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Title:
AUGMENTED-FIELD-OF-VIEW, HIGH-RESOLUTION OPTICAL MICROSCOPY METHOD AND OPTICAL MICROSCOPE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2023/036946
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to an optical microscope (100) and a microscopy method. According to the invention, the microscope comprises an imaging module (200) comprising an optical beam splitter (40), a first optical system (41, 42, 43), a first camera (51), a second optical system (44, 45, 46, 47) and a second camera (52), the second optical system (44, 45, 46, 47) and the second camera (52) being configured to acquire a low-magnification image, and the first optical system (41, 42, 43) comprising a reflective scanning device (42, 48) placed in a plane (72) optically conjugate with the Fourier plane (71) of the optical microscope (100), a controller (300) being configured to angularly orient the reflective scanning device (42, 48) so that the first camera (51) acquires at least a first image (61, 62,..., 6N) of a segment of the object field of the microscope objective (21, 22, 23).

Inventors:
BADON AMAURY (FR)
RECHER GAËLLE (FR)
NASSOY PIERRE (FR)
Application Number:
PCT/EP2022/075139
Publication Date:
March 16, 2023
Filing Date:
September 09, 2022
Export Citation:
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Assignee:
UNIV BORDEAUX (FR)
CENTRE NAT RECH SCIENT (FR)
INST DOPTIQUE THEORIQUE ET APPLIQUEE – IOTA (FR)
International Classes:
G02B21/36; G02B21/08; G02B21/18; G02B26/10; G02B21/00
Foreign References:
DE202005021436U12008-02-14
US20050243412A12005-11-03
EP2606394A12013-06-26
DE102009010446A12010-09-02
DE102016120312B32017-10-05
US20140146376A12014-05-29
US20180074306A12018-03-15
US20110096393A12011-04-28
US20180202935A12018-07-19
Attorney, Agent or Firm:
CHAUVIN, Vincent et al. (FR)
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Claims:
Revendications Microscope optique (100) comprenant un corps de microscope et un boîtier (10) entourant le corps du microscope, le microscope optique comprenant un porte-échantillon (11) apte à recevoir un échantillon (1) dans un plan objet (3), un objectif de microscope (21, 22, 23) apte à collecter un faisceau image (30) issu d'un champ objet dans le plan objet (3) et à former une image intermédiaire du champ objet dans un plan image (33), le microscope optique ayant un plan de Fourier (71) situé entre le plan objet (3) et le plan image (33) à l'intérieur du boîtier du microscope, caractérisé en ce que le boîtier comporte un port de sortie et, le microscope optique comporte un module d'imagerie (200) arrangé à l'extérieur du boîtier du microscope et un contrôleur (300), le module d'imagerie (200) comprenant une première caméra (51), une seconde caméra (52), un séparateur optique de faisceau (40) apte à recevoir le faisceau image (30) du plan image (33) et à former un premier faisceau image (31) et un second faisceau image (32), un premier système optique (41, 42, 43) disposé entre le séparateur de faisceau (40) et la première caméra (51), un second système optique (44, 45, 46, 47) disposé entre le séparateur de faisceau (40) et la seconde caméra (52), le second système optique (44, 45, 46, 47) et la seconde caméra (52) étant configurés pour acquérir une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23), le premier système optique (41, 42, 43) ayant un grossissement supérieur au second système optique (44, 45, 46, 47) et le premier système optique (41, 42, 43) comprenant un système optique de déport (41) disposé de manière à déporter le plan de Fourier (71) via le port de sortie à l'extérieur du boîtier et former l'image du plan de Fourier (71) dans un plan de Fourier image (72), le premier système optique (41, 42, 43) comportant un dispositif réflectif de balayage (42, 48) disposé dans ou à proximité du plan de Fourier image (72) conjugué optiquement avec le plan de Fourier (71) du microscope optique (100) et le premier système optique (41, 42, 43) comportant une lentille (43), la première caméra (51) étant placée dans le plan focal de la lentille (43), le contrôleur (300) étant adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage (42, 48) de façon à ce que la première caméra (51) acquière au moins une première image (61, 62,..., 6 N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23), simultanément avec l'image large vue du champ objet acquise par la seconde caméra (52), et dans lequel le contrôleur (300) est adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) dans une série d'au moins deux positions, la première caméra (51) étant adaptée pour acquérir une série de premières images (61,

