des infections à Pseudomonas aeruginosa doivent encore émerger afin de répondre au problème de santé publique important que constituent les infections par Pseudomonas aeruginosa.

La présente invention vise ainsi à proposer un actif thérapeutique permettant de lutter efficacement contre les infections bactériennes, en particulier les infections à Pseudomonas aeruginosa, qui remédie aux problèmes liés à la résistance de Pseudomonas aeruginosa aux antibiotiques et à l’absence de thérapies efficaces contre cet agent infectieux responsable d’infections nosocomiales et cause principale de mortalité des patients atteints de mucoviscidose.

A cet effet, les présents inventeurs ont recherché à développer de nouveaux actifs de type anticorps anti-infectieux, et ils se sont plus particulièrement intéressés pour cela, en tant que cible moléculaire, à la protéine membranaire OprF, également nommée porine OprF. La protéine OprF est une protéine de 38 kDa à pore conducteur de large diamètre, très abondante, impliquée dans un grand nombre de fonctions variées et qui est hautement conservée dans toutes les souches de Pseudomonas aeruginosa (No d’accession Genbank : AFM37279.1 ). Son rôle important dans la virulence de Pseudomonas aeruginosa, décrit par l’art antérieur, en fait une cible potentielle pour des thérapies anti-infectieuses.

Des anticorps dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ont été proposés par l’art antérieur, illustré en particulier par les documents WO 2016/033547, Moon et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 1988, 29: 1277-1284, et Rawling et al., 1995, Infection and Immunity, 63: 38- 42. Ces anticorps sont cependant obtenus à partir de l’inoculation, soit de fragments solubles de la protéine OprF, soit de la protéine OprF entière solubilisée au moyen d’un détergent, c’est-à-dire se trouvant sous une forme ne correspondant pas à la conformation native de la protéine telle qu’adoptée au sein de la membrane bactérienne. Ces anticorps ne peuvent par conséquent pas reconnaître les épitopes conformationnels exposés naturellement par la protéine au sein de la bactérie.

Les présents inventeurs ont découvert que des anticorps particuliers, ou des parties de ces anticorps, dirigés contre l’antigène membranaire OprF, possèdent une activité biologique de neutralisation de la protéine OprF particulièrement forte, et ce pour l’ensemble de ses épitopes linéaires et conformationnels natifs, et possèdent de ce fait une grande efficacité thérapeutique contre les infections bactériennes par Pseudomonas aeruginosa. Cherchant à produire des anticorps se liant spécifiquement à la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa, les présents inventeurs ont développé un procédé innovant, qui a mené à la découverte d’anticorps présentant une affinité particulièrement forte pour la protéine sous sa forme membranaire native.

Ce procédé consiste, schématiquement, à produire des anticorps à partir de banques immunes produites chez le primate à partir de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. Il est également applicable à d’autres antigènes que la porine OprF de Pseudomonas aeruginosa

Plus particulièrement, le procédé de préparation d’anticorps, ou de fragments fonctionnels d’anticorps, selon l’invention comprend une étape de production de protéoliposomes dans lesquels la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa se trouve dans sa forme native et active, exposant les épitopes conformationnels. Cette étape peut être réalisée par mise en contact d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa et d’un liposome synthétique, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire pour former un milieu réactionnel, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine. La protéine s’insère alors dans la bicouche lipidique du liposome synthétique pour former un protéoliposome. Une telle étape est notamment décrite dans la publication de Maccarini et al., Langmuir 2017, 33, 9988-9996. La bicouche lipidique du liposome mimant la membrane de Pseudomonas aeruginosa, la protéine OprF s’y trouve dans une orientation adéquate pour présenter une conformation native et une conformation à canal ouvert. Plus particulièrement, au sein des protéoliposomes, la protéine OprF se trouve avantageusement sous ses deux formes, ouverte et fermée, qui sont naturellement présentes au sein de la membrane bactérienne ou dans les vésicules relarguées par la bactérie pour contrecarrer la réponse immunitaire. En particulier, l’analyse des protéoliposomes réalisée par les inventeurs a démontré que la protéine OprF : s’y trouve dans la bonne orientation au sein de la membrane liposomale ; y est présente dans ses deux topologies membranaires, ouverte et fermée, caractérisées par 8 et 16 passages transmembranaires respectivement ; y forme des pores / canaux au sein de la membrane liposomale ; s’y trouve sous forme oligomérisée.

Le procédé développé par les inventeurs comprend ensuite une étape d’immunisation d’un mammifère non humain, de préférence d’un macaque ( Macaca fascicularis), avec ces protéoliposomes, puis la fabrication d’une banque d’anticorps, et en particulier d’une banque de fragments scFv, à partir d’échantillons de moelle osseuse du sujet immunisé.

Le criblage par une technique d’expression, notamment par expression phagique (pour l’anglais « phage display »), de cette banque de scFv a permis aux inventeurs d’identifier plus de 1 1 séquences associées à des clones positifs, dont les régions de détermination de la complémentarité ont été déterminées. Il a ainsi été découvert par les présents inventeurs que les anticorps dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa présentant des séquences spécifiques pour les trois régions de détermination de la complémentarité de chacune des régions variables de chaîne lourde et de chaîne légère présentent une affinité et une spécificité particulièrement importantes pour les épitopes natifs de cette protéine, faisant d’eux des principes actifs de choix pour le traitement thérapeutique des infections à Pseudomonas aeruginosa, et ce d’autant plus que leur caractère primatisé les rend particulièrement bien tolérés chez l’humain. On entend dans la présente description, par le terme traitement, aussi bien le traitement curatif que le traitement préventif. On ne préjugera pas ici des phénomènes sous-tendant l’obtention d’un tel résultat avantageux. On peut cependant penser, comme exposé ci-avant, qu’il provient au moins en partie de la combinaison de la technique de l’expression de la protéine OprF dans les protéoliposomes et de l’utilisation de ces protéoliposomes réaliser une immunisation chez le macaque. Rien dans l’art antérieur ne laissait présager qu’une telle combinaison pouvait conduire à l’identification de régions d’anticorps responsables d’une liaison spécifique avec une très forte affinité de ces anticorps avec la porine membranaire OprF de Pseudomonas aeruginosa, et plus particulièrement ses épitopes linéaires et conformationnels natifs.

Ainsi, selon un aspect de la présente invention, il est proposé un anticorps monoclonal dirigé contre, c’est-à-dire se liant spécifiquement à, la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou un fragment fonctionnel de cet anticorps. Cet anticorps ou fragment fonctionnel comprend :

- une région variable de chaîne lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VH-CDR1 : GYXaa _! FXaa ₂ Xaa ₃ Xaa ₄ G (SEQ ID NO : 1 ) dans laquelle Xaa _! représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2 représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3 représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa ₄ représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,

VFI-CDR2 : INAXaasTGKXaa ₆ (SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaas représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa ₆ représente un résidu alanine ou un résidu sérine,

VH-CDR3 : VR,

- et une région variable de chaîne légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VL-CDR1 : SSVXaa ₇ TXaa ₈ Xaa ₉ (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa ₇ représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa ₈ représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaag représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,

VL-CDR2 : Xaa- _|0 TS dans laquelle Xaa-i ₀ représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,

VL-CDR3 : QQGXaanXaai2Xaai3 (SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa-n représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa- _|2 représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa-i ₃ représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.

