ANTIEPILÉPTICO

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con Ia prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad, así como con Ia prevención y/o el tratamiento de Ia epilepsia, de las crisis epilépticas o de las convulsiones, con Ia disminución de los niveles de colesterol-LDL y con Ia inhibición de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa para Ia prevención de Ia dislipemia y de las enfermedades cardiovasculares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La gran incidencia de las enfermedades neurodegenerativas y de las enfermedades asociadas al envejecimiento es un problema de primer orden en todo el mundo. Por ello es necesaria Ia búsqueda de compuestos neuroprotectores que eviten o palien dichas enfermedades. De todas ellas, Ia enfermedad de Alzheimer (EA) es Ia más prevalente, estimándose que en el año 2040, 81 millones de personas sufrirán esa enfermedad (Blennow et al., Lancet 2006; 368: 387-403). Sólo en España se estima que más de medio millón de personas sufren actualmente EA. Los costes asociados a esta enfermedad son proporcionalmente altos, y se calcula que el coste total derivado del cuidado de los enfermos de Alzheimer es de 81.000 y 22.000 millones de € en Estados Unidos y en el Reino Unido, respectivamente. Actualmente no existen fármacos eficientes que prevengan o impidan esta enfermedad, con Io que Ia búsqueda y validación de nuevos compuestos neuroprotectores que eviten el daño neuronal es una necesidad.

En Ia actualidad, se están siguiendo diferentes estrategias para Ia obtención de nuevos compuestos, una vez que se ha visto que los actuales fármacos ofrecen pocos beneficios a los pacientes. Estos fármacos retrasan temporalmente (en el mejor de los casos un año), algunos síntomas de Ia dolencia, pero no evitan su evolución. Las opciones terapéuticas actuales se basan en Ia inhibición de Ia acetilcolinesterasa con fármacos como el donepezilo, Ia galantamina o Ia rivastigmina, o en Ia capacidad de Ia memantina en antagonizar un receptor de glutamato, el NMDA (ácido N-metil- D-aspártico).

Debido al poco éxito de estos fármacos se han abierto nuevas líneas de investigación, y, entre ellas, destaca en los últimos tiempos Ia investigación de los inhibidores de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutahl-coenzima A reductasa (HMGR) (más conocidos como estatinas) como agentes terapéuticos. La HMGR es Ia enzima que cataliza el paso limitante en Ia biosíntesis del colesterol, por Io que su inh ibición por las estatinas es una estrategia terapéutica habitual para disminuir los altos niveles de colesterol asociados a las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Estos fármacos reducen el riesgo de infarto de miocardio y de muerte coronaria, y son considerados seguros. Además, Ia hipercolesterolemia (definida como un alto nivel de colesterol en sangre) es el principal factor de riesgo para Ia enfermedad cardiovascular isquémica, como Ia ateroesclerosis.

Diversos factores genéticos y ambientales que afectan al metabolismo del colesterol están asociados con Ia EA. Por ejemplo, Ia isoforma ε4 de Ia apolipoproteína E (apoE4) es un factor de riesgo para Ia EA y está ligado a un incremento de los niveles de colesterol . La aterosclerosis, que tiene a Ia hipercolesterolemia como principal factor de riesgo, parece estar asociada también a Ia EA. Además, estudios epidemiológicos indican que altos niveles de colesterol en suero incrementan el riesgo de EA, y se ha propuesto que Ia regulación homeostática del metabolismo del colesterol puede estar alterada en el alzhéimer. Por otra parte, se ha descrito una reducción significativa del riesgo de Alzhéimer en pacientes tratados con estatinas. En conjunto, todos estos estudios sugieren que Ia reducción de los niveles de colesterol puede inhibir Ia patogénesis de Ia enfermedad de Alzhéimer (CoIe & Vassar; Neurobiol Dis 2006; 22[2]:209-22).

El colesterol es transportado por Ia sangre mediante diferentes tipos de lipoproteínas, donde los mayores portadores de colesterol son las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de alta densidad (HDL). Las LDL son lipoproteínas especializadas en el transporte del colesterol y de los triglicéridos desde el hígado a tejidos periféricos, donde son captados por las células a través de los receptores LDL (R-LDL) en membrana celular. Las LDL también regulan Ia síntesis de colesterol, y se han asociado los altos niveles de colesterol-LDL al riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares (ECV). Por su parte, las HDL son lipoproteínas que transportan el colesterol desde los diferentes tejidos hasta el hígado. Debido a que las HDL pueden retirar el colesterol de las arterias y transportarlo de vuelta al hígado para su excreción, se les otorga un papel protector frente a las enfermedades cardiovasculares. Los inhibidores de Ia HMGR son los agentes hipolipemiantes de más éxito en Ia historia, siendo capaces de reducir los niveles de colesterol total a base de disminuir los niveles de colesterol-LDL sin alterar los de colesterol-HDL.

Recientemente se han descrito nuevas propiedades de las estatinas, especialmente a nivel de daño cerebral causado por trauma o en demencias, proponiéndose nuevas actividades antioxidantes y antiinflamatorias (Pahan, CeII Mol Life Sci. 2006; 63[10]:1165-78), y se ha demostrado que ciertas estatinas (e.g ., simvastatina) intensifican Ia capacidad de memoria y aprendizaje en ratones (Ling et al., Ann Neurol. 2006; 60[6]:729-39) o protegen de las crisis convulsivas asociadas a fenómenos epilépticos (Lee et al., Neurosci Lett. 2008; 440: 260-4). Además, las estatinas también han demostrado su eficacia en ensayos clínicos en fase Il que sugieren resultados positivos frente al tratamiento del vasoespasmo cerebral (Fandino et al., Neurocirugía. 2007; 18: 16-27), así como frente a Ia muerte neuronal inducida por daño isquémico en Ia retina (Honjo et al., Arch. Ophthalmol. 2002; 120: 1707-13). No obstante, actualmente se encuentra en discusión si los efectos neuroprotectores de las diferentes estatinas comerciales (e.g., atorvastatina, lovastatina, simvastatina, etc.) son debidos a un efecto directo sobre el metabolismo lipídico, o si por el contrario es consecuencia de rutas alternativas.

La solicitud de patente WO 99/1 1258 describe un compuesto de estructura similar al de Ia presente invención. No obstante, este documento no especifica Ia configuración de los distintos centros quirales presentes en el compuesto. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Aunque existe literatura sobre el potencial efecto neuroprotector de las estatinas, los autores de esta invención han encontrado que un derivado de monacolina J no comercial, en concreto el 2-etil-butirato de (1 S,2S,6R,8S,8aR)- 1 _> 2 _> 6 _> 7 _> 8 _> 8a-hexahidro-3 _> 7-dimetil-8-[2-[(2R _> 4R;-tetrahidro-4-hidroxi-6-oxo-2H- piran-2-il]etil]-1-naftalenilo (también identificado en ocasiones en esta solicitud de patente como NST0037) es un agente con un potencial neuroprotector sorprendente, además de tener una alta capacidad de disminuir los niveles de lípidos (colesterol y triglicéridos) de Ia sangre, inhibiendo de forma muy eficiente Ia HMGR, y protegiendo de Ia epilepsia, de las crisis epilépticas y de las convulsiones. Además, y de forma sorprendente, este compuesto es más seguro que las estatinas comerciales, mostrando niveles de toxicidad por debajo de Ia estatina más biosegura, Ia simvastatina. Adicionalmente, se trata de un compuesto que resulta más barato de sintetizar debido al bajo coste de Ia cadena lateral a añadir a Ia molécula de monacolina J.

La actividad neuroprotectora de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto frente a diferentes agresiones que causan Ia muerte neuronal en líneas celulares humanas de origen colinérgico mediante diferentes tipos de agresiones que causan estrés oxidativo, estrés reticular o apoptosis (Ejemplo 2, Figuras 1 a 4). Dicho ejemplo pone de manifiesto el potencial empleo de dicho compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia muerte neuronal asociada a enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.) o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad.

La actividad neuroprotectora de dicho compuesto se ha confirmado en un modelo de enfermedad de Alzheimer en ratón, donde este compuesto ejerce un efecto neuroprotector frente a Ia muerte neuronal en el hipocampo causada por una sustancia excitotóxica (Ejemplo 3, Figura 5). Además, se ha comprobado que dicha sustancia recupera Ia memoria temporal y espacial de los ratones con neurodegeneración (Ejemplo 3, Figuras 6 y 7), además de evitar Ia muerte de los animales causada por Ia administración de una sustancia excitotóxica (Ejemplo 3, Figura 8). Dichos ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo de este compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia muerte neuronal y del déficit cognitivo asociados a enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.) o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad.

La actividad antiepiléptica y anticonvulsivante de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante Ia determinación de Ia protección de las crisis epilépticas y de las convulsiones en un modelo de epilepsia en ratones (Ejemplo 4, Figuras 9 y 10). Dicho ejemplo pone de manifiesto el potencial empleo de este compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia epilepsia y de las crisis convulsivas o convulsiones.

La actividad hipolipemiante de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante Ia determinación de Ia inh ibición de Ia HM GR en comparación con dos estatinas comerciales, Ia simvastatina y Ia atorvastatina (Ejemplo 5, Figura 11 ).

Adicionalmente se ha demostrado Ia capacidad hipolipemiante de dicho compuesto en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón, observándose un efecto similar a Ia simvastatina en Ia disminución de los niveles de colesterol plasmático total, del colesterol asociado a LDL, del colesterol asociado a VLDL y de Ia fracción de colesterol esterificado. Por el contrario, y al igual que Ia simvastatina, no altera los niveles de colesterol asociado a HDL ni los de Ia fracción de colesterol libre, Io que Ie otorga un papel protector frente a enfermedades cardiovasculares (ECV) (Ejemplo 5, Figuras 12 a 1 7). Dichos ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo de dicho compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia hipercolesterolemia asociada a enfermedades cardiovasculares (e.g., infarto de miocardio, ateroesclerosis, cardiopatía congénita, cardiopatía adqu irida, cardiopatía isquémica, cardiopatía hipertensiva, valvulopatías, miocardiopatías, trastornos sanguíneos, etc.). La actividad hipolipemiante de dicho compuesto se ha confirmado en un modelo de hiperlipidemia inducida en ratón (Ejemplo 6, Figuras 1 8 a 23), observándose un efecto mayor a Ia simvastatina en Ia disminución de los niveles de colesterol plasmático total, del colesterol asociado a LDL y de Ia fracción de colesterol libre y esterificado. Por el contrario, este compuesto no altera los niveles de colesterol asociado a HDL ni los de colesterol asociado a VLDL, Io que Ie otorga un papel protector frente a enfermedades cardiovasculares (ECV). Dichos ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo de dicho compuesto en Ia prevención y/o tratamiento de Ia hipercolesterolemia asociada a enfermedades cardiovasculares (e.g., infarto de miocardio, ateroesclerosis, cardiopatía congénita, cardiopatía adquirida, cardiopatía isquémica, cardiopatía hipertensiva, valvulopatías, miocardiopatías, trastornos sanguíneos, etc.). La bioseguridad de dicho compuesto se ha puesto de manifiesto mediante Ia evaluación de su toxicidad en un modelo de embrión de pez cebra, en comparación con una estatina comercial, Ia simvastatina, observándose que es menos tóxica que Ia simvastatina a diferentes concentraciones ya que produce una menor mortalidad (Ejemplo 7, Figuras 24 y 25). Adicionalmente, se ha demostrado que Ia dosis letal 50 (LD50) es mayor en el caso del compuesto NST0037 que en el de Ia simvastatina en todos los puntos temporales evaluados, Io que indica una mayor bioseguridad de dicho compuesto (Ejemplo 7, Figuras 26). Adicionalmente, se ha demostrado que este compuesto produce un mayor porcentaje de larvas sanas al final del experimento, así como un menor porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo (Ejemplo 7, Figuras 27 y 28). Adicionalmente, este compuesto no produce una variación significativa del porcentaje de latidos cardíacos a altas concentraciones, a diferencia de Ia simvastatina que produce una disminución significativa del ritmo cardíaco a altas concentraciones (Ejemplo 7, Figuras 29).

Por tanto, un aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) [también identificado en ocasiones en esta solicitud de patente como NST0037]:

(I) su forma hidroxiácida, las sales farmacéuticamente aceptables de dicho hidroxiácido y prodrogas y solvatos farmacéuticamente aceptables del compuesto y de su forma hidroxiácida.

Otro aspecto de Ia presente invención, es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida, y al menos un adyuvante, portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso como medicamento.

Según otro aspecto, Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma h idroxiácida para su uso como agente neuroprotector, en particular en Ia prevención y/o el tratamiento de: a. enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.), más concretamente, como neuroprotector frente a procesos de apoptosis, estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico asociados a dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas, b. deterioro cognitivo, c. enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, d. procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, e. epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, f. enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o g. infecciones fúngicas o víricas

Un aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), de su forma hidroxiácida, de u na sal farmacéuticamente aceptable de d icho h idroxiácido y/o d e u n a p rod rog a o so l vato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento. Según una real ización particular, el medicamento es para su uso como agente neuroprotector, en particular en Ia prevención y/o el tratamiento de: a. enfermedades neurodegenerativas (e.g . , Alzheimer, Parkinson , esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus,

Huntington, etc.), más concretamente, como neuroprotector frente a procesos de apoptosis, estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico asociados a dichas enfermedades neurodegenerativas crónicas, b. deterioro cognitivo, c. enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, d. procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, e. epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, f. enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, e hipertrigliceridemia, o g. infecciones fúngicas o víricas

Otro aspecto de Ia presente invención es un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.

Otro aspecto de Ia presente invención es un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida para su uso en Ia prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con el gen seladin-1/DHCR24.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I), de su forma hidroxiácida, de una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o de una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida en Ia elaboración de un medicamento caracterizado por incrementar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.

En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método para Ia prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, epilepsia, crisis epilépticas y convulsiones, enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis, fibrilación auricular, dislipemia, hipercolesterolemia, hiperlipidemia e hipertrigliceridemia, o infecciones fúngicas o víricas en un sujeto con necesidad de tratamiento, que comprende Ia administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente eficiente de un compuesto de fórmula (I), su forma hidroxiácida o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por xantina/xantina oxidasa (XXO). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por XXO) de los cultivos tratados con 10 μM xantina (X) 60 mU/mL xantina oxidasa (XO) y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto a los tratamientos con XXO sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 2 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por tunicamicina (Tm). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por Tm) de los cultivos tratados con 24 μM Tm y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto a los tratamientos con Tm sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 3 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por camptotecina (CPT). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por CPT) de los cultivos tratados con 20 nM CPT y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto a los tratamientos con CPT sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 4 son dos gráficas de barras que representan el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia apoptosis producida por camptotecina (CPT) determinada por citometría de flujo. La Figura 4A muestra el porcentaje de inhibición de Ia apoptosis producida por 50 μM CPT y NST0037 a 10, 40 y 100 μM en comparación con el control de inhibición el Z-VAD-fmk a 50 μM, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes. ^* Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 4B muestra que el pretratamiento con NST0037 potencia el efecto antiapoptótico del compuesto (40 μM NST0037 y tratamiento 24 h con 50 μM de CPT como inductor de Ia apoptosis), siendo esta protección inhibida parcialmente por Ia adición de mevalonato (MEV), precursor de Ia ruta de biosíntesis del colesterol y producto de Ia reacción enzimática que cataliza Ia enzima HMG-CoA Reductasa. La Figura 4B muestra el porcentaje de inhibición de Ia apoptosis producida por 50 μM CPT con un pretratamiento de 24 h con 40 μM NST0037 solo o junto con 100 μM mevalonato (MEV), y el efecto del inhibidor Z-VAD-fm k a 50 μ M como control, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes. ^* Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT sola, ^# diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT y NST0037, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 5 es una composición de micrografías que muestra las regiones CA1 y CA2 del hipocampo de ratones donde las muestras han sido teñidas con hematoxilina&eosina. La figura representa el análisis histopatológico de Ia estructura celular de estas regiones en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 6 es una gráfica de barras donde se analiza el estado de Ia memoria temporal según el protocolo de Dere y colaboradores (Dere, E., Huston, J. P. & De Souza Silva, M. A. Neurobiol Learn Mem 2005; 84: 214-21 ). Las barras representan las medias±SEM de Ia memoria temporal expresada en unidades arbitrarias (eje Y), en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 7 es una gráfica de barras donde se analiza el estado de Ia memoria espacial según el protocolo de Dere y colaboradores (Dere, E., Huston, J. P. & De Souza Silva, M. A. Neurobiol Learn Mem 2005; 84: 214-21 ). Las barras representan las medias±SEM de Ia memoria espacial expresada en unidades arbitrarias (eje Y), en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.). La Figura 8 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los ratones en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.). La Figura 9 es una gráfica de barras donde se representa Ia media±SEM del tiempo en minutos tras Ia inoculación de KA en el que aparece Ia primera convulsión (eje Y) en función del pretratamiento recibido (eje X). El grupo de pretratamiento con PBS se representa en negro y el grupo de tratamiento con NST0037 a 50 mg/Kg de peso se representa en gris. La Figura 10 es una gráfica de dispersión XY que representa el nivel de severidad del status epilepticus observado según Ia escala de Racine (Racine, Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1972; 32[3]:281 -94), frente al tiempo post-inoculación de Ia sustancia epileptogénica (ácido kaínico o kainato o KA). La gráfica muestra Ia evolución del estado epileptogénico de los animales según el tratamiento recibido: PBS se representa con círculos y línea negros y el grupo de tratamiento con NST0037 a 50 mg/Kg de peso se representa con cuadrados y línea grises. La Figura 1 1 es una gráfica de dispersión XY que representa las curvas de dosis-respuesta del compuesto NST0037 en comparación con dos estatinas comerciales (simvastatina y atorvastatina) sobre Ia actividad enzimática de Ia HMGR in vitro. La gráfica muestra el porcentaje de actividad enzimática de Ia HMGR con respecto al control de los compuestos en diferentes dosis, representando Ia media±SD de al menos cuatro ensayos independientes.

La Figura 12 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol total plasmático de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 13 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol LDL plasmático (c-LDL) de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 14 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol HDL plasmático (c-HDL) de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 15 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol VLDL plasmático (c-VLDL) de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 16 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol esterificado (CE) plasmático de ratones macho ApoB100 tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 17 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol libre (CL) plasmático de ratones macho ApoBl OO tras 12h de ser tratados con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al tiempo Oh, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 18 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol total (CT) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 19 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol LDL (c-LDL) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 20 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol HDL (c-HDL) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos. La Figura 21 es un diagrama de barras que representa los niveles de colesterol VLDL (c-VLDL) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada u no de los gru pos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 22 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol esterificado (CE) en ratones macho C57BL6 tras 24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos.

La Figura 23 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre (CL) en ratones macho C57BL6 tras

24h de ser tratados i.p. con 500 mg/kg de Tritón 1339 (Tiloxapol) y 50 mg/kg de

NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SD de cada uno de los grupos.

La Figura 24 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los embriones-larvas en función del tratamiento recibido: control, NST0037 (a una dosis de 2 mg/L) o simvastatina (a una dosis de 2 mg/L). ^* Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de χ ²

(p<0.01 ).

La Figura 25 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los embriones-larvas en función del tratamiento recibido: control, NST0037 (a una dosis de 0.2 mg/L) o simvastatina (a una dosis de 2 mg/L). ^* Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de χ ²

(p<0.01 ).

La Figura 26 es una gráfica de dispersión XY que representa Ia dosis letal 50 (LD50) de los dos compuestos (NST0037 o simvastatina) frente al tiempo de tratamiento.

La Figura 27 es una gráfica de barras que representa el porcentaje de larvas sanas que se obtienen al final de experimento en función del tratamiento recibido (NST0037 o simvastatina) y Ia dosis usada (0.02, 0.06 ó 0.2 mg/L), y donde se representa las medias ± SD.

La Figura 28 es una gráfica de dispersión XY que representa el porcentaje de embriones-larvas con deformidades o aspecto anómalo en función del tratamiento recibido (NST0037 o simvastatina). ^* Diferencia significativa entre los dos tratamientos, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 29 es un gráfica de barras que representa el porcentaje del ritmo cardiaco de los embriones-larvas tratados con dosis crecientes de los compuestos NST0037 o simvastatina, a las 72 horas post-tratamiento, representando las medias ± SD. La línea negra punteada horizontal representa el valor medio del ritmo cardiaco correspondiente a los controles. ^* Diferencia significativa de los tratamientos respecto al control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 30 es una gráfica que muestra Ia actividad antifúngica del compuesto NST0037 y de Ia simvastatina. En ella se representa el logaritmo de las concentraciones ensayadas (mM) frente al diámetro de los halos de inhibición (cm).