62,..., 6N) d'au moins deux portions du champ objet sans déplacement de l'échantillon, sans changement d'objectif de microscope et sans changement de grossissement optique entre le champ objet et la première caméra (51), le microscope (100) comprenant un système de traitement d'image adapté pour recevoir la série de premières images (61,

62,..., 6N) et pour reconstruire une image mosaïque (600) haute résolution du champ objet. Microscope optique selon la revendication 1 comprenant un oculaire disposé pour former une image visuelle du champ objet. Microscope optique selon la revendication 2 dans lequel l'image visuelle s'étend sur un champ de vue inscrit dans l'image mosaïque. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) comprend un miroir plan monté sur un actionneur galvanométrique ou motorisé, le miroir plan étant mobile autour d'un ou deux axes. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) comprend un microsystème électromécanique à base de micromiroirs. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel le microscope est de type droit ou inversé. Microscope optique selon l'une des revendications 1 à 6 comprenant un dispositif d'affichage adapté pour afficher simultanément l'image large vue du champ objet et ladite au moins une première image (61, 62,..., 6 N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23). Procédé de microscopie optique comprenant les étapes suivantes : collection d'un faisceau image (30) issu d'un champ objet dans un plan objet (3) d'un objectif de microscope et formation d'une image intermédiaire dans un plan image (33) conjugué optiquement avec le plan objet (3) ;

Collection du faisceau image issu du plan image (33) et séparation optique en un premier faisceau image (31) et un second faisceau image (32) ; 16

Transmission du premier faisceau image (31) via un premier système optique (41, 42, 43) vers une première caméra (51), le premier système optique (41, 42, 43) comportant un dispositif réflectif de balayage angulaire (42, 48) disposé dans ou à proximité d'un plan (72) conjugué optiquement avec le plan de Fourier (71) du microscope optique ; et simultanément, transmission du second faisceau image (32) via un second système optique (44, 45, 46, 47) vers une seconde caméra (52), le premier système optique (41, 42, 43) ayant un grossissement supérieur au second système optique (44, 45, 46, 47); acquisition via la seconde caméra (52) d'une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23) ; orientation angulaire du dispositif réflectif de balayage (42, 48) pour l'acquisition via la première caméra (51) d'au moins une première image (61, 62,..., 6N) d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope (21, 22, 23), simultanément avec l'acquisition de l'image large vue via la seconde caméra (52).

Description:
Microscope optique et procédé de microscopie optique haute résolution à champ de vue augmenté

Domaine technique

[0001] La présente invention concerne le domaine technique de la microscopie optique et de l'acquisition d'images de haute résolution en microscopie optique.

Technique antérieure

[0002] Dans le domaine ci-dessus, il est connu d'intégrer une caméra sur un port de sortie d'un microscope optique pour acquérir des images via le microscope. Il est aussi connu de changer une partie du système optique du microscope, en commutant l'objectif de microscope et/ou des éléments optiques internes au microscope, pour augmenter le grossissement du système optique entre l'échantillon et la caméra. Un tel changement de grossissement permet d'augmenter la résolution spatiale de l'image de microscopie formée sur la caméra.

[0003] Toutefois, l'augmentation de la résolution spatiale s'accompagne généralement d'une réduction du champ de l'image sur la caméra. Pour obtenir une image de différentes régions d'intérêt d'un échantillon, on utilise généralement une platine de déplacement du porte-échantillon, pour ramener la région d'intérêt au centre de l'image de haute résolution.

[0004] Cependant, les mouvements mécaniques liés au déplacement du porte-échantillon ou à une commutation d'une partie du système optique peuvent induire des vibrations néfastes pour certains échantillons fragiles et mobiles comme des échantillons biologiques en solution, par exemple des suspensions colloïdales, des organoïdes. De plus, ces mouvements mécaniques entraînement généralement un désalignement entre les différentes images. Enfin, ces systèmes sont relativement lents.