Un anticorps, au sens de la présente invention, désigne de manière conventionnelle en elle-même une glycoprotéine composée de deux types de chaînes glycopolypeptidiques, appelées chaîne lourde et chaîne légère, un anticorps étant constitué de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères, liées par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée d’une région variable et d’une région constante. Les régions variables de chaîne lourde VH et de chaîne légère VL possèdent chacune trois zones hypervariables, dites régions de détermination de la complémentarité (CDR). On entend ainsi dans la présente, par « région de détermination de la complémentarité », de manière classique en elle-même, chacune des trois régions hypervariables des régions variables des chaînes lourdes et légères d’un anticorps, qui constituent les éléments du paratope et permettent de déterminer la complémentarité de l’anticorps avec l’épitope de l’antigène. Ces trois régions hypervariables sont encadrées par quatre régions constantes qui constituent la charpente (régions FR) et donnent une configuration stable au domaine variable. Les CDR d’un anticorps sont définies, à partir de la séquence d’acides aminés des chaînes lourdes et légères de l’anticorps, selon des critères bien connus de l’homme du métier. Les CDR des anticorps selon l’invention sont plus particulièrement déterminées selon la nomenclature IMGT. On entend en outre, par fragment fonctionnel de l’anticorps, tout fragment de l’anticorps conservant la capacité de liaison à l’antigène et ayant de ce fait la même affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa que l’anticorps d’origine. De tels fragments peuvent notamment être des fragments Fv, scFv, Fab, Fab’, F(ab‘)2, des nanobodies, etc. Les fragments d’anticorps selon la présente invention peuvent également comprendre des séquences peptidiques n’appartenant pas à l’anticorps d’origine, correspondant par exemple à des peptides de liaison entre des parties de l’anticorps, telles que des parties de chaîne lourde et de chaîne légère, ou encore à des étiquettes peptidiques, par exemple C-terminales, permettant par exemple leur purification, leur détection, etc., telles qu’une étiquette polyhistidine et une étiquette c-myc, bien connues de l’homme du métier.

On englobe également dans l’expression « fragment d’anticorps » les formes multivalentes de fragments d’anticorps, notamment les formes bi-, tri- ou tétravalente de deux, trois ou quatre fragments, notamment de scFv, telles que les diabodies, triabodies et tétrabodies.

L’anticorps monoclonal selon l’invention peut être du type bispécifique, ou plus généralement présenter toute forme multivalente.

Les fragments variables à chaîne unique (scFv), protéines de fusion entre la région variable de la chaîne lourde VH et la région variable de la chaîne légère VL, sont particulièrement préférés dans le cadre de l’invention. Ces fragments scFv peuvent notamment comprendre, entre ces régions variables, un peptide de liaison reliant la région variable de chaîne lourde et la région variable de chaîne légère. Ce peptide de liaison peut être tout peptide classique en lui- même dans le domaine des scFv. Il comprend de préférence au moins 5 acides aminés, et préférentiellement entre 5 et 20 acides aminés environ. Il peut par exemple présenter la séquence GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 1 1 ). D’autres exemples de peptides de liaison pouvant être mis en oeuvre selon l’invention sont décrits dans la publication de Chen et al., 2013, Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369 (en particulier dans le tableau 3).

Le peptide de liaison peut connecter l’extrémité N-terminale de la région variable de chaîne lourde et l’extrémité C-terminale de la région variable de chaîne légère. Préférentiellement, il connecte l’extrémité N-terminale de la région variable de chaîne légère et l’extrémité C-terminale de la région variable de chaîne lourde.

Les fragments scFv peuvent être produits à partir de l’ADN complémentaire (ADNc) codant pour la région variable de la chaîne lourde VH et de l’ADNc codant pour la région variable de la chaîne légère VL, par exemple obtenus à partir d’un hybridome, d’une bactérie, d’un système acellulaire ou de tout autre système de production de protéines recombinantes produisant l’anticorps selon l’invention, selon les techniques d’expression de protéines conventionnelles. Plus généralement, les anticorps ou fragments d’anticorps selon l’invention peuvent être produits par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, ou être isolés par purification à partir d’une source naturelle, notamment d’un hybridome.

Les anticorps ou fragments d’anticorps répondant à la définition de l’invention présentent une affinité élevée pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. La constante de dissociation de la liaison de ces anticorps ou fragments d’anticorps avec l’antigène peut notamment être de l’ordre de 200 nM. Ces anticorps ont en outre un fort pouvoir neutralisant vis-à-vis de la bactérie in cellulo.

Par souci de simplification, on désignera dans la présente description l’anticorps monoclonal selon l’invention par le terme « anticorps », et le fragment fonctionnel de cet anticorps par l’expression « fragment d’anticorps » ou « fragment de cet anticorps ».

Au sens de la présente invention, une séquence ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec une séquence de référence est une séquence présentant une ou plusieurs variations par rapport à cette séquence de référence, tout en assurant à l’anticorps ou au fragment d’anticorps une affinité pour l’antigène, comme pour la séquence de référence. Ces variations peuvent être des délétions, des substitutions et/ou des insertions d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence.

Le pourcentage d’identité correspond au pourcentage d’acides aminés identiques entre les séquences comparées, obtenu après alignement optimal des deux séquences. L’alignement optimal des séquences peut être réalisée de toute manière classique en elle-même pour l’homme du métier, par exemple en utilisant le logiciel BLAST. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles l’acide aminé est identique entre les deux séquences, et en le divisant par le nombre total de positions dans la séquence, le résultat étant multiplié par 100.

Lorsque la séquence du CDR d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention présente un pourcentage d’identité inférieur à 100 % par rapport à une des séquences listées ci-avant, en particulier par rapport à une des séquences SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 ou SEQ ID NO : 4, elle peut présenter des insertions, délétions et/ou substitutions par rapport à cette séquence de référence. Lorsqu’il s’agit d’une substitution, la substitution est de préférence réalisée par un acide aminé de la même famille que l’acide aminé d’origine, par exemple d’un résidu basique tel que l’arginine par un autre résidu basique comme un résidu lysine, d’un résidu acide tel que l’aspartate par un autre résidu acide comme le glutamate, d’un résidu polaire comme la sérine par un autre résidu polaire comme la thréonine, d’un résidu aliphatique comme la leucine par un autre résidu aliphatique comme l’isoleucine, etc.

Préférentiellement, l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention répond à l’une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :

- Xaai représente un résidu thréonine,

- Xaa3 représente un résidu arginine,

- Xaas représente un résidu acide glutamique,

- Xaa ₆ représente un résidu alanine,

- et/ou Xaa-i3 représente un résidu valine.

De préférence, l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention est tel que dans la séquence SEQ ID NO : 1 , correspondant au CDR de la chaîne lourde VH-CDR1 , Xaa ₃ représente un résidu arginine et dans la séquence SEQ ID NO : 2, correspondant au CDR de la chaîne lourde VH-CDR2, Xaa ₆ représente un résidu alanine.

L’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention est en outre de préférence tel que dans la séquence SEQ ID NO : 1 , correspondant au CDR de la chaîne lourde VH-CDR1 , Xaai représente un résidu thréonine, dans la séquence SEQ ID NO : 2, correspondant au CDR de la chaîne lourde VH- CDR2, Xaas représente un résidu acide glutamique et dans la séquence SEQ ID NO : 4, correspondant au CDR de la chaîne légère VL-CDR3, Xaa-i ₃ représente un résidu valine.

Des séquences particulièrement préférées selon l’invention sont les séquences suivantes :

- pour VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5), GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6), GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7), GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8), GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) ou GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) ;

- pour VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12), INADTGKS

(SEQ ID NO : 13), INADTGKA (SEQ ID NO : 14) ou INAETGKS (SEQ ID NO : 15) ;

- pour VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17), SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVSTNY (SEQ ID NO : 19), SSVATGF (SEQ ID NO : 20), SSVSTSY (SEQ ID NO : 21 ), SSVRTGY (SEQ ID NO : 22) ou SSVSTGY (SEQ ID NO : 23) ;

- pour VL-CDR2 : GTS ou RTS ;

- pour VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24), QQGHTI (SEQ ID NO : 25), QQGNTI (SEQ ID NO : 26) ou QQGHSI (SEQ ID NO : 27).

Des anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :

- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5)

VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12)

VH-CDR3 : VR

- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)

VL-CDR2 : GTS

VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24).

D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :

- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VH-CDR1 : GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6)

VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13)

VH-CDR3 : VR

- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VL-CDR1 : SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) VL-CDR2 : GTS

VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).

D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que : - les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VH-CDR1 : GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) ou GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13) ou INADTGKA (SEQ ID NO : 14) VH-CDR3 : VR

- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaîne légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :

VL-CDR1 : SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)

VL-CDR2 : GTS

VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).