La Figura 31 es una gráfica de barras que muestra el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 por el tratamiento con NST0037 en las células SK-N-MC. Se muestra Ia cuantificación relativa (RQ) de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, normalizada por el 18S, y referida al valor de las células sin tratamiento (control), para los tratamientos durante 24 h con NST0037 a 1 , 4, 10 y 40 μM. Se muestran los resultados de dos ensayos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto al control de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 32 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por ácido okadaico (OA). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por OA) de los cultivos tratados con 20 nM OA y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto a l os tratamientos con OA sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 33 es una gráfica de dispersión XY que representa el efecto protector del compuesto NST0037 de Ia muerte causada por ácido 3- nitropropiónico (3-NP). La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por 3-NP) de los cultivos tratados con 30 μM 3-NP y NST0037 a diferentes concentraciones, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto a los tratamientos con 3-NP sola, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 34 es una gráfica de barras que representa el efecto inhibidor del pretratamiento del compuesto NST0037 sobre Ia activación de Ia caspasa 3/7, inducida por camptotecina (CPT). La figura muestra el porcentaje de Ia caspasa 3/7 activa referida a las células control, sin tratamiento, producido por 50 μM CPT y pretratamiento con NST0037 a 10 y 40 μM, mevalonato a 100 μM y Ia combinación de ambos compuestos, además, se utiliza el inhibidor Z-VAD- fmk a 50 μM como control de inhibición, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes. ^* Diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT sola, * diferencia significativa respecto al tratamiento con CPT y NST0037, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 35 son dos gráficas de barras en las que se muestra el porcentaje de Aβ(1-40) (A) y Aβ(1-42) (B) secretado y cuantificado mediante

ELISA y referido a las células control a 48 h. Se muestran los resultados de un ensayo representativo por duplicado (media+SD). * Diferencia significativa respecto al control de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 36 es una gráfica de barras que representa el efecto del mevalonato sobre Ia protección por NST0037 de Ia muerte celular producida por XXO. La figura muestra el porcentaje de Ia muerte celular (tomando el 100% Ia producida por XXO) de los cultivos tratados con 10 μM xantina (X) 60 mU/mL xantina oxidasa (XO) y 40 μM NST0037 y mevalonato a 10, 40 y 100 μM, representando las medias+SD de 3 experimentos independientes por triplicado. ^* Diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO sola; * diferencia significativa respecto al tratamiento con XXO y NST0037, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 37 es una composición de micrografías que muestra Ia inm unoh istoqu ím ica de MAP2 en el h ipocampo de ratones con u na magnificación de 12.5X y en más detalle de las áreas CA1 y CA2-CA3 con una magnificación de 200X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia distrofia neurítica en función del pretratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.). La Figura 38 es una composición de micrografías que muestra: (A) Ia región CA2 y CA3 del hipocampo de ratones donde a las muestras se les ha realizado Ia inmunohistoqu ímica de HN E, Ia técnica de T. U . N . E. L. y Ia inmunohistoquímica de GFAP, todas las imágenes tienen una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico del daño oxidativo, Ia apoptosis y astrogliosis en el hipocampo en función del pretratamiento (-24 y - 0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica [ácido kaínico o kainato o KA]), Ia inoculación de Ia sustancia excitotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 39 es una gráfica de Kaplan-Meier que representa el índice de supervivencia de los ratones en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 40 es una gráfica de barras donde se analiza Ia resistencia del animal. Las barras representan las medias±SEM del ratio entre el tiempo de permanencia en el cilindro de los animales a los 7 d.p.i. respecto del estado basal (eje Y), en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 41 es una gráfica de barras donde se analiza Ia fuerza en las extremidades delanteras del animal. Las barras representan las medias±SEM del ratio Ia fuerza de los animales en gramos por quintuplicado a los 7 d.p.i. respecto del estado basal (eje Y), en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 42 es una composición de micrografías que muestra las regiones de Ia sustancia nigra y del estriado de ratones donde las muestras han sido teñidas con Fluoro Jade B con una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia neurodegeneración en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 43 es una composición de micrografías que muestra las regiones de Ia sustancia nigra y el estriado de ratones donde a las muestras se les ha realizado Ia inmunohistoquímica contra tirosina-hidroxilasa con una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia muerte de neuronas dopaminérgicas de Ia sustancia nigra y de Ia desaparición de Ia extensiones nerviosas del estriado en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de

Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 7 d.p.i.).

La Figura 44 es una gráfica de dispersión XY donde se analiza Ia resistencia del animal. Las barras representan las medias±SEM del ratio entre el tiempo de permanencia en el cilindro de los animales a los 7, 14 y 21 d.p.i. respecto del estado basal (eje Y) en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días post-inoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 21 d.p.i.).

La Figura 45 es una composición de micrografías que muestra Ia región de Ia sustancia nigra de ratones donde a las muestras se les ha realizado Ia inmunohistoquímica contra tirosina-hidroxilasa y HNE con una magnificación de 100X. La figura representa el análisis histopatológico de Ia muerte y Ia peroxidación lipídica en neuronas dopaminérgicas de Ia sustancia nigra en función del tratamiento (-24 y -0.5 horas de Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica [MPTP]), Ia inoculación de Ia sustancia neurotóxica (0 días postinoculación [d.p.i.]) y el posterior tratamiento (hasta 21 d.p.i.).

La Figura 46 es una gráfica de dispersión XY que representa Ia permeabilidad efectiva expresada como P _e (cm/s) frente al paso de BHE (%) de Ia atorvastatina, Ia simvastatina y el NST0037 mediante determinación in vitro por el método PAMPA. Como controles positivo y negativo se emplearon verapamilo y teofilina respectivamente.

La Figura 47 es un diagrama de barras que representa el efecto de Ia simvastatina y NST0037 sobre los niveles de colesterol en las líneas celulares humanas HepG2 y SK-N-MC. Los resultados se expresan como el porcentaje de reducción de colesterol respecto al control en cada, línea tras Ia incubación de los compuestos ácidos durante 2Oh en ausencia de FBS. Las determinaciones fueron llevadas a cabo por medios enzimáticos y fluorométricos y los resultados son Ia media±SD. ^* Diferencia significativa respecto a las células sin tratar, de acuerdo al test de Student (p<0.05). En el caso de HepG2 se hicieron 2 ensayos independientes por triplicado y en el caso de las SK-N-MC tres ensayos independientes por triplicado.

La F ig u ra 48 es un conjunto de gráficas de dispersión XY que representan Ia concentración plasmática de colesterol y sus diversas fracciones además de Ia concentración de apoB en ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos y los tiempos. ^* Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). + Diferencia significativa respecto tiempo inicial de ese mismo grupo.

La Figura 49 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre y esterificado en ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 50 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el estado de oxidación en el plasma de ratones hembra apoB100 de 12 semanas de edad tras 7, 21 y 28 días de tratamiento con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 51 es un conjunto de gráficas de dispersión XY que representan Ia concentración plasmática de colesterol y sus diversas fracciones en ratones hembra apoB100 de 6 meses de edad tras uno, dos y tres meses de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). + Diferencia significativa respecto tiempo inicial de ese mismo grupo.

La Figura 52 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol libre y esterificado en ratones hembra apoB100 de 6 meses de edad tras uno, dos o tres meses de tratamiento oral con 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 53 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el colesterol y sus diversas fracciones en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 54 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementan los triglicéridos plasmáticos en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 55 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa el estado redox plasmático en ratas zucker macho de 11 semanas de edad tras 7 días de tratamiento oral con 30 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05).

La Figura 56 es un diagrama de barras que representa el número de veces que incrementa Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 en el cerebro de ratones salvajes C57BL6 a las 4h de Ia administración oral a 50 mg/kg de NST0037 o simvastatina, representando Ia media±SEM de cada uno de los grupos. ^* Diferencia significativa respecto al grupo control, de acuerdo al test de Student (p<0.05). La Figura 57 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de larvas sanas (sin problemas toxicológicos) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, representando Ia media del porcentaje±SEM de animales sanos después del tratamiento con diferentes dosis de NST0037 o de simvastatina. El eje de las Y determina el porcentaje de larvas sanas y el eje de las X, las concentraciones usadas de ambos compuestos. Las barras en gris representan el grupo de animales tratados con NST0037 y las barras de color negro representan los animales tratados con simvastatina.

La Figura 58 es un diagrama de barras que representa el porcentaje de larvas con aspecto anómalo (sintomatología) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, representando Ia media del porcentaje±SEM de larvas con deformaciones o aspecto anómalo después del tratamiento con diferentes dosis de NST0037 o de simvastatina. El eje de las Y determina el porcentaje de larvas con aspecto anómalo y el eje de las X las diferentes alteraciones de Ia sintomatología. Las barras en gris representan el grupo de animales tratados con NST0037 y las barras de color negro representan los animales tratados con simvastatina.

La Figura 59 es un diagrama de barras que representa Ia variación del peso de peces cebra adultos en un ensayo de toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina . Los datos se presentan como el peso med io de los animales±SD en función del tiempo de estudio y del grupo de tratamiento. Las barras en color blanco indican el peso de los animales en función del tratamiento, refiriéndose al estudio basal (0 dpt). Las gráficas de color gris indican el peso de los animales en función del tratamiento, refiriéndose al estudio a 7 dpt. Las gráficas de color negro indican el peso de los animales en función del tratamiento, refiriéndose al estudio a 14 dpt. ^* Comparación estad ística con el método t-Student, donde se determinan diferencias significativas en el peso de los animales de un mismo grupo respecto al tiempo basal (p < 0.05).

La Figura 60 es una composición de micrografías que muestra el estudio histopatológico en diferentes órganos de peces cebra adultos tras ensayo de toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina. Los animales fueron tratados con una dosis de 2000 mg/Kg, sacrificados a los 14 días post-tratamiento, realizados cortes histológicos representativos de los diferentes grupos de estudio y teñidos con hematoxilina-eosina. Los órganos estudiados que se muestran son: cerebro, riñon, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, músculo e hígado.

La Figura 61 es una composición de micrografías que muestra el estudio histopatológico en el ovario de peces cebra adultos tras ensayo de letalidad por exposición constante en el agua (4 d ías) del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina. Los animales fueron tratados con dos dosis de 32 y 100 mg/Kg, sacrificados a los 4 días post-tratamiento, realizados cortes histológicos representativos de los diferentes grupos de estudio y teñidos con hematoxilina-eosina. El ovario fue el único órgano estudiado que sufrió alteraciones patológicas. Se muestra un corte histológico del ovario de una hembra del grupo control, y ovarios de hembras de los grupos de tratamientos con NST0037 y simvastatina en función de Ia dosis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones Para facilitar Ia comprensión de Ia invención objeto de esta solicitud de patente, a continuación se expone el significado de algunos términos y expresiones utilizados en el contexto de Ia invención.

El término "neuroprotector", tal como aqu í se util iza, se refiere a cualquier sustancia capaz de producir Ia atenuación o desaparición de los efectos de Ia degeneración o muerte neuronal mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, autofagia, daño oxidativo, excitotoxicidad, daño de retículo endoplásmico, deposición de subproductos, pérdida de Ia arquitectura celular, etc., o a Ia disminución o desaparición de sus efectos secundarios.

El término "estatina", tal como aquí se utiliza, se refiere a un inhibidor de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HMGR), enzima que cataliza el paso limitante de Ia biosíntesis del colesterol, e incluye cualquier estatina tanto natural como sintética o semisintética. Algunas estatinas pueden presentarse en forma cerrada (lactona) o en forma abierta (hidroxiácido). Los hidroxiácidos (forma abierta) pueden prepararse a partir de las lactonas correspondientes por hidrólisis convencional, por ejemplo, con hidróxido sódico en metanol, hidróxido sódico en tetra h id rofu rano-agua y similares. En Ia forma abierta (hidroxiácido), las estatinas reaccionan para formar sales con cationes de metales y aminas, farmacéuticamente aceptables, formadas a partir de bases orgánicas o inorgánicas. Las sales farmacéuticamente aceptables de las estatinas pueden diferir de los ácidos libres correspondientes en algunas características físicas tales como solubilidad y punto de fusión, pero se consideran equivalentes a Ia forma de ácido libre para los fines de esta invención. La forma abierta (hidroxiácido) libre de las estatinas puede regenerarse a partir de Ia forma de sal, si se desea, poniendo en contacto Ia sal con una solución acuosa diluida de un ácido tal como ácido clorhídrico y similares. La forma cerrada (lactona) de las estatinas puede regenerarse por disolución de Ia forma abierta (hidroxiácido) en un disolvente inerte tal como, por ejemplo, tolueno, benceno, acetato de etilo y similares, a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 0 ⁰ C y aproximadamente el punto de ebullición del disolvente, típicamente (aunque no necesariamente) con separación simultánea del agua resultante y catálisis con ácidos fuertes, e.g., ácido clorhídrico y similares. Asimismo, las estatinas pueden existir en forma solvatada o no solvatada y tales formas son equivalentes a Ia forma no solvatada para los fines de esta invención.

El término "cardioprotector", tal como aqu í se util iza, se refiere a cualquier sustancia capaz de producir Ia atenuación o desaparición de los efectos subyacentes a las enfermedades cardiovasculares o cardiopatías o del daño cardíaco mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer, por ejemplo, necrosis, apoptosis, isquemia, arritmia, deposición de subproductos, pérdida de Ia arquitectura celular, etc., o a Ia disminución o desaparición de sus efectos secundarios.

El término "hipolipemiante", tal como aqu í se util iza, se refiere a cualquier sustancia farmacológicamente activa que tenga Ia propiedad de disminuir los niveles de lípidos en sangre o en otros tejidos. La importancia de estas sustancias viene dada porque el exceso de algunos tipos de lípidos (colesterol o triglicéridos) o de las lipoproteínas, es uno de los principales factores de riesgo para las enfermedades cardiovasculares.

El término "hipocolesterolémico", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia farmacológicamente activa que tenga Ia propiedad de disminuir los niveles de colesterol en sangre o en otros tejidos.

El término "hipotrigliceridémico", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier sustancia farmacológicamente activa que tenga Ia propiedad de disminuir los niveles de triglicéridos en sangre o en otros tejidos. El término "antiepiléptico o anticonvulsivante", tal como aquí se utiliza, se refiere a Ia atenuación de las crisis epilépticas o convulsivas, por ejemplo, en Ia duración y/o en Ia intensidad, o a Ia desaparición de las crisis epilépticas o convulsivas, o a Ia disminución o desaparición de sus efectos secundarios.

El término "bioseguro" tal como aquí se utiliza, se refiere a ausencia de efectos tóxicos, generación de tumores, alteraciones en el desarrollo embrionario (teratogénesis) u otros efectos adversos.

El término "enfermedad neurodegenerativa", tal como aquí se utiliza, incluye enfermedades que resultan de Ia degeneración o deterioro del tejido nervioso, en particular de las neuronas, que conduce, a Io largo del tiempo, a una disfunción o a una incapacidad; el término degeneración incluye pérdida de Ia viabilidad celular, pérdida de Ia función celular y/o pérdida del número de células (neuronas u otras). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple, etc. En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad relacionada con Ia muerte neuronal causada por una sustancia que, por ejemplo, causa estrés oxidativo o estrés de retículo endoplásmico o apoptosis o excitotoxicidad o muerte neuronal en general.

El término "enfermedad asociada con una oxidación indeseada", tal como aquí se utiliza, se refiere a una enfermedad causada por una oxidación indeseada (e.g., excesiva) o en el que dicha oxidación indeseada es un síntoma. Dicha oxidación indeseada puede ser Ia consecuencia del daño causado por radicales libres a proteínas, DNA y/o lípidos independientemente del radical libre específico implicado o de Ia diana. La oxidación indeseada implica una generación excesiva de radicales libres que puede causar una disfunción en células, tejidos u órganos y puede constituir, por tanto, un mecanismo potencial de una enfermedad. En una realización particular, dicha oxidación indeseada puede ser causada por Ia edad (envejecimiento) o por un proceso neurodegenerativo y puede provocar por sí sola o en combinación con otros factores el comienzo de diversas enfermedades. En una realización concreta, dicha oxidación indeseada se relaciona con el daño oxidativo causado por una sustancia que causa estrés oxidativo.

El término "proceso patológico asociado a Ia edad", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier evento o combinación de eventos relacionado/s con el envejecimiento que produzca/n pérdida de viabilidad celular del tejido nervioso o sensibilización celular del tejido nervioso, pérdida de Ia función celular y/o pérdida del número de células (neuronas u otras), incluyendo disfunción metabólica de las células, procesos de estrés, infecciones por patógenos, alteraciones genéticas, susceptibilidad genética, trauma, isquemia, epilepsia, etc. El término "enfermedad cardiovascular", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier enfermedad o disfunción o alteración del corazón o del resto del sistema cardiovascular o de Ia sangre.

El término "epilepsia", tal como aquí se utiliza, se refiere a un síndrome cerebral crónico de causas diversas, caracterizada por crisis recurrentes debidas a unas descargas excesivas hipersincrónicas de impulsos nerviosos por las neuronas cerebrales, asociadas eventual mente con d iversas manifestaciones clínicas y parad ínicas. Las crisis pueden ser convulsivas o no convulsivas. La epilepsia puede tener muchas causas; en unos casos puede ser debida a lesiones cerebrales de distintos tipos (e.g., traumatismos craneales, secuelas de meningitis, tumores, etc.); en otros casos no hay ninguna lesión sino una predisposición de origen genético a padecer Ia crisis; en otros casos, Ia etiología de Ia epilepsia puede ser ambiental, por tratamientos farmacológicos, por excitotoxicidad, trauma, procesos de estrés, envejecimiento, problemas del desarrollo, enfermedades neurológicas, crisis psicológicas, problemas en Ia gestación, problemas en el parto, etc.

El término "epiléptico o convulsivante", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier crisis epiléptica o convulsión de cualquier etiología, por ejemplo, genética, ambiental, por tratamientos farmacológicos, por excitotoxicidad, por trauma, por procesos de estrés, por envejecimiento, por problemas del desarrollo, por enfermedades neurológicas, por crisis psicológicas, por problemas en Ia gestación, por problemas en el parto, etc. Una crisis epiléptica ocurre cuando una actividad anormal eléctrica en el cerebro causa un cambio involuntario de movimiento o función del cuerpo, de sensación, en Ia capacidad de estar alerta o de comportamiento, y pueden ser parciales o generalizadas (convulsivas o no-convulsivas).

El término "deterioro cognitivo", tal como aquí se utiliza, se refiere a Ia pérdida o alteración de las funciones mentales, tales como memoria, orientación, lenguaje, reconocimiento visual o conducta que interfieren con Ia actividad e interacción social de Ia persona afectada de forma persistente en el tiempo

El término "infecciones fúngicas o víricas", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier colonización de un virus u hongo microscópico que resulta perjudicial para el funcionamiento normal o para Ia supervivencia del organismo colonizado o huésped.

El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos, primates y humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza. En una realización particular, dicho sujeto es un mamífero que padece, o es susceptible de padecer, procesos patológicos asociados a Ia edad, tal como envejecimiento, o una enfermedad neurodegenerativa, tal como una enfermedad neurodegenerativa crónica. El término "farmacéuticamente aceptable", tal como aquí se utiliza, se refiere a que el compuesto es tolerable fisiológicamente y no produce, en general, una reacción alérgica o una reacción desfavorable similar, tal como un trastorno gástrico, mareo o similares, cuando se administra a un sujeto; preferiblemente, dicho término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno o recogido en Ia farmacopea estadounidense o en otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales (e.g., farmacopea europea, etc.).

El término "sal farmacéuticamente aceptable", tal como aquí se utiliza, incluye "sales metálicas farmacéuticamente aceptables" así como "sales de a m i n a fa rm acéutica m ente acepta bl es" . E l térm i no "sa l m etá l ica farmacéuticamente aceptable" contempla sales formadas con iones de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio, hierro o zinc. El término "sal de amina farmacéuticamente aceptable" contempla sales con amoníaco y bases nitrogenadas orgánicas suficientemente fuertes para formar sales con ácidos carboxílicos. Dichas sales farmacéuticamente aceptables pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia.