[0005] Il existe un besoin pour un appareil et un procédé d'acquisition d'image de microscopie optique ayant à la fois une haute résolution et un champ image étendu, qui soit rapide et sans vibrations.

Exposé de l'invention [0006] Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un microscope optique comprenant un corps de microscope et un boîtier entourant le corps du microscope, le microscope optique comprenant un porte- échantillon apte à recevoir un échantillon dans un plan objet, un objectif de microscope apte à collecter un faisceau image issu d'un champ objet dans le plan objet et à former une image intermédiaire du champ objet dans un plan image, le microscope optique ayant un plan de Fourier situé entre le plan objet et le plan image à l'intérieur du boîtier du microscope.

[0007] Plus particulièrement, on propose selon l'invention un microscope optique dans lequel le boîtier comporte un port de sortie et, le microscope optique comportant un module d'imagerie arrangé à l'extérieur du boîtier du microscope et un contrôleur, le module d'imagerie comprenant une première caméra, une seconde caméra, un séparateur de faisceau apte à recevoir le faisceau image du plan image et à former un premier faisceau image et un second faisceau image, un premier système optique disposé entre le séparateur de faisceau et la première caméra, un second système optique disposé entre le séparateur de faisceau et la seconde caméra, le second système optique et la seconde caméra étant configurés pour acquérir une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope, le premier système optique ayant un grossissement supérieur au second système optique et le premier système optique comprenant un système optique de déport disposé de manière à déporter le plan de Fourier via le port de sortie à l'extérieur du boîtier et à former l'image du plan de Fourier dans un plan de Fourier image, le premier système optique comportant un dispositif réflectif de balayage disposé dans ou à proximité du plan de Fourier image conjugué optiquement avec le plan de Fourier du microscope optique et le premier système optique comportant une lentille, la première caméra étant placée dans le plan focal de la lentille, le contrôleur étant adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage de façon à ce que la première caméra acquière au moins une première image d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope, simultanément avec l'image large vue du champ objet acquise par la seconde caméra, et dans lequel le contrôleur est adapté pour orienter angulairement le dispositif réflectif de balayage angulaire dans une série d'au moins deux positions, la première caméra étant adaptée pour acquérir une série de premières images d'au moins deux portions du champ objet sans déplacement de l'échantillon, sans changement d'objectif de microscope et sans changement de grossissement optique entre le champ objet et la première caméra, le microscope comprenant un système de traitement d'image adapté pour recevoir la série de premières images et pour reconstruire une image mosaïque haute résolution du champ objet.

[0008] Ce module d'imagerie permet d'agrandirfortement la zone observée de l'échantillon de façon rapide et sans avoir à déplacer physiquement l'échantillon.

[0009] D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du microscope conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes.

[0010] De façon avantageuse, le microscope comprend un oculaire disposé pour former une image visuelle du champ objet.

[0011] Avantageusement, l'image visuelle s'étend sur un champ de vue inscrit dans l'image mosaïque.

[0012] Selon un mode de réalisation, le dispositif réflectif de balayage angulaire comprend un miroir plan monté sur un actionneur galvanométrique ou motorisé, le miroir plan étant mobile autour d'un ou deux axes.

[0013] Selon un autre mode de réalisation, le dispositif réflectif de balayage angulaire comprend un microsystème électromécanique à base de micromiroirs.

[0014] Le microscope est de type droit ou inversé.

[0015] Selon un aspect particulier et avantageux, le microscope comprend un dispositif d'affichage adapté pour afficher simultanément l'image large vue du champ objet et ladite au moins une première image d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope.