Des anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention présentent des CDR de séquences indiquées dans le tableau 1 ci-après, la séquence du VH-CDR3 étant VR :

Tableau 1

D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention présentent des CDR de séquences indiquées dans le tableau 2 ci-après, la séquence du VH-CDR3 étant VR :

Tableau 2 Un anticorps ou un fragment d’anticorps particulier selon l’invention comprend une paire de séquences choisie parmi les paires de séquences suivantes : SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31 , SEQ ID NO : 32 et SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO : 41 , SEQ ID NO : 42 et SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO : 49, ou une paire de séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec l’une de ces paires de séquences. On entend par là toute paire de séquences dans laquelle chacune des séquences présente au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec respectivement une des séquences d’une paire de séquences parmi les paires de séquences listées ci- avant.

Les séquences d’une paire de séquences peuvent être liées directement l’une à l’autre, en particulier par une liaison peptidique, ou être liées l’une à l’autre par une séquence d’un peptide de liaison.

Un fragment d’anticorps particulier selon l’invention, notamment un fragment scFv, comprend, et est de préférence constitué de, une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51 , SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 60, ou une séquence ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec l’une de ces séquences.

En particulier, le peptide de liaison de séquence (G4S)3 (SEQ ID NO : 1 1 ) figurant dans ces séquences peut être remplacé par tout autre peptide de liaison. De préférence, la région variable de chaîne lourde et la région variable de chaîne légère de l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention proviennent du macaque ( Macaca fascicularis). Il peut en être de même de la région constante de chaîne lourde et/ou de la région constante de chaîne légère. Le macaque présente notamment l’avantage d’une très grande homologie des séquences génétiques avec l’homme. Autrement, l’une ou plusieurs de ces régions peut provenir d’un animal transgénique.

Préférentiellement, l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention ne présente pas la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 73. Il ne comprend notamment pas une région variable de chaîne légère présentant la séquence SEQ ID NO : 74, ou encore un CDR de région variable de chaîne légère présentant la séquence SEQ ID NO : 75, c’est-à-dire un CDR de région variable de chaîne légère de séquence SSVXaa ₇ TXaa ₈ Xaa9 (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa ₇ , Xaa ₈ et Xaag sont comme définis précédemment, mais Xaa ₇ et Xaa ₈ ne représentent pas, simultanément, un résidu asparagine pour Xaa ₇ et un résidu sérine pour Xaa ₈ .

L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être un anticorps ou fragment d’anticorps recombinant comprenant le paratope d’un anticorps produit par un hybridome, notamment de macaque, et dont les régions constantes ont été modifiées de sorte à minimiser l’immunogénicité vis-à-vis de l’humain. Par exemple, il s’agit d’un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique ou d’un anticorps ou fragment d’anticorps humanisé.

Un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique désigne ici, de manière classique en elle-même, un anticorps ou fragment d’anticorps qui contient une région variable naturelle dérivée d’un anticorps d’une espèce donnée, en association avec les régions constantes d’un anticorps d’une espèce hétérologue à cette espèce. De tels anticorps peuvent par exemple être préparés par recombinaison génétique.

L’anticorps ou fragment d’anticorps chimérique selon l’invention est préférentiellement tel que la région constante de chaîne lourde et/ou la région constante de chaîne légère, lorsqu’il en comporte, sont d’origine humaine, les régions variables étant quant à elles de préférence dérivées du macaque.

Un anticorps ou fragment d’anticorps humanisé comprend des CDR issus d’un anticorps de mammifère non humain, de préférence, selon la présente invention, de macaque, et des régions charpente FR et C dérivées d’anticorps humain.

Il entre dans les compétences de l’homme du métier de déterminer quelles modifications peuvent être apportées à un anticorps donné pour l’humaniser. A titre d’exemple, cette humanisation peut être réalisée par fusion avec une région constante de chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 61 (lgG1 humain, allotype G1 m1 ,17).

Entrent également dans le cadre de la présente invention des anticorps ou fragments d’anticorps modifiés, tout en conservant leur affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa, par exemple pour optimiser certaines de leurs fonctions effectrices. Les modifications peuvent être réalisées sur un résidu d’acide aminé ou sur une liaison peptidique. Un exemple de telle modification est la liaison de polyéthylène glycol.

Un autre aspect de l’invention concerne une molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’invention.

Cette molécule d’acide nucléique peut par exemple présenter une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 62 à SEQ ID NO : 72. Ces séquences codent pour des fragments d’anticorps conformes à l’invention, dans lesquels un peptide de liaison de séquence (G ₄ S) ₃ (SEQ ID NO : 1 1 ) relie la région variable de chaîne lourde et la région variable de chaîne légère.

L’invention concerne également un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique selon l’invention. Ce vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en oeuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant pour l‘anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps selon l’invention.

La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique ou un vecteur d’expression selon l’invention. Cette cellule hôte peut aussi bien être une cellule procaryote, en particulier bactérienne, notamment pour la production en masse de l'anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps, qu’une cellule eucaryote, pouvant être inférieur ou supérieur, par exemple de levure, d’invertébrés ou de mammifères. En particulier, entrent dans le cadre de l’invention des lignées cellulaires exprimant, de manière stable, inductible ou constitutive, ou bien transitoire, un anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps selon l’invention.

Les anticorps ou fragments d’anticorps selon l’invention peuvent être produits par toute méthode conventionnelle connue de l’homme du métier. Ils peuvent notamment être obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.

Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l’invention, un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention comprend la culture de cellules hôtes selon l’invention, c’est-à-dire comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, ou un vecteur d’expression contenant une telle molécule d’acide nucléique, dans des conditions permettant l’expression dudit anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps, et la récupération de l’anticorps, ou fragment fonctionnel de cet anticorps, ainsi produit.

Des procédés alternatifs de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention entrent également dans le cadre de l’invention, notamment par inoculation d’un mammifère non humain avec l’antigène OprF de Pseudomonas aeruginosa, le cas échéant avec un adjuvant de Freund, et criblage des hybridomes produisant un anticorps présentant une affinité pour cet antigène, les anticorps ou fragments d’anticorps conformes à l’invention étant identifiés par analyse de leur séquence. A cet effet, la protéine OprF utilisée pour l’inoculation se trouve sous forme de protéoliposomes, tels que décrits dans la publication de Maccarini et al. précitée.

L’inoculation peut être réalisée par toute voie, notamment par injection sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, etc. Il peut être réalisé une ou plusieurs injections, à plusieurs jours d’intervalle.

Un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon un mode de réalisation particulier de l’invention comprend des étapes successives de :

- fabrication de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. Cette étape peut être réalisée par mise en contact, pour former un milieu réactionnel, d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la porine OprF de Pseudomonas aeruginosa et d’un liposome synthétique, notamment de composition lipidique définie, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire, ce système pouvant par exemple être issu d’un lysat bactérien ou de tout autre lysat provenant de levures, de cellules de mammifères, de germe de blé ou de tout autre source biologique, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine, par exemple selon le protocole décrit dans la publication de Maccarini et al. précitée ;

- inoculation d’un mammifère non humain, notamment de l’espèce Macaca fascicularis, avec lesdits protéoliposomes ;

- construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère,

- criblage de ladite banque vis-à-vis desdits protéoliposomes, par une technique d’expression, notamment d’expression phagique (pour l’anglais « phage display ») et dosage d'immunoadsorption par enzyme liée (ELISA) par exemple,

- et sélection et récupération des clones réactifs contre la cible protéoliposomique.

Selon la présente invention, on considère de préférence qu’un clone est réactif contre la cible protéoliposomique lorsque sa constante de dissociation, telle que mesurée par ELISA, vis-à-vis de cette cible, est inférieure ou égale à 10 mM.

Préférentiellement, le procédé comprend, pour les clones réactifs vis-à-vis des protéoliposomes ainsi sélectionnés, une étape d’isolation et de vérification de leur redondance éventuelle par séquençage.

La construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère, peut par exemple comprendre l’amplification par transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) des ARN messagers (ARNm) codant les domaines variables VLk, VLÀ et VH des anticorps, construction d’une banque de scFv par clonage séquentiel des domaines variables VLk, nΐ_l et VH dans un vecteur phagemidique, et encapsidation et amplification de la banque de scFv en phage, notamment en phage M13K07 de la société Invitrogen®.

Le procédé de préparation d’un anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention peut comprendre une étape d’humanisation d’un anticorps ou fragment d’anticorps produit à partir du mammifère non-humain, par greffage d’au moins une séquence de CDR de cet anticorps ou fragment d’anticorps sur une région de charpente FR d’un anticorps humain.