El compuesto 2-etil-butirato de (1 S,2S,6R,8S,8aR)-1 ,2,6,7,8,8a- hexahidro-aj-dimetil-β-p-^R^R^-tetrahidro^-hidroxi-e-oxo^H- piran^-illetil]- 1 -naftalenilo puede ser obtenido por métodos de semisíntesis, tal como se describe para otros compuestos de Ia misma familia en Ia patente norteamericana US 4866090.

Numerosos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 frente a Ia acción de u na sustancia causante de estrés oxidativo, as í como su efecto neuroprotector frente a Ia acción de una sustancia causante de estrés de retículo endoplásmico, y su efecto neuroprotector frente a Ia acción de una sustancia causante de apoptosis en neuronas humanas colinérgicas, así como su efecto neuroprotector frente a una sustancia que causa excitotoxicidad, daño oxidativo, apoptosis, atrofia del hipocampo, muerte neuronal, deterioro cognitivo, pérdida de memoria temporal, pérdida de memoria espacial, etc.

El efecto neuroprotector frente a Ia acción de una sustancia causante de estrés oxidativo, tal como xantina/xantina oxidasa (XXO) se describe en el Ejemplo 2. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037, es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por estrés oxidativo, Io que pone de man ifiesto Ia capacidad neuroprotectora de este compuesto (Figura 1 ). Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de Ia muerte neuronal causada por Ia acción de una sustancia causante de estrés de retículo endoplásmico (tunicamicina), determinando que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por estrés de retículo endoplásmico, Io que pone de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 2). Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de Ia muerte neuronal causada por Ia acción de una sustancia causante de apoptosis (camptotecina), determinando que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por apoptosis, Io que pone de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 3). Asimismo, con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector de dicho compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis por citometría de flujo de Ia muerte neuronal causada por apoptosis y su inhibición por dicho compuesto, en comparación con un inhibidor específico de Ia muerte neuronal por apoptosis, el Z-VAD-fmk, determinando que el compuesto NST0037 es capaz de inhibir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por apoptosis y que este efecto neuroprotector se potencia con el pretratamiento del compuesto NST0037 y que es parcialmente dependiente de Ia biosíntesis de colesterol (Figura 4).

Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de Ia muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica (el kainato) en las neuronas del hipocampo de ratones, tal como se describe en el Ejemplo 3. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa Ia muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica, Io que pone de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 5). En dicha gráfica se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce Ia protección de las neuronas del hipocampo inhibiendo Ia muerte neuronal en las zonas CA1 y CA2. Por el contrario, Ia administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ningún cambio histopatológico destacable, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control. Asimismo, como es conocido, Ia muerte de neuronas del hipocampo induce, en algunos casos, el deterioro cognitivo del animal viéndose afectados los procesos de memoria; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto se veía acompañado de una reducción de Ia pérdida de memoria temporal y espacial producida por una sustancia excitotóxica. En los resultados obtenidos sobre Ia memoria temporal (Figura 6), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce Ia protección de Ia pérdida de este tipo de memoria. En los resultados obtenidos sobre Ia memoria espacial (Figura 7), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce Ia protección de Ia pérdida de este tipo de memoria. Por el contrario, Ia administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ningún cambio destacable sobre el estado cognitivo de los animales, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control. Asimismo, como es conocido, Ia administración de una sustancia excitotóxica y Ia muerte neuronal induce, en algunos casos, Ia muerte del animal; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 se veía acompañado de una reducción de Ia mortalidad producida por una sustancia excitotóxica. En los resultados obtenidos (Figura 8), se demuestra que el tratamiento con NST0037 administrado antes y después, o solamente después, de Ia administración del kainato produce un mayor índice de supervivencia, Io que indica que el tratamiento con dicho compuesto protege a los animales de Ia muerte y del resto de efectos orgánicos producidos por una sustancia excitotóxica. Por el contrario, Ia administración del compuesto NST0037 por sí solo no produce ninguna variación destacable sobre el índice de supervivencia de los animales, no mostrando diferencias apreciables con el grupo control.

Asimismo, como es conocido, Ia administración de una sustancia excitotóxica induce, en algunos casos, crisis convulsivas y epilepsia en el animal; por este motivo, los inventores analizaron si el efecto neuroprotector del compuesto NST0037 se veía acompañado de un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante producido por una sustancia excitotóxica (Ejemplo 4), observándose que Ia administración de NST0037 retrasaba el tiempo de aparición de Ia primera convulsión (latencia) (Figura 9), produciendo además una disminución en Ia gravedad y Ia duración de los síntomas epilépticos (Figura 10), Io que demuestra el efecto antiepiléptico o anticonvulsivante del compuesto NST0037.

Además, y debido a Ia naturaleza del compuesto NST0037, se estudió Ia capacidad inhibidora de Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutahl coenzima A reductasa (HMGR). Sorprendentemente, y tal como se muestra en el Ejemplo 5 los resultados demuestran que el compuesto NST0037 presenta un efecto hipocolesterolémico evidente. En los resultados obtenidos y tal como muestra Ia Figura 11 , se puede apreciar que Ia actividad inhibitoria de Ia enzima HMGR por parte del compuesto NST0037 está dentro del rango de dos de las estatinas comerciales (atorvastatina y simvastatina) usadas habitualmente para disminuir los niveles de colesterol en Ia población humana. Aquí se demuestra que el compuesto NST0037 ejerce un efecto inhibitorio de dicha enzima muy similar a Ia estatina con mayor actividad demostrada (Ia atorvastatina), e inhibe 7,5 veces más Ia enzima HMGR que Ia estatina más segura (Ia simvastatina). Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores ana l iza ron con más deta l l e I a actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las variaciones de las fracciones de colesterol en el plasma de ratones con hipercolesterolemia endógena, tal como se describe en el Ejemplo 5. Para ello, se comparó el efecto del compuesto NST0037 y de Ia simvastatina en dos grupos de ratones, determinándose los niveles de colesterol total tras Ia administración de los compuestos (Figura 12), donde se observó, de forma sorprendente, que ambos compuestos producían un efecto hipocolesterolémico similar. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol en las fracciones de LDL, HDL y VLDL, determinándose que ambos compuestos disminuyen de forma similar los niveles de colesterol en las fracciones LDL y VLDL, pero no en las HDL (Figura 13 a 15), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol libre y esterificado, determinándose que ambos compuestos disminuyen de forma similar los niveles de colesterol esterificado, pero no libre (Figura 16 a 17), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores ana l iza ron con más deta l l e I a actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las variaciones de las fracciones de colesterol en el plasma de ratones con hipercolesterolemia inducida, tal como se describe en el Ejemplo 6. Para ello, se comparó el efecto del compuesto NST0037 y de Ia simvastatina en dos grupos de ratones, determinándose los niveles de colesterol total tras Ia administración de los compuestos (Figura 18), donde se observó, de forma sorprendente, que el compuesto NST0037 presentaba un mayor efecto hipocolesterolémico que Ia simvastatina. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol en las fracciones de LDL, HDL y VLDL, determinándose que el compuesto NST0037 disminuye más eficientemente los niveles de colesterol en Ia fracción LDL que Ia simvastatina, no alterando los niveles de colesterol ni en las fracciones HDL (al igual que Ia simvastatina) ni en las VLDL (al contrario que Ia simvastatina) (Figuras 19 a 21 ), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector. Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, se analizaron los niveles de colesterol libre y esterificado, determinándose que en ambos casos el NST0037 disminuye de forma más eficiente que Ia simvastatina ambas fracciones de colesterol (Figura 22 y 23), Io que demuestra un efecto hipocolesterolémico y cardioprotector.

Para que un compuesto pueda ser administrado a Ia población humana, es necesario que se demuestre su inocuidad y seguridad. Con este objetivo, los inventores analizaron Ia bioseguridad del compuesto NST0037 en un modelo toxicológico ampliamente utilizado, el embrión de pez cebra, siguiendo Ia metodología descrita en el protocolo C15 de Ia OECD, tal como se describe en el Ejemplo 7. En este modelo, los inventores compararon el efecto del compuesto en comparación con Ia simvastatina en concentraciones superiores a las dosis utilizadas en Ia clínica, con el objetivo de causar daños evidentes en los embriones para poder definir mejor los efectos adversos de dicho compuesto. Así Ia administración de una alta dosis de NST0037 provocó Ia mortalidad de todos los embriones del ensayo, al igual que ocurrió con Ia misma dosis de simvastatina, aunque ésta resultó más tóxica, ya que Ia disminución del índice de supervivencia comenzó antes en el tiempo (Figura 24). Cuando se utilizó una dosis 10 veces menor, Ia simvastatina produjo una disminución significativa del índice de supervivencia en comparación con los controles, mientras el NST0037 no produjo una disminución estadísticamente significativa de Ia supervivencia de los embriones, indicando su mayor seguridad (Figura 25). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudiaron las dosis letales 50 (LD ₅₀ ) en diferentes puntos temporales con tratamientos de NST0037 o de simvastatina en método sem iestático, observándose que en todos los tiempos las LD ₅ O de Ia simvastatina eran menores que las de NST0037, Io que indica una mayor bioseguridad de este último compuesto (Figura 26). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudió el porcentaje de larvas sanas al final del experimento en comparación con Ia simvastatina, observándose un mayor número de larvas sanas en los tratamientos con NST0037 en comparación con Ia simvastatina (Figura 27). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudió el porcentaje de larvas con deformidades o de aspecto anómalo con el tiempo en comparación con Ia simvastatina, observándose un menor número de larvas con deformidades o de aspecto anómalo en los tratamientos con NST0037 en comparación con Ia simvastatina (Figura 28). Con el objetivo de definir mejor Ia bioseguridad del compuesto, se estudió el porcentaje de latidos cardíacos en función de Ia dosis utilizada comparando NST0037 con Ia simvastatina, observándose una mayor disminución del ritmo cardíaco en Ia mayor dosis evaluada de simvastatina que en Ia de NST0037, mientras que a dosis menores solamente Ia simvastatina produjo una disminución estadísticamente significativa del ritmo cardíaco (Figura 29), Io que indica una mayor bioseguridad del compuesto NST0037.

También se estudió Ia actividad antifúngica del compuesto NST0037 mediante bioensayo frente a estatinas (lovastatina, atorvastatina y simvastatina). Los resultados obtenidos mostraron que el compuesto NST0037 fue el único capaz de producir halos de inhibición en todo el rango de concentraciones ensayadas, incluso a las más bajas (Figura 30), Io que indica una mayor actividad antifúngica.

Por otra parte, se estudió Ia capacidad del compuesto NST0037 para incrementar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, ya que se han demostrado los efectos neuroprotectores del aumento de expresión de este gen frente a Ia enfermedad de Alzheimer (Cechi et al., J. CeII. Mol. Med. 2008; 12: 1990-2002). Se ha descrito (Greeve et al., J. Neurosci. 2000; 20: 7345-52) que el producto del gen seladin-1/DHCR24 ejerce su poder neuroprotector mediante el efecto antiapoptótico por inhibición de Ia caspasa-3, y regulando Ia síntesis de colesterol a partir de desmosterol, Io que determina Ia generación de una barrera contra las agresiones neurotóxicas y previene Ia producción de β-amiloide. Estos mecanismos de acción indican que el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 tiene un efecto neuroprotector general, con Io que aquellos fármacos que producen un aumento de Ia expresión de este gen pueden ser potencialmente utilizados en Ia prevención y/o tratamiento de Ia muerte neuronal asociada a enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, status epilepticus, Huntington, etc.) o de enfermedades asociadas con una oxidación indeseada o de procesos patológicos asociados a Ia edad. La capacidad de aumentar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 mediante Ia administración de NST0037 se describe en el Ejemplo 9, en comparación con Ia memantina (uno de los fármacos utilizados habitualmente para tratar Ia EA). En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de aumentar cuantitativamente, de forma significativa y dosis-dependiente Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, Io cual se demuestra mediante el análisis de Ia expresión relativa usando PCR cuantitativa a tiempo real. Dichos resultados ponen de manifiesto Ia capacidad neuroprotectora del compuesto NST0037 (Figura 31 ). Adicionalmente, el aumento de Ia expresión del gen seladin- 1/DHCR24 y el incremento en Ia cantidad de Ia proteína codificada por este gen han sido corroborados en un estudio paralelo utilizando Ia simvastatina. Los resultados indican que también esta estatina es capaz de aumentar Ia expresión de este gen, expl icando así su capacidad n euro protectora, e indicando que se trata de un mecanismo general de Ia familia de las estatinas que son capaces de aumentar Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24.

Adicionalmente se estudió el efecto neuroprotector en cultivos neuronales humanos del compuesto NST0037 frente a agresiones que mimetizan algunas de las enfermedades neurodegenerativas, como Ia EA mediante Ia inhibición de Ia proteín fosfatasa 1 (Figura 32) o de Ia enfermedad de Huntington mediante Ia inhibición de Ia succinato deshidrogenasa (Figura 33). Además se estudió el efecto sobre Ia modulación de las caspasas efectoras 3/7, determinándose que el compuesto NST0037 previene Ia activación de las mismas, y que este efecto está relacionado con Ia ruta de biosíntesis de colesterol (Figura 34). Además, se determinó que el compuesto NST0037 es capaz de reducir los niveles de Aβ(1 -40) y Aβ(1 -42) en un modelo celular neuronal humano que sobreexpresa Ia proteína APP (Figura 35). Además se determinó que el efecto neuroprotector del NST0037 frente a Ia muerte causada por estrés oxidativo es modulado por el mevalonato, el cual es un precursor de Ia ruta de biosíntesis del colesterol y el producto de Ia reacción enzimática que cataliza Ia enzima HMG-CoA Reductasa (Figura 36).

Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de las huellas histopatológicas asociadas a Ia muerte neuronal causada por una sustancia excitotóxica (el kainato) en las neuronas del hipocampo de ratones, tal como se describe en el Ejemplo 15. En dicho ejemplo se observa que el compuesto NST0037 es capaz de prevenir o mejorar Ia distrofia neurítica (Figura 37), así como del daño oxidativo, de Ia apoptosis y de Ia astrogliosis (Figura 38) causada por Ia administración de una sustancia excitotóxica.

Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron el potencial efecto terapéutico del tratamiento con NST0037 en un modelo agudo de enfermedad de Parkinson en ratón tal como se describe en el Ejemplo 16. Para ello, y tras Ia administración aguda de una neurotoxina parkinsoniana específica de las neuronas dopaminérgicas (MPTP), se observó que el NST0037 era capaz de modificar los efectos deletéreos causados por Ia neurotoxina como Ia mortalidad (Figura 39), el déficit locomotor en relación a los parámetros de resistencia (Figura 40) y fuerza (Figura 41 ), Ia neurodegeneración (Figura 42) además de Ia pérdida de neuronas dopaminérgicas (Figura 43) en regiones implicadas en Ia enfermedad de Parkinson como Ia sustancia nigra o el estriado. Con el objetivo de definir mejor el efecto neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron el potencial efecto terapéutico del tratamiento con NST0037 en un modelo subcrónico de enfermedad de Parkinson en ratón tal como se describe en el Ejemplo 17. Para ello, y tras Ia administración subcrónica de una neurotoxina parkinsoniana específica de las neuronas dopaminérgicas (MPTP), se observó que el NST0037 era capaz de modificar los efectos deletéreos causados por Ia neurotoxina como el déficit locomotor en relación a Ia resistencia motora (Figura 44), Ia muerte neuronal o del daño oxidativo asociado a Ia peroxidación lipídica (Figura 45) en Ia sustancia nigra. Con el objetivo de definir mejor el paso de barrera hematoencefálica del compuesto NST0037, los inventores analizaron diferentes parámetros como Ia lipofilicidad teórica, el porcentaje de paso y Ia permeabilidad efectiva (Figura 46, Tabla I) tal como se describe en el Ejemplo 18.

Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores analizaron con más detalle Ia actividad hipocolesterolémica mediante el análisis de las reducciones de colesterol en dos líneas celulares humanas de origen hepático y neuronal (Figura 47), tal como se describe en el Ejemplo 19. Además, el tratamiento durante 28 días del compuesto NST0037 de forma oral en ratones con hiperlipidemia familiar produjo una disminución de los niveles de colesterol total, ApoB, c-LDL, c- VLDL, c-HDL (Figura 48), colesterol libre y esterificado (Figura 49) y del estado de oxidación plasmático (Figura 50), tal como se describe en el Ejemplo 20. Además, el tratamiento durante 3 meses del compuesto NST0037 de forma oral en ratones con hiperlipidemia familiar produjo una disminución de los niveles de colesterol total, c-LDL y de aumento de c-HDL (Figura 51 ), y una disminución de los niveles de colesterol libre y esterificado (Figura 52), tal como se describe en el Ejemplo 21.

Con el objetivo de definir mejor el efecto hipocolesterolémico del compuesto, los inventores analizaron con más detalle Ia actividad hipocolesterolémica mediante reducciones de colesterol y de las fracciones asociadas (Figura 53), de triglicéridos (Figura 54), y del estado redox plasmático en ratas Zucker con hiperlipidemia endógena (Figura 55), tal como se describe en el Ejemplo 22. Con el objetivo de definir mejor Ia modulación del gen seladin-1/DHCR24 por el compuesto NST0037, los inventores analizaron su regulación en el cerebro de ratones tratados oralmente con NST0037 (Figura 56) tal como se describe en el Ejemplo 18, demostrando que a las 4h de Ia administración de NST0037 se produce un aumento de Ia expresión de este gen neuroprotector. Con el objetivo de definir mejor Ia inocuidad y seguridad del compuesto

NST0037 y para corroborar los estudios realizados en el Ejemplo 7 con embriones de pez cebra, los inventores decidieron analizar Ia bioseguridad del compuesto NST0037 en larvas tal como se describe en el Ejemplo 24. En este modelo, los inventores compararon el efecto del compuesto en comparación con Ia simvastatina realizando curvas crecientes de concentraciones, que revelaron una alta seguridad del compuesto ya que no se produjo mortalidad alguna con ninguno de los dos tratamientos (Tabla II), y donde Ia simvastatina produjo un menor porcentaje de larvas sanas que el NST0037 (Figura 57) y un mayor porcentaje de larvas con aspecto anómalo (Figura 58). Con el objetivo de definir mejor Ia inocuidad y seguridad del compuesto

NST0037 y para corroborar los estudios realizados en ejemplos previos, los inventores decidieron analizar Ia bioseguridad del NST0037 tras tratamiento en peces adultos en comparación con Ia simvastatina, tal como se describe en el Ejemplo 25. Los resultados indicaron que mientras Ia simvastatina produce una pérdida significativa de peso en los animales, el NST0037 no varía significativamente dicho parámetro (Figura 59). Además, mientras Ia simvastatina produjo variaciones histopatológicas en los animales tratados, el NST0037 produjo menos efectos deletéreos (Figura 60). Con el objetivo de definir mejor Ia inocuidad y seguridad del compuesto NST0037 y para corroborar los estudios realizados en ejemplos previos, los inventores decidieron analizar Ia bioseguridad del NST0037 tras tratamiento en peces adultos en comparación con Ia simvastatina, tal como se describe en el Ejemplo 26. Los resultados indicaron que mientras Ia simvastatina produce una mortalidad significativa a los 4 días de tratamiento, Ia mortalidad asociada al NST0037 fue residual (Tabla III). Además, mientras Ia simvastatina produjo variaciones histopatológicas claras en el ovario de los animales tratados con 100 mg/Kg, el NST0037 no produjo ningún efecto deletéreo a esta dosis (Figura 63).

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener el compuesto NST0037, y/o su forma hidroxiácida y/o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido y/o una prodroga o solvato farmacéuticamente aceptable del compuesto o de su forma hidroxiácida junto con u no o más adyuvantes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "sal, prodroga o solvato" farmacéuticamente aceptable se refiere a cualquier sal, solvato farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que, en su administración al receptor, es capaz de proporcionar (de forma directa o indirecta) un compuesto tal y como se ha descrito en Ia presente invención. No obstante, las sales farmacéuticamente inaceptables también caen dentro del alcance de Ia invención, ya que éstas pueden ser útiles para Ia preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales y prodrogas puede ser llevada a cabo mediante métodos conocidos en el estado de Ia técnica.