[0016] L'invention propose également un procédé de microscopie optique comprenant les étapes suivantes : collection d'un faisceau image issu d'un champ objet dans un plan objet d'un objectif de microscope et formation d'une image intermédiaire dans un plan image conjugué optiquement avec le plan objet ; collection du faisceau image issu du plan image et séparation optique en un premier faisceau image et un second faisceau image ; transmission du premierfaisceau image via un premier système optique vers une première caméra, le premier système optique comportant un dispositif réflectif de balayage angulaire disposé dans ou à proximité d'un plan conjugué optiquement avec le plan de Fourier du microscope optique ; et simultanément, transmission du second faisceau image via un second système optique vers une seconde caméra, le premier système optique ayant un grossissement supérieur au second système optique ; acquisition via la seconde caméra d'une image large vue apte à s'étendre sur tout le champ objet de l'objectif de microscope ; orientation angulaire du dispositif réflectif de balayage pour l'acquisition via la première caméra d'au moins une première image d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope, simultanément avec l'acquisition de l'image large vue via la seconde caméra.

[0017] Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.

Brève description des dessins

[0018] De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où :

[0019] La figure 1 est une vue schématique d'un microscope comprenant un module d'imagerie et un contrôleur selon l'invention ;

[0020] La figure 2 est une vue de dessus d'un module d'imagerie selon un exemple de réalisation ;

[0021] La figure 3 est une vue schématique d'un dispositif réflectif de balayage angulaire selon un mode de réalisation ;

[0022] La figure 4 est un exemple d'image large vue du champ objet à basse résolution et d'une première image d'une portion du champ objet capturées simultanément ;

[0023] La figure 5 est une vue schématique illustrant un exemple de reconstruction d'une image mosaïque haute résolution du champ objet. [0024] Il est à noter que sur ces figures les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références.

Description détaillée

[0025] La figure 1 représente un microscope optique 100 auquel est fixé un module d'imagerie 200 selon l'invention. Le module d'imagerie est associé à un contrôleur 300 comportant en particulier un système de traitement d'image. Le microscope optique 100 est ici de type inversé. Par exemple, le microscope utilisé est un microscope Zeiss Axiovert 200. En variante, la présente divulgation s'adapte aisément à un microscope droit.

[0026] De manière classique, le microscope optique 100 comprend un corps ou bâti 10, un porte-échantillon 11, au moins un objectif de microscope 21, au moins une source de lumière 13 et/ou 14, un oculaire 12 et un port de sortie 2.

[0027] De façon avantageuse, le microscope comporte plusieurs objectifs de microscope 21, 22, 23 ayant en général des grossissements différents, par exemple xlO, x20, x50, xlOO. Les objectifs de microscope 21, 22, 23 sont montés sur une platine rotative 20 support d'objectif.

[0028] Un échantillon 1 est disposé sur le porte-échantillon 11. L'échantillon est situé dans un plan objet 3 de l'objectif de microscope 21. L'échantillon peut être tout type d'échantillon physique, chimique ou biologique. En particulier, l'échantillon peut être un échantillon biologique en solution, par exemple une suspension colloïdale, ou comporte un organoïde en solution. Le porte-échantillon est ici non-motorisé. On positionne manuellement l'échantillon par rapport à l'objectif de microscope. En option, le porte- échantillon est monté sur une platine de déplacement suivant un ou plusieurs axes X, Y et/ou Z.

[0029] La source de lumière 13 permet d'éclairer l'échantillon 1 par le dessus, sur un large champ. L'autre source de lumière 14 éclaire l'échantillon par en-dessous, à travers l'objectif de microscope 21. Les sources de lumière 13 et 14 sont adaptées à des modalités d'imagerie différentes. La source 13 éclairant en transmission est principalement utilisée pour de la microscopie de champ clair ou de l'imagerie de phase. La source 14 éclairant en réflexion est utilisée principalement pour de l'imagerie de fluorescence.

[0030] Comme indiqué plus haut, le microscope de la figure 1 est un microscope inversé. Autrement dit, dans le cas où on utilise la source de lumière 13, le microscope collecte la lumière transmise par l'échantillon et forme une image de l'échantillon dans un plan image 33. Dans le cas où on utilise l'autre source de lumière 14, le microscope collecte la lumière réfléchie par l'échantillon ou émise par fluorescence via un séparateur optique de faisceau 17. Dans les deux cas, le faisceau image 30 est collecté et se propage en dessous du porte-échantillon.

[0031] L'utilisateur peut observer l'échantillon à l'œil nu par l'oculaire 12. L'utilisateur visualise ainsi rapidement une grande image circulaire de l'échantillon formée notamment par l'objectif de microscope et visualisée via l'oculaire.

[0032] D'autre part, le microscope comporte un système optique d'imagerie interne comprenant par exemple le séparateur de faisceau 17, un miroir 18 et un système optique à lentille 19. Ce système optique d'imagerie forme une image de l'échantillon dans le plan image 33. Le plan image 33 est conjugué optiquement avec le plan objet 3 de l'objectif de microscope 31. On note 71 le plan de Fourier du microscope. Pour un objectif de microscope 21 corrigé à l'infini, le plan de Fourier est situé en aval de l'objectif de microscope 21 et en amont de la lentille 19. Le plan de Fourier 71 est situé à l'intérieur du bâti du microscope et n'est en général pas accessible. Par contre, le plan image 33 est généralement situé à l'extérieur du bâti microscope, le faisceau image 30 étant transmis à travers le port de sortie 2.

[0033] Dans un microscope conventionnel, une caméra est généralement placée dans le plan image 33 sur le port de sortie 2 pour détecter l'image de l'échantillon. Toutefois, l'image conventionnelle acquise par une caméra dans le plan image 33 est d'étendue beaucoup plus petite que l'image observée à travers l'oculaire. Selon la forme du capteur de la caméra, cette image acquise est de forme carrée ou rectangulaire. Cette différence entre l'image vue à travers l'oculaire et l'image acquise dans le plan image 33 est due à la taille du capteur et au nombre de pixels des caméras actuelles, limité généralement entre 1 et 5 millions de pixels. L'image acquise présente une haute-résolution spatiale associée à une étendue de champ réduite afin de satisfaire les conditions d'échantillonnage de Nyquist.

[0034] Comme illustré sur les figures 1 et 2, à la place du détecteur d'image classique placé sur le port de sortie, on dispose le module d'imagerie 200. Le module d'imagerie 200 comporte un séparateur optique de faisceau 40, une première caméra 51 et une seconde caméra 52. Le séparateur optique de faisceau 40 reçoit le faisceau image 30 provenant du port de sortie 2. Le séparateur optique de faisceau 40 sépare angulairement le faisceau image 30 en un premier faisceau image 31 se propageant dans une direction et un second faisceau image 32 se propageant dans une autre direction. Le séparateur optique de faisceau 40 peut avoir une répartition en énergie de 50-50, c'est-à-dire 50% sur chaque bras. En variante, la répartition d'énergie du séparateur optique de faisceau 40 peut être différente, par exemple de 80-20.

[0035] Un premier système optique est disposé entre le séparateur optique de faisceau 40 et la première caméra 51. Le premier système optique comprend par exemple une lentille 41, un miroir plan 42 et une autre lentille 43. Le premier système optique dirige le premier faisceau image 31 vers la première caméra 51. Les lentilles 41 et 43 sont par exemple de focale identique. A titre d'exemple, on utilise ici des lentilles 41, 43 ayant une longueur focale de 100 mm.

[0036] Un second système optique est disposé entre le séparateur optique de faisceau 40 et la seconde caméra 52. Le second système optique comprend par exemple une lentille 44, un système optique réflectif à deux miroirs 45 et 46 et une autre lentille 47. De préférence, le second système optique est fixe. Le second système optique dirige le second faisceau image 32 vers la seconde caméra 52. Les deux miroirs 45 et 46 sont plans et servent à replier le chemin optique pour rendre le module d'imagerie 200 plus compact. Les lentilles 44 et 47 sont choisies pour former un système optique de grossissement inférieur à 1. A titre d'exemple, on choisit ici une lentille 44 ayant une longueur focale Fi de 250 mm et une lentille 47 ayant une longueur focale de 75 mm. Le rapport entre les longueurs focales des lentilles 44 et 47 est ici de 0,3. La lentille 44 de longueur focale Fi est placée à la distance Fi du plan image 33 en sortie du microscope. Entre les lentilles 44 et 47, le second faisceau image 32 est collimaté. Ainsi, le faisceau incident sur les miroirs 45 et 46 est collimaté. La seconde caméra 52 est placée dans le plan focal de la lentille 47. Le second système optique et la seconde caméra 52 sont ainsi disposés et configurés pour permettre d'acquérir une image large vue 60 s'étendant par exemple sur tout le champ objet de l'objectif de microscope 21. Cette image large vue 60 est en général de forme carrée ou rectangulaire et présente au moins le même champ que l'image vue à travers l'oculaire.

[0037] Le premier système optique a un grossissement supérieur à celui du second système optique. Dans l'exemple détaillé ci-dessus, le premier système optique a un grossissement de 1 et le second système optique a un grossissement de 0,3.

[0038] De plus, le premier système optique comporte un dispositif réflectif de balayage. Dans le mode de réalisation illustré sur les figures 1 à 3, le dispositif réflectif de balayage comprend un miroir plan 42 monté sur un actionneur 48 mobile autour d'au moins un axe de rotation et de préférence deux axes de rotation. Sur la figure 2, l'actionneur comporte des servomoteurs pour pivoter le miroir 42 autour de deux axes de rotation transverses. En variante, on utilise un actionneur galvanométrique à deux axes qui permet un balayage plus rapide que des servomoteurs. Dans un autre mode de réalisation, le dispositif réflectif de balayage angulaire comprend un microsystème électromécanique (ou MEMS pour « Micro Electro-Mechanical System » en anglais) à base de micromiroirs. Les MEMS autorisent aussi un balayage plus rapide que des servomoteurs.

[0039] La lentille 41 de longueur focale F? est placée à la distance F? du plan image 33 en sortie du microscope. Un plan 72 conjugué optiquement avec le plan de Fourier 71 du microscope optique 100 est obtenu en aval de la lentille 41, à la distance F? de cette lentille 41. Autrement dit, la lentille 41 forme l'image du plan de Fourier 71 dans un plan de Fourier image, noté 72. Le miroir plan 42 est disposé au voisinage ou dans le plan de Fourier image 72. Le premier faisceau image 31 incident sur le miroir plan 42 est collimaté. Un contrôleur 300 électronique permet de commander l'orientation de l'actionneur 48 et donc la position angulaire du miroir plan 42. La première caméra 51 est placée dans le plan focal de la lentille 43.

[0040] Le miroir plan 42 étant orienté dans une première position, la première caméra 51 acquiert une première image 61 d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope 21. L'acquisition de la première image 61 sur la première caméra 51 et de l'image large vue 60 sur la seconde caméra 52 peuvent être simultanées. Comme illustré sur la figure 4, on dispose ainsi d'une image large vue 60, en particulier de tout le champ objet de l'échantillon, et d'une première image 61 de plus haute résolution d'une portion du champ objet plus petite que l'image large vue 60. L'image large vue 60 et la première image 61 peuvent être affichées sur un ou plusieurs écrans de visualisation. L'image large vue affichée est rafraîchie en temps réel. Cet affichage temps réel présente un avantage important dans le cas d'échantillons biologiques ou présentant des réactions physicochimiques susceptibles d'évoluer dans le temps. De plus, l'affichage simultané de l'image large vue 60 et de la première image 61 permettent à l'utilisateur de situer la position de la première image 61 de haute résolution dans le champ objet de l'image large vue, connaissant la position de l'actionneur 48 du miroir 42. Sur la figure 4, on a représenté sur l'image large vue 60, les contours correspondant à la première image 61 affichée à côté. La première image 61 et éventuellement l'image large sont stockées en mémoire, par exemple dans la mémoire d'un ordinateur ou du contrôleur 300. On enregistre aussi en mémoire les coordonnées de la première position du miroir plan 42 correspondant à la première image 61.

[0041] Le miroir plan 42 étant orienté dans une deuxième position, la première caméra 51 acquiert une deuxième image 62 d'une autre portion du champ objet de l'objectif de microscope 21. Les coordonnées de la deuxième position du miroir plan 42 correspondant à la deuxième image 62 sont enregistrées en mémoire. La deuxième image 62 est affichée sur écran et aussi enregistrée en mémoire. On peut ainsi obtenir des images haute résolution de différentes portions de l'échantillon en orientant simplement le miroir 42 et sans déplacer l'échantillon. La première image 61 et la deuxième image 62 ont la même résolution spatiale. De plus, l'affichage simultané de l'image large vue, de la première image 61 et de la deuxième image 62, permet à l'utilisateur de naviguer aisément dans le plan objet via l'orientation du miroir 42 dans le plan de Fourier image 62. On rappelle que l'image large vue est remise à jour en temps réel. Par une calibration établissant la correspondance entre la position du miroir et la position dans le champ objet, l'utilisateur connaît la position de chaque image de haute résolution par rapport au plan objet. L'ordre de grandeur de l'inclinaison du miroir 42 pourdéplacer la zone imagée de l'image est de quelques degrés, parexemple de 5 degrés.

[0042] De la même manière, le miroir étant orienté successivement suivant N orientations différentes, on acquiert une série de N deuxièmes images 61, 62, ... 6N, qui sont stockées en mémoire ainsi que les positions correspondantes du miroir 42 pour chaque image acquise. Le contrôleur comprend un système de traitement d'images qui permet de reconstruire une image mosaïque 600 de l'échantillon à haute résolution à partir de la série de N deuxièmes images 61, 62, ... 6N comme illustré sur la figure 5.

[0043] Le procédé de reconstruction d'image est par exemple basé sur la méthode connue d'assemblage ou de fusion d'images (stitching en anglais). L'assemblage ou la fusion d'images utilise seulement des images haute-résolution et les assemble en trouvant les éléments identiques entre deux images voisines. En cas de superposition sur le bord des images, il existe plusieurs possibilités, par exemple de moyenner les deux images qui se superposent.

[0044] L'image mosaïque 600 peut être construite et remise à jour au fur et à mesure de l'acquisition des deuxièmes images 61, 62, ... 6N. On obtient ainsi une image mosaïque qui présente à la fois un large champ et une haute résolution sur tout le champ. De plus, la première image large vue peut être affichée en temps réel simultanément et à côté de l'image mosaïque 600. Cette configuration permet d'orienter l'acquisition d'image haute résolution dans une partie de l'image large vue en cours d'évolution évolué par exemple, tout en conservant les autres images de haute résolution tout autour.

[0045] L'utilisation du dispositif de balayage d'image permet l'acquisition et la reconstruction d'une image mosaïque large champ et de haute résolution sans déplacer l'échantillon sur le porte-échantillon. Lorsqu'on utilise des servo-moteurs relativement lents, la reconstruction complète d'une image mosaïque est limitée par le temps de déplacement des servo-moteurs. L'utilisation d'actionneurs galvanométriques ou de MEMS permet d'augmenter la vitesse de déplacement du dispositif de balayage. La cadence d'acquisition et de reconstruction d'une image mosaïque est alors limitée par la cadence d'acquisition de la première caméra 51. Par exemple, si le nombre N d'images nécessaires pour reconstruire une image mosaïque sur le champ de vue d'ensemble à haute-résolution est égal à 10, le temps d'acquisition total est seulement égal à 10 fois la durée d'acquisition d'une seule image, soit seulement quelques millisecondes.

[0046] Le module d'imagerie 200 permet ainsi d'obtenir une image mosaïque de haute résolution sur un grand champ de vue sans déplacer l'échantillon et sans changer d'objectif de microscope. Il n'y a ainsi pas de décalage entre les différentes images acquises 61, 62, ... 6N. Le module imagerie 200 permet d'augmenter les performances d'un microscope déjà existant pour un coût modéré.

[0047] Dans l'exemple détaillé ci-dessus, le module d'imagerie permet d'obtenir une image mosaïque ayant un champ de vue augmenté d'un facteur 10 par rapport à une seule première image 61 tout en étant rapide. Le système est simple d'utilisation. Le module d'imagerie 200 est compact (dimensions environ 30cmx30cmxl5cm).

[0048] Le même procédé peut être appliqué quel que soit l'objectif de microscope utilisé 21, 22 ou 23.

[0049] La rapidité du système est cruciale dans le domaine de la biologie, notamment pour observer des phénomènes rapides et/ou pour de l'imagerie de fluorescence où le photoblanchiment est directement lié à la durée d'exposition et/ou à la durée de la mesure. Un autre avantage de l'invention est relatif au gain sur la taille des données stockées. Seules certaines zones de l'échantillon présentant un intérêt peuvent être imagées à haute-résolution ce qui permet de ne pas stocker inutilement de l'information non- exploitée. Le module se différencie ici de l'emploi d'une caméra présentant un grand nombre de pixels qui est onéreuse et qui enregistre une grande image à haute-résolution, sans ajustement possible, et produit donc une grande quantité d'information inutile.

[0050] Le module d'imagerie 200 est compatible avec tout microscope inversé conventionnel du commerce. Il permet d'agrandir fortement la zone observée de l'échantillon de façon rapide et sans avoir à déplacer physiquement l'échantillon. Pour un coût modéré, il permet ainsi d'augmenter grandement les performances d'un microscope déjà existant. Il permet aussi de faciliter, par un gain de temps, les expériences en microscopie corrélative visant à combiner les images de microscopie électronique et de microscopie optique. [0051] Le module d'imagerie est d'un coût de fabrication relativement limité, il contient seulement des composants peu onéreux, en comparaison avec des systèmes de balayage rapides tels que les scanners résonants.

[0052] Le module d'imagerie permet d'implémenter un procédé de microscopie optique. Le procédé de microscopie comporte les étapes suivantes.

[0053] On collecte un faisceau image 30 issu du champ objet d'un échantillon situé dans le plan objet 3 d'un objectif 21 de microscope. On forme une image intermédiaire dans un plan image 33 conjugué optiquement avec le plan objet 3.

[0054] On collecte le faisceau image 30 issu du plan image 33et on le sépare angulairement en un premier faisceau image 31 et un second faisceau image 32.

[0055] On transmet le premier faisceau image 31 via le premier système optique vers la première caméra 51, le premier système optique comportant un dispositif réflectif de balayage angulaire disposé dans ou à proximité d'un plan 72 conjugué optiquement avec le plan de Fourier 71 du microscope optique 100.

[0056] Simultanément, on transmet le second faisceau image 32 via le second système optique vers la seconde caméra 52. Le premier système optique a un grossissement supérieur au second système optique.

[0057] On acquiert via la seconde caméra 52 une image large vue s'étendant par exemple sur tout le champ objet de l'objectif de microscope 21.

[0058] On oriente angulairement le dispositif réflectif de balayage pour acquérir via la première caméra 51 au moins une première image 61 d'une portion du champ objet de l'objectif de microscope 21, 22, 23.

[0059] On dispose ainsi simultanément d'une image large vue 60 et d'au moins une première image 61 d'une portion du champ objet sans changer d'objectif de microscope. En changent l'orientation du dispositif réflectif de balayage suivant N orientations différentes, on acquiert successivement une série de N deuxièmes images 61, 62, ... 6N. A l'étape 320, on assemble les différentes images 61, 62, ... 6N ainsi obtenues de façon à reconstruire une image mosaïque 600 large vue et de haute résolution sur au moins sur une partie de l'image mosaïque. L'image mosaïque, qui présente à la fois une haute résolution et un large champ, est obtenue sans déplacer l'échantillon et sans changer d'objectif de microscope.

[0060] La présente divulgation trouve des applications dans le domaine de l'observation d'échantillons sensibles au déplacement, en particulier en biologie (cellules, organoïdes, embryons, etc.) mais également en physique (nano-films par exemple) ou en chimie (suspensions colloïdales par exemple).

[0061] Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l'invention dans le cadre des revendications annexées.