Il peut en outre comprendre des substitutions, insertions et/ou délétions d’un ou plusieurs acides aminés d’un anticorps ou fragment d’anticorps produit à partir du mammifère non-humain.

L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention trouve une application particulièrement avantageuse pour le traitement des infections bactériennes, en particulier des infections à Pseudomonas aeruginosa.

Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique, notamment une composition de vaccin, pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier les infections à Pseudomonas aeruginosa, et notamment les infections pulmonaires aigües et chroniques. Cette composition comprend un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’invention en tant que substance active, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La composition pharmaceutique selon l’invention peut se présenter sous toute forme galénique adaptée à une administration à un mammifère, notamment sous une forme galénique adaptée à une administration orale ou parentérale. En particulier, elle peut se présenter sous une forme galénique adaptée à une injection intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou à une administration par voie intranasale ou par inhalation.

Le véhicule peut consister en tout véhicule classique en lui-même, notamment dans le domaine des compositions de vaccin. Il peut notamment s’agir d’un véhicule aqueux.

La composition pharmaceutique selon l’invention peut en outre contenir tout additif classique en lui-même, ainsi éventuellement que d’autres principes actifs. A titre d’additifs pouvant être mis en œuvre dans la composition pharmaceutique selon l’invention on peut citer les agents tensioactifs, notamment de type polysorbate, les solvants ou encore les agents stabilisateurs, par exemple de type glycine, arginine ou autres, etc.

Un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation, à titre prophylactique ou curatif, d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel de cet anticorps en tant que médicament, et en particulier pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier contre les infections à Pseudomonas aeruginosa, notamment les infections du système respiratoire, et plus particulièrement les infections pulmonaires, notamment les infections pulmonaires aigües et chroniques.

Cette utilisation comprend l’administration dudit anticorps ou fragment d’anticorps, ou d’une composition pharmaceutique le contenant, à un mammifère, notamment un humain, dans une dose thérapeutiquement efficace.

Cette administration peut être réalisée par toute voie. Elle est de préférence réalisée par voie orale ou par voie parentérale, en particulier par injection intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie intranasale ou par inhalation.

L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être administré à l’individu traité en dose unique, ou en plusieurs doses, notamment réparties à plusieurs jours d’intervalle.

La dose efficace, la durée d’administration et le nombre d’administrations dépendent de l’individu traité, en particulier de son âge, son poids, ses symptômes, etc. La détermination de conditions exactes du traitement est du ressort du praticien.

A titre d’exemple, une dose thérapeutiquement efficace de l’anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention peut être comprise entre 1 et 1000 mg, pour un traitement en dose unique.

L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être utilisé pour traiter tout individu en ayant besoin, notamment tout individu souffrant d’une infection bactérienne, en particulier une infection à Pseudomonas aeruginosa, ou, à titre préventif, tout individu à risque susceptible de contracter une telle infection, par exemple les patients affaiblis sur le plan immunitaire, les patients atteints de mucoviscidose, les patients sous ventilation mécanique ou les grands brûlés, lors d’une hospitalisation. Un tel traitement préventif permet d’éliminer de manière considérable les risques d’infection à Pseudomonas aeruginosa.

La présente invention concerne également d’autres utilisations de l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, par exemple pour la détection, et le cas échéant la purification, de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa. La présente invention concerne ainsi l’utilisation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention pour la détection, in vitro ou ex vivo, de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide biologique, notamment un fluide corporel issu d’un individu, en particulier d’un individu humain ou animal. On entend par là que le fluide corporel a été extrait dudit individu.

Cette détection peut être réalisée par toute technique classique en elle-même pour l’homme du métier, par exemple par Western blot, cytométrie de flux, résonance de plasma de surface, ELISA, etc.

Un autre aspect de l’invention concerne un kit de diagnostic pour la détection de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide biologique, notamment un fluide corporel issu d’un individu, en particulier un individu humain ou animal. Ce kit contient un anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention, et des instructions pour la mise en oeuvre d’un procédé de détection, in vitro ou ex vivo, de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans un fluide corporel issu d’un individu, au moyen de cet anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d’anticorps.

Ce kit peut également comprendre tout réactif classique en lui-même pour la mise en oeuvre d’un tel procédé de détection.

L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut autrement être utilisé pour la préparation d’anticorps bi-spécifiques.

Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en oeuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 15, dans lesquelles :

La figure 1 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution du sérum, pour un test ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ) réalisé sur des sérums prélevés d’un macaque, aux jours 0, 24 et 38 après immunisation de ce macaque par des protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa (OPRF J0, OPRF J24, OPRF J38) et sur un sérum prélevé d’un macaque, au jour 38 après immunisation du macaque par l’albumine de sérum bovin (BSA J38).

La figure 2 montre les séquences de 6 fragments scFv dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa conformes à l’invention, dans lesquelles sont soulignées les séquences correspondant aux 6 CDR, ainsi que la séquence du peptide de liaison liant la région variable de chaîne lourde à la région variable de chaîne légère - dans ces séquences, l’extrémité N-terminale est à gauche, et l’extrémité C-terminale est à droite, de manière conventionnelle.

La figure 3 montre les séquences de 5 autres fragments scFv dirigés contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa conformes à l’invention, dans lesquelles sont soulignées les séquences correspondant aux 6 CDR, ainsi que la séquence du peptide de liaison liant la région variable de chaîne lourde à la région variable de chaîne légère - dans ces séquences, l’extrémité N-terminale est à gauche, et l’extrémité C-terminale est à droite, de manière conventionnelle.

La figure 4 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E2) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 5 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E5) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 6 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F8) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 7 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (G9) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 8 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E3) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 9 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (E7) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 10 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F10) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 1 1 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F3) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 12 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (F4) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif. La figure 13 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (A1 ) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 14 représente un graphe montrant la densité optique à 450 nm, en fonction du taux de dilution, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés pour différentes dilutions d’un fragment scFv conforme à l’invention (A8) et pour l’albumine de sérum bovin (BSA) en tant que témoin négatif.

La figure 15 représente des graphes montrant la densité optique (DO) à 450 nm en fonction de la concentration, pour des tests ELISA (affinité vis-à-vis de la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa) réalisés respectivement sur quatre fragments scFv conformes à l’invention, dénommés E7, F8, F10 et G9. La figure 16 montre un graphe représentant la valeur obtenue par soustraction de l’absorbance à 680 nm de l’absorbance à 490 nm (« A490-A680 nm »), lors d’un test in cellulo de détermination du pouvoir neutralisant, face à l’infection de macrophages (« Ma ») par Pseudomonas aeruginosa (« Pa »), de fragments scFv conformes à l’invention (F8, G9, E7), par dosage de l’activité de la lactate déshydrogénase.

A/ Production de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa

Construction d’un vecteur recombinant exprimant OprF

Le vecteur recombinant plVEX2.4-OprF, dans lequel OprF comprend une étiquette poly-histidine N-terminale, est construit en clonant le gène OprF amplifié à partir d’ADN génomique de Pseudomonas aeruginosa amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), au moyen des amorces suivantes :

Sens 5’-GG AATT CCAT AT GAAACT G AAG AACACCTT AG-3' (SEQ ID NO : 76) Antisens 5’-T AG AAGCT G AAGCCAAGT AACT CG AGT AACGC-3' (SEQ ID NO : 77)

dans le vecteur d’expression plVEX2.4d (Roche Diagnostics). A cet effet, il est mis en œuvre 30 cycles de PCR en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité. Le produit PCR ainsi obtenu est ensuite purifié grâce à l’utilisation du kit QIAquick gel (Qiagen) puis digéré avec les enzymes de restriction Ndel, Xhol (Roche Diagnostics), à nouveau purifié puis lié grâce au kit Rapid DNA ligation kit (Roche Diagnostics) dans le vecteur plasmidique plVEX2.4d (Roche Diagnostics) préalablement digéré par les enzymes Ndel et Xhol. Le plasmide recombinant résultant plVEX2.4-OprF est vérifié par séquençage (LGC Genomics) afin de valider l’insertion du gène codant pour OprF en phase avec l’étiquette poly-histidine du vecteur plVEX2.4d.

Préparation de liposomes

Des liposomes sont préparés en séchant une composition lipidique préalablement solubilisée dans du chloroforme, pour les différentes compositions lipidiques (LC) suivantes :

- Composition Lipidique 1 (LC1 ) : cholestérol, 1 ,2-dioléoyl-sn-glycéro-3- phosphocholine (DOPC), 1 ,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), 1 ,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate (sel de sodium) (DMPA), ratio molaire [2-4-2-2] ;

- LC1’: LC1 + 1 mg/mL monophosphoryl lipide A (MPLA) ;

- LC2: 1 -palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE), 1 - palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1 '-rac-glycérol) (sel de sodium) (POPG), E. coli cardiolipine (CL), ratio molaire [6-2-2] ;

- LC2’: LC2 + 1 mg/mL MPLA ;

- LC3: POPE, POPG, E. coli CL, DMPA, ratio molaire [6-2-1 -1] ;

- LC 3’: LC 3 + 1 mg/mL MPLA (Avanti Polar Lipids).

Le séchage est réalisé par évaporation sous azote. Les traces résiduelles de chloroforme sont éliminées en utilisant une pompe à vide. Le film lipidique est ensuite hydraté dans 500 mI d’une solution de Tris (50 mM, pH 7,5) en vortexant, puis soumis à 4 cycles de congélation/décongélation en azote liquide. Le mélange lipidique est extrudé en utilisant une extrudeuse (Avanti Polar Lipids) pour produire des liposomes de taille en moyenne, d’environ 200 nm. Les liposomes ainsi obtenus sont conservés à 4°C.

Production et purification de protéoliposomes contenant OprF en système acellulaire La protéine membranaire OprF de Pseudomonas aeruginosa est synthétisée en présence des différentes compositions de liposomes (LC1 , ou LC2, ou LC3 ou LC1’, ou LC2’ ou LC3’) en utilisant le kit de synthèse protéique acellulaire RTS 500 ProteoMaster E. coli HY, de Biotechrabbit. A cet effet, le plasmide recombinant plVEX2.4-OprF contenant le gène codant pour la protéine OprF fusionnée à une étiquette poly-histidine (6xHis) est ajouté à une concentration de 15 pg/ml au lysat cellulaire du kit en présence d’une quantité de 1 à 4 mg/ml de liposomes d’une des 6 compositions lipidiques LC1 à LC3’. Les protéoliposomes contenant la protéine recombinante OprF sont produits à 25°C pendant 16 h sous agitation (300 tr/min) dans un rapport de 1/30 de volume réactionnel/volume du contenant. Les protéoliposomes recombinants résultant sont ensuite purifiés en 2 étapes :

- tout d’abord dans un gradient de sucrose de 0-40% en tampon Tris 50 mM pH 7,5 sur lequel le mélange réactionnel est déposé sur le haut du gradient puis centrifugé à 287.660g pendant 2 h en utilisant un rotor TH-641. Des fractions de 1 ml sont récoltées à partir du haut du gradient et analysées par western blot en utilisant un anticorps anti-histidine couplé à la peroxydase de raifort HRP (Sigma),

- ensuite, 1 ml d’un tampon Tris 50 mM pH 7,5 est ajouté à chaque fraction contenant les protéoliposomes contenant OprF, et la solution est centrifugée à 30.000g pendant 30 min à 4°C, pour former un culot de protéoliposomes. Le culot est lavé 2 fois pendant 30 min à 4°C avec une solution de NaCI 5M et ensuite re-suspendu dans une solution de Tris 50 mM pH 7,5 à la concentration désirée. La pureté des échantillons est analysée sur un gel SDS- PAGE coloré au bleu de Coomassie.

On obtient des protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa.

B/ Préparation et criblage d’une banque de fragments scFv

Immunisation des animaux

Des fragments scFv dirigés contre la cible antigénique membranaire bactérienne OprF de Pseudomonas aeruginosa sont obtenus à partir d’une immunisation par les protéoliposomes obtenus à partir de la composition lipidique LC1 , effectuée aux jours J0, J14, J28 et J50 d’un macaque ( Macaca fascicularis). Le macaque est élevé en conditions stériles en présence d’un congénère et sans aucune autre espèce. Avant la première injection, une analyse sanguine est réalisée afin de connaître le statut physiologique de l’animal. 100 pg de la composition LC1 dans du tampon phosphate salin (PBS) stérile, mélangés à 50/50 avec un adjuvant de Freund (complet pour la primo injection, incomplet pour les suivantes) lui sont injectés en injection sous- cutanée en 2 points (à raison de 250 mI par point) dans la zone scapulaire de l’animal, selon le profil suivant : administrations aux jours 0, 14, 28, 50.

La réponse immunitaire est analysée par dosage immunoenzymatique (ELISA) à partir de sérums prélevés aux jours J0, J24, J38 pour faire une titration des anticorps dirigés contre la cible antigènique membranaire OprF. Des prélèvements de la moelle osseuse sont effectués après la dernière injection (J50) aux jours J53, J60, J67 et J74 sur l’animal anesthésié.

Titration des sérums

La réponse humorale après immunisation est analysée par la méthode ELISA indirecte utilisant une série de dilutions des sérums pré-immuns et immuns (dilutions de 100, 1000, 10 000, 1 000 000, 10 000 000 et 100 000 000) en suivant le protocole décrit dans le livre « Phage Display », Methods and Protocols, Springer Protocols, chapitre « Construction of Macaque Immune Libraries », Arnaud Avril et al., Methods Mol Biol. 2018; 1701 : 83-1 12. doi: 10.1007/978-1 -4939-7447-4_5. Brièvement, l’antigène membranaire OprF sous forme de protéoliposomes ou un contrôle négatif tel que l’albumine de sérum bovin (BSA) est tout d’abord déposé au fond des plaques ELISA et incubé 16 h à 4°C. Après une étape de saturation (2% de lait déshydraté re-suspendu dans 200 mI de tampon phosphate salin PBS), chaque sérum dilué (à 1/100 initialement puis 1/10, dans du PBS/Tween® 0.05 %/BSA 0,5 %) est ensuite testé en parallèle contre l’antigène OprF ou le contrôle négatif (BSA) pendant 2 h à 37°C. Les anticorps spécifiques dirigés contre OprF sont ensuite révélés en utilisant un anticorps secondaire anti-Fc du macaque conjugué à la peroxydase de raifort HRP et par addition de tétraméthylbenzidine (TMB) jusqu’à l’apparition d’une coloration dans les puits. L’analyse des résultats s’effectue par lecture de la densité optique à 450 nm. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 1 . pour les sérums prélevés aux jours JO, J24 et J38 après immunisation avec les protéoliposomes contenant OprF et pour les sérums obtenus au jour J38 pour l’immunisation avec la BSA.

Au jour J38, un titre de 1/200000 est observé, qui est compatible avec la suite du procédé.

Prélèvements de la moelle osseuse et isolement des lymphocytes B

Le prélèvement des moelles osseuses s’effectue sur l’animal anesthésié. Les prélèvements s’effectuent au niveau de la fosse trochantérique fémorale et au niveau du tubercule de l’humérus, au moyen d’un trocart de Mallarmé. Chaque prélèvement est récolté dans un tube Falcon® de 50 ml contenant une solution de citrate à 10-15%. Approximativement, 5 ml d’échantillon sont obtenus aux jours J53, J60, J67 et J74. Chaque prélèvement est ensuite centrifugé pendant 10 min à 500g (1500 tr/min) à 4°C. Le surnageant est prélevé et placé dans un cryotube, puis conservé à -20°C. L’ARN total de chacune des moelles osseuses est ensuite extrait par la technique du Trizol/Chloroforme et quantifié par lecture de la densité optique (DO) à 260 nm et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre.

Les résultats obtenus sont montrés dans le tableau 3 ci-après.

Tableau 3

Amplification par RT-PCR des ARN codant pour les parties variables VLK, VLÀ et VH

Les ARN messagers (ARNm) codant pour les domaines variables des chaînes lourdes et légères G et k/l pour chacun des échantillons de moelle osseuse sont rétro-amplifiés pour obtenir une banque d’ADN complémentaire (ADNc) en utilisant des amorces spécifiques, décrites dans la publication de Avril et al., 2018, Methods Mol. Biol., 1701 : 83-1 12. La qualité de l’amplification est contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose. Les produits PCR amplifiés à partir de la banque d’ADNc obtenue les jours J53 à J74 sont clonés dans le plasmide pGemT (Promega), selon le protocole du fournisseur, afin d’obtenir une banque de clones sécurisés.

Construction d’une banque de fragments scFv

A partir des ADN obtenus aux jours J53 et J60, 2 banques (une pour chaque jour) sont construites par clonage séquentiel en insérant, selon le protocole du fournisseur, d’abord les fragments VL dans le vecteur phagemidique pïh1 (Addgene) puis les fragments VH, pour obtenir une construction au format VH- [(G ₄ S)X3 (SEQ ID NO : 1 1 )]-VL-6xHistidine-EQKLISEEDL (SEQ ID NO : MM), dans lequel les fragments VH et VL sont reliés par le peptide de liaison GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 1 1 ) reliant l’extrémité C-terminale du fragment VH à l’extrémité N-terminale du fragment VL, et dans comprenant à son extrémité C-terminale une étiquette poly-histidine (SEQ ID NO : 79) et une étiquette c-myc (SEQ ID NO : 78).

Pour les ADN obtenus au jour J53, on obtient une banque de 1 ,5.10 ⁷ UFC (75 % d’inserts de taille complète). Pour les ADN obtenus au jour J60, on obtient une banque de 1.10 ⁷ UFC (100 % d’inserts de taille complète).

Criblage des banques des fragments scFv par la technique d’expression phaqique (« phaqe displav ») - identification des fragments présentant une affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa

La banque est encapsidée et amplifiée en phage M13Ko7 (Nebb), selon le protocole du fournisseur.

Les banques de scFv contenues dans les phagemides sont soumises à 4 tours de sélection contre les protéoliposomes contenant l’antigène membranaire OprF fixé sur des plaques 96 puits.

Le protocole de criblage est le suivant : une plaque de microtitrage est enduite pendant la nuit avec l'antigène ciblé à une concentration de 10 pg/ml dans du PBS à 4°C. Ensuite, la plaque est bloquée avec 3% de BSA dans du PBS pendant 2 h à 37°C ; après lavage, la banque est incubée pendant 2 h supplémentaires à 37°C. Au cours du premier tour, la plaque est lavée 2 fois en utilisant du PBS contenant 0,1 % de Tween® 20 avec un intervalle de 5 min entre chaque lavage. Finalement, la plaque est lavée, rincée avec du PBS stérile et le phage est élué avec de la trypsine (1 0 mg/ml dans du PBS) pendant 30 min à 37°C. Les phages élués sont utilisés pour l'infection d'Escherichia coli (souche SURE, Stratagene, cultivée dans un milieu SB (Super Broth) supplémenté avec de la tétracycline (10 pg/ml) et de la carbénicilline (50 pg/ml). Pour la production de nouvelles particules de phage, la souche infectée est co-infectée avec un phage auxiliaire et cultivée pendant une nuit à 30°C dans un milieu SB supplémenté avec de la tétracycline (10 pg/mL), de la carbénicilline (50 pg/mL) et de la kanamycine (70 pg/mL). Les particules de phage sont précipitées en utilisant du PEG / NaCI (4% (p/v) PEG- 8000, 3% (p/v) NaCI) et utilisées pour le cycle suivant. Le deuxième tour est réalisé comme décrit précédemment. Les souches infectées du troisième tour sont cultivées sur des milieux SB dans des boîtes de Pétri et sont utilisées pour le criblage.

Après chaque tour, seuls les phages ayant interagi avec OprF sont élués. La réactivité des phages après chaque tour de sélection contre la cible OprF est testée par dosage ELISA. Les phages montrent une augmentation du signal par un facteur 30 entre le premier tour de sélection et le 4 ^eme tour, indiquant un enrichissement des scFvs réactifs contre OprF.

96 clones isolés à partir du deuxième, troisième et quatrième tours de sélection sont récoltés et utilisés pour produire des scFv solubles. De ces clones, 57 clones positifs sont sélectionnés et 15 d’entre eux sont retenus. Une analyse de la séquence nucléotidique et peptidique des 57 clones est réalisée afin de déterminer la redondance potentielle de certaines séquences. 43 séquences sont identifiées comme non redondantes et non recombinées. Parmi ces 43 séquences, 1 1 d’entre elles sont produites en bactérie Escherichia coli, selon le protocole suivant : l'ADN phagemidique isolé après le processus de sélection est utilisé pour transformer la souche d'E. Coli non suppresseur de telle sorte qu'elle exprime le fragment scFv soluble. Des colonies uniques de transformants choisis au hasard sont utilisées pour inoculer 5 ml de milieu SB supplémenté en carbénicilline. Les cultures sont incubées pendant une nuit à 37°C sous agitation vigoureuse (250 tr/min). 500 ml de milieu SB supplémenté en carbénicilline sont ensuite inoculés avec 500 mI de chaque culture. Les cultures sont cultivées à 30°C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteigne 1 ,5. De l'IPTG (1 mM) est ensuite ajouté pendant une nuit pour induire l'expression génique à 22°C. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 2500 g pendant 15 min à 4°C. Les scFv sont extraits avec du sulfate de polymyxine B et purifiés sur une colonne de nickel (colonne Ni-NTA, Qiagen) selon les instructions du fabricant, puis dialysés contre du PBS.

Les scFv correspondants produits sont ensuite purifiés pour confirmation de leur affinité contre la cible OprF par la méthode ELISA.

Ces 1 1 fragments scFv comprennent les séquences indiquées dans le tableau 4 ci-après.

Tableau 4

Ces séquences y sont prolongées, à leur extrémité C-terminale, par une étiquette poly-histidine (SEQ ID NO : 79) et une étiquette c-myc (SEQ ID NO : 78).

Ces fragments scFv comprennent tous :

- une région variable de chaîne lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes :

VH-CDR1 : GYXaai FXaa ₂ Xaa ₃ Xaa ₄ G (SEQ ID NO : 1 ) dans laquelle Xaai représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2 représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa ₃ représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4 représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,

VH-CDR2 : INAXaa ₅ TGKXaa ₆ (SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa ₅ représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa ₆ représente un résidu alanine ou un résidu sérine,

VH-CDR3 : VR,

- et une région variable de chaîne légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes :

VL-CDR1 : SSVXaa ₇ TXaa ₈ Xaa ₉ (SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa ₇ représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa ₈ représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa ₉ représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,

VL-CDR2 : Xaa-ioTS dans laquelle Xaa-io représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,

VL-CDR3 : QQGXaaiiXaa-i2Xaa-i3 (SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa-n représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa-12 représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa-13 représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.

Ces fragments scFv sont tous conformes à la présente invention.

Chacune des séquences de ces fragments scFv est montrée sur la figure 2 pour A1 , A8, E2, E3, E5, E7 et sur la figure 3 pour F3, F4, F8, F10, G9. Les séquences des CDR y sont soulignées. On y distingue ainsi, de gauche à droite, les séquences successives des CDR de la région variable de chaîne lourde (VH-CDR1 , puis VH-CDR2, puis VH-CDR3), puis des CRD de la région variable de chaîne légère (VL-CDR1 , puis VL-CDR2, puis VL-CDR3). La séquence du peptide de liaison est également soulignée, entre les deux triplets de CDR.

C/ Analyse de l’affinité de fragments scFv conformes à l’invention pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa

Les 11 fragments scFvs produits ci-dessus sont purifiés.

On obtient les quantités suivantes de chaque fragment scFv conforme à l’invention : 0,346 mg/ml E2, 0,401 mg/ml E3, 0,559 mg/ml E5, 0,453 mg/ml E7, 0,387 mg/ml F4, 0,436 mg/ml F3, 0,333 mg/ml F8, 0,403 mg/ml F10, 0,570 mg/ml G9, 0,385 mg/ml A1 et 0,626 mg/ml A8.

Un dosage ELISA est réalisé sur des plaques MaxiSorp®, pour confirmer l’affinité de ces fragments scFv contre la cible OprF sous la forme de protéoliposomes, de la façon suivante.

La plaque est saturée par 2,5% de lait déshydraté re-suspendu dans 200 mI de tampon phosphate salin PBS.

Les fragments scFv sont incubés à différents taux de dilution : 1 /20, 1 /40, 1 /80, 1 /160, 1 /320, 1 /640, 1/1280, dans du PBS/Tween®-20 0,05%/BSA 0,5%. La détection est réalisée en utilisant un anticorps secondaire anti-étiquette c-myc couplé à la peroxydase de raifort. La densité optique à 450 nm est relevée.

Les résultats obtenus, pour le fragment selon l’invention et pour un témoin négatif (BSA) sont montrés sur la figure 4 pour E2, figure 5 pour E5, figure 6 pour F8, figure 7 pour G9, figure 8 pour E3, figure 9 pour E7, figure 10 pour F10, figure 1 1 pour F3, figure 12 pour F4, figure 13 pour A1 et figure 14 pour A8.

On y voit que l’ensemble des fragments scFv selon l’invention présentent une haute affinité pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa.

A titre d’exemple, la constante de dissociation Kd est déterminée pour les fragments scFv E7, F8, F10 et G9, par une méthode ELISA.

A cet effet, 100 mI de protéoliposomes OprF (contenant une concentration en OprF de 1 pg/ml) contenus dans du tampon de fixation (0,1 M carbonate de sodium, 0,1 M bicarbonate de sodium) sont fixés au fond des puits d’une plaque 96 puits (Thermo Scientific®) pendant une nuit à 4 °C et sous agitation. Les puits sont ensuite bloqués pendant 1 h à 21 °C avec 100 mI de tampon TBS Tween (TBST) contenant 5 % de lait. Après lavage des puits avec 100 mI de tampon TBST, 100 mI du fragment scFv (E7, F8, F10 ou G9), aux dilutions 1 /50 ; 1 /200 ; 1 /400 ; 1 /800 ; 1 /1600 et 1 /3200 dans du tampon TBST, sont ajoutés aux puits correspondants et incubés pendant 1 h à 37 °C sous agitation. Après lavage des puits, 100 mI d’anticorps anti-c-myc-Peroxidase (Roche) (dilution 1 /10000 dans du tampon TBST contenant 5 % de lait) sont ajoutés aux puits et incubés pendant 1 h à 37 °C sous agitation. Après 3 lavages des puits, 50 mI de TMB sont ajoutés aux puits et la plaque est incubée à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant environ 15 min. 50 mI d’HCI 1 M sont ensuite ajoutés et l’absorbance de chaque puit est mesurée à 450 nm. Ces données d’absorbance sont alors analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism (analyse par régression non linéaire, équation « un site - liaison spécifique » (« one site-specific binding »)) afin de calculer la constante de dissociation Kd de chaque fragment scFv testé. A titre comparatif, une mesure est également réalisée sur le tampon seul.

Les résultats obtenus, pour chacun des fragments E7, F8, F10 et G9, sont montrés sur la figure 15.

Les valeurs des constantes de dissociation Kd ainsi déterminées sont indiquées dans le tableau 5 ci-dessous.

Tableau 5

Ces résultats témoignent d’une très bonne affinité des fragments selon l’invention pour la cible protéoliposomique contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa.

D / Détermination du pouvoir neutralisant de fragments scFv conformes à l’invention in cellulo

Les fragments E7, F8 et G9 ont été testés dans cette expérience, pour déterminer leur pouvoir neutralisant face à l’infection de macrophages par Pseudomonas aeruginosa (souche CHA) à une MOI (multiplicité d’infection) de 10.

Le protocole suivant a été mis en oeuvre :

- Différenciation des cellules THP-1 (lignée monocytaire humaine) en macrophages suite à l’ajout de phorbol myristate acétate (PMA) : ajout de 15 mI de PMA (solution stock à 0,1 mg/ml) à 10 ml de cellules THP-1 en suspension dans du milieu RPMI contenant 10 % de sérum de veau foetal décomplémenté (dSVF) (440 000 cellules/ml) ; incubation de la boîte de culture T25 dans une étuve à 37 °C (atmosphère contenant 5 % de CO2) pendant minimum 48h afin de permettre la différenciation des cellules THP-1 en macrophages adhérents ;

- Culture et préparation de P.aeruginosa (souche CHA) : lancement d’une culture de bactéries P. aeruginosa (souche CHA) à partir d’une petite quantité de stock glycérol bactérien placé dans 10 ml de milieu de culture LB ; incubation de la culture bactérienne à 37 °C sous agitation pendant une nuit ; dilution de la culture dans du milieu LB jusqu’à obtention d’une mesure de densité optique à 600 nm égale à 0,5 dans 1 ml de culture (6 x 10 ⁸ CFU/ml) ; centrifugation à 4000 g pendant 5 min ; retrait du surnageant et reprise du culot dans 1 ml de milieu de culture RPMI - 10 % dSVF ; 2 ^eme centrifugation à 4000 g pendant 5 min ; retrait du surnageant et reprise du culot dans 1 ml de milieu de culture RPMI - 10 % dSVF ; dilution dans le même milieu afin d’obtenir une suspension contenant 15 000 000 de bactéries/ml ; incubation à 37 °C pendant 2h de : 35 mI de la suspension de P. aeruginosa + 35 mI de scFv E7 en PBS (0,453 mg/ml), 35 mI de la suspension de P. aeruginosa + 35 mI de scFv F8 en PBS (0,333 mg/ml), 35 mI de la suspension de P. aeruginosa + 35 mI de scFv G9 en PBS (0,570 mg/ml), 35 mI de la suspension de P.aeruginosa ;

- Préparation des macrophages : retrait du surnageant de culture ; ajout de

2 ml de Versène afin de décoller les cellules adhérentes ; après décollement du tapis cellulaire, ajout de 2 ml de milieu et récupération des cellules ; centrigugation à 400 g pendant 5 min ; resuspension du culot cellulaire dans 2 ml de milieu et comptage des cellules ; répartition de la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque 96 puits de façon à obtenir 15000 cellules/puit et ajout de la quantité nécessaire de milieu RPMI-10 % dSVF afin d’obtenir les volumes finaux indiqués dans le tableau 6 ci-dessous :

Tableau 6 - M représente les macrophages - Réalisation du test de cytotoxicité permettant de quantifier le relarguage de LDH (Lactate Déshydrogénase) cellulaire dans le milieu de culture, selon le protocole défini dans la notice du kit de dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) « Pierce® LDH cytotoxicity assay kit » : ajout de 10 mI de PBS stérile aux puits n° 1 à 5 des lignes A, B, C et aux puits n° 1 des lignes D, E , F ; ajout de 10 mI de P. aeruginosa (Pa) aux puits n° 3 des lignes A, B, C et aux puits n° 1 des lignes D, E, F ; ajout de 20 mI du mélange : Pa + F8 aux puits n°2 des lignes D, E, F, Pa + G9 aux puits n°3 des lignes D, E, F, Pa + E7 aux puits n°4 des lignes D, E, F ; ajout de 10 mI d’eau stérile ultrapure aux puits n° 1 et 3 des lignes A, B, C ; incubation de la plaque dans une étuve à 37 °C (atmosphère contenant 5 % de CO2) pendant 16h ; ajout de 10 mI de tampon de lyse (10 x) aux puits n°2 et 5 des lignes A, B, C ; incubation pendant 45 min dans une étuve à 37 °C (atmosphère contenant 5 % de C0 ₂ ) ; centrifugation de la plaque à 250 g pendant 3 min ; transfert de 50 mI de chaque puit dans une nouvelle plaque 96 puits ; ajout à chaque puit de 50 mI du mélange réactionnel ; incubation de la plaque à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 min ; ajout à chaque puit de 50 mI de la solution stop ; mesure de l’absorbance de chaque puit à 490 et 680 nm ; soustraction des valeurs d’absorbances : A ₄ 90nm - Aesonm-

Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 16. On observe une diminution d’environ 2/3 de la cytotoxicité de P. aeruginosa envers les macrophages en présence des fragments ScFv selon l’invention. Ceci démontre une action neutralisante de ces fragments contre P. aeruginosa.

E / Analyse des protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa avant servi à l’obtention des ScFv conformes à l’invention

Les protéoliposomes obtenus dans l’expérience décrite en A/ ci-avant ont été soumis aux analyses suivantes.

E.1 / Matériel et méthodes

Digestion à la trypsine - Les protéoliposomes OprF (LC1 ) purifiés par centrifugation en gradient de saccharose ont été protéolysés en utilisant un rapport massique trypsine : protéine de 1 :10 à température ambiante (RT). Les échantillons ont été récupérés à différents moments et chargés sur un gel SDS-PAGE pour une analyse Western blot ultérieure. Microscopie électronique à coloration négative - Les échantillons ont été préparés en utilisant la technique de coloration négative sur grille (SOG). 10 pL de protéoliposomes OprF (LC1 , [OprF]: 0,1 mg / mL) ou 10 pL de liposomes (4 mg/mL) incubés dans le mélange réactionnel sans ADN (= contrôle négatif) ont été ajoutés à une grille à décharge luminescente recouverte d'un film de carbone pendant 3 min et la grille a été colorée avec 50 pl d'acide phosphotungstite (PTA, à 1 % dans de l'eau distillée) pendant 2 min. L'excès de solution a été absorbé par du papier filtre et la grille a été séchée à l'air. Les images ont été prises dans des conditions de faible dose (<10 e- / Â2) avec des valeurs de défocalisation entre 1 ,2 et 2,5 pm sur un microscope électronique Tecnai 12 LaB6 à une tension d'accélération de 120 kV à l'aide de la caméra CCD Gatan Orius® 1000. La taille moyenne des pores a été déterminée à l'aide du programme de traitement d'image open source ImageJ. Fonctionnalisation de la pointe AFM - Les pointes d'or (NPG-10, Bruker Nano AXS) ont été recouvertes de NTA-SAM après une nuit d'incubation dans une solution de NTA-SAM (Prochimia) 0,1 mM dans de l'éthanol. Ensuite, les pointes ont été rincées abondamment à l'éthanol, séchées à l'azote et incubées pendant 1 h dans du N1SO4 à 40 mM dans une solution de PBS et stockées à 0-5°C.

AFM basée sur la force/distance (FD) - Un AFM Résolve ^® (Bruker) a été utilisé en mode « PeakForceTapping ». Des cantilevers rectangulaires avec des constantes de ressort nominales d’environ 0,06-0,12 N.m ¹ et une fréquence de résonance d’environ 18 kFlz dans l'eau ont été choisis. Toutes les expériences AFM ont été réalisées dans une solution tampon d'imagerie à température ambiante (environ 24 °C). Les cartes d'adhésion ont été obtenues en faisant osciller la pointe fonctionnalisée à 0,25 kFlz, avec une amplitude de 25 nm, et en appliquant une force d'imagerie de 100 pN. Des topographies de 128x128 ou 256x256 pixels ont été effectuées en numérisant 0,125 ligne par sec. La vitesse de rétraction était de 1500 nm/sec et le temps de contact entre la pointe et l'échantillon était de 500 ms.

Analyse des données

Les courbes force/distance (FD) de chaque expérience de reconnaissance d'interaction ont été enregistrées et exportées sous forme de fichiers texte. NanoScope Analysis v1.9 et BiomecaAnalysis ont été utilisés pour traduire les courbes force / temps en courbes FD montrant des événements d'adhésion spécifiques. Les courbes force / distance obtenues ont ensuite été analysées sur la base du modèle WLC (pour l’anglais Worm Like Chain, modèle du ver). Ce modèle est le plus approprié et le plus fréquemment utilisé pour décrire l'extension des polypeptides. L'extension z de la macromolécule est liée à la force de rétraction F _acih par l’équation :

dans laquelle la longueur de persistance l _p est une mesure directe de la rigidité de la chaîne, l _c est la longueur totale de contour de la biomacromolécule et K _B est la constante de Boltzmann.

Le nombre de monomères dans les chaînes polypeptidiques a ensuite été dérivé de l'équation suivante : c

N

P

E.2 / Détermination de l’orientation des protéines OprF au sein de la membrane liposomale par AFM (microscopie à force atomique)

Les échantillons de protéoliposomes OprF ont été adsorbés sur une surface de mica et analysés par AFM en utilisant une sonde fonctionnalisée par un groupement Tris-Ni ⁺ -NTA liant l’étiquette poly-histidine N-terminale d'OprF. L'analyse par AFM a été effectuée avec et sans détergent Triton® X-100. La solution de Triton® 1 x a été utilisée pour solubiliser les protéines OprF de la membrane liposomale, exposant ainsi tous les étiquettes poly-histidines situées à l'intérieur du liposome et leur permettant d'être liées par la sonde fonctionnalisée. Les images topographiques, acquises sans et avec Triton® X- 100, ont mis en évidence des protéoliposomes OprF à la surface de l'échantillon. En l'absence de Triton®, très peu de phénomènes d'adhésion spécifiques entre la sonde fonctionnalisée et l’étiquette poly-histidine N- terminale d'OprF se sont produits à la surface des protéoliposomes, comme l’ont montré les cartes d'adhésion correspondantes illustrant les forces d'adhésion entre 80 et 150 pN. En revanche, en présence de Triton®, de nombreux événements d'adhésion spécifiques ont été détectés. En moyenne, la sonde fonctionnalisée a lié l’étiquette poly-histidine d'une protéine OprF sur 6 sans Triton®, et de 5 protéines OprF sur 6 avec Triton®, démontrant que l’étiquette poly-histidine N-terminale d'OprF était principalement située à l'intérieur du liposome.

E.3/ Détermination de la topologie des protéines OprF dans la membrane liposomale par digestion à la trypsine et AFM

Les protéoliposomes OprF purifiés par ultracentrifugation en gradient de saccharose ont été soumis à une expérience de protéolyse limitée afin de déterminer la topologie d'OprF dans la membrane liposomale. La séquence de la protéine OprF contient 32 sites de clivage à la trypsine. Sans protection membranaire d’OprF, la trypsine génère des peptides d'une masse allant de 146 à 4649 Da (programme PeptideCutter). Le résultat de la digestion à la trypsine des protéoliposomes OprF, visualisé par Western blot en utilisant un anticorps anti-histidine, a démontré qu’OprF adopte au moins deux topologies membranaires différentes dans les liposomes : une première topologie dans laquelle OprF est entièrement insérée dans la membrane et donc protégée de la protéolyse, car le signal correspondant à l’étiquette poly-histidine de la protéine OprF totale n'a pas disparu avec le temps ; et une deuxième topologie dans laquelle environ seulement la moitié de la protéine 6xFlis-OprF est intégrée dans la membrane, car un plus petit fragment de protéine situé entre le poids moléculaire 20 et 25 kDa a été généré au fil du temps.

Ces premières observations ont ensuite été corroborées et affinées par AFM. L'analyse des courbes force/distance (FD) montrant des phénomènes d'adhésion spécifiques dans la solution de Triton® 1x a indiqué qu’OprF adopte deux topologies transmembranaires différentes dans la membrane liposomale, correspondant à ses conformations de canal fermé et ouvert. Sur la base du modèle WLC, 64 % des phénomènes d'adhésion spécifiques correspondaient à 8 domaines transmembranaires (conformation de canal fermé) et 36 % des phénomènes d'adhésion spécifiques correspondaient à 16 domaines transmembranaires (conformation de canal ouvert). E.4 / Étude de l'activité de formation de pores d’OprF dans les protéoliposomes en utilisant la microscopie électronique à coloration négative et l'AFM

La microscopie électronique à coloration négative et l'analyse AFM des protéoliposomes OprF ont permis de visualiser l'activité de formation de pores d’OprF dans la membrane liposomale. Sur les images de microscopie électronique, une série de « trous » d'une taille moyenne de 9,5 ± 4 nm correspondant à des pores ont été observés au travers des membranes des liposomes dans lesquels OprF a été reconstituée. Une telle perforation de la membrane liposomale n'a pas été observée sur les images des liposomes contrôles, incubés avec le lysat cellulaire et le mélange réactionnel du système acellulaire sans ADN (contrôle négatif). En outre, les images topographiques d’AFM de la surface des protéoliposomes OprF ont également révélé la présence de pores entourés de protéines OprF et ayant un diamètre moyen de 10 nm. La formation de pores a donc été attribuée à l'activité de la protéine OprF dans la membrane liposomale.