Cualquier compuesto que es una prodroga del compuesto de fórmula (I) o de su forma hidroxiácida está dentro del alcance de Ia invención. El término "prodroga" se utiliza en su significado más amplio y abarca aquellos derivados que son convertidos in vivo a los compuestos de Ia invención. Tales derivados serían evidentes para un experto medio en Ia materia e incluyen los siguientes derivados de los presentes compuestos: esteres, esteres de aminoácidos, esteres de fosfatos, esteres de sales sulfonato de metales, carbamatos y amidas. Los compuestos según Ia invención pueden estar en forma cristalina, bien como compuestos libres o como solvatos (por ejemplo, hidratos) y se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de Ia presente invención. Los métodos de solvatación en general son conocidos en el estado de Ia técnica. En una realización particular el solvato es un hidrato. Las composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto

NST0037, o una forma hidroxiácido del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido, pueden formularse en cualquier forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por Ia vía de administración elegida, e.g., oral, parenteral (subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.), tópica, rectal, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas por esta invención pueden formularse en una forma farmacéutica sólida de administración por vía oral (e.g., granulos, comprimidos, cápsulas, etc.), en una forma farmacéutica l íquida de administración por vía oral (e.g ., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), en una forma farmacéutica para su administración por vía parenteral (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). Para ello, en cada caso, se elegirán los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para Ia forma farmacéutica de administración y vía de administración elegida, por ejemplo, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., para Ia formulación de formas farmacéuticas de administración sólidas, y tampones, tensioactivos, etc., para Ia formulación de formas farmacéuticas de administración l íquidas. Dichos vehículos y excipientes deben ser farmacéuticamente aceptables y farmacológicamente tolerables y han de poder ser combinados con otros componentes de Ia formulación sin ejercer ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas farmacéuticas de administración de dicho principio activo puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 1 ^a Edición, 1993, Luzán 5, S. A. de Ediciones. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende, el compuesto NST0037, o una forma hidroxiácido del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido, en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente eficiente" se refiere a Ia cantidad de compuesto calculada para producir el efecto deseado. La dosis del compuesto NST0037, o una forma hidroxiácido del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho hidroxiácido, a administrar a un sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores, entre los que se incluyen las características del compuesto utilizado, e.g., su actividad y vida med ia biológ ica , Ia concentración del compuesto en Ia composición farmacéutica, Ia situación clínica del sujeto, Ia severidad de Ia patología, Ia forma farmacéutica de administración elegida, etc. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos o, alternativamente, se pueden seguir otras pautas de administración, no necesariamente diaria sino también de forma puntual, semanal, etc.

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención, si se desea, puede usarse junto con otros fármacos, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo, enfermedades asociadas con una oxidación indeseada, procesos patológicos asociados a Ia edad y progeria, epilepsia, crisis epilépticas, convulsiones, enfermedades cardiovasculares, o infecciones fúngicas o víricas con el fin de aumentar Ia eficiencia de Ia composición farmacéutica proporcionada por esta invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos ad icionales pueden formar parte de Ia misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que Ia composición farmacéutica proporcionada por esta invención o en momentos diferentes (administración secuencial) respecto a Ia administración de Ia composición farmacéutica proporcionada por esta invención. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar Ia invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de Ia misma.

EJEMPLO 1 Síntesis de 2-etil-butirato de (1S,2S,6R,8S,8aR)-1,2,6J,8,8a-hexahidro-3J- d¡met¡l-8-r2-r(2R,4R)-tetrah¡dro-4-h¡drox¡-6-oxo-2H-pir an-2-¡llet¡ll-1- naftalenilo

El compuesto identificado como NST0037 se preparó siguiendo Ia metodología descrita en Hoffman, et al. {J. Med. Chem., 1986, 29, 849-852) para compuestos similares.

1.1. Purificación de lovastatina

Partiendo de un extracto de procedencia natural, Ia lovastatina se purificó por cromatografía en columna utilizando como eluyente un gradiente de hexano y acetato de etilo.

1.2. Obtención de monacolina J

Se prepara una disolución de 0,7 g de hidróxido potásico en 0.5 mi de agua y se añade poco a poco 3 mi de metanol. Posteriormente, se añaden 0.5 g de Lovastatina y se pone Ia disolución a reflujo durante 21 horas. Después del tratamiento de Ia reacción se obtiene una mezcla al 50% de monacolina J y producto de apertura. 1.3. Preparación del derivado protegido

Se prepara una disolución de 0,5 g de Monacolina J en 10 mi de diclorometano. Se añaden 0,4345 g de imidazol y se agita hasta disolución. A continuación se añade 0,4835 g de cloruro de terc-butil-dimetilsilano disueltos en 5 mi de diclorometano, y se continúa Ia agitación durante 24 horas. Se sigue Ia reacción por TLC utilizando como eluyente diclorometano-metanol (10:1 ). Rendimiento: 96 %.

1.4. Preparación del derivado adiado

En un matraz con atmósfera inerte, se disuelven 0,3 g del derivado protegido obtenido previamente en 2 mi de piridina. Posteriormente, se añade 0,06 g de DMAP disuelta en 2 ml_ de piridina. Se coloca el matraz de reacción en baño de hielo y se añaden 0,378 mi del cloruro de 2-etilbutirilo. A continuación se agita durante una hora a 0 ^o C y a temperatura ambiente durante 18 horas. Se sigue Ia reacción por TLC utilizando como eluyente hexano-acetato de etilo (2:1 ). Rendimiento 95%. 1.5. Síntesis del compuesto final

0,368g del derivado obtenido previamente se disuelven en 2 mi de THF. A continuación, se añade sobre el medio de reacción una disolución de 0,16 mi de ácido acético y 2,16 mi de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. Se sigue Ia reacción por TLC utilizando como eluyente diclorometano-acetona (6:1 ). Rendimiento 75 %.

EJEMPLO 2

Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por diferentes agresiones: estrés oxidativo, estrés de retículo endoplásmico v apoptosis

2.1. Protección por NST0037 dé la muerte neuronal inducida por estrés oxidativo

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el sigu iente med io de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que origina daño oxidativo (produce radicales libres como peróxido de hidrógeno, anión superóxido, radical hidroxilo) Io que desencadena muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo (medio)

- Xantina/xantina oxidasa (XXO): medio más xantina 10 μM/ xantina oxidasa 60 mU/mL, que produce Ia muerte del 50% de las células. - XXO más NST0037: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más

NST0037 a 1 , 4, 10, 20, 40 ó 100 μM.

Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células que metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondhal). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 1 , como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia XXO. Se observó protección de Ia muerte desde 1 a 100 μM de NST0037, siendo las diferencias respecto a Ia XXO estad ísticamente significativas, según Ia f de Student, para todas las concentraciones evaluadas, alcanzando una máxima protección del 78% a 20 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés oxidativo.

2.2. Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por estrés de retículo endoplásmico

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con tunicamicina que origina estrés reticular. La tunicamicina es un inhibidor de Ia N-glicosilación de proteínas, Io que produce el plegam iento anormal de las prote ínas en el retículo endoplásmico, con Io que dichas proteínas se acumulan y producen estrés que desemboca en Ia muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes:

- Control: medio de cultivo (medio)

- Tunicamicina (Tm): medio más tunicamicina 24 μM, que produce Ia muerte del 50% de las células.

- Tm más NST0037: medio más Tm (24 μM) más NST0037 a 1 , 4, 10, 40 ó 100 μM.

Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia med ida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 2, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia Tm. Se observó protección de Ia muerte desde 1 a 100 μM de NST0037, alcanzando un 55% a 40 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por estrés de retículo endoplásmico. 2.3. Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por apoptosis El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con camptotecina que origina parada del ciclo celular. La camptotecina que es un inhibidor de Ia Topoisomerasa I, por Io que impide Ia duplicación del DNA y desencadena Ia parada del ciclo celular y Ia muerte por apoptosis. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo (medio)

- Camptotecina(CPT): medio más camptotecina 20 nM, que produce Ia muerte del 50% de las células.

- Camptotecina más NST0037: medio más camptotecina (20 nM) más NST0037 a 1 , 4, 10, 20, 40 ó 100 μM. Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 3, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia camptotecina. Se observó protección de Ia muerte desde 4 a 100 μM de NST0037, alcanzando un 18%, 28%, 27% y 27% a 4, 10, 40 y 100 μM, respectivamente. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por parada del ciclo celular. 2.4. Determinación de Ia inhibición de Ia apoptosis mediante citometría de flujo

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el sigu iente med io de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia apoptosis (muerte celular programada) causada por el tratamiento con camptotecina que inh ibe Ia enzima topoisomerasa I , Io que impide Ia duplicación del DNA y desencadena muerte celular apoptótica. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 6 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 8x10 ⁵ células/pocilio y 7x10 ⁵ células/pocilio para el ensayo con pretratamiento; para cada condición del ensayo se sembraron 2 pocilios de Ia placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ se procedió a los tratamientos celulares con 2 mi de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo (medio)

- Camptotecina: medio más camptotecina 50 μM.

- Camptotecina más Z-VAD-fmk: medio más camptotecina 50 μM más Z-VAD-fmk 50 μM, como control positivo de inhibición. - Camptotecina más NST0037: medio más camptotecina 50 μM más

NST0037 a 10, 40 ó 100 μM.

En el ensayo con pretratamiento las células se trataron previamente con 40 μM de NST0037, 100 μM de mevalonato o ambos juntos durante 24 h y después se trataron con 50 μM camptotecina, el resto del procedimiento fue similar al ensayo sin pretratamiento.

Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 6 h, pasadas las cuales se recogieron junto con su medio de cultivo y se centrifugaron a 300xg durante 5 min. Se eliminó el medio, se realizó un lavado con PBS y se fijaron durante 2 minutos con 500 μl de etanol al 70% a - 2O ⁰ C. Una vez fijadas se centrifugaron a 400xg durante 5 min, se lavaron con PBS y se les añadió yoduro de propidio a 0,05 mg/ml, diluido en buffer de ciclo (Citrato sódico 0,1 %, Nonidet P-40 0,3% y RNAsa 0,02 mg/ml) y se incubaron 1 hora a 37 ⁰ C. Pasado este tiempo se analizaron por citometría de flujo, comparando Ia fluorescencia del yoduro de propidio frente a Ia cantidad de DNA. El porcentaje de apoptosis se midió sobre Ia región sub-G1 de cada una de las condiciones.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 4A y B, como el porcentaje de Ia inhibición de Ia apoptosis de cada tratamiento referido a Ia apoptosis producida por Ia camptotecina. Se observó una protección máxima del 18% a 40 y 100 μM de NST0037 (Figura 4A), por Io que este compuesto muestra un efecto protector de Ia apoptosis en células humanas de origen neuronal. El Z-VAD-fmk, inhibidor específico de caspasas, inhibió específicamente Ia apoptosis producida por Ia camptotecina. Estos resultados fueron corroborados mediante experimentos de pretratamiento del NST0037 a 40 μM (Figura 4B), Io que produjo un aumento del porcentaje de protección (llegando hasta el 45%). Adicionalmente se determinó que Ia protección ejercida por NST0037 es inhibida parcialmente por Ia adición de mevalonato al medio, Io que indica que el efecto neuroprotector del NST0037 está relacionado con Ia biosíntesis del colesterol o con alguno de los precursores de Ia ruta.

EJEMPLO 3 Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal en el hipocampo, del déficit cognitivo y de Ia muerte causada por una sustancia excitotóxica

3.1. Efecto protector de NST0037 frente a Ia muerte neuronal en el hipocampo de ratones causada por una sustancia excitotóxica

En base a los resultados del Ejemplo 2, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 demostrado en neuronas colinérgicas humanas se corroboraba en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA). Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con

PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iv) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a

50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. v) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a

50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia arquitectura celular del hipocampo se utilizó Ia tinción con hematoxilina y eosina en cortes de 5 μm de grosor.

Como muestra Ia Figura 5, Ia pauta de administración PBS+KA+PBS produjo un severo daño neuronal en Ia región CA1 y CA2 del hipocampo de los ratones. En las muestras de dicho grupo observamos ausencia de neuronas, evidencias de necrosis y numerosos núcleos picnóticos, Io que demuestra muerte neuronal. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presenta ba n u n a estru ctu ra cel u l a r ig u al a l os control es (g ru po

PBS+PBS+PBS) sin evidencias de daño celular en las regiones CA1 y CA2.

Además y de manera sorprendente, las muestras del grupo

PBS+KA+NST0037, mostraron diversas señales de daño y muerte neuronal en el hipocampo. Sin embargo, comparando de visu las muestras de los grupos

PBS+KA+PBS frente a las del grupo PBS+KA+NST0037 observamos un mayor número de neuronas del hipocampo sin daño en el grupo con el tratamiento de

NST0037, Io que indica su efecto neuroprotector. Por último las muestras del grupo NST0037+PBS+NST0037 presentaban un patrón igual al observado en los animales del grupo PBS+PBS+PBS.

En resumen, el pretratamiento con NST0037 (grupo NST0037+KA+NST0037) protegió completamente de Ia muerte neuronal producida por el KA en las regiones CA1 y CA2 del hipocampo. Además el comienzo del tratamiento con NST0037 después de Ia inoculación de KA redujo cualitativamente el daño y Ia muerte neuronal en esta región. También se demostró que Ia administración diaria de NST0037 durante 8 días no fue neurotóxica para los ratones. 3.2. Efecto protector de NST0037 frente al deterioro de Ia memoria de tipo episódica en ratones causado por una sustancia excitotóxica

La excitotoxicidad que produce el KA induce, a los pocos días tras su inoculación en ratones, el deterioro de Ia memoria de tipo episódico, afectando a Ia memoria temporal y produciendo un grave déficit en Ia memoria espacial. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de una protección de Ia memoria que se deteriora por efecto de una sustancia excitotóxica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. iii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iv) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. v) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

A los 3 días post-inoculación de KA les fue realizado a los animales un test de reconocimiento de objetos denominado test de memoria integral. En Ia

Figura 6 se muestran los resultados de Ia relación en el tiempo de exploración de los objetos antiguos frente a los objetos recientes (memoria temporal). Se observó que el grupo con Ia pauta de tratamiento NST0037+KA+NST0037 evitó

Ia disminución en Ia capacidad de memoria temporal en comparación con los ratones d e l g ru po PBS+KA+PBS. Además los animales del grupo

PBS+KA+NST0037 también presentaron una mejora del estado de Ia memoria temporal respecto a los tratados del grupo PBS+KA+PBS. Los datos también mostraron que el grupo de los ratones con Ia pauta NST0037+PBS+NST0037 también presentaron una mejora de Ia memoria temporal respecto al grupo

PBS+PBS+PBS.

En Ia Figura 7 se muestran los resultados de Ia relación en el tiempo de exploración del objeto antiguo desplazado frente al objeto antiguo sin desplazar

(memoria espacial). El grupo de ratones con las pautas de tratamiento

NST0037+KA+NST0037 o NST0037+PBS+NST0037 mostraron una ratio de exploración de objetos que demuestra que Ia memoria espacial se encuentra intacta ya que no se observan diferencias respecto al grupo PBS+PBS+PBS. Sin embargo los ratones del grupo PBS+KA+PBS presentaron un deterioro grave de Ia memoria espacial. El grupo del tratamiento PBS+KA+NST0037 mostró una mejora de este tipo de memoria respecto a los que fueron tratados del grupo PBS+KA+PBS. Estos estudios indican que el tratamiento antes y después (o sólo después) del daño con una sustancia excitotóxica con el compuesto NST0037, tiene un efecto de protección de Ia memoria episódica (temporal y espacial) que degenera tras Ia administración de una sustancia excitotóxica. 3.3. Efecto protector de NST0037 frente a Ia muerte causada por una sustancia excitotóxica

Es conocido que Ia administración de una sustancia excitotóxica a animales induce, en algunos casos, Ia muerte del animal. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de una reducción de Ia mortalidad producida por una sustancia excitotóxica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veintiocho animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, siguieron Ia siguiente pauta: vi) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. vii) Pauta PBS+KA+PBS: 6 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de PBS. viii) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. ix) Pauta NST0037+KA+NST0037: 6 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. x) Pauta NST0037+PBS+NST0037: 5 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de PBS y durante los siguientes 3 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. Durante todo el tiempo del ensayo se registraron los óbitos, los resultados se muestran en Ia Figura 8 mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier.

Los resultados del estudio de Ia mortalidad producida por el KA mostraron que el grupo con Ia pauta de tratamiento NST0037+KA+NST0037 protegió de Ia muerte asociada al daño producido por una sustancia excitotóxica. Además, y I o q u e es m ás i m porta nte , el grupo con Ia pauta de tratamiento

PBS+KA+NST0037 aumenta Ia supervivencia de los animales frente a los del grupo con Ia pauta PBS+KA+PBS.

Estos estudios indican que el tratamiento antes y después (o sólo después) del daño con una sustancia excitotóxica con el compuesto NST0037, tiene un efecto de protección de mortalidad causada por Ia administración de una sustancia excitotóxica.

EJEMPLO 4

Efecto antiepiléptico de NST0037 frente a Ia acción de una sustancia excitotóxica

Es conocido que Ia administración de una sustancia excitotóxica a animales induce, en algunos casos, crisis epilépticas y convulsiones en los an imales. Debido a esto los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 se veía acompañado de un efecto antiepiléptico producido por una sustancia excitotóxica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 25 mg/kg de kainato (KA) disuelto en PBS. Trece animales fueron pretratados a 24 y 0.5 horas antes de Ia inoculación con KA mediante inyección intraperitoneal con PBS (pauta de administración PBS+KA) y 6 fueron pretratados a 24 y 0.5 horas antes de Ia inoculación con KA mediante inyección intraperitoneal con NST0037 a una dosis de 50 mg/kg (pauta de administración NST0037+KA). Tras Ia inoculación los animales fueron alojados en cubetas de manera individual para su seguimiento. Durante Ia observación se registró el nivel máximo de epilepsia de los animales según Ia escala Racine cada diez minutos y durante al menos 120 minutos post-inoculación (m.p.i.). Posteriormente se realizaron estudios comparativos de los fenómenos epileptogénicos entre el tratamiento con PBS (PBS+KA) y con NST0037 (NST0037+KA). Se observaron diferencias en el porcentaje de animales que entraron en status epilepticus, es decir que presentaron convulsiones clónico- tónicas, entre el grupo de NST0037+KA y que fue de un 33.3% (2 de 6) frente al grupo de pauta de tratamiento con PBS+KA y que fue de un 76.9% (10 de 13), Io que demuestra que el compuesto NST0037 es antiepiléptico y anticonvulsivante. También se observaron diferencias en el tiempo en el que aparecían las primeras convulsiones (periodo de latericia), donde Ia latencia del grupo NST0037+KA (1 03.3±13.1 min .) fue mayor que con Ia pauta de tratamiento PBS+KA (74.6±8.6 min.) como se muestra Ia Figura 9, Io que demuestra un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante del compuesto NST0037. En base a estos resultados los inventores decidieron averiguar si el efecto antiepiléptico y anticonvulsivante se confirmaba con los niveles de epilepsia y por Ia gravedad de los síntomas, observando que los animales del grupo con Ia pauta PBS+KA alcanzaban un nivel de epilepsia 4 en Ia escala Racine, mientras Ia pauta NST0037+KA no produjo en ningún momento un nivel de epilepsia 3 en dicha escala, indicando que el compuesto NST0037 es antiepiléptico y anticonvulsivante. Además, a partir de los 100 m.p.i. Ia pauta NST0037+KA produjo Ia desaparición de los síntomas epileptogénicos, mientras Ia pauta de PBS+KA presentaba espasmos y convulsiones graves.

Estos estudios indican que el tratamiento con el compuesto NST0037, tiene un efecto antiepiléptico y anticonvulsivante debido a Ia administración de una sustancia excitotóxica.

EJEMPLO 5

Actividad inhibitoria de Ia HMGR y efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón

5.1. Efecto inhibitorio de NST0037 sobre Ia actividad enzimática de Ia HMGR

Debido a Ia naturaleza del compuesto, se determinó el grado de inhibición de Ia enzima HMGR por el compuesto NST0037, ya que este enzima es clave en Ia síntesis de colesterol celular y en Ia regulación fisiológica de dicha síntesis. El efecto de este compuesto se comparó con el de dos estatinas conocidas, Ia atorvastatina y Ia simvastatina, compuestos para los que ya está descrito un potente efecto inhibitorio sobre HMGR. Durante Ia reacción, Ia HMGR utiliza NADPH como agente reductor y como sustrato 3-hidroxi-3- metilglutaril coenzima A (HMGCoA), produciendo ácido mevalónico, CoASH y NADP+. La disminución de Ia absorbancia a Ia que absorbe el NADPH (340 nm) es una medida directa de Ia actividad catalítica de Ia HMGR y sirve para calcular los porcentajes de inhibición de diferentes compuestos. Para llevar a cabo las medidas de inhibición de HMGR, el ensayo se llevó a cabo en placa de 96 pocilios, con un volumen de reacción total de 200 μl. El buffer de reacción (KH ₂ PO ₄ 50 mM, KCI 1 M, Bovine Serum Albumin [BSA] 2 mg/ml y DTT 5 mM, a pH=7.3) se preparó en el momento de llevar a cabo Ia reacción y se mantuvo a 37 ⁰ C. En los ensayos se incluyeron:

- Un blanco: Carente de HMGR que informa de Ia estabilidad de NADPH durante Ia reacción.

- Un control: Contiene todos los componentes de Ia reacción pero carece de compuesto problema. - Compuestos problema: NST0037, Atorvastatina y Simvastatina a diversas concentraciones. En todos los casos se empleo Ia forma acida de los compuestos.

Se llevaron a cabo cinco ensayos independientes con NST0037, cuatro ensayos independientes con atorvastatina y seis ensayos independientes con simvastatina, determinándose Ia potencia de Ia inhibición en un rango de concentraciones que permitían definir las constantes de inhibición al 50% (IC ₅ o), mediante determinación espectrofotométrica de Ia caída de NADPH a 37 ⁰ C, y tal y como se muestra en Ia Figura 1 1. El descenso de absorbancia a 340 nm permite calcular el porcentaje de actividad enzimática HMGR respecto al control . Las IC50 fueron determinadas mediante el método Trimmed Spearman-Karber (Versión 1 .5). Los resultados indican que Ia potencia de inhibición de NST0037 está sorprendentemente próxima a Ia de Ia estatina más potente, Ia atorvastatina, y es 7,5 veces más potente que Ia simvastatina, Io que demuestra un efecto inhibidor de Ia HMGR claro.

5.2. Efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)

En base a los resultados del punto anterior, los inventores decidieron averiguar si Ia actividad inhibidora de Ia enzima HMGR por el compuesto NST0037 se correspondía con una variación de colesterol total y de sus fracciones en un modelo de hiperlipidemia endógena en ratón.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 46 semanas de edad y de Ia cepa ApoB100, Ia cual presenta una deficiencia en Ia retirada de colesterol de Ia sangre que produce un aumento anormalmente elevado de colesterol en plasma. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Para llevar a cabo el experimento a los animales en condición de ayuno se les extrajo sangre por punción ocular. De dicha sangre se obtuvo el plasma en el que se determinaron los niveles de colesterol total y de sus fracciones previo a Ia administración de las sustancias a estudio. Inmediatamente después, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 50 mg/kg de cada uno de los compuestos problema. Cuatro animales fueron tratados únicamente con el vehículo y fueron considerados el grupo control. Un segundo grupo de cinco ratones recibió 50 mg/Kg de simvastatina. Por último, un tercer grupo de cinco ratones recibió 50 mg/Kg de NST0037. Transcurridas doce horas de los tratamientos, se extrajo sangre de nuevo a los animales en condición de ayuno y se obtuvo el plasma de dicha sangre. La Figura 12 muestra los niveles plasmáticos de colesterol a tiempo inicial (tO) y doce horas tras Ia administración de vehículo, simvastatina o NST0037 en los diferentes grupos de ratones (t12), demostrando que ambos compuestos presentan un efecto hipocolesterolémico significativo. En relación a las diferentes fracciones de colesterol, ambos compuestos disminuyeron apreciablemente los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL) y de muy baja densidad (c-VLDL), sin alterar los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (c-HDL), tal y como se muestra en las Figuras 13 a 15. En relación a los niveles de colesterol libre (CL) y colesterol esterificado (CE), ambos compuestos disminuyeron de forma similar los niveles de CE sin alterar los de CL, tal y como se muestra en las Figuras 16 y 17. Los resultados mostrados en este apartado demuestran que el compuesto

NST0037 muestra un efecto sorprendentemente similar a Ia simvastatina, reduciendo los niveles de CT, c-LDL, c-VLDL y CE de manera significativa sin alterar los de c-HDL ni de CL.

EJEMPLO 6

Efecto hipocolesterolémico de NST0037 en un modelo de hiperlipidemia inducida en ratón

En base a los resultados obtenidos en Ia experimentación con animales ApoB100, los inventores decidieron averiguar si el compuesto NST0037 mostraba también un efecto hipocolesterolémico en un modelo de hiperlipidemia inducida aguda.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones salvajes machos de 6 semanas de edad y de Ia cepa C57BL6. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Para llevar a cabo el experimento a los animales en condición de ayuno se les extrajo sangre por punción ocular. De dicha sangre se obtuvo el plasma en el que se determinaron los niveles de colesterol total y de sus fracciones, previamente a Ia administración de las sustancias a estudio. Inmediatamente después, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 500 mg/kg de Tritón 1339 también conocido como tiloxapol. A los treinta minutos, los animales fueron inoculados intraperitonealmente con 50 mg/kg de cada uno de los compuestos problema. Siete animales fueron tratados únicamente con el vehículo y fueron considerados el grupo control. Un segundo grupo de seis ratones recibió 50 mg/Kg de simvastatina. Por último, un tercer grupo de siete ratones recibió 50 mg/Kg de NST0037. Transcurridas veinticuatro horas de los tratamientos, se extrajo sangre de nuevo a los animales en condición de ayuno y se obtuvo el plasma de dicha sangre. La Figura 18 muestra el número de veces que incrementa el colesterol total tras veinticuatro horas de Ia administración del Tritón 1339 seguida de Ia administración de vehículo, simvastatina o NST0037 en los diferentes grupos de ratones, demostrando que ambos compuestos problema presentan un efecto hipocolesterolémico, siendo estadísticamente significativo únicamente en el caso del tratamiento con NST0037. En relación a las diferentes fracciones de colesterol, ambos compuestos disminuyeron los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (c-LDL), siendo estadísticamente significativa dicha reducción sólo en el caso de NST0037. Sólo Ia simvastatina disminuyó los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de muy baja densidad (c-VLDL), no siendo alterados con ninguno de los dos compuestos los niveles de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (c-HDL) tal y como se muestra en las Figuras 19 a 21 . A diferencia de Ia simvastatina, NST0037 disminuyó los niveles de colesterol esterificado (CE), tal y como se muestra en Ia Figura 22. En relación a los niveles de colesterol libre (CL), ambos compuestos disminuyeron de forma similar los niveles de esta fracción, tal y como se muestra en las Figura 23.

Los resultados mostrados en este apartado demuestran sorprendentemente que el compuesto NST0037 presenta u n efecto hipocolesterolémico igual o mayor a Ia simvastatina, reduciendo los niveles de CT y c-LDL de manera estadísticamente significativa. Estos resultados confirman el efecto hipocolesterolémico de NST0037 observado en el modelo de ratones apoB100.

EJEMPLO 7

Bioseguridad de NST0037 en embrión de pez cebra

7.1. Análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina

Para evaluar Ia bioseguridad del compuesto NST0037 se analizaron sus efectos toxicológicos en el modelo de embrión de pez cebra mediante Ia determinación de los parámetros de seguridad del protocolo C15 de Ia OECD.

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI ₂ ^» 2H ₂ O ₂ 0.29 g/L, MgSO ₄ ^» 7H ₂ O ₂ 0.12 g/L, NaHCO ₃ 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.

Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 ⁰ C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado. Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 d ías postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta: > 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

Durante todo el tiempo que dura el ensayo se registró Ia mortalidad de los embriones-larvas, mostrándose los resultados en las Figuras 24 y 25 mediante Ia realización de curvas de Kaplan-Meier. Los resultados del estudio de Ia mortalidad inducida por las dos sustancias a estudio mostraron que el compuesto NST0037 es sorprendentemente más seguro que Ia simvastatina a las dosis evaluadas, siendo las curvas de supervivencia estadísticamente diferentes comparando ambos tratamientos. 7.2. Análisis de las dosis letales 50 del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función del tiempo

En base a los resultados del apartado anterior, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de las dosis letales 50 (LD ₅ o) a Io largo del tiempo.

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI ₂ ^» 2H ₂ O ₂ 0.29 g/L, MgSO ₄ ^» 7H ₂ O ₂ 0.12 g/L, NaHCO ₃ 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri. Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos.

Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar

(NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 ⁰ C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.

Los estudios fueron llevados a cabo en u n total de 9 d ías postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta: > 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

Durante el tiempo que duró el estudio, se registró el número de embriones/larvas muertas a intervalos de 24 horas y se calculó Ia LD ₅₀ en cada punto temporal del experimento, tal y como se muestra en Ia Figura 26. Los resultados muestran que en los primeros días post-tratamiento (hasta día 2) Ia

LD ₅₀ de ambos compuestos se encuentra por encima de Ia máxima dosis evaluada. No obstante, a partir del tercer día y hasta Ia finalización del experimento Ia simvastatina presentó una LD ₅₀ menor que Ia del compuesto NST0037, Io que indica su mayor toxicidad. A partir del día 2 de tratamiento las

LD ₅₀ de ambos compuestos fue diminuyendo progresivamente a Io largo de todo el experimento, aunque Ia simvastatina siempre presentó una LD ₅₀ por debajo del compuesto NST0037, indicando que NST0037 es más bioseguro que Ia simvastatina.

7.3. Análisis del porcentaje de larvas sanas al final del experimento del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función del tiempo En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis del porcentaje de larvas sanas al final del experimento.

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI ₂ ^» 2H ₂ O ₂ 0.29 g/L, MgSO ₄ ^» 7H ₂ O ₂ 0.12 g/L, NaHCO ₃ 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.

Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 ⁰ C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.

Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 días postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo sem i-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta: > 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

> 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

Los resultados al final del experimento permitieron recoger el porcentaje de larvas que llegan sanas al final del experimento, definido como el número de larvas vivas y sin síntomas de anomalías fisiopatológicas externas (morfológica y/o en comportamiento), siendo éste un parámetro que determina Ia bioseguridad de una sustancia a estudio y es complementaria a los índices de supervivencia y a las LD ₅ O- Tal y como se muestra en Ia Figura 27, se observaron diferencias evidentes entre los porcentajes de larvas sanas entre los dos tratamientos evaluados en las dosis más altas a estudio (0.06 y 0.2 mg/L), llegando más larvas sanas al final del experimento con el tratamiento con NST0037, Io que indica su mayor bioseguridad.

7.4. Análisis del porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo al final del experimento del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función del tiempo En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis del porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo, recogiendo el número de larvas que presenten anomalías corporales y/o pigmentarias, así como Ia fase de reabsorción de Ia vesícula vitelina a intervalos adecuados (cada 24 horas). Las anomalías registradas en el estudio se describen a continuación:

• Trombosis intracraneal : es un coágulo en el interior de un vaso sanguíneo, en este caso de cualquier vaso cerebral. • Trombosis cardiaca: ocurre en un vaso cardiaco.

• Edema (o hidropesía) cardiaco: es Ia acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial y también en las cavidades del organismo. En el caso del corazón, se produce acumulación de líquido en Ia bolsa pericárdica.

• Malformación: es una diferencia notable en Ia forma del cuerpo o parte del cuerpo, u órgano del cuerpo (interno o externo) comparada con Ia forma promedio de Ia parte en cuestión. Normalmente las malformaciones observadas en nuestro estudio son del saco vitelino

(yolk).

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI ₂ ^H ₂ O ₂ 0.29 g/L, MgSOWH ₂ O ₂ 0.12 g/L, NaHCO ₃ 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri. Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa petri con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas petri a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 ⁰ C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado. Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 días postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta:

> 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. > 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

Los resultados indican que el porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo es dependiente del tiempo y del tratamiento, tal y como se muestra en Ia Figura 28, observándose que a Ia dosis evaluada (0.2 mg/L) Ia simvastatina indujo en los embriones-larvas un porcentaje significativo de anomalías o problemas toxicológicos, mientras el compuesto NST0037 no mostró efectos toxicológicos significativos, Io que indica su mayor bioseguridad. El tratamiento con simvastatina produjo trombosis intracraneales y cardíacas y edemas pericárdicos. También los datos de Ia gráfica muestran que los animales se fueron recuperando a Io largo del tiempo de los problemas inducidos por Ia simvastatina, indicando que el tratamiento con 0.2 mg/L de esta sustancia no fue suficientemente tóxico para inducir Ia muerte del animal, con Ia consiguiente mejora de los mismos.

Estos resultados indican que el compuesto NST0037 es más seguro que Ia simvastatina, ya q ue ésta induce un mayor porcentaje de problemas toxicológicos de manera significativa con mayor gravedad. 7.5. Análisis de Ia variación de Ia cardiotoxicidad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en función de Ia dosis

En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de Ia cardiotoxicidad tras el tratamiento con los diferentes compuestos y a varias dosis. El estudio de este parámetro (cardiotoxicidad), no sólo determina el ritmo cardiaco de los animales sino que además, nos permite observar alteraciones en el latido cardiaco (taquicardia, bradicardia, etc) o anomalías en el desarrollo del corazón (pericarditis, atrofia, hipertrofia, etc.).

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI ₂ ^H ₂ O ₂ 0.29 g/L, MgSOWH ₂ O ₂ 0.12 g/L, NaHCO ₃ 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa peth.

Para asegurar Ia exposición en los estadios más tempranos del desarrollo, los huevos fueron rápidamente transferidos (un mínimo de 50 por condición) a otra placa peth con las soluciones a ensayar de los compuestos. Posteriormente, sólo los huevos fertilizados (10 por condición experimental) fueron transferidos de las placas peth a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Los embriones fueron incubados sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 ⁰ C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.

Los estudios fueron llevados a cabo en un total de 9 d ías postfertilización, donde Ia frecuencia de renovación del tratamiento se realizó todos los días, realizando así un ensayo semi-estático. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta:

> 10 animales control, tratados con agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo.

> 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución y con recambio diario durante los 9 días que duró el ensayo. Se determinó el ritmo cardiaco de los embriones-larva de pez cebra mediante análisis visual en estereomicroscopio, con determinación del latido cardiaco con Ia ayuda de un contador manual durante un periodo de un minuto. Los diferentes tratamientos variaron el ritmo cardíaco de los animales, tal y como se muestra en Ia Figura 29, observándose que las larvas tratadas con simvastatina presentaron una disminución estadísticamente significativa respecto los controles a partir de Ia dosis de 0.06, y que llegó a ser muy evidente a Ia dosis de 2 mg/L. Por el contrario, Ia disminución del ritmo cardíaco con el compuesto NST0037 sólo fue estadísticamente significativo a Ia dosis 2 mg/L en comparación con los controles, mientras a concentraciones menores no presentó diferencias con los controles. Además, a Ia máxima dosis utilizada de ambos compuestos (2 mg/L), el ritmo cardiaco de los animales tratados con simvastatina fue estadísticamente menor que a los tratados con NST0037, demostrando de nuevo que el compuesto NST0037 es más bioseguro que Ia simvastatina. Por Io tanto, NST0037 es un compuesto más cardioseguro que Ia simvastatina.

EJEMPLO 8 Actividad fungicida de NST0037

La actividad fungicida de NST0037 se analizó mediante bioensayo frente a Candida albicans. Para ello se prepararon disoluciones de Ia forma β- hidroxiácida de NST0037, lovastatina, atorvastatina y simvastatina. Las concentraciones ensayadas fueron las siguientes: 2, 1 .5, 1 , 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.025 y 0.01 mM. Se prepararon placas de medio MA (conteniendo por litro: 20 g de extracto de malta, 20 g de glucosa, 1 g de micopeptona y 10 g de agar) previamente inoculadas con un cultivo de Candida albicans CECT 1002. Con ayuda de un sacabocados (6 mm diámetro) se prepararon varios pocilios en los que se depositaron 40 μL de las soluciones anteriores. El estudio se realizó por triplicado y en cada placa se incluyeron triplicados para cada compuesto y concentración. Las placas se mantuvieron a 4 ⁰ C durante 1 hora y posteriormente se incubaron a 28 ⁰ C durante toda Ia noche. La presencia de actividad antifúngica se determinó mediante Ia formación de halos de inhibición del crecimiento de C. albicans. Los resultados obtenidos mostraron que el compuesto NST0037 tiene una mayor actividad antifúngica que las estatinas incluidas en el ensayo. Como se muestra en Ia Figura 30 este comportamiento se observó durante todo el rango de concentraciones. En el caso de las concentraciones más elevadas (2- 0.25 mM) el compuesto NST0037 mostró valores ligeramente superiores a Ia simvastatina, Ia estatina que mostró Ia mayor actividad fungicida. Sin embargo, al utilizar las concentraciones más bajas (0.06 y 0.025 mM), el compuesto NST0037 fue el único capaz de producir halos de inhibición. EJEMPLO 9

Inducción de Ia expresión celular del gen 24- dehidrocolesterol reductasa (Seladin-1/DHCR24) por el tratamiento con NST0037

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

Se analizó Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 (NCBI Reference Sequence: NM_014762.3) mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real en comparación con Ia memantina (fármaco habitualmente utilizado para tratar Ia enfermedad de Alzheimer). Las células SK-N-MC fueron tratadas durante 24 h en ausencia (control) o presencia de NST0037 o de memantina a 1 , 4, 10 ó 40 μM. El RNA total se extrajo mediante el kit High Puré RNA Isolation (Roche) y Ia cantidad y calidad del RNA se analizaron mediante espectrofotometría (Infinite 200 con NanoQuant, Tecan) y visualización de las bandas 18S y 28S mediante electroforesis. La RT-PCR se realizó mediante dos pasos, en primer lugar se pasó el m RNA a cDNA usando el RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) y posteriormente se analizó Ia expresión génica mediante sondas TaqMan utilizando las sondas val idadas Hs00207388_m 1 para seladin- 1/DHCR24 y Hs99999901_s1 para 18S (utilizado para normalizar los resultados) en el equipo 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Se realizaron dos ensayos independientes por triplicado. La cantidad relativa de Ia expresión del gen se determinó utilizando el método ΔΔCt con el software SDS v2.1.1 (Applied Biosystem); Ia expresión de 18S fue usada para normalizar Ia medida. Los resultados obtenidos, como aparece en Ia Figura 31 , muestran el aumento de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24 con el tratamiento con NST0037 a las concentraciones ensayadas, pero no con el tratamiento con memantina, Io que indica que el tratamiento con NST0037 produce el aumento específico de Ia expresión del gen seladin-1/DHCR24, que está relacionado con Ia biosíntesis de colesterol y con capacidad anti-apoptótica mediante Ia inhibición de Ia caspasa 3.

EJEMPL0 10

Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por Ia inhibición de Ia proteín fosfatasa 1 (PPD

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con ácido okadaico (OA) que inhibe Ia actividad de Ia proteín fosfatasa 1 (PP1 ). El OA es una de las drogas más utilizadas para el estudio del mecanismo de fosforilación de Ia proteína tau, involucrada en Ia patogénesis y Ia progresión de Ia EA. La inhibición de Ia PP1 produce alteraciones del citoesqueleto y daño mitocondrial. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa. Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes:

- Control: medio de cultivo (medio)

- Ácido okadaico (OA): medio más OA 20 nM, que produce Ia muerte del 50% de las células.

- OA más NST0037: medio más OA (20 nM) más NST0037 a 1 , 4, 10, 40 ó 100 μM. Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El Test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 32, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por OA. Se observó protección de Ia muerte desde 4 a 40 μM de NST0037, alcanzando un 57% a 40 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por inhibición de Ia PP1.

EJEMPLO 11 Protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por Ia inhibición de Ia succinato deshidroqenasa

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el sigu iente med io de cultivo: "Minimun Essential Méd ium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%. Se analizó Ia inhibición producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con ácido 3-Nitropropiónico (3-NP). El 3-NP es un inhibidor irreversible de Ia enzima succinato deshidrogenasa que en modelos animales produce estrés oxidativo y muerte celular apoptótica en el estriado, que mimetiza cambios neuroquímicos y anatómicos asociados a Ia enfermedad de Huntington (HD). Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes:

- Control: medio de cultivo (medio) - 3-Nitropropiónico (3-NP): medio más 3-NP 30 μM, que produce Ia muerte del 50% de las células.

- 3-NP más NST0037: medio más 3-NP (30 μM) más NST0037 a 0.1 , 1 , 4, 10, 40, 100 o 200 μM.

Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO2) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm. Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 33, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por 3-NP. Se observó protección de Ia muerte desde 1 a 100 μM de NST0037, alcanzando un 41 % a 40 μM. Estos resultados indican que el compuesto NST0037 muestra un efecto protector de Ia muerte de células humanas de origen neuronal causada por inhibición de enzima succinato deshidrogenasa.

EJEMPLO 12 Inhibición del NST0037 de Ia activación de caspasa 3/7 en un modelo celular de apoptosis

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo:" Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácido no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.

La inducción de apoptosis sobre las células en cultivo se realizó mediante incubación con camptotecina (CPT), que desencadena Ia activación

Ia apoptosis celular. La apoptosis fue determinada mediante Ia medida de Ia activación de las caspasas efectoras, caspasa 3 o caspasa 7, para Io que se utilizó un kit de detección fluorimétrica de caspasa 3/7 activa (Apo-ONE®

Homogeneous Caspase-3/7, Promega). La caspasa 3 ó 7 activa de las células, producen Ia ruptura de un sustrato, Io que lleva a Ia emisión de fluorescencia, que es leída mediante un fluorímetro. De esta manera, se analizó el efecto del pretratamiento del compuesto NST0037 a 10 y 40 μM sobre Ia activación de Ia caspasa 3/7 producida por 50 μM de camptotecina (CPT) en las células SK-N-

MC. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio, para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa. Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO2 se procedió al pretratamiento con NST0037 a 10 y 40 μM.

Tras 24 h, se realizaron los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: Control: medio de cultivo (medio) Camptotecina (CPT): medio con CPT a 50 μM - Camptotecina (CPT): medio con CPT a 50 μM, con diferentes pretratamientos con NST0037 (10 ó 40 μM) y/o mevalonato (MEV; a 100 μM) o Z-VAD-fmk (50 μM). Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con estos tratamientos durante 6 h, tras Io que se añadió el tampón de lisis celular y el sustrato de las caspasas a las concentraciones especificadas por el fabricante; se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se congeló a -2O ⁰ C durante una noche. Al día siguiente se midió Ia fluorescencia (499/521 nm, Exci/Emi).

En Ia Figura 34 se muestra el porcentaje de activación de Ia caspasa 3/7 respecto a las células control de los diferentes tratamientos. Se observó una inhibición de Ia caspasa 3/7 respecto a Ia camptotecina del 26 y 33 % a 10 y 40 μM de NST0037, respectivamente, Io que demuestra un efecto anti-apoptótico funcional de este compuesto. Por otro lado, el mevalonato revirtió esta inhibición, por Io que se demuestra que el efecto del NST0037 sobre Ia caspasa 3/7 está relacionado con Ia biosíntesis del colesterol o de alguno de los precursores de Ia ruta de biosíntesis de este. El Z-VAD-fmk, como inhibidor de caspasas, inhibió totalmente Ia activación de Ia caspasa 3/7.

EJEMPLO 13

El compuesto NST0037 reduce Ia producción del péptido β-amiloide en un modelo celular El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)" transfectadas establemente con una construcción que lleva el gen APP (proteína precursora del beta amiloide, Gen ID: 351 ) en Ia isoforma 695, que es Ia variante más frecuente expresada en neuronas, con Io que se consigue sobreexpresión de Ia proteína APP. En todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 0,05 mg/ml y suero fetal bovino 10%, Ia expresión de APP se selecciona mediante Ia adición del antibiótico higromicina B a 0.16 mg/mL. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 6 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 8x10 ⁵ células/pocilio, para cada condición del ensayo se sembraron 2 pocilios de Ia placa. Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO2 se procedió a los tratamientos celulares con 2 mi de volumen total para las condiciones siguientes:

- Control: medio de cultivo (medio)

- NST0037: medio más NST0037 a 1 , 4, 10 ó 40 μM.

Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con estos tratamientos durante 48 h, recogiéndose entonces 500 μl de medio condicionado para realizar las medidas. Del medio condicionado fueron eliminados los restos celulares mediante centrifugación a 300xg y después se añadió inhibidores de proteasas (Mini EDTA-free, Roche). Se midieron las dos especies más frecuentes de Aβ: 1 -40 y 1 -42. Para Aβ(1 -42) fue necesario concentrar el medio 5 veces para realizar las medidas, utilizando el sistema de filtración Amicon Ultra (Millipore). Se analizó Ia cantidad de Aβ(1 -40) y Aβ(1-42) del medio condicionado para cada tratamiento mediante ELISA (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), utilizando el kit "beta amyloid 40 ELISA" y "beta amyloid 42 ELISA" (Biosource), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los resultados se cuantificaron utilizando una curva de concentraciones crecientes con péptidos sintéticos. Los valores básales de Aβ secretado en estas células son de 1340+141 pg/ml para Aβ(1-40) y de y 20+3 pg/mL para Aβ(1 -42).

Los resultados obtenidos para los tratamientos se muestran en Ia Figura 35, en Ia que se muestra el porcentaje de Aβ(1-40) (A) y Aβ(1 -42) (B) respecto a las células control a 48 h. Para Aβ(1 -40) se obtiene una reducción tras el tratamiento con 10, 40 y 100 μM de NST0037. Para Aβ(1-42) se obtuvo una reducción tanto a 10 como a 40 μM de NST0037.

De estos resultados se concluye que NST0037 reduce Ia secreción de Aβ en células de neuroblastoma humano que sobreexpresan APP. La producción de Aβ se ha relacionado con muerte celular tanto in vitro como in vivo y, además, está asociado con las placas seniles que se encuentran en los enfermos de alzhéimer.

EJEMPLO 14 Efecto del mevalonato sobre Ia protección por NST0037 de Ia muerte neuronal inducida por estrés oxidativo.

El ensayo fue realizado sobre células en cultivo de neuroblastoma humano SK-N-MC procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)", en todos los casos se sigu ieron estrictas normas de esteril idad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células fueron mantenidas en el siguiente medio de cultivo: "Minimun Essential Médium Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, gentamicina 0.05 mg/ml y suero fetal bovino 10%. Se analizó el efecto del mevalonato sobre Ia protección producida por el compuesto NST0037 de Ia muerte celular causada por el tratamiento con xantina/xantina oxidasa que origina daño oxidativo y muerte celular. Estas células, en pase no superior a 15, fueron sembradas sobre placas de 96 pocilios tratadas para células adherentes con una concentración celular de 5x10 ⁴ células/pocilio; para cada condición del ensayo se sembraron 3 pocilios de Ia placa.

Tras 24 h de incubación de las células a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ se procedió a los tratamientos celulares con 100 μl de volumen total para las condiciones siguientes: - Control: medio de cultivo

- Xantina/xantina oxidasa (XXO): medio más xantina 10 μM/ xantina oxidasa 60 mU/mL, que produce Ia muerte del 50% de las células.

- XXO más NST0037: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más NST0037 a 40 μM. - XXO más mevalonato: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más mevalonato a 10, 40 ó 100 μM.

- XXO más NST0037 más mevalonato: medio más XXO (10 μM / 60 mU/mL) más NST0037 a 40 μM más mevalonato a 10, 40 ó 100 μM. Las células fueron incubadas (a 37 ⁰ C y 5% CO ₂ ) con los tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se añadió el reactivo WST-1 (Roche). El test WST-1 se basa en Ia medida de Ia actividad metabólica. El daño celular produce Ia pérdida de Ia habilidad de las células de obtener Ia energ ía necesaria para mantener sus funciones metabólicas y el crecimiento celular, por Io que las células que metabólicamente activas (vivas) reducen Ia sal de tetrazolium a formazán mediante el sistema succinato-tetrazolium reductasa (de Ia cadena respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440nm. A las 2 horas de añadido el reactivo se realizó Ia lectura en un lector de placas a 440 nm.

Los resultados obtenidos se muestran, como aparece en Ia Figura 36, como el porcentaje de muerte celular para cada tratamiento referido a Ia muerte producida por Ia XXO. Se observó que el mevalonato por sí solo no protege de Ia muerte por XXO, ni produce aumento de toxicidad, mientras que el NST0037 a 40 μM protegió un 57 % de Ia muerte y este efecto fue inhibido por Ia adición de mevalonato a 10, 40 y 100 μM, siendo las diferencias estadísticamente significativas, según Ia t de Student, para 10 y 100 μM. Estos resultados indican que Ia protección observada del compuesto NST0037 está relacionada con Ia biosíntesis del colesterol o de alguno de los precursores de Ia ruta.

EJEMPLO 15

Protección por NST0037 de las huellas neuropatolóqicas asociadas a Ia muerte neuronal en el hipocampo 15.1. Efecto protector de NST0037 de Ia distrofia neurítica producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo

En base a los resultados de neuroprotección, los inventores decidieron averiguar si el efecto neuroprotector de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia protección de otro signo de daño neuronal como es Ia distrofia neurítica.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia distrofia neurítica en el hipocampo se realizó Ia inmunohistoquímica de campo claro contra Ia proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP2) en cortes coronales de 5 μm de grosor. Como muestra Ia Figura 37, Ia pauta de administración PBS+KA+PBS produce una disminución del mareaje de MAP2 en especial en zonas de CA1 , CA3 y giro dentado del hipocampo, respecto a Ia pauta de administración PBS+PBS+PBS que muestra un mareaje uniforme. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón de tinción igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin evidencias de distrofia neurítica en estas regiones del hipocampo. Además, y de manera sorprendente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA disminuye claramente Ia pérdida de mareaje de MAP2 en el hipocampo. En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege de Ia distrofia neurítica producida por éste en el hipocampo.

15.2. Efecto protector de NST0037 del daño oxidativo producido por una sustancia excitotóxica en el hipocampo En base a los resultados de protección de Ia neurodegeneración y Ia distrofia neurítica , los i nventores decid ieron averig uar si el efecto neuroprotector de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia protección de otro signo d e neurodegeneración asociado a Ia enfermedad como es el daño oxidativo.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis del daño oxidativo por peroxidación lipídica en el hipocampo se realizó Ia inmunohistoquímica de campo claro contra el 4-hidroxinonenal (HNE) en cortes coronales de 5 μm de grosor.

Como muestra Ia Figura 38, Ia pauta de administración PBS+KA+PBS produce un aumento de Ia señal de HNE en Ia región CA3 del hipocampo respecto a Ia pauta de administración PBS+PBS+PBS que no muestra este mareaje de peroxidación lipídica. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón de tinción igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS) sin neuronas marcadas con HNE en estas regiones del hipocampo. Además, y de manera sorprendente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA reduce el número de neuronas con mareaje de HNE en el hipocampo. En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege del daño oxidativo inducido por este en el hipocampo.

15.3. Efecto protector de NST0037 de Ia apoptosis producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo

En base a los anteriores resultados, los inventores decidieron averiguar si el efecto antioxidante de NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia protección frente a Ia muerte por apoptosis, mecanismo que está asociado a Ia enfermedad.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo d ía los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia presencia de neuronas en apoptosis en el hipocampo se realizó Ia técnica de T. U . N . E . L . (Marcación de Ia UTP fi nal med iada por I a transferasa desoxinucleotidil terminal del inglés TdT-mediated dUTP nick end labelling) de fluorescencia en cortes coronales de 5 μm de grosor.

La pauta de administración PBS+KA+PBS produce muerte neuronal por apoptosis en el hipocampo y en especial en las regiones CA1 , CA3 (Figura 38) y giro dentado. Sin embargo, las muestras del grupo NST0037+KA+NST0037 no presentaron neuronas positivas para T.U.N.E.L. mostrando un patrón igual a los controles (grupo PBS+PBS+PBS). Adicionalmente, observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA reduce el número de neuronas en apoptosis a unas pocas células aisladas en

Ia región CA3 del hipocampo.

En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege del daño oxidativo y de Ia apoptosis inducida por este en las neuronas del hipocampo. 15.4. Efecto protector de NST0037 de Ia astroqliosis producida por una sustancia excitotóxica en el hipocampo

En base a los anteriores resultados, los inventores decidieron averiguar si el efecto antioxidante y antiapoptótico mostrado por el NST0037 en el hipocampo demostrado en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón mediante administración de kainato (KA) estaba acompañado de Ia reducción de Ia astrogliosis reactiva, que es otra huella histopatológica que se detecta en el cerebro de pacientes de Ia enfermedad de Alzheimer.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa FVB/NHan. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Veinticinco animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo, todos por vía intraperitoneal (i.p.) con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 4 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo día los animales fueron inoculados con una nueva dosis de PBS y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. ii) Pauta NST0037+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días con NST0037 a 50 mg/kg, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg. iii) Pauta PBS+KA+PBS: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 d ías, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de PBS. iv) Pauta PBS+KA+NST0037: 7 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días, en el segundo día los animales fueron inoculados con una dosis de kainato a 25 mg/Kg y durante los siguientes 7 días con una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. El análisis de Ia astrogliosis reactiva se realizó mediante Ia inmunohistoquímica de campo claro contra Ia proteína fibrilar acida de Ia glía (GFAP) en cortes coronales de 5 μm de grosor, Ia cual está presente en los astrocitos.

La pauta de administración PBS + KA+PBS produce un aumento significativo de Ia activación y propagación de astrocitos en el neuropilo del hipocampo (Figura 38). Por el contrario, las muestras del grupo

NST0037+KA+NST0037 presentaron un patrón astrocítico muy similar al de los controles (grupo PBS+PBS+PBS). Sorprendentemente, también observamos que el tratamiento con NST0037 tras el pretratamiento con PBS y Ia inoculación de KA reduce el número de astrocitos y Ia intensidad del mareaje con GFAP en el hipocampo.

En resumen, el tratamiento con NST0037, tanto anterior como posterior a Ia inoculación de KA, protege del daño oxidativo, de Ia apoptosis y evita Ia astrogliosis reactiva inducida por este en Ia región del hipocampo.

EJEMPLO 16

Protección por NST0037 de los síntomas clínicos, de los déficits locomotores, de Ia neurodeqeneración y de Ia muerte neuronal causada por una neuortoxina parkinsoniana administrada de forma En base a los resultados de neuro protección demostrada por el compuesto NST0037 en un modelo de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratón, los investigadores decidieron evaluar Ia capacidad neuroprotectora del compuesto en un modelo de Ia enfermedad de Parkinson basado en Ia muerte de neuronas dopaminérgicas inducida por una sustancia neurotóxica como es el 1 -metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) . La inyección sistémica de

MPTP en ratón induce una muerte masiva de las neuronas dopaminérgicas de

Ia sustancia nigra, Io cual reduce Ia concentración de dopamina en esta región y en otras como el estriado que están muy vinculadas a Ia actividad locomotora en humanos. Debido a estos fenómenos este modelo ha sido ampliamente utilizado para el estudio de Ia enfermedad de Parkinson ya que reproduce uno de los eventos centrales en dicha enfermedad como es el deterioro motor. En este ejemplo se presentan los resultados del análisis del efecto de NST0037 frente a Ia neurodegeneración y los síntomas que induce el MPTP en una administración aguda.

16.1. Efecto protector de NST0037 frente a Ia muerte causada por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérqicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c. Durante todo el procedimiento experimental fueron registrados los óbitos en los distintos grupos de tratamiento, con estos datos se realizaron las correspondientes curvas de supervivencia que se presentan en Ia Figura 39.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce un aumento estadísticamente significativo (p<0.05) de Ia mortalidad en los ratones. Sin embargo, y de forma sorprendente, el tratamiento con NST0037 promueve Ia supervivencia de los animales tras Ia administración aguda de MPTP ya que no se observaron diferencias significativas entre el grupo NST0037+MPTP+NST0037 y el grupo PBS+PBS+PBS (p>0.05). 16.2. Efecto protector de NST0037 frente al declive en Ia resistencia motora causado por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de

MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Antes del inicio de los tratamientos y una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento les fue realizado a los animales un test de resistencia locomotora denominado test de Rota-rod durante 2 minutos, registrando el tiempo que resistían los animales caminando por un cilindro que aumentaba su velocidad desde los 4 a los 40 r.p.m. En Ia figura 40 se muestra Ia ratio, entre el final del ensayo y el estado basal, del tiempo que los animales de los diferentes grupos se mantienen caminando sobre el cilindro.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de Ia resistencia motora en los ratones desde su estado basal hasta 7 días después de Ia administración aguda del MPTP (p<0.05). Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con NST0037 evita el deterioro motor de los animales manteniendo Ia resistencia de los ratones en el nivel que mostraban antes de Ia administración del MPTP (p>0.05), patrón que es igual al de los ratones no inyectados con MPTP y tratados con PBS (p>0.05).

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de Ia pérdida de resistencia inducida por Ia administración aguda de MPTP.

16.2. Efecto protector de NST0037 frente a Ia disminución de Ia fuerza causada por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.)- Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Antes del inicio de los tratamientos y una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento les fue realizado a los animales un test de fuerza en las denominado test de Grip-strength, registrando Ia fuerza de agarre a una barra en gramos que realizaban los animales con las patas delanteras por quintuplicado. En Ia figura 41 se muestra Ia ratio, entre Ia fuerza mostrada por los animales al final del ensayo respecto Ia del estado basal.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de Ia fuerza que los ratones ejercen al agarrarse con las patas delanteras desde su estado basal hasta 7 días después de Ia administración aguda del MPTP (p<0.05). Además, el tratamiento con NST0037 evita Ia pérdida de fuerza que induce el MPTP y tras 7 días de tratamiento los ratones del grupo NST0037+MPTP+NST0037 muestran unos niveles de fuerza iguales a los de antes de Ia administración del MPTP (p>0.05), patrón que es muy similar al de los ratones no inyectados con MPTP y tratados con PBS (p>0.05).

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de Ia pérdida de resistencia y de fuerza inducida por Ia administración aguda de MPTP.

16.3. Efecto protector de NST0037 frente a Ia neurodegeneración causada por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia protección que mostraba el compuesto NST0037 frente al deterioro del estado psicomotor producido por el MPTP, se veía acompañado de Ia neurodegeneración en regiones del cerebro implicadas en Ia actividad locomotora, y relacionadas con Ia enfermedad de Parkinson como son Ia sustancia nigra y el estriado.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s. c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de

MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia neurodegeneración en Ia sustancia nigra y del estriado se realizó Ia tinción fluorescente de Fluoro Jade B (FJB) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En

Ia figura 42 se muestra una fotografía representativa de cada grupo y en ambas zonas bajo estudio.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce un claro aumento de las células positivas para FJB tanto en Ia sustancia nigra como en el estriado respecto a las muestras del grupo PBS+PBS+PBS. En contraste, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un número de células en degeneración y positivas para FJB significativamente menor a las del grupo PBS+MPTP+PBS.

En resumen , el tratam iento con NST0037 protege del deterioro psicomotor y de Ia neurodegeneración, inducida por Ia administración aguda de MPTP, en las neuronas dopaminérgicas de Ia sustancia nigra, así como de las terminaciones nerviosas que inervan el estriado. 16.4. Efecto protector de NST0037 frente a Ia pérdida de neuronas dopaminérgicas por Ia administración aguda de una sustancia neurotóxica

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia protección que mostraba el compuesto NST0037 frente a Ia neurodegeneración producida por el MPTP, se veía acompañada de Ia protección de neuronas dopaminérgicas en regiones del cerebro deterioradas en Ia enfermedad de Parkinson como son Ia sustancia nigra y el estriado.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones. Cuarenta animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i) Pauta PBS+PBS+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con PBS con una dosis diaria durante 2 días por vía subcutánea (s.c), en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de PBS, a intervalos de 2 horas por vía intraperitoneal (i.p.). Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c. ii) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de PBS por vía s.c.

MI) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c, en el segundo día los animales fueron inoculados con 4 dosis de

MPTP a 20 mg/Kg, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 7 días se les administró una dosis diaria de NST0037 a 50 mg/kg por vía s.c.

Una vez concluido el tiempo de 7 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia presencia de neuronas dopaminérgicas en Ia sustancia nigra y del estriado se realizó Ia inmunohistoquímica contra Ia proteína tirosina-hidroxilasa (TH) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En Ia figura 43 se muestra una fotografía representativa de cada grupo y en ambas zonas bajo estudio. La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una evidente disminución de Ia cantidad de neuronas dopaminérgicas ya que se detecta una ausen cia cl a ra d e m a reaj e con TH en com pa rac ión con el g ru po PBS+PBS+PBS, tanto en los cuerpos neuronales de Ia sustancia nigra como en las extensiones nerviosas en el estriado. En cambio, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un mayor número de células TH- positivas en Ia sustancia nigra así como una mayor intensidad de mareaje en el estriado que las del grupo PBS+MPTP+PBS.

En resumen , el tratam iento con NST0037 protege del deterioro psicomotor de los ratones, además de Ia neurodegeneración y de Ia muerte neuronal inducida por Ia administración aguda de MPTP, en Ia sustancia nigra y el estriado.

EJEMPLO 17 Protección por NST0037 de los déficits locomotores, de Ia muerte neuronal v del daño oxidativo causado por una neurotoxina parkinsoniana administrada de forma subcrónica

Debido a los resultados obtenidos y presentados en el Ejemplo 16 los inventores decidieron analizar el efecto del NST0037 en los síntomas clínicos y en Ia neuropatología inducida en Ia sustancia nigra por Ia administración subcrónica del MPTP en ratón. 17.1. Efecto protector de NST0037 frente al declive en Ia resistencia motora causado por Ia administración subcrónica de una sustancia neurotóxica que induce Ia muerte de las neuronas dopaminérgicas

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i.) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS. ii.) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg. Siete días antes del inicio de los tratamientos y a los 7, 14 y 21 días post-inoculación del M PTP les fue real izado a los animales un test de resistencia locomotora denominado test de Rota-rod durante 2 minutos, registrando el tiempo que resistían los animales caminando por un cilindro que aumentaba su velocidad desde los 4 a los 40 r.p.m. En Ia figura 44 se muestra Ia ratio, entre los diferentes puntos temporales del ensayo y el estado basal, del tiempo que los animales de los diferentes grupos se mantienen caminando sobre el cilindro.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una disminución estadísticamente significativa de Ia resistencia motora en los ratones desde su estado basal a partir de los 14 días después de Ia administración subcrónica del MPTP (p<0.05). Sin embargo, sorprendentemente, el tratamiento con NST0037 evita el deterioro motor de los animales manteniendo Ia resistencia de los ratones en el nivel que mostraban antes de Ia administración del MPTP (p>0.05). En resumen, el tratamiento con NST0037 protege de Ia pérdida de resistencia inducida por Ia administración sub-crónica de MPTP.

17.2. Efecto protector de NST0037 frente a Ia pérdida de neuronas dopaminérgicas por Ia administración subcrónica de una sustancia neurotóxica Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia protección que mostraba el compuesto NST0037 frente al deterioro del estado psicomotor producido por el MPTP, se veía acompañada de neurodegeneración en una de las regiones más importantes del cerebro que está implicada en Ia enfermedad de Parkinson como es Ia sustancia nigra.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i.) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS. ii.) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de

MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 21 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia presencia de neuronas dopaminérgicas en Ia sustancia nigra se realizó Ia inmunohistoquímica contra Ia proteína tirosina-hidroxilasa (TH) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En Ia Figura 45 se muestra una fotografía representativa de cada grupo.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS produce una evidente pérdida de neuronas dopaminérgicas ya que observamos una ausencia clara de mareaje con TH en algunas regiones de Ia sustancia nigra. En cambio, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentaron un mayor número de células TH-positivas en Ia misma región de Ia sustancia nigra.

En resumen, el tratamiento con NST0037 protege del deterioro psicomotor de los ratones, además de Ia muerte neuronal inducida en Ia sustancia nigra por Ia administración subcrónica de MPTP.

17.3. Efecto protector de NST0037 frente al daño oxidativo inducido por Ia administración subcrónica de una sustancia neurotóxica para las neuronas dopaminérgicas

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia neuroprotección mostrada por el compuesto NST0037 frente a

Ia neurodegeneración producida por el MPTP en Ia sustancia nigra se veía acompañada de Ia reducción de otra huella histopatológica del daño neuronal como es el daño oxidativo. Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron machos de 12 semanas de edad y de Ia cepa CD1. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante las inoculaciones y manipulaciones.

Veinte animales fueron utilizados en este ensayo y los tratamientos, todos por vía intraperitoneal, fueron llevados a cabo con un volumen de 100 μl, según las siguientes pautas: i.) Pauta PBS+MPTP+PBS: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de PBS, a partir del segundo d ía los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de PBS. ii.) Pauta NST0037+MPTP+NST0037: 10 animales se trataron inicialmente con una dosis diaria durante 2 días de NST0037 a 50 mg/kg, a partir del segundo día los animales fueron inoculados con 1 dosis diaria de MPTP a 30 mg/Kg durante 5 días, a intervalos de 2 horas por vía i.p. Durante los siguientes 21 días se les administró 3 dosis semanales de NST0037 a 50 mg/kg.

Una vez concluido el tiempo de 21 días de tratamiento los animales fueron sacrificados y los encéfalos fueron diseccionados. Las muestras de encéfalo fueron procesadas e incluidas en parafina. Para el análisis de Ia peroxidación lipídica en las neuronas de Ia sustancia nigra se realizó Ia inmunohistoquímica de campo claro contra el 4-hidroxinonenal (HNE) en cortes sagitales de 5 μm de grosor. En Ia Figura 45 se muestra una fotografía representativa de cada grupo.

La pauta de administración PBS+MPTP+PBS induce Ia presencia de mareaje contra HNE en numerosas neuronas de Ia sustancia nigra. En contraste, las muestras del grupo NST0037+MPTP+NST0037 presentan un número discreto de neuronas aisladas con mareaje HNE-positivo en Ia sustancia nigra.

En resumen , el tratam iento con NST0037 protege del deterioro psicomotor de los ratones, además de Ia muerte neuronal y del daño oxidativo por peroxidación lipídica inducido en Ia sustancia nigra por Ia administración sub-crónica de MPTP.

EJEMPLO 18

Estudio del paso de barrera hematoencefálica de Ia forma acida de NST0037 en un ensayo in vitro (PAMPA)

El ensayo tuvo por objeto predecir si el compuesto NST0037, en comparación con Ia simvastatina y Ia atorvastatina, en sus formas activas, eran capaces de atravesar Ia barrera hematoencefálica (BHE) para Io cual, dicha barrera se mimetizó en un sistema in vitro que permitió Ia evaluación del compuesto sin empleo de células. Para ello, se llevó a cabo el denominado ensayo PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeation Assay), que emplea un sistema sandwich que contempla el paso de compuestos por medio de difusión pasiva. Como control positivo se empleó verapamilo, un compuesto de elevada permeabilidad, mientras que como control negativo se empleó teofilina, un compuesto que no atraviesa BHE.

Para mimetizar Ia BHE se hizo uso de una mezcla de lípidos comercial derivada de cerebro de cerdo con una composición de fosfol ípidos muy semejante a Ia que constituye Ia barrera, y que se denomina PBL (Porcine Polar Brain Lipid). El verapamilo, Ia teofilina y Ia atorvastatina se prepararon a 10 mM en DMSO, mientras que el NST0037 y Ia simvastatina se prepararon en agua y se activaron con NaOH 0.1 N a 4 ⁰ C durante 12h.

En el momento del ensayo, se preparó 1 .5 mL de los compuestos a evaluar y de los controles, en todos los casos a 100 μM a partir de los stocks en un tampón fosfato a pH 7.4 que contenía fosfato sódico monobásico (0.41 M) y fosfato potásico dibásico (0.287M). Para ello se llevó a cabo una dilución 1/100 de los compuestos, igualando el contenido de DMSO al 1 % en todos los casos. En una placa con filtro de 96 pocilios, con una membrana de PVDF, con un tamaño de poro de 45 μm (MAIPN4550, Millipore) se añadieron 5 μl_ de PBL a 20 μg/mL. Transcurridos dos minutos, se añadieron 300 μl_ del tampón fosfato empleado para diluir los compuestos. Esta placa se consideró Ia placa aceptora y se situó en Ia parte superior del sandwich. Sobre otra placa de 96 pocilios que ensamblaba perfectamente con Ia anterior (MATRNP550 de Millipore) se añadieron 300 μl_ de los compuestos a 100 μM y por triplicado. Además, se incluyó un blanco que incluía únicamente el 1 % de DMSO en el tampón fosfato empleado. Esta placa se denominó placa donadora. La placa aceptora fue situada cuidadosamente sobre Ia placa donadora formando el sistema sandwich. Los compuestos objeto de estudio difundieron desde los pocilios de Ia placa donadora a los pocilios correspondientes de Ia placa aceptora durante las 18h en las que el sistema se mantuvo intacto. El compuesto restante preparado se conservó en las mismas condiciones de humedad, temperatura y oscuridad que el sistema sandwich constituido por las placas. Transcurrido este tiempo, 100 μL de los pocilios de las placas donadoras y de las aceptoras se transvasaron a una placa de 96 pocilios especial para lectura al UV. Además, se transvasaron 100 μL, por triplicado, de los compuestos preparados para Ia realización del ensayo y conservados de modo igual a las placas (pocilios básales). La placa UV se introdujo en un espectrofotómetro en el cual se llevó a cabo un sean en el UV desde 230 a 498 nm, con lecturas cada 4 nm. A partir de los datos del espectrofotómetro se calculó el porcentaje de paso de barrera así como Ia permeabilidad efectiva (Pe). Para calcular Ia P _e , se aplicó Ia siguiente fórmula:

[Droga] _aceptora Pe = C x - Ln { 1- ) [Droga] equilibrio

Donde:

V ₀ X V ₁

C =

(V ₀ x V _A ) x Área x Tiempo [Droga] _a ce _P tora = Absorbancia del pocilio aceptor

[Droga] equilibrio = Aborbancia de Ia media de los pocilios básales / 2

V _A = Volumen del pocilio aceptor = 0.3 cm ³

V ₀ = Volumen del pocilio donador = 0.3 cm ³

Área = 0.24 cm ²

Tiempo = 64.000 s

El cálculo teórico de Ia lipofilicidad de un compuesto se puede obtener calculando el logaritmo del coeficiente de partición octanol/agua, que viene dado por cLogP. cLogP se calculó teóricamente mediante el programa CLOGP (OSIRIS Property Explorer) introduciendo las estructuras químicas en el software. La n para cada compuesto viene indicada en Ia tabla junto con los resultados numéricos de Ia media±SD de los valores obtenidos en el ensayo.

Tabla I

Como se puede observar en Ia Tabla I y en Ia Figura 46, tanto Ia simvastatina como el NST0037 presentaron un índice de paso de BHE muy similar. En ambos casos, se prevee para estos compuestos un paso de BHE intermedio entre el verapamilo (P _e =10±2 x 10 ^~6 cm/s) y Ia teofilina (P _e =0.2±0.1 x 10 ^~6 cm/s). Estos datos de paso de BHE vienen confirmados por el rango de lipofilicidad, mostrando por ambos compuestos, y que presentan una cLogP muy parecida. Sin embargo, Ia atorvastatina, a pesar de presentar una elevada cLogP, apenas atraviesa BHE, haciéndolo en el mismo rango que Io hace el control negativo, Ia teofilina.

EJEMPLO 19

Efecto de NST0037 sobre los niveles intracelulares de colesterol total en líneas celulares humanas hepáticas y neuronales

El ensayo tuvo por objeto determinar en qué grado el compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, era capaces de modificar los niveles de colesterol total en líneas celulares de origen neuronal y hepático. Para llevar a cabo este ensayo, los compuestos se activaron con NaOH hasta Ia apertura completa de Ia forma lactona.

Tanto Ia línea Hep G2 (hepatocarcinoma humano) como Ia línea SK-N- MC (neuroblastoma humano) se obtuvieron de Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC no. HB-8065 y HTB-10 respectivamente). En todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y Ia manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase Il que siguen Ia norma europea EN 12469. Las células mantenidas en pase se sembraron en placas de 96 pocilios en MEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales y 0.05 mg/mL de gentamicina. En el caso de las HepG2 se sembraron 4x10 ⁴ células/pocilio y en el caso de las SK-N-MC 5x10 ⁴ células/pocilio. Transcurridas 24h de Ia siembra, las células fueron desprovistas de FBS durante 8h. Seguidamente, las células fueron incubadas con los tratamientos a diversas concentraciones durante 2Oh. Tras el periodo de incubación, las células se lavaron con PBS y se usaron con un tampón fosfato con 0.5% de tritón X-100. La lisis se completó mediante una doble congelación-descongelación.

La cuantificación de colesterol total se llevó a cabo mediante técnicas enzimáticas y fluorométricas. 25 μL de cada lisado se transvasaron a una placa de 96 pocilios junto con una curva patrón de colesterol que partía de 10 μg/mL hasta 0.08 μg/mL. Sobre las muestras se añadieron 75 μL de Ia mezcla reactiva preparada a base de MES 0.05 M (pH 6.5) conteniendo colesterol oxidasa (0.5 U/mL), colesterol esterasa (0.8 U/mL), peroxidasa de rábano (4 U/mL) y ampliflu red (20 μg/mL) y se incubó 15 minutos a 37 ⁰ C. La intensidad de fluorescencia se determinó a 530 nm de excitación y 580 nm de emisión mediante un fluorímetro. Los resultados fueron normalizados por proteína Ia cual se determinó mediante Ia técnica del BCA.

En Ia Figura 47 se puede apreciar como el NST0037 presentó un efecto hipocolesterolémico en ambos tipos celulares, si bien fue en las células neuronales donde las reducciones de colesterol fueron más drásticas. En el caso de HepG2, NST0037 resultó ser más potente que Ia simvastatina, mientras q ue en S K-N-MC, las reducciones de colesterol con ambos compuestos fueron semejantes. EJEMPLO 20

Efecto hipocolesterolémico de NST0037 administrado oralmente durante 28 días en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar) En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037, los investigadores decidieron evaluar el efecto de Ia administración oral y en el tiempo de NST0037 en el mismo modelo de hipelipidemia endógena familiar (ratones apoB100) que se había empleado en el Ejemplo 5.2. El objetivo de este nuevo estudio fue analizar si Ia administración oral prolongada es eficaz para disminuir los niveles de colesterol en el tiempo.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones hembra de 12 semanas de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.

Los ratones fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =8); grupo simvastatina (n = 8); grupo NST0037 (n = 8). Tras un acondicionamiento a Ia dieta, a los ratones se les administró oralmente y a Ia misma hora (15.00 a 18.0Oh) durante 28 días consecutivos 50 mg/kg de simvastatina o NST0037 (en sus formas lactonas), em pleando en am bos casos como veh ícu lo carboximetilcelulosa al 0.25 % en agua. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los 7, 21 y 28 días de iniciar los mismos, se llevaron a cabo extracciones de sangre retro-orbital previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total (CT), colesterol libre (CL), colesterol (CE), c-HDL, c-LDL, c- VLDL y apoB100 por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas. Para comprobar si el efecto a nivel de lípidos implicaba una alteración del estrés oxidativo, se evaluó además el estado redox en los plasmas obtenidos mediante Ia técnica del TEAC ("Trolox Antioxidant Capacity Assay"). Esta técnica, determina Ia capacidad antioxidante in vitro dando una idea del estado redox de Ia muestra analizada mediante Ia capacidad de absorbancia por transferencia de electrones. A los plasmas diluidos 1/10 en PBS (10 μl_), se les añadió en una placa de 96 pocilios los diferentes componentes de Ia reacción, mioglobina, ABTS (ácido 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-sulfónico), peróxido de hidrógeno y H ₂ O ₂ . Tras 3 minutos de incubación, Ia absorbancia se midió a 405 nm (con una referencia de 600 nm).

En Ia Figura 48 se puede observar que ambos tratamientos son capaces de disminuir de manera significativa los niveles plasmáticos de colesterol total. Este hecho se manifiesta principalmente en una disminución de VLDL y HDL además de en un menor incremento de LDL. Además, los niveles de Ia apolipoproteína B (apoB) fueron visiblemente disminuidos por los tratamientos. En Ia Figura 49 se muestran además Ia disminución de los niveles de CL y CE tras los tratamientos con el compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina, siendo esta reducción más acusada a partir de los 21 d ías de tratamiento. Adicionalmente se demostró, como se presenta en Ia Figura 50, que los tratamientos con NST0037 y con simvastatina disminuyen el estado redox de los plasmas de los animales.

En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 28 d ías mediante administración oral a ratones con hiperlipidemia congénita produce una disminución de los niveles de colesterol total, esterificado, libre, de todas las fracciones lipoprotéicas asociadas al colesterol, de los niveles de ApoB y del estado redox de los animales.

EJEMPLO 21

Efecto hipocolesterolémico de NST0037 administrado oralmente durante tres meses en un modelo de hiperlipidemia endógena (familiar)

En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037, los investigadores decidieron evaluar el efecto de Ia administración oral durante 3 meses de NST0037 en el mismo modelo de hipelipidemia endógena familiar (ratones apoB100). Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratones hembra de 6 meses de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.

Los animales fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =8); grupo simvastatina (n = 6); grupo NST0037 (n = 8). Tras un acondicionamiento a Ia dieta, a los ratones se les administró oralmente durante 3 meses 50 mg/kg de NST0021 o NST0037, tres veces semanales, empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0.25 % en suero salino fisiológico. El grupo control recibió este mismo vehículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los uno, dos y tres meses de iniciar el mismo, se llevó a cabo una extracción de sangre retro-orbital previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total, colesterol libre (CL), colesterol (CE), c-HDL, c-LDL y, c-VLDL por técn icas enzimáticas y espectrofotométricas. En Ia Figura 51 se puede observar como ambos tratamientos disminuyeron las diferentes fracciones de colesterol. No obstante, y de forma sorprendente, NST0037 disminuyó en mayor medida los niveles de c-LDL y aumentó los de c-HDL, mostrando así un mejor perfil cardioprotector que Ia simvastatina. Estos resultados se correlacionaron con los efectos de los tratamientos sobre los niveles de CL y CE (Figura 52), y donde que se apreció que el NST0037 produce una disminución significativa tanto de CL como de CE.

En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 3 meses mediante administración oral a ratones con hiperlipidemia congénita produce una disminución de los niveles de colesterol total, esterificado, libre, así como una disminución de los niveles de c-LDL y un aumento del c-HDL, Io que demuestra su poder cardioprotector.

EJEMPLO 22 Efecto hipolipemiante de NST0037 en ratas zucker genéticamente obesas En base a los resultados presentados previamente sobre el carácter hipocolesterolémico del compuesto NST0037 en ratones, los investigadores decidieron evaluar el efecto de Ia administración oral durante 7 días de

NST0037 en un modelo de h ipel ipidem ia endógena en ratas Zucker genéticamente obesas, con niveles de lípidos anormalmente elevados.

Todos los animales incluidos durante el proceso experimental fueron ratas zucker macho de 11 semanas de edad. Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). Los animales tuvieron su respectivo periodo de cuarentena y fueron tratados con Ia máxima precaución para minimizar posibles contaminaciones durante los tratamientos y manipulaciones.

Los animales fueron divididas en tres grupos: grupo control (n =7); grupo simvastatina (n = 7); grupo NST0037 (n = 7). Tras un acondicionamiento a Ia dieta, a las ratas se les administró oralmente y a Ia misma hora (15.00 a 18.0Oh) durante 7 días consecutivos 30 mg/kg de NST0021 o NST0037, empleando en ambos casos como vehículo carboximetilcelulosa al 0.5 % en agua. El grupo control recibió este mismo veh ículo. Antes de iniciar los tratamientos y a los 7 días del mismo se extrajo sangre por punción lingual bajo anestesia previo ayuno de 16h. De dicha sangre se obtuvo el plasma donde se evaluaron los niveles de colesterol total, c-HDL, c-LDL, c-VLDL, y triglicéridos (TG) por técnicas enzimáticas y espectrofotométricas. Para comprobar si el efecto a nivel de lípidos implicaba una alteración del estrés oxidativo, se evaluó además el estado redox en los plasmas obtenidos mediante Ia técnica del TEAC ("Trolox Antioxidant Capacity Assay"). Esta técnica, determina Ia capacidad antioxidante in vitro dando una idea del estado redox de Ia muestra analizada mediante Ia capacidad de absorbancia por transferencia de electrones. A los plasmas diluidos 1/10 en PBS (10 μL), se les añadió en una placa de 96 pocilios los diferentes componentes de Ia reacción, mioglobina, ABTS [ácido 2 , 2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-sulfónico)] y peróxido de hidrógeno. Tras 3 minutos de incubación, Ia absorbancia se midió a 405 nm (con una referencia de 600 nm).

En Ia Figura 53 se puede apreciar que tanto Ia simvastatina como el NST0037 fueron capaces de disminuir igualmente los niveles plasmáticos de LDL, hecho directamente relacionado con Ia inhibición de Ia actividad HMGR, que lleva a un aumento de expresión de receptores LDL. En este caso, el efecto de NST0037 alcanzó significación estad ística. Además, ambos compuestos produjeron un aumento de HDL, Io que implica un efecto cardioprotector. En Ia Figura 54 se observa como los compuestos disminuyeron los n iveles de trigl icéridos plasmáticos, Io que indica un efecto hipotrigliceridémico. Además, mientras que en las ratas control se produjo un incremento del estrés oxidativo (Figura 55), determinado por medio del estado redox en plasma mediante TEAC, en las ratas tratadas con simvastatina y NST0037 se produjo una drástica disminución, Io que indica un efecto antioxidante. En este caso, los resultaros fueron estadísticamente significativos sólo en el caso de NST0037.

En resumen, el tratamiento con NST0037 durante 7 días mediante administración oral a ratas Zucker genéticamente obesas con hiperlipidemia endógena produjo una disminución de los niveles de c-LDL, de triglicéridos, y del estado redox, Io que demuestra su poder cardioprotector.

EJEMPLO 23

Efecto de NST0037 sobre Ia expresión del gen 24- dehidrocolesterol reductasa (Seladin-1/DHCR24) en ratones salvajes

En base a los resultados presentados en el Ejemplo 9 sobre Ia inducción del gen seladin-1/DHCR24 en líneas neuronales humanas, los investigadores decidieron analizar si el NST0037 modulaba dicho gen en cerebros de ratones tratados con este compuesto. Para llevar a cabo este estudio, ratones macho C57BL6 de 3 meses de edad (n=3/grupo) fueron tratados oralmente con 50 mg/kg de simvastatina o NST0037. Un grupo control recibió únicamente el vehículo, y que consistió en carboximetilcelulosa al 0.25% en suero salino fisiológico. 4h después de las administraciones orales, los animales fueron sacrificados bajo anestesia gaseosa con isofluorano y los cerebros, previamente perfundidos con PBS, fueron extraídos e inmediatamente después congelados en nitrógeno líquido. Posteriormente, el RNA total del cerebro se extrajo mediante el kit High Puré RNA Isolation (Roche) y Ia cantidad y calidad del RNA se analizaron mediante espectrofotometría (Infinite 200 con NanoQuant, Tecan) y visualización de las bandas 18S y 28S mediante electroforesis. La RT-PCR se realizó mediante dos pasos, en primer lugar se pasó el mRNA a cDNA usando el RNA to cDNA kit (Applied Biosystem) y posteriormente se analizó Ia expresión génica mediante sondas TaqMan utilizando las sondas validadas Mn00519071_m1 para seladin- 1/DHCR24 y Hs99999901_s1 para 1 8S (util izado para normal izar los resultados) en el equipo 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). La cantidad relativa de Ia expresión del gen se determinó utilizando el método ΔΔCt con el software SDS v2.1.1 (Applied Biosystem); Ia expresión de 18S fue usada para normalizar Ia medida.

En Ia Figura 56 se puede observar como tanto Ia simvastatina como el NST0037 aumentaron Ia expresión del gen a las 4h de su administración en igual medida. Estos resultados confirman los datos previos en neuronas humanas donde se observaba un aumento de Ia expresión de seladin-1 como mecanismo neuroprotector del NST0037. Además, estos resultados confirman el paso de barrera hematoencefálica presentado en ejemplos previos.

En resumen, el tratamiento oral con NST0037 a ratones salvajes produce un aumento del gen neuroprotector seladin-1 /DHCR24, Io que confirma además que el compuesto atraviesa Ia barrera hematoencefálica.

EJEMPLO 24

Análisis comparativo en índice de supervivencia de dos compuestos en larvas de pez cebra 24.1. Análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas de pez cebra. Ensayo de toxicidad aguda.

Para evaluar Ia bioseguridad del compuesto NST0037 se analizaron sus efectos toxicológicos en el modelo de larva de pez cebra med iante Ia determinación de los parámetros de seguridad del protocolo C15 de Ia OECD.

Los huevos fertilizados fueron obtenidos por apareamiento natural del pez cebra (Danio rerio, cepa AB). Un total de 8-10 parejas fueron utilizadas para cada cruce y se generaron un total de 200-250 huevos de media por pareja. Los huevos se recogieron inmediatamente después del desove y fueron lavados con agua de dilución (CaCI ₂ ^H ₂ O ₂ 0.29 g/L, MgSOWH ₂ O ₂ 0.12 g/L, NaHCO ₃ 0.065 g/L, KCI 0.006 g/L) ajustándose a pH 7.8 ± 0.2, acorde con el Reglamento CE n° 440/2008 método C.1 y depositados en una placa petri.

Los embriones se desarrollaron con normalidad hasta 96 horas postfertilización en su medio de crecimiento. En dicho momento, las larvas fueron transferidas de las placas petri de crecimiento a las cámaras de exposición (placas microtiter M24) por medio de pipetas y expuestos a las sustancias a testar (NST0037 o simvastatina), con agua de dilución (controles) o con diferentes concentraciones de los tratamientos. Las larvas fueron incubadas sin aireación adicional, a Ia temperatura apropiada (25±1 ⁰ C) y bajo un régimen de 12 h luz/12 h oscuridad. Cada experimento fue realizado en triplicado.

Los estudios fueron llevados a cabo durante 24 horas de tratamiento, realizando así un ensayo de toxicidad aguda. Los tratamientos llevados a cabo siguieron Ia siguiente pauta:

> 10 animales control, tratados con agua de dilución durante un periodo de 24 horas.

> 30 animales tratados con el compuesto NST0037 (10 larvas por triplicado) diluido en agua de dilución durante un periodo de 24 horas.

> 30 animales tratados con el compuesto simvastatina (10 embriones por triplicado) diluido en agua de dilución durante un periodo de 24 horas. Después del tiempo de exposición de las sustancias a estudio, se determinó el registro de Ia mortalidad de las larvas. La Tabla Il muestra el análisis del índice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas de pez cebra. En Ia tabla se muestra el número de larvas utilizadas para Ia experimentación, Ia dosis en mg/Kg (de peso del animal), el tiempo de tratamiento y el número de larvas muertas respecto al total. Tabla Il Grupo (NST0037) Larvas Dosis (mg/Kg) Tiempo (Dias) Mortalidad

1 10 Vehicle ^a 1 0/10

2 30 10 1 0/30

3 30 30 1 0/30

4 30 100 1 0/30

5 30 300 1 0/30

6 30 1000 1 0/30

Grupo

Larvas Dosis (mg/Kg) Tiempo (Días) Mortalidad (simvastatína}

1 10 Vehicle ^a 1 0/10

2 30 10 1 0/30

3 30 30 1 0/30

4 30 100 1 0/30

5 30 300 1 0/30

6 30 1000 1 0/30 aAαuadeembrιones

Los resultados del estudio mostraron que ambos compuestos presentan un perfil toxicológico similar en cuanto al parámetro de inducción de mortalidad de larvas de pez cebra, no observándose Ia presencia de ningún óbito a ninguna de las dosis usadas.

24.2. Análisis del porcentaje de larvas sanas tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas. Ensayo de toxicidad aguda.

Basándose en los resultados anteriores, los inventores quisieron determinar si Ia ausencia de mortalidad registrada por el compuesto NST0037 estaba asociada a un porcentaje de larvas sanas igual o menor al del tratamiento con simvastatina. El porcentaje de larvas sanas fue definido como el número de larvas vivas y sin síntomas de anomalías fisiopatológicas externas (morfológica y/o en comportam iento), siendo éste un parámetro que determ ina Ia bioseguridad de una sustancia a estudio y es complementaria a los índices de supervivencia y a las LD ₅ O- Tal y como se muestra en Ia Figura 58, se observaron diferencias en los porcentajes de larvas sanas entre los dos tratamientos evaluados a Ia dosis más alta de estudio (1000 mg/Kg), llegando al 67.9 ± 3.3 para el compuesto NST0037, siendo del 53.3 ± 8.8 para Ia simvastatina, Io que indica sorprendentemente una mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en el modelo de larva de pez cebra.

24.3. Análisis del porcentaje de larvas con aspecto anómalo (sintomatología) tras exposición del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en larvas. Ensayo de toxicidad aguda. En base a los resultados de los apartados anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis del porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo, recogiendo el porcentaje de larvas que presenten anomalías corporales y/o pigmentarias. Las anomalías registradas en el estudio se describen a continuación:

• Trombosis en el saco vitelino o yolk: es un coágulo en el interior de un vaso sanguíneo, en este caso de cualquier vaso que riega el yolk.

• Trombosis cardiaca: ocurre en un vaso cardiaco. • Edema (o hidropesía) cardiaco: es Ia acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial y también en las cavidades del organismo. En el caso del corazón, se produce acumulación de líquido en Ia bolsa pericárdica.

Los resultados indican que el porcentaje de larvas con deformidades o aspecto anómalo es muy similar entre ambos compuestos, no obstante, y tal y como muestra Ia Figura 58, se observa sorprendentemente que Ia simvastatina indujo un mayor porcentaje de larvas con sintomatología toxicológica que el compuesto NST0037, Io que indica una mayor bioseguridad de este último.

En resumen, el tratamiento con NST0037 a larvas de pez cebra en un amplio rango de concentraciones no produce mortalidad alguna, además de presentar un mayor porcentaje de larvas sanas y un menos número de larvas con deformidades o aspecto anómalo que Ia simvastatina.

EJEMPLO 25 25.1. Estudio de Ia variación del peso de peces cebra adultos en un ensayo de Toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina

En base a los resultados de ejemplos anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de Ia variación del peso de peces cebra adultos, mediante un ensayo de dosis simple recogido por Ia Agencia Europea del Medicamento (EMEA). Este estudio del EMEA trata sobre Ia calidad y Ia cantidad del fenómeno tóxico producido por Ia adm in istración ún ica de una sustancia o combinación de sustancias, relacionado con el tiempo. Estos estudios dan parte de información de los posibles efectos de sobredosis producidos en humanos y pueden ser útiles para el diseño de estudios de toxicidad donde se requiere dosis repetidas de administración del tratamiento.

Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). El ensayo desarrollado presentó los siguientes parámetros de estudio: S Duración del tratamiento: 24 horas por exposición en el agua. S Tiempo post-tratamiento: 14 días. S Número de animales: 7 por concentración.

S Recipientes de ensayo: peceras de 9 litros de capacidad, llenándolas con un volumen de 5 litros con agua de recirculación de los racks filtrado.

S Carga de animal: peso medio de los peces, entre 0.54-0.60 gr. S Concentración de ensayo: 2000 mg/kg. S Luz: fotoperiodos de 12/12 horas de luz/oscuridad. S Temperatura: 25 ± 1 ⁰ C. S Alimento: no se alimenta a los animales 24 horas antes del tratamiento y tampoco durante las 24 horas que dura el ensayo. Posteriormente, se alimentaron como al resto de los animales. •/ Peso de los animales: se pesaron a tiempo 0 (antes del tratamiento), a 7 y a 14 días post-tratamiento. En este caso se utilizó como parámetro de toxicidad el peso de los animales de los diferentes grupos de estudio a tres tiempos establecidos: antes del comienzo de los tratamientos (0 dpt), a día 7 post-tratamiento y a día 14 post-tratamiento. En Ia Figura 59 se muestra el promedio de los pesos de los animales en función del tratamiento y del tiempo post-exposición de las sustancias. Los resultados indicaron que mientras que los peces sin tratamiento aumentaron de peso a Io largo del estudio, mientras que los tratados con simvastatina redujeron significativamente el peso. Por su parte el tratamiento con NST0037, de manera sorprendente, no modificó el peso durante Ia duración del ensayo, Io que indica que presenta un mejor perfil de seguridad de Ia simvastatina.

25.2. Estudio histopatolóqico en peces cebra adultos tras ensayo de toxicidad de dosis única (24 horas) por exposición en el agua del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina

En base a los resultados de los estudios anteriores, los inventores decidieron averiguar si existían diferencias en el estudio histopatológico de los diferentes grupos de tratamiento mediante Ia tinción de las muestras con hematoxilina-eosina, Ia cual permite discernir marcas patológicas en los órganos o tejidos de los animales a estudio. Para ello, los peces se sacrificaron a 14 días post-tratamiento (previamente anestesiados) y las muestras (pez entero) fueron incluidas en parafina. Posteriormente se realizó Ia tinción de hematoxilina-eosina para Ia realización de los estudios histopatológicos, obteniéndose un mínimo de 6 cortes longitudinales por animal, con el objetivo de recoger diferentes zonas de estudio del mismo órgano. Los órganos estudiados fueron los siguientes: cerebro, riñon, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, músculo e hígado. En Ia figura 60, se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado en los animales tratados con Ia dosis de 2000 mg/Kg. De todos los órganos estudiados, los únicos que presentaron rasgos patológicos discernibles fueron el intestino y el ovario. En el intestino se detectó huellas de atrofia en las vellosidades intestinales, siendo más acusada en los animales tratados con simvastatina que en los tratados con NST0037. En el ovario de las hembras tratadas con simvastatina se detectó atrofia en ovocitos terciarios. Además, el hígado de los animales tratados con ambos compuestos presentó zonas discretas de inflamación.

En resumen, el tratamiento con NST0037 a peces cebra adultos no modificó el peso de los mismos durante un experimento de 14 días, mientras con simvastatina se detectó una disminución significativa del peso de los animales. Además, Ia simvastatina produjo mayores efectos histopatológicos que el NST0037, demostrándose que este último compuesto es más seguro. EJEMPLO 26

26. 1 . Estudio de letalidad por exposición constante en el agua (4 días) de NST0037 en comparación con Ia simvastatina en pez cebra adulto.

En base a los resultados de ejemplos anteriores, los inventores decidieron averiguar si Ia mayor bioseguridad del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina se corroboraba mediante el análisis de Ia letalidad por exposición constante en el agua durante 4 días según el test de toxicidad aguda para peces de Ia OECD (Draft Revised Guideline 203). El objeto de este ensayo es determinar Ia toxicidad letal aguda de una sustancia en peces de agua dulce. La toxicidad aguda es el efecto adverso, discernible, inducido en un organismo como consecuencia de Ia exposición a una sustancia dada durante un corto período de tiempo (días). En el presente ensayo, Ia toxicidad aguda viene expresada como Ia dosis letal media (LD ₅₀ ), es decir, Ia dosis que en el agua causa Ia muerte del 50% de los peces de un lote sometido a ensayo durante un período de exposición continuo.

Los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo estrictamente las normas Guidance on the Operation of Animáis (Scientific Procedures, Act. 1986). El ensayo desarrollado presentó los siguientes parámetros de estudio:

S Método estático: se realizó un ensayo de toxicidad durante el cual no hubo renovación de Ia solución de ensayo.

S Se efectúa un control (o testigo), sin sustancia de ensayo además de las concentraciones de ensayo propiamente dichas. S Duración: 4 días.

S Número de animales: 7 por concentración. S Recipientes: cubetas de 9 litros, llenándolas con un volumen de 5 litros, con agua de recirculación de los racks filtrado. S Carga: peso medio de los peces: 0.46 gr ± 0.03, quedando Ia carga en

0.49 gr/litro.

S Concentraciones de ensayo: 5 concentraciones (1 , 3.2, 10, 32 y 100 mg/kg).

S Luz: fotopehodos de 12/12 horas de luz/oscuridad. S Temperatura: 25±1 ⁰ C. S Alimento: ninguno. Como parámetro de toxicidad se registraron los óbitos de los animales a estudio durante todo el tiempo del ensayo.

La Tabla III muestra el anál isis del índ ice de supervivencia del compuesto NST0037 en comparación con Ia simvastatina en peces cebra adultos tratados durante 4 días con los compuestos en el agua. En Ia tabla se muestra el número de animales utilizados para Ia experimentación, Ia dosis en mg/Kg (de peso del animal), el tiempo de tratamiento y el número de animales muertos respecto al total.

Tabla III

Dosis

Grupo (NSTG037) Anímales Tiempo (Días) Mortalidad (mg/kg)

1 7 Vehículo ⁸ 4 0/7

2 7 1 4 0/7

3 7 3.2 4 0/7

4 7 10 4 0/7

5 7 32 4 0/7

6 7 100 4 1/7

Dosis

Grupo (símvastatín) Anímales Tiempo (Días) Mortalidad (mg/kg)

1 7 1 4 0/7

2 7 3.2 4 0/7

3 7 10 4 0/7

4 7 32 4 0/7

5 7 100 4 6/7 βAgua del sistema.

Tal y como se muestra en Ia Tabla III, Ia mortalidad producida por ambos compuestos en este ensayo de toxicidad aguda demuestran sorprendentemente que Ia simvastatina fue significativamente más tóxica que el compuesto NST0037 (χ ² , p-valor < 0.001 ), ya que a día 4 post-tratamiento, el 14% (1/7) de los animales tratados con NST0037 murieron, siendo del 86 % (6/7) el porcentaje de mortalidad observado para el grupo de tratamiento con simvastatina. Según Io observado en este estudio, Ia LD ₅ O del compuesto NST0037 fue superior a 100 mg/Kg después de 4 días de tratamiento continuo con el compuesto. La simvastatina presentó una LD ₅₀ de 60.55 mg/Kg después de 4 dpt; de nuevo y de manera sorprendente fue más tóxica que el compuesto NST0037, ya que Ia simvastatina alcanzó Ia LD ₅₀ con menos dosis que NST0037 y en el mismo tiempo. 26. 2. Estudio histopatolóqico en peces cebra adultos tras ensayo de letalidad por exposición constante en el agua (4 días) de NST0037 en comparación con Ia simvastatina en pez cebra adulto

En base a los resultados de los estudios anteriores, los inventores decidieron averiguar si existían diferencias en el estudio histopatológico de los diferentes grupos de tratamiento mediante Ia tinción de las muestras con hematoxilina-eosina, Ia cual permite discernir marcas patológicas en los órganos o tejidos de los animales a estudio. Para ello, los peces Los peces que sobrevivieron al tratamiento se sacrificaron a 4 d ías post-tratamiento (previamente anestesiados) y las muestras (pez entero) fueron incluidas en parafina. Posteriormente se realizó Ia tinción de hematoxilina-eosina para Ia realización de los estudios histopatológicos, obteniéndose un mínimo de 6 cortes longitudinales por animal, con el objetivo de recoger diferentes zonas de estudio del mismo órgano. Los órganos estudiados fueron los siguientes: cerebro, riñon, páncreas, intestino, ojo, branquias, ovario, testículo, músculo e hígado.

En Ia Figura 61 , se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado en los animales tratados. En ella se muestran imágenes representativas del estudio histopatológico realizado. Las únicas dosis que indujeron problemas toxicológicos fueron las de 32 y 100 mg/Kg, restringiéndose las alteraciones patológicas a los ovarios. Mientras las hembras control mostraron fol ículos ováricos normales en diferentes estadios de maduración, las hembras tratadas con 100 mg/Kg de ambos compuestos presentaron daño ovárico, observándose una degeneración masiva de los ovocitos secundarios y terciarios, además de alteración estromal. Por otro lado, el grupo de hembras tratadas con 30 mg/kg de simvastatina también presentó daño histopatológico en el ovario, no siendo observado sorprendentemente en el grupo de hembras tratadas con Ia misma dosis del compuesto NST0037, Io que indica que el compuesto NST0037 es más seguro que Ia simvastatina en este modelo experimental.

En resumen, el tratamiento con NST0037 a peces cebra adultos durante 4 días a 100 mg/Kg presentó una mortalidad residual, Ia cual fue ampliada en las mismas condiciones con simvastatina. Además, los daños histopatológicos encontrados se restringieron a los ovarios de los animales y se detectaron a las dosis de 32 y 100 mg/Kg para Ia simvastatina, mientras que con NST0037 el daño ovárico sólo se detecto a Ia dosis más alta, Io que demuestra que este último compuesto es más seguro.