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Title:
AVERMECTIN-SENSITIVE AND AVERMECTIN-INSENSITIVE SEA LICE GLUCL RECEPTORS AND USES THEREOF AS THERAPEUTIC TARGETS FOR DETECTING ANTIPARASITIC DRUGS AGAINST CALIGUS ROGERCRESSEYI
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2021/212243
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the identification of new glutamate-activated chloride channels of Caligus rogercresseyi (CrGluCl), corresponding to CrGluCl-B to CrGluCl-E receptors, according to SEQ ID N°: 2-5, and the use of these channels as therapeutic targets for detecting antiparasitic drugs against Caligus rogercresseyi. The procedure for testing such drugs corresponds to a high-throughput method that comprises: introducing individually into an expression vector, any of SEQ ID N°: 2-5, to express a single CrGluCl channel selected from the CrGluCl-B, CrGluCl-C, CrGluCl-D or CrGluCl-E receptors; or, co-expressing in different vectors, two or more channels in any combination, either of new channels (CrGluCl-B to CrGluCl-E) or together with known channels (CrGluCl-A). Said vectors are introduced into a host cell, which is exposed to a potential-sensing fluorescent dye that allows each test compound to be classified as active or inactive based on the ability of the test compound to cause a change in the fluorescence.

Inventors:
CORNEJO ISABEL (CL)
CID PABLO (CL)
SEPULVEDA FRANCISCO (CL)
LUMMIS SARAH C R (GB)
Application Number:
PCT/CL2020/050043
Publication Date:
October 28, 2021
Filing Date:
April 23, 2020
Export Citation:
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Assignee:
CENTRO DE ESTUDIOS CIENTIFICOS CECS (CL)
International Classes:
C07K14/435
Other References:
ISABEL CORNEJO ET AL: "Identification and Functional Expression of a Glutamate- and Avermectin-Gated Chloride Channel from Caligus rogercresseyi, a Southern Hemisphere Sea Louse Affecting Farmed Fish", PLOS PATHOGENS, 25 September 2014 (2014-09-25), pages 1 - 17, XP055764645, DOI: doi.org/10.1371/journal.ppat.1004402
N. D. TRIBBLE ET AL: "Identification of the genes encoding for putative gamma aminobutyric acid (GABA) and glutamate-gated chloride channel (GluCl) alpha receptor subunits in sea lice (Lepeophtheirus salmonis)", JOURNAL OF VETERINARY PHARMACOLOGY AND THERAPEUTICS., vol. 30, no. 2, 1 April 2007 (2007-04-01), GB, pages 163 - 167, XP055764912, ISSN: 0140-7783, DOI: 10.1111/j.1365-2885.2007.00823.x
DATABASE EMBL [online] 15 November 2019 (2019-11-15), "Caligus rogercresseyi isolate FCH chromosome 16.", XP002801631, retrieved from EBI accession no. EMBL:CP045905 Database accession no. CP045905
ADRIAN J. WOLSTENHOLME: "Glutamate-gated Chloride Channels", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 287, no. 48, 4 October 2012 (2012-10-04), pages 40232 - 40238, XP055764909, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.R112.406280
Attorney, Agent or Firm:
DENTONS LARRAIN RENCORET SPA (CL)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Secuencias aisladas de ADN del canal de cloruro activado por glutamato de Caligus rogercresseyi (CrGluCl), CARACTERIZADO porque comprenden cualquiera de los receptores CrGluCl-B al CrGluCl-E, según las SEQ ID NO: 2-5 respectivamente.

2. Un vector para la expresión de una proteína del canal CrGluCl, CARACTERIZADO porque dicho vector comprende cualquiera de las secuencias aisladas de ADN de los receptores CrGluCl-B al CrGluCl-E, según las SEQ ID NO: 2-5 respectivamente.

3. Uso de la secuencia aislada de ADN de los receptores CrGluCl o del vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, CARACTERIZADO porque sirven como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

4. El uso según la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque comprende uno de los receptores CrGluCl-B, CrGluCl-C, CrGluCl-D o CrGluCl-E, como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi. 5. El uso según la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque comprende la mezcla de dos o más receptores CrGluCl-B al CrGluCl-E, como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

6. El uso según la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque comprende la mezcla de uno de los receptores CrGluCl-B al CrGluCl-E, junto con un receptor CrGluCl-A, como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

7. Un método de high-throughput para probar drogas contra Caligus rogercresseyi , CARACTERIZADO porque comprende expresar uno o más de los receptores CrGluCl s, según: i) cuando se expresa un solo canal, clonar uno de los receptores CrGluCl-B, CrGluCl-C, CrGluCl-D o CrGluCl-E según las SEQ ID NO:2-5 respectivamente, en un vector de expresión; ii) cuando se expresan dos o más canales, clonar al menos dos receptores CrGluCl-A al CrGluCl-E en cualquier combinación, según las SEQ ID N°: 1-5 respectivamente, en dos vectores de expresión; iii) introducir el o los vectores, con uno o más canales CrGluCls, según las etapas i) y ii), dentro de una célula hospedera; iv) cultivar dicha célula hospedera del paso iii), en condiciones de cultivo in vitro ; v) probar el efecto de una librería de compuestos de interés sobre la actividad de receptores CrGluCl, solos (individualmente) o en mezclas de dos o más receptores, introducidos dentro de la célula hospedera, para la identificación de drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi, capaces de activar el o los canales; vi) detectar una señal fluorescente, basado en la adición a dicha célula hospedera de un colorante fluorescente sensor de potencial, donde, si el compuesto de prueba produce un cambio de fluorescencia, esto corresponde a un cambio en el potencial de membrana en la célula que expresa los CrGluCl y; vii) clasificar cada compuesto de prueba como activo o inactivo, en base a la habilidad del compuesto de prueba para provocar un cambio en la fluorescencia o dejarla inalterada, respectivamente.

8. El método según la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el compuesto de prueba puede activar uno o más de cualquiera de los receptores CrGluCl-A al CrGluCl-E en cualquier combinación.

9. Un kit para clonar e identificar canales CrGluCl, CARACTERIZADO porque comprende una molécula aislada de ADN que codifica los canales CrGluCl-A al CrGluCl-E según las SEQ ID NO: 1 a 5 respectivamente; vectores para la clonación de dichas secuencias; los partidores Forward y Reverse según las SEQ ID NO: 6-7, 8-

9, 10-11, 12-13 y 14-15 para la amplificación de los receptores CrGluCl-A al CrGluCl-E respectivamente; reactivos necesarios para la clonación de dichas secuencias en el vector de expresión; reactivos para llevar a cabo la detección por PCR; e instrucciones para el uso de dicho kit.

REIVINDICACIONES MODIFICADAS

WO 202l/2l22433idas Por la oficina Internacional el 05 junio de 2021 PCT/CL2020/050043

REIVINDICACIONES

1. Un método de high-throughput para probar drogas contra Caligus rogercresseyi, CARACTERIZADO porque comprende expresar una o más de las subunidades formadoras de los receptores de canal de cloruro activado por glutamato de Caligus rogercresseyi (CrGIuCIs), según: i) cuando se expresa una sola subunidad del receptor, clonar una de las isoformas CrGIuCI-B, CrGIuCI-C, CrGIuCI-D o CrGIuCI-E según las SEQ ID N°:2-5 respectivamente, en un vector de expresión; ii) cuando se expresan dos o más subunidades, clonar al menos dos de los receptores CrGIuCI-A al CrGIuCI-E en cualquier combinación, según las SEQ ID N°: 1-5 respectivamente, en dos vectores de expresión; iii) introducir el o los vectores, con una o más subunidades CrGIuCI, según las etapas i) y ii), dentro de una célula hospedera; iv) cultivar dicha célula hospedera del paso iii), en condiciones de cultivo in vitro ; v) probar el efecto de una librería de compuestos de interés sobre la actividad de receptores CrGIuCI, generados por la expresión de una subunidad sola (individualmente) o en mezclas de dos o más subunidades, introducidos dentro de la célula hospedera, para la identificación de drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi, capaces de activar el o los canales; vi) detectar una señal fluorescente, basado en la adición a dicha célula hospedera de un colorante fluorescente sensor de potencial de membrana, donde, si el compuesto de prueba produce un cambio de fluorescencia, esto corresponde a un cambio en el potencial de membrana en la célula que expresa los CrGIuCI y; vii) clasificar cada compuesto de prueba como activo o inactivo, en base a la habilidad del compuesto de prueba para provocar un cambio en la fluorescencia o dejarla inalterada, respectivamente.

2. El método según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque el compuesto de prueba puede activar uno o más de los receptores de glutamato formados por las subunidades CrGIuCI-A al CrGIuCI-E en cualquier combinación.

3. Las secuencias aisladas de ADN de las subunidades formadoras de los receptores de canal de cloruro activado por glutamato de Caligus rogercresseyi (CrGIuCI) según la reivindicación 1, CARACTERIZADAS porque comprenden las subunidades de los receptores CrGIuCI-B al CrGIuCI-E, según las SEQ ID N°: 2-5 respectivamente.

4. Un vector para la expresión de una proteína del receptor CrGIuCI según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque dicho vector comprende cualquiera de las secuencias aisladas de ADN de las subunidades de los receptores CrGIuCI-B al CrGIuCI-E, según las SEQ ID N°: 2-5 respectivamente.

5. Uso de las secuencias aisladas de ADN de las subunidades de los receptores CrGIuCI según la reivindicación 3 o del vector según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque sirven como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

6. El uso según la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque comprende uno de los receptores formados por las subunidades CrGIuCI-B, CrGIuCI-C, CrGIuCI-D o CrGIuCI-E, como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

7. El uso según la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque comprende la mezcla de dos o más subunidades de los receptores CrGIuCI-B, CrGIuCI-C, CrGIuCI-D o CrGIuCI-E, como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

8. El uso según la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque comprende la mezcla de al menos una de las subunidades de los receptores CrGIuCI-B, CrGIuCI-C, CrGIuCI-D o CrGIuCI-E, junto con una subunidad CrGIuCI-A, como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

9. Un kit para clonar e identificar canales CrGIuCI, CARACTERIZADO porque comprende una molécula aislada de ADN que codifica las subunidades CrGIuCI-A al CrGIuCI-E según las SEQ ID N°: 1 a 5 respectivamente; vectores para la clonación de dichas secuencias; los partidores Forward y Reverse según las SEQ ID NO: 6-7, 8-9, 10-11, 12-13 y 14-15 para la amplificación de los transcritos CrGIuCI-A al CrGIuCI-E respectivamente; reactivos necesarios para la clonación de dichas secuencias en el vector de expresión; reactivos para llevar a cabo la detección por PCR; e instrucciones para el uso de dicho kit.

Description:
Receptores GluCls de piojos de mar, sensibles e insensibles a avermectina y sus usos como blancos terapéuticos para detectar drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere al campo de la acuicultura, específicamente, se relaciona con moléculas de ácido nucleico aisladas (polinucleótidos) que codifican para nuevos canales de cloruro activados por glutamato (GluCls) identificados en el parásito marino Caligus rogercresseyi (CrGluCl). Dichos canales pueden ser usados como potenciales blancos terapéuticos para el hallazgo de nuevas drogas antiparasitarias contra Caligus rogercresseyi.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los copépodos marinos de la familia Caligidae (orden Siphonostomatoida) que agrupa a decenas de especies de los géneros Caligus y Lepeophtheirus son ectoparásitos de peces. Estos piojos de mar parasitarios se adhieren a los peces y se alimentan de su tejido epidérmico y sangre y, cuando están presentes en un entorno de piscicultura, provocan morbilidad y mortalidad con un impacto económico extremadamente alto en la industria. Lepeophtheirus salmonis es la especie de calígida más importante que afecta a la acuicultura de salmón y trucha del hemisferio norte [1] Un piojo de mar diferente, Caligus rogercresseyi es el parásito más importante que afecta el cultivo en agua de mar de salmón del Atlántico y trucha arco iris en Chile. C. rogercresseyi se describió como una especie separada sólo en el año 2000 [2] y queda mucho por saber sobre su biología. Al igual que en el hemisferio norte, la infestación de C. rogercresseyi dentro de la industria acuícola chilena de importancia nacional se asocia con un aumento de los costos y una disminución de la productividad con un alto impacto económico y social [3-5]

La infestación por piojos de mar en granjas de peces se ha combatido, con un grado variable de éxito, utilizando diversos tratamientos químicos como peróxido de hidrógeno, piretroides, compuestos organofosforados, inhibidores de la síntesis de quitina y avermectinas [3] Las avermectinas, emamectina e ivermectina son lactonas macrocíclicas (MLs) que se han utilizado ampliamente para controlar las infecciones parasitarias en humanos y animales, y en Chile el benzoato de emamectina ha sido el tratamiento de elección. El compuesto, que está formulado como SLICE (Merck Animal Health), se administra por vía oral con alimento para peces y proporciona protección duradera contra todas las formas adheridas de piojo de mar. La importancia de la ivermectina va más allá de la acui cultura, ya que durante más de 35 años ha sido el tratamiento principal de enfermedades parasitarias en medicina humana y veterinaria, y su descubrimiento se distinguió con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2015 [6]

Los estudios en nematodos han demostrado que las avermectinas interfieren con la transmisión sináptica a través de la activación irreversible de los canales de cloruro receptores de glutamato, que conducen a la parálisis del parásito y la muerte [7] Aunque han tenido mucho éxito como fármacos antiparasitarios durante largos períodos de tiempo, ha surgido resistencia a las avermectinas lo que se ha convertido en un problema importante en todo el mundo [8]

Los canales de cloruro dependientes de glutamato (GluCls) pertenecen a los receptores de asa Cys, corresponden a canales de iones pentaméricos dependientes de ligando, que están ampliamente presente en nematodos e insectos. Estructuralmente, se ensamblan como homopentámeros o heteropentámeros. Se han identificado subunidades a y b funcionales (subunidades GluCl-a y GluCl-b), también llamadas GLC-1 y GLC-2, en los nematodos Caenorabditis elegans [9, 10] y Haemonchus contortus [11] La familia GluCl de C. elegans ahora se extiende a seis genes: glc- 1 a glc- 4, y avr-14 y avr-15 [12] Sólo se ha descrito una subunidad del receptor, DmGluCla en Drosophila melanogaster que es responsable de la sensibilidad de este insecto a las avermectinas [13], y lo mismo parece ser el caso en la mayoría de los insectos estudiados [12] Nuestra comprensión de las propiedades estructurales y funcionales de estos receptores ha avanzado significativamente con la publicación de estructuras cristalinas de la subunidad de C. elegans GluCla (CeGluCla) [14, 15] Estas estructuras muestran los estados abierto y cerrado del canal, y revelan el sitio de unión de glutamato en el dominio extracelular, y del fármaco ivermectina entre segmentos de transmembrana.

El papel fisiológico de estos receptores en los invertebrados es mediar y regular las sinapsis inhibitorias y la excitabilidad celular, lo que los convierte en un objetivo farmacológico muy importante y eficaz para los parasiticidas contra helmintos y artrópodos [12] La gran ventaja de usar GluCls como blancos para los medicamentos antiparasitarios es su ausencia en vertebrados, lo que en principio permite usar medicamentos que afectan exclusivamente al parásito sin efecto significativo en el huésped. La emamectina, una molécula de la misma familia que la ivermectina, se ha utilizado para combatir la infestación por C. rogercresseyi en la salmonicultura en Chile desde el año 2000 [2], pero han surgido informes de resistencia creciente a la droga [16] La resistencia a los medicamentos en el piojo marino del hemisferio norte también es un problema creciente [17] Un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares de la resistencia, que son probablemente secundarios a cambios en la expresión génica inducidos por el fármaco, es esencial para el diseño de estrategias para evitarla, sin embargo estos se desconocen [16, 18- 20] Posibles formas en que puede surgir la resistencia a los medicamentos incluyen un cambio en el blanco farmacológico que implique que el medicamento no se una a él o que su unión no produzca el efecto molecular esperado, cambios en el metabolismo del medicamento, o su eliminación activa por parte del parásito, el huésped o ambos [8, 21] Estudios recientes de la respuesta transcripcional a emamectina han demostrado que los piojos de mar resistentes tienen niveles disminuidos de expresión de ARNm de acetilcolina neuronal o GABA-C1, pero no de receptores de GluCla [22, 23] No está claro cómo estos cambios podrían relacionarse con la resistencia. Los cambios en la expresión de proteínas que podrían ser más relevantes funcionalmente, como las bombas MDR1 exportadoras de drogas, son menores o están ausentes en los piojos resistentes a la droga.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN Entendiendo que una caracterización del objetivo farmacológico de ivermectina y benzoato de emamectina en C. rogercresseyi , podría ayudar a comprender los mecanismos de resistencia de los fármacos, clonamos el transcrito correspondiente al marco de lectura completo de un receptor de GluCl de C. rogercresseyi , estudiamos su función en ovocitos de Xenopus mediante métodos electrofisiológicos y utilizamos modelos moleculares para comprender mejor el modo de interacción de las avermectinas y el receptor [24] Esta subunidad, originalmente denominada CrGluCla, es activada por glutamato e irreversiblemente por ivermectina y emamectina, y media corrientes de cloruro.

Más recientemente, y estimulados por los nuevos datos transcriptómicos que aparecen en el GenBank , hemos identificado secuencias correspondientes a cuatro nuevos transcritos completos de CrGluCl, lo que eleva el número de receptores de canal de cloruro dependientes de glutamato de C. rogercresseyi a cinco. Hemos cambiado el nombre del ya reportado y de los nuevos receptores, que están codificados por genes separados, a CrGluCl-A al CrGluCl-E (SEQ ID NO: 1 a 5, respectivamente). Un estudio de las propiedades funcionales de estos receptores revela que todos, excepto CrGluCl-E, tienen función autónoma cuando se expresan en ovocitos de Xenopus laevis y se analizan por electrofisiología, y pueden activarse por glutamato, pero varían ampliamente en su sensibilidad a la ivermectina. En efecto, CrGluCl-B es insensible a las avermectinas y, además, confiere resistencia a los receptores que surgen de la co-expresión con CrGluCl-A y CrGluCl-C normalmente activados por ivermectina. Estas diferencias funcionales recientemente reportadas, sugieren que su expresión diferencial en el parásito puede originar la resistencia a avermectinas.

Nuestros estudios, que identifican nuevos tipos de receptores de GluCl en C. rogercresseyi que varían en sensibilidad a las avermectinas antiparasitarias, junto con nuestra demostración de que se prestan para ensayos de high throughput (alto rendimiento) proporcionan la base para un concepto destinado a encontrar nuevos bloqueadores o activadores específicos de los CrGluCls. Por lo tanto, los CrGluCls podrían convertirse en blancos de nuevas drogas antiparasitarias contra C. rogercresseyi que permitan la rotación de medicamentos y eviten la aparición de resistencia. La presente invención involucra un método en el que se implementa un análisis de high throughput usando CrGluCl-A (SEQ ID NO: 1), un receptor de glutamato de C. rogercresseyi previamente identificado, y CrGluCl-B (SEQ ID NO: 2), CrGluCl-C (SEQ ID NO: 3), CrGluCl-D (SEQ ID NO: 4) o CrGluCl-E (SEQ ID NO: 5) recientemente identificados, pero no publicados. Los nuevos receptores individualmente, o en co-expresión en diferentes mezclas con otros nuevos receptores o el previamente identificado, son utilizados como blancos farmacológicos para identificar compuestos (nuevos o conocidos) capaces de afectar a los receptores, tanto sensibles como resistentes a avermectinas. Las drogas identificadas como activas podrían ser eficientes en el tratamiento de los parásitos de piojos de mar, tanto sensibles como resistentes a avermectinas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS

Figura 1: Representación esquemática de los transcritos de GluCl que emergen del estudio de bases de datos. Las barras vacías representan transcritos parciales de C. rogercresseyi (GAZXOlOxxx) obtenidos de https://ww.ncbi.nlm.nih.gov/ utilizando "canal de cloruro de glutamato " como consulta. Las secuencias TSA (derivadas de la base de datos Transcriptome Shotgun Assembly) del Grupo A se pueden atribuir a CrGluCl-A previamente identificado (GenBank KX599189). Otros TSAs se clasifican en cuatro grupos (B-E) mediante análisis de BLAST contra transcritos presentes en la base de datos de L. salmonis (https://licebase.org/) y están representados por las barras grises, o desde la información genómica de C. rogercresseyi que se encuentra en https:/7ww. ncbi .nlm.nih.gov/ (barras achuradas). Las flechas identifican la ubicación de los partidores utilizados en las reacciones de RT-PCR para obtener ADNc de longitud completa. La continuidad de contigs genómicos se muestra como líneas de puntos.

Figura 2: Secuencias de aminoácidos predichas para CrGluCl-A al CrGluCl-E. Los péptidos señal putativos ( SignalP 4.1 server) se muestran en cursiva roja, con las partes cortadas en gris. Los residuos de cisteína necesarios para la formación de las asas C se resaltan en amarillo; en gris y en rojo se identifican residuos implicados en la unión de glutamato e ivermectina respectivamente. La posición de los dominios transmembrana así como los residuos implicados en la unión del glutamato y la ivermectina, se basan en la estructura cristalina de GluCla de C. elegans [16] En rojo y debajo de las secuencias, se destacan los aminoácidos que participan en la unión de ivermectina en el GluCla de C. elegans pero que no se conservan en los receptores CrGluCl. La secuencia de CrGluCl-A está depositada en el GenBank con el identificador KX599189. Los aminoácidos resaltados en negro con letras rojas muestran sitios de variantes alélicas. Alineaciones generadas con Clustal Omega ( //www. ebi . ac uk/Tool s/m sa/cl ustal o/) .

Figura 3: Corrientes activadas por glutamato de ovocitos de Xenopus microinyectados con ARNc de CrGluCl-B. Fig. 3A. Trazas de corriente obtenidas en los potenciales de membrana indicados durante la aplicación de glutamato en el baño a concentraciones de 10 mM a 3 mM, o ivermectina 3 mM, durante los tiempos que se muestran en las barras. Fig. 3B. La dependencia de CT de la corriente activada por glutamato 1 mM con las respectivas relaciones de corriente en función de voltaje (IV) tomadas de las rampas de voltaje aplicadas durante el experimento que se muestra en el panel Fig. 3C. Los métodos son los mismos que los descritos anteriormente [24]

Figura 4: Concentración-dependencia del efecto del glutamato sobre CrGluCl-B y CrGluCl-C. Gráficos que resumen los resultados de la relación concentración-respuesta de las corrientes sensibles al glutamato mediadas por CrGluCl-B y -C. Las respuestas se normalizaron al efecto máximo provocado por el glutamato. Las líneas son ecuaciones de Hill ajustadas a los conjuntos de datos que son medias ± SD de 16 y 6 experimentos para

CrGluCl-B y CrGluCl-C, respectivamente. Los datos para CrGluCl-A son de cinco experimentos separados y se muestran para comparación. Figura 5: Efecto de la ivermectina o la emamectina sobre la respuesta de CrGluCl-B al glutamato. Fig. 5A-Fig. 5D muestran las trazas de corriente obtenidas en los potenciales de membrana indicados durante la aplicación en el baño de glutamato 1 mM, y el efecto de la aplicación de ivermectina o de emamectina a 1 mM durante los tiempos mostrados en las barras. PTX muestra la adición de picrotoxina a 100 mM.

Figura 6: Corrientes activadas por glutamato en ovocitos inyectados con ARNc CrGluCl-C. Fig. 6A. Trazas de corriente obtenidas en los potenciales de membrana indicados durante la aplicación en el baño de concentraciones crecientes de glutamato como se indica en las cajas. Fig. 6B. Efecto de PTX sobre la corriente dependiente de glutamato de un ovocito que expresa CrGluCl-C. Fig. 6C. Dependencia de CT de la corriente activada con 0,3 mM glutamato. Las respectivas relaciones de corriente- voltaje tomadas de las rampas de voltaje aplicadas durante este experimento se muestran en el panel Fig. 6D.

Figura 7: Activación irreversible de CrGluCl-C por ivermectina. Fig. 7A. Traza de corriente obtenida a 60 mV durante la aplicación en baño de glutamato 300 pM y luego de ivermectina a 100 nM durante los tiempos que se muestran en las barras. También se muestran el efecto de la adición de picrotoxina a 100 pM y de la reducción en la concentración extracelular de CT. Fig. 7B. Relaciones IV para las corrientes, después de la adición de ivermectina y el efecto de bajo CT para el registro en A. Fig. 7C. Efecto de concentraciones crecientes de ivermectina sobre CrGluCl-C. La dependencia de la dosis promedio para el efecto de la ivermectina se muestra en Fig. 7D. Los datos (medias ± SD) se normalizan al efecto máximo de la ivermectina y se originan en siete experimentos separados. La línea es un ajuste de la ecuación de Hill a los valores y se compara con la medida previamente para CrGluCl-A [24]

Figura 8: Corrientes espontáneamente activas en ovocitos inyectados con ARNc para CrGluCl-D. Fig. 8A. Las corrientes se miden a los voltajes indicados y las adiciones de PTX o glutamato son las indicadas. Fig. 8B. Curvas IV tomadas de A antes o después de la inhibición con 100 pM de PTX. Fig. 8C y Fig. 8D. Las trazas corrientes tomadas a 60 mV muestran su dependencia de CT y la ausencia de efecto de ivermectina. El efecto PTX disminuye con el tratamiento previo con glutamato. Fig. 8E. Las curvas IV corresponden a la traza en C y representan el control inicial de la corriente espontánea sin adición y en presencia de PTX o bajo CT extracelular.

Figura 9: Propiedades funcionales de los receptores de CrGluCl-A y CrGluCl-B co expresados en ovocitos de Xenopus. Fig. 9A. Corrientes provocadas por glutamato 3 mM o ivermectina 1 mM en un ovocito que expresa las isoformas A y B después de la microinyección de 10 ng de ARNc respectivamente para CrGluCl-A y CrGluCl-B. Registro obtenido a 60 mV. Fig. 9B. Relaciones IV correspondientes al control antes de cualquier adición o durante la aplicación de glutamato (primera adición) o ivermectina. Fig. 9C. Resumen de las corrientes provocadas por el glutamato o la ivermectina en ovocitos que expresan los receptores CrGluCl-A o CrGluCl-B por sí solos o en mezclas en las diversas proporciones indicadas. El ARN total inyectado fue siempre de 20 ng. Los datos son medias ± SDs, con n indicadas debajo de las columnas. Aquellas respuestas a glutamato significativamente diferentes de las de CrGluCl-B por sí solo se indican como sigue: * P <0,001, ** P = 0,007 ANOVA con corrección de Bonferroni. La misma prueba no dio diferencias significativas en la respuesta a ivermectina entre ninguno de los experimentos de expresión mixta CrGluCl-A: CrGluCl-B y aquella de CrGluCl-B por sí sola. Fig. 9D. Relación dosis-respuesta de las corrientes sensibles al glutamato en experimentos de expresión mixta de CrGluCl-A:CrGluCl-B. Los datos se normalizan (media ± SD) al efecto máximo del glutamato y se originan en 7, 7 y 5 experimentos separados para las mezclas 4:1, 1:1 y 1:4 respectivamente. Las líneas son ajustes de ecuaciones de Hill. También se muestran las respuestas de los receptores expresados por separado para comparación.

Figura 10: Propiedades funcionales de los receptores de CrGluCl-C y CrGluCl-B coexpresados en ovocitos de Xenopus. Fig. 10A. Corrientes provocadas por glutamato 3 mM o ivermectina 1 mM en un ovocito que expresa las isoformas C y B después de la microinyección de 10 ng de ARN de CrGluCl-C y 10 ng de CrGluCl-B. Registros realizados a 60 mV. Fig. 10B. Relaciones IV correspondientes al control antes de cualquier adición o durante los estímulos con glutamato (primera adición) o ivermectina. Fig. 10C. Relación dosis-respuesta de las corrientes sensibles al glutamato de experimentos de expresión mixta CrGluCl-C:CrGluCl-B. Los datos se normalizan (medias ± SD) al efecto máximo del glutamato y se originan en 13 experimentos separados. La línea es un ajuste de ecuación de Hill. Las respuestas de los receptores CrGluCl-C y CrGluCl-B expresados por separado se toman de la Fig. 4 y se muestran para comparación. Fig. 10D. Resumen de las corrientes provocadas por glutamato o ivermectina en los ovocitos que expresan sea los receptores CrGluCl-C o los CrGluCl-B, los mismos datos que en la Fig. 9C, o juntos en una proporción

1:1. El ARN total inyectado fue siempre de 20 ng. Los datos son medias ± SD. El número de experimentos para la mezcla 1:1 de receptores C y B es 13. La respuesta de este receptor mixto al glutamato fue significativamente diferente de la observada con CrGluCl-B por sí solo cuando se analizó mediante ANOVA con corrección de Bonferroni. Las respuestas respectivas a ivermectina no resultaron significativamente diferentes.

Figura 11: Propiedades funcionales de los receptores de CrGluCl-D y CrGluCl-B coexpresados en ovocitos d Xenopus. Fig. 11A. Corrientes provocadas por glutamato 3 mM o ivermectina 1 mM en un ovocito que expresa las isoformas D y B, 48-72 h después de la microinyección de 10 ng de ARN para ambos, CrGluCl-D y CrGluCl-B. Registro tomado a 60 mV. Fig. 11B. Relaciones IV correspondientes al control antes de cualquier adición o durante las aplicaciones de glutamato o ivermectina. Fig. 11C. Resumen de las corrientes provocadas por glutamato o ivermectina en los ovocitos que expresan los receptores CrGluCl- D y CrGluCl-B en proporción 1:1. El ARN total inyectado fue siempre de 20 ng. Los datos son medias ± SD de 6 experimentos separados. Fig. 11D. Relación dosis-respuesta de las corrientes sensibles al glutamato de experimentos de expresión mixta CrGluCl-D:CrGluCl-B. Los datos se normalizan (medias ± SD) al efecto máximo del glutamato y se originan en 6 experimentos separados. La línea es un ajuste de la ecuación de Hill. Figura 12: Plan de trabajo para el uso de CrGluCls en células HEK293 para identificar químicos de una biblioteca de fármacos potenciales que afectan su actividad. El ADN de CrGluCl se transfecta en células HEK293 (1), y las células se transfieren a placas de 96 pocilios (2). Posteriormente, las células se cargan con colorante fluorescente FMP sensible al potencial de membrana (3) y los compuestos se agregan pocilio a pocilio (4) desde una placa de 96 pocilios (se muestra una concentración creciente de ligando potencial). La fluorescencia se lee en un lector multi-placa FlexStation (5). El registro de la evolución de la fluorescencia se muestra en el gráfico, con las respuestas de 8 pocilios diferentes a los que se les ha añadido diferentes concentraciones de un compuesto a los 20 segundos (flecha). AF es el cambio en la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias. Figura 13: Resultados de los ensayos de fluorescencia que prueban los efectos del aumento de las concentraciones de glutamato en las células HEK-293 transfectadas con receptores CrGluCl. Fig. 13A-Fig. 13C muestran la evolución de la intensidad de fluorescencia (AF) en respuesta a los aumentos graduales de glutamato en las células transfectadas con ADNc para CrGluCl-A, CrGluCl-B o una mezcla de los mismos, respectivamente. Los experimentos individuales se muestran como salidas directas del lector multi-placas como se describe en la Fig. 12. En el momento señalado por la flecha se añadió glutamato para alcanzar la concentración indicada. Figura 14: Respuestas a la dosis de glutamato e ivermectina obtenidas por el método de fluorescencia de alto rendimiento utilizando receptores CrGluCl. Fig. 14A. Relaciones dosis-respuesta de las respuestas fluorescentes sensibles al glutamato de las células HEK-293 que expresan CrGluCl-A, CrGluCl-B o una transfección mixta de ambos receptores. Los datos se normalizan (medias ± SD) al máximo efecto del glutamato y se originan en 4 experimentos separados. Las líneas son ecuaciones de Hill ajustadas a los datos. Fig. 14B. Como en A, pero usando concentraciones crecientes de ivermectina (medias ± SD, n = 4).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Para una mejor comprensión del presente invento, es necesario entregar las siguientes definiciones, las que sólo deben ser entendidas como elementos que ayudan al entendimiento de las características técnicas particulares en este campo técnico.

Como se utiliza en el presente invento, el término "high throughput" corresponde a un método de alto rendimiento para ensayar fármacos, se basa en el screening a gran escala de bibliotecas químicas que se exponen a células de interés, para analizar si estos fármacos activan o no una respuesta en las células. Para esto se utilizan micro-placas con diferentes compuestos o concentraciones diferenciales de ligando a las que se expondrán dichas células, utilizando en este caso un indicador fluorescente que permite detectar si la célula reacciona o no con dicho ligando y a qué concentraciones.

Como se utiliza en el presente invento, el término "canal" se refiere a proteínas transmembrana que permite el paso de iones permitiendo la generación de potenciales de acción. Específicamente, como se usa en la presente, se refiere a los canales de cloruro activado por glutamato (GluCls), los cuales pueden estar constituidos por diferentes subunidades o receptores.

Como se utiliza en el presente invento, el término " receptor " se refiere a proteínas o glicoproteínas donde se unen específicamente otras sustancias o ligandos. Como se usa en la presente, se refiere específicamente a cualquiera de los 5 receptores del canal GluCls identificados en C. rogercresseyi denominados como CrGluCl-A al -E, respectivamente.

Como se utiliza en el presente invento, el término "co-expresión" se refiere a la expresión de dos o más receptores GluCls de C. rogercresseyi que están clonados en vectores separados, para su posterior expresión conjunta en una célula de interés.

Como se utiliza en el presente invento, el término "contigs" se traduce como contiguo, y corresponde a una serie de secuencias de ADN superpuestas utilizadas para hacer un mapa físico que reconstruye la secuencia original de ADN de un cromosoma o de una región de un cromosoma.

Como se utiliza en el presente invento, el término “partidores” corresponde a secuencias cortas de ADN de cadena simple que se utilizan para la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dichas secuencias hibridan con la secuencia de ADN que se desea amplificar. El partidor Forward híbrida con la hebra de ADN de manera de cubrir un segmento en el que se inicia el mensaje que codifica la proteína, mientras que el partidor Reverse híbrida con la hebra de ADN cubriendo un segmento en el que se termina dicho mensaje. Como se utilizan en la presente invención, dichos partidores son útiles para la amplificación de las secuencias de los receptores CrGluCl-A al E de C. rogercresseyi.

Como se utiliza en el presente invento, el término "BLAST” se refiere al acrónimo de Basic Local Alignment Search Tool. Es una herramienta de bioinformática que compara diferentes secuencias problema con las bases de datos de secuencias existentes. Donde el algoritmo del programa, permite asociar las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia problema, y así asignarle una posible función o identificación en base a las secuencias más estrechamente relacionadas a nuestra secuencia problema.

Como se utiliza en el presente invento, el término TSA se refiere a secuencias derivadas de la base de datos Transcriptome Shotgun Assembly

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa/). Como se utiliza en el presente invento, el término NCBI se refiera National Center for

Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

A continuación, describimos las características moleculares y funcionales de los recién descubiertos GluCls de C. rogercresseyi y utilizamos dos de ellos en un ensayo de high throughput que puede detectar tanto su activación por el agonista natural que actúa en el sitio ortostérico como el activador alostérico ivermectina.

Los receptores de los canales de GluCl están representados por cinco transcritos diferentes capaces de codificar polipéptidos completos.

La exploración de la base de datos de transcripción corta (TSA) de C. rogercresseyi con una consulta de " canal de cloruro activado por glutamato " reveló 19 secuencias peptídicas cortas. Tres de estas (Grupo A en la Fig. 1) correspondían a fragmentos parciales del CrGluCl-A [24] ya identificado y caracterizado, y uno pertenecía a un receptor de glicina y -por lo tanto- se descartó en el análisis posterior. El análisis de la secuencia mostró cuatro TSAs (Grupo B en la Fig. 1) que exhibieron superposición entre sí y su ensamblaje sugirió su codificación para un péptido GluCl completo. La supuesta proteína codificada de este modo se denominó CrGluCl-B.

Con los restantes 11 TSAs se realizó un análisis BLAST contra transcritos presentes en la base de datos de L. salmonis (https://bcebase.org/) e información genómica para C. rogercresseyi en https://www.ncbi.nlm.nlh.gov/. Con este abordaje, se identificaron tres presuntas subunidades separadas que denominamos CrGluCl-C, CrGluCl-D y CrGluCl-E (Grupos C-E en la Fig. 1).

La secuencia presunta de CrGluCl-C se generó con 3 TSAs de C. rogercresseyi que proporcionaron una secuencia parcial que se completó con información de la base de datos genómica de C. rogercresseyi de NCBI (Grupo C en la Fig. 1).

Un marco de lectura abierto ORF putativo para CrGluCl-D se generó a partir de tres TSAs de C. rogercresseyi que se ensamblaron de acuerdo a la homología con una única secuencia de TSA de L. salmonis (Grupo D en la Fig. 1). El CrGluCl-E se obtuvo de 5 TSAs de C. rogercresseyi que se complementaron con referencia a dos TSAs de L. salmonis y se completaron con información de la base de datos genómica de C. rogercresseyi de NCBI (Grupo E en la Fig. 1).

Se diseñaron partidores para abarcar los nucleótidos de un ORF de longitud completa para cada una de las cuatro subunidades B-E, desde la metionina inicial hasta el codón de término (Tabla 1 y flechas en la Fig. 1). El uso de estos partidores en reacciones de RT-PCR permitió obtener cDNAs a partir de especímenes de C. rogercresseyi adultos los que permitieron predecir secuencias peptídicas CrGluCl-B, CrGluCl-C, CrGluCl-D y CrGluCl-E.

Las secuencias de aminoácidos predichas CrGluCl-A, -B, -C, D y -E (Fig. 2) mostraron las características generales de los canales de cloruro activados por glutamato previamente identificados. Todos tienen péptidos señal predichos consistentes con una expresión de proteína de membrana plasmática, seguidos de un gran dominio N-terminal que presenta los residuos de cisteína necesarios para la formación de las asas Cys típicas de los receptores LGIC. A continuación aparecen cuatro dominios transmembrana conservados (Ml- M4) y un segmento C-terminal corto. Los aminoácidos identificados que constituyen los sitios de unión para glutamato e ivermectina se conservan en gran medida en los CrGluCls.

EJEMPLOS La descripción paso a paso para el clonamiento de los receptores identificados, el uso de los receptores recientemente identificados y el método que permite probar drogas como blancos farmacológicos contra el parásito, se demuestra a través de los siguientes ejemplos comparativos. Ejemplo 1: Clonación de los canales de cloruro activado por glutamato.

Las condiciones para la clonar los receptores por PCR, fue previamente descrita [24] Brevemente, los partidores para cada receptor se diseñaron para abarcar los nucleótidos de los ORFs de marco de lectura abierto de longitud completa para cada una de las 5 subunidades A- E, desde la metionina inicial hasta el codón de término (Tabla 1, y flechas en la Fig. 1). Las letras mayúsculas en los partidores Forward y Reverse en las secuencias de la tabla 1, son sitios de restricción EcoRI y Xbal respectivamente. Por otra parte, los procedimientos para realizar un clonamiento de secuencias de interés y la amplificación por PCR pueden encontrarse en detalle en el libro “ Molecular cloning a laboratory manuaF (Sambrook, Joseph. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Coid Spring Harbor, N.Y. :Cold Spring Harbor Laboratory Press), el cual se incorpora a la presente solicitud como referencia.

Tabla 1: Secuencias de los partidores para la detección por PCR.

Construcción de vectores de expresión. Para expresar los canales en los ovocitos de X laevis , el ORF se cortó con las enzimas de restricción fíg\\\ y Xbal desde CrGluCl/pCR3.1 y se subclonó direccionalmente en el vector pTLB y se insertó un sitio BamHl río abajo del codón de término [24]

Preparación de ARNc. Los plásmidos CrGluCl/pTLB se linealizaron con la enzima BamHl (Roche) y se usaron como plantilla para la síntesis de ARNc (ARN capeado) usando el kit mMessage Machine SP6 (Ambion, Austin, TX, EE. UU.) [24] Se generaron ADNc completos por RT-PCR a partir de muestras de C. rogercresseyi adultos a partir de las cuales se obtuvieron secuencias de péptidos putativos de longitud completa de CrGluCl-B, CrGluCl- C, CrGluCl-D y CrGluCl-E (SEQ ID NO: 2-5, respetivamente). Estos se muestran junto con el de CrGluCl-A (SEQ ID NO: 1) en la alineación múltiple de la figura 2.

Ejemplo 2: Ensayo de los receptores por fijación de voltaje en ovocitos de Xenopus laevis.

Se realizó un experimento de medición de corriente con fijación de voltaje utilizando dos microelectrodos intracelulares (denominado aquí como voltage-clamp) en ovocitos de X laevis defoliculados y microinyectados con 20 ng de ARNc, los que se mantienen a 16°C en una solución de Barth modificada. El registro de voltage-clamp se realizó a temperatura ambiente utilizando un amplificador TURBO TEC-10CX (npi electronic GmbH, Tamm, Alemania) y el software PClamp 10.6 (Axon Instruments, EE. UU.), de 2 a 4 días después de la inyección de ovocitos. Los ovocitos se registraron en una cámara (Modelo RC-1Z, Warner Instrumenst, EE. UU.) bajo superfusión continua. Los electrodos tenían una resistencia de 0,5-2 MW cuando se llenaban con 3 M KC1. La referencia del baño fue KC1 3 M en un puente de agar al 3% conectado a un electrodo Ag-AgCl. Las corrientes se registraron utilizando un protocolo que consiste en un período de potencial de mantenimiento de -30 mV durante 40 ms seguido de un salto de voltaje a -100 mV durante 20 ms y una rampa de -100 mV a 60 mV de una duración de 360 ms. La señal filtrada a 1 kHz se adquirió con un convertidor analógico digital Digidata 1440A y se analizó con el software Axon pClamp 10.6. La solución que bañaba los ovocitos durante los registros electrofisiológicos tenía la siguiente composición (mM): 115 NaCl, 2 KC1, 1,8 CaCl 2 , 1 MgCh, 10 HEPES pH 7,5 obtenido con NaOH. Para la solución baja en [CT] 0 , todo el NaCl se reemplazó con la sal de gluconato de Na. Las soluciones de stock de los fármacos en DMSO fueron: emamectina 10 mM, ivermectina 10 mM, picrotoxina 100 mM. Estos se diluyeron en solución de baño para obtener concentraciones finales. Se observó que la concentración de DMSO más alta utilizada no tenía efecto sobre las corrientes de CrGluCl. Para la obtención de las curvas Dosis-Respuesta, las corrientes medidas en el potencial de +60mV de cada concentración de agonista (glutamato o avermectina) añadida, fueron extraídas y sometidas a un ajuste mediante la ecuación de Hill de 4 parámetros (Fórmula 1) utilizando Sigmaplot 12.3. Las corrientes fueron normalizadas de acuerdo con la corriente máxima extrapolada entregada por el ajuste de Hill. De este modo se obtuvo la concentración que genera el 50% del efecto máximo (EC50) y el coeficiente de Hill (n H ) para cada situación.

Los análisis fueron hechos usando los programas Excel o Sigmaplot 12.3. Las cifras estadísticas están dadas como promedios con su desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron en Sigmaplot 12.3 considerando el nivel de significación como P < 0,05.

Ejemplo 3: Expresión funcional de canales de cloruro activados por glutamato putativos de Calieus roeercressevi.

La evaluación el ectrofi si ológica de las propiedades funcionales de los nuevos GluCls identificados en C. rogercresseyi se llevó a cabo después de la expresión en ovocitos de X laevis. La expresión se logró mediante microinyección de ARNc derivado del ADNc de las variantes CrGluCl-A, -B, -C, -D y -E de los receptores, seguido de un registro el ectrofi si ológico [24]

CrGluCl-B. En el caso del receptor CrGluCl-A (anteriormente llamado CrGluCla) se ha expresado previamente en ovocitos de Xenopus y se demostró en ensayos electrofisiológicos que se activa por glutamato para promover las corrientes de cloruro que pueden ser bloqueadas por la picrotoxina, un inhibidor del canales aniónicos dependientes de ligando. Las avermectinas ivermectina y emamectina activan CrGluCl-A de manera irreversible con valores de EC50 de alrededor de 200 nM [24] Ensayos similares realizados con CrGluCl-B también muestran que esta subunidad se comporta como un receptor de canal de C1 activado por glutamato (Fig. 3). El gráfico muestra las trazas de corriente obtenidas utilizando voltage-clamp en un ovocito previamente inyectado con ARNc de CrGluCl-B. Las corrientes hacia afuera (de signo positivo) y hacia adentro (de signo negativo) se registraron respectivamente a 60 y -80 mV, y corresponden al cloruro que fluye hacia adentro y hacia afuera del ovocito, respectivamente (Fig. 3A). La superfusión con concentraciones crecientes de L-glutamato condujo a un aumento gradual de la corriente en ambos voltajes. Tal como se informó para CrGluCl-A [24], no hay desensibilización de la respuesta de CrGluCl-B al glutamato. En contraste con la respuesta de glutamato, la ivermectina no tuvo ningún efecto sobre las corrientes que revelaron una resistencia completa del CrGluCl-B al fármaco antiparasitario. La figura 4 muestra la dependencia de la dosis del efecto glutamato sobre CrGluCl-B medido a 60 mV. La relación promedio, informada como círculos en la figura, puede describirse mediante una ecuación de Hill y representa un resumen de 16 experimentos. Los ajustes separados de la ecuación de Hill para estos experimentos dieron una EC50 de 388 ± 203 mM y n H de 1,7 ± 0,1 (Medias ± SD, n = 16). El resultado de experimentos similares con CrGluCl-A también se muestra como triángulos apuntando hacia abajo. Estos resumen 8 experimentos cuyos ajustes individuales de ecuaciones de Hill dieron una EC50 de 7,2 ± 2,7 mM y n H de 1,65 ± 0,63 (Media ± SD, n = 5). Los valores publicados anteriormente fueron 6,9 ± 0,83 pM y 1,3 ± 0,18 [24]

La Figura 3B muestra que la corriente dependiente de glutamato fue transportada por Cl , dado que un reemplazo parcial del Cl extracelular con un anión impermeante, redujo fuertemente la corriente de salida (entrada de Cl ). Las relaciones corriente-voltaje también se tomaron durante la aplicación de glutamato en condiciones extracelulares normales y en bajo [Cl ]. La Figura 3C muestra una relación corrí ente-vol taje antes de la adición de glutamato. Esta pequeña corriente invirtió su signo a un potencial, E rev , de -50 mV. En presencia de glutamato, se ve que el aumento en la corriente ocurre a todos los voltajes probados con una relación corriente vs. voltaje casi lineal y un E rev más despolarizado, es decir más positivo. En la solución extracelular baja en Cl , el E rev se despolarizó aún más y la relación IV apareció ligeramente rectificada hacia adentro, como se esperaba para una corriente activada por Cl . En seis experimentos separados el E rev para la corriente activada por glutamato cambió de -25 ± 6,2 (cerca del potencial de equilibrio de cloruro de los ovocitos de Xenopus [30]) a 8 ± 8,2 mV en Cl bajo, dando un valor calculado de P duconato /Pci de 0,2 ± 0,06 (media ± SD).

Avermectinas tales como la ivermectina, son activadores potentes e irreversibles de algunos receptores ionotrópicos de invertebrados y activan de forma potente el CrGluCl-A. Sin embargo, como se muestra arriba (y ver también la Fig. 9C), la ivermectina no aumenta la actividad de CrGluCl-B. Aunque las avermectinas no producen la activación esperada del CrGluCl-B, parecen interactuar con el canal, ya que este es incapaz de responder a la adición del agonista natural glutamato después de haber sido tratado con ivermectina o emamectina. Esto se muestra en la Fig. 5, donde en A se observa que la respuesta de CrGluCl-B a glutamato 1 mM es robusta y reversible. Esto fue seguido por la adición de ivermectina a 1 mM que no induce ninguna corriente. Una adición adicional de glutamato da una respuesta muy disminuida. La figura 5B muestra que no hay atenuación de la respuesta de glutamato tras una segunda adición del agonista, cuando no interviene el tratamiento con ivermectina, pero el fármaco puede disminuir la corriente en presencia continua de glutamato. Se obtiene un resultado muy similar cuando se usa la emamectina en lugar de la ivermectina (Fig. 5C y D). En siete experimentos separados, la corriente activada por el glutamato fue de 4,67 ± 1,17 mA antes y 1,70 ± 1,69 después del tratamiento con ivermectina (media ± SD). Los resultados equivalentes de los experimentos que probaron el efecto de la emamectina arrojaron corrientes respectivas de 4,27 ± 0,85 pA y 0,39 ± 0,19 pA (medias de 5 experimentos ± SD).

CrGluCl-C. La figura 6 muestra los resultados de ensayos electrofisiológicos en ovocitos de Xenopus inyectados con el ARNc de CrGluCl-C. En contraste con los resultados con las variantes A y B, el glutamato activó CrGluCl-C de manera dependiente de la concentración, pero la respuesta fue transitoria (Fig. 6A) a todas las concentraciones probadas. Este tipo de respuesta al glutamato no es infrecuente (Ej., [7, 13, 25]). La dependencia de la concentración de la respuesta máxima al glutamato se muestra en la Fig. 4, donde se compara con las de las isoformas A y B. La relación promedio, informada por triángulos en el gráfico, puede describirse mediante una ecuación de Hill y representa un resumen de 6 experimentos. Los ajustes separados de la ecuación de Hill para estos experimentos dieron una EC50 de 67 ± 25 pM y n H de 2,5 ± 0,56 (Media ± SD, n = 6). CrGluCl-C solo se inhibe parcialmente a 100 pM de picrotoxina (PTX, Fig. 6B), una concentración que provoca una inhibición casi completa de las variantes A y B. Las Figuras C y D muestran que la corriente a través de CrGluCl-C es aniónica ya que la corriente externa dependiente de glutamato disminuye en baja solución externa de Cl . El gráfico IV en D muestra poca rectificación para la corriente inducida por glutamato que tiene un E rev a —32 mV. La reducción en Cl extracelular cambia E rev en una dirección despolarizada y la relación IV adquiere cierta rectificación interna, consistente con la permeación de aniones. En cinco experimentos separados, el cambio de E rev observado fue de -25 ± 6,1 a 8 ± 8,2 mV dando un valor calculado de Pduconato/Pci de 0,1 ± 0,09. El potencial de membrana espontáneo en ausencia de agonista fue de -51 ± 11 mV (todos medias ± SD).

El canal de CrGluCl-C es sensible a la ivermectina como se ve en la Fig. 7A que muestra un registro de la corriente de CrGluCl-C a 60 mV y donde la adición de glutamato 0,3 mM produjo el aumento esperado en la corriente de salida. Después de la eliminación del glutamato, la ivermectina a 100 nM también provocó un aumento estable en la corriente de salida, la que pudo ser inhibida parcialmente por PTX a 100 pM. La corriente también disminuyó luego de la eliminación parcial de Cl de la solución extracelular, lo que indica su naturaleza aniónica. Las relaciones IV en la Fig. 7B muestran los resultados antes de la adición de ivermectina junto con aquellos en presencia del fármaco antes y después de una perfusión con solución de bajo Cl . Sus respectivos valores de E rev fueron -55, -41 y 10 mV. En cinco experimentos separados, el potencial de membrana cambió de -25 ± 8,9 (en la concentración normal de Cl ), a 18 ± 11 mV (en la solución baja en Cl ), dando un valor de Pduconato/Pci calculado de 0,13 ± 0,08 (media ± SD).

La Figura 7C muestra que la ivermectina provoca una activación gradual en la corriente de aniones a concentraciones crecientes y que el efecto del fármaco es irreversible. Los círculos en el gráfico de la Fig. 7D muestran la respuesta promedio de CrGluCl-C a la ivermectina y una ecuación de Hill ajustada a los datos. Los ajustes separados a los datos de siete experimentos arrojaron un valor de EC50 de 31,1 ± 14,4 nM y de 2,1 ± 0,67 para n H (medias ± SD). Estos se comparan con los valores de EC50 de 181 nM y n H de 2,1 previamente reportados para la isoforma CrGluCl-A [24] La corriente máxima alcanzada a una concentración de ivermectina saturante fue de 3,7 ± 1,3 mA (n = 10), que se compara con una corriente máxima de 3,5 ± 1,7 pA para la corriente máxima producida por el glutamato.

CrGluCl-D. La evaluación el ectrofi si ológica de las propiedades funcionales de CrGluCl-D después de la expresión de ovocitos dio resultados sorprendentes. En efecto, los ovocitos microinyectados con CrGluCl-D mostraron grandes corrientes espontáneas. Para evaluar si estas corrientes corresponden a la actividad del receptor de GluCl, se evaluó su sensibilidad al inhibidor del canal aniónico dependiente de ligando PTX, su selectividad aniónica y los posibles efectos del glutamato o la ivermectina para modular la corriente espontánea. La Fig. 8A muestra que tanto las corrientes grandes hacia adentro como hacia afuera en los ovocitos microinyectados con ARNc para CrGluCl-D fueron marcadamente inhibidas de manera reversible por PTX. El efecto se revirtió fácilmente mediante lavado y puede reproducirse en un tratamiento adicional con el bloqueador. La adición de 100 pM y luego 1 mM de glutamato produjo solo un efecto muy leve. La figura 8B muestra las relaciones IV tomadas antes y durante la aplicación PTX. El potencial de inversión de la corriente espontánea en este experimento fue de -25 mV, cercano al valor informado de la Eci de ovocitos. El PTX inhibe la corriente notablemente y desplaza el potencial de membrana a valores más hiperpolarizados. Las figuras 8C y D ilustran experimentos que muestran el efecto de disminuir el CT extracelular en las corrientes de ovocitos expresando CrGluCl-D, y también exploran una posible interacción, tal vez alostérica, entre el tratamiento con glutamato o ivermectina y el efecto de PTX. Tanto la adición de PTX como la disminución del Cl extracelular conducen a una disminución de la corriente en estos ovocitos que expresan CrGluCl-D. La aplicación de glutamato o ivermectina no tuvo efecto, pero el efecto de PTX disminuyó después del tratamiento con glutamato seguido de ivermectina o cuando se hizo de manera concomitante con la aplicación de glutamato. Las relaciones IV muestran que la eliminación parcial de Cl extracelular desplaza el E rev a voltajes positivos. En cuatro experimentos separados, el E m cambió de -21 ± 10,2 a 14,5 ± 14,8 mV, dando una relación de permeabilidad P duconato /Pci de 0,21 ± 0,12. El potencial de membrana espontáneo de los ovocitos que expresan CrGluCl-D está cerca de Eci, la inhibición de sus corrientes espontáneas por PTX y el cambio en la sensibilidad a PTX inducida por el tratamiento con agonistas de GluCl, respaldan la hipótesis de que las corrientes observadas en estas células corresponden a receptores de glutamato activados por ligando que se encuentran espontáneamente activos.

CrGluCl-E. La microinyección en ovocitos de esta isoforma de GluCl de C. rogercesseyi genera corrientes espontáneas bajas y no muestra ninguna respuesta al glutamato hasta 1 mM o ivermectina 1 mM. Suponemos que corresponde a una forma inactiva de CrGluCl o que la proteína no alcanza la membrana plasmática de los ovocitos. Es importante mencionar, sin embargo, que cuando se co-expresa CrGluCl-E junto a CrGluCl-C se obtiene un receptor activo con propiedades nuevas, sugiriendo se han formado heteropentámeros CrGluCl -E: CrGluCl -C con características funcionales diferentes a las de los canales CrGluCl ya descritos.

Ejemplo 4: Propiedades funcionales de las subunidades de CrGluCl co-expresadas.

Los receptores de glutamato de los invertebrados pertenecen al grupo de proteínas del canal de iones dependientes de ligando (LGIC) de asa Cys que pueden ensamblarse como homo o héteropentámeros de diferentes estequiometrías. La mayoría de los GluCls expresados con éxito in vitro han sido homoméricos [12] y no se sabe si esto implica que la composición de subunidades de GluCls nativos en especies con genes que codifican subunidades múltiples también es homomérica.

Para entender esto, nos propusimos explorar si las diferentes isoformas de GluCl identificadas en C. rogercresseyi podrían formar heterómeros con propiedades emergentes distintas de las de las respectivas subunidades cuando se co-expresan en ovocitos de Xenopus.

Co-expresiones de CrGluCl-A y CrGluCl-B. La co-expresión de las isoformas A y B en los ovocitos de Xenopus produce actividades receptoras con características que difieren de las de cualquiera de las subunidades expresadas por separado. La figura 9A muestra un registro de las corrientes que surgen después de microinyectar ovocitos de Xenopus con una mezcla de ARNcs 4:1 CrGluCl-A:CrGluCl-B. Estos ovocitos respondieron al glutamato con el rápido desarrollo de corrientes robustas similares en cinética a las obtenidas después de la expresión de las subunidades separadas. La respuesta a la ivermectina fue pequeña e irreversible y la adición posterior de glutamato provocó solo un pequeño aumento en la corriente, que recuerda a lo que se ve al expresar CrGluCl-B por sí solo. La relación IV de la corriente inducida por el glutamato fue óhmica y tuvo un E rev de -23 mV, un cambio desde el E rev de -59 mV en condiciones control.

Se obtuvieron resultados similares en ensayos de ovocitos de Xenopus microinyectados con mezclas de ARNcs 1:1 y 1:4 de CrGluCl-A:CrGluCl-B. En la Fig. 9C se da un resumen de las respuestas a glutamato 3 mM e ivermectina 1 mM de las tres mezclas A:B probadas junto con las respuestas de los ovocitos inyectados individualmente con CrGluCl-A o CrGluCl-B. Las tres mezclas presentaron respuestas robustas al glutamato, pero las de la ivermectina fueron bastante pequeñas (nótese la discontinuidad del eje, y el cambio de escala en la ordenada de la figura 9C). En comparación con la respuesta de glutamato de CrGluCl-B, las de CrGluCl-A y la expresión mixta 4:1 y 1:4 A:B son significativamente más pequeñas. La respuesta a la ivermectina de todos los ovocitos con expresión mixta A:B en proporciones 4:1, 1:1 y 1:4 no difirió significativamente de la (falta de) respuesta a la ivermectina de CrGluCl-B.

Los valores de EC50 para el glutamato de CrGluCl-A y -B difieren significativamente. EC50 para CrGluCl-A, a 7 mM, se encuentra entre los más bajos reportados. Los de helmintos e insectos CeGluCip, DmGluCla, HcGluCla y AeGluCl son 380, 23, 28 y 30 pM respectivamente [9, 13, 26] Los valores de EC50 para CrGluCl-B, por otro lado, son mucho más altos alcanzando los 400 pM. La expresión mixta de la respuesta a la dosis de glutamato de CrGluCl-A y CrGluCl-B (mostrada en la Fig. 9D junto con las curvas para CrGluCl-A y CrGluCl-B para comparación) proporciona una EC50 intermedia para glutamato relativamente independiente de las proporciones de la mezcla Los valores de EC50 y n H para los ovocitos con expresión mixta en razones A:B de 4:1, 1:1 y 1:4 fueron respectivamente 89 ± 47 pM y 0,68 ± 0,10 (7); 82 ± 35 y 0,88 ± 0,19 (7); y 72 ± 47 pM y 1,08 ± 0,16 (5). Los valores se derivan de ajustes a los experimentos individuales y son promedios ± SD del número de experimentos entre paréntesis.

Co-expresión de CrGluCl-C y CrGluCl-B. La Fig. 10A muestra un registro de corriente en un ovocito inyectado con una mezcla CrGluCl-C:CrGluCl-B en proporción 1:1. Al igual que en la expresión mixta CrGluCl-A junto con la isoforma CrGluCl-B, el glutamato 3 mM provocó una corriente robusta, mientras que la adición de ivermectina 1 mM no logró producir una respuesta significativa. Como antes, la respuesta de glutamato se vio atenuada en una segunda adición del agonista. A diferencia de la respuesta de glutamato de CrGluCl-C por sí sola, la corriente asociada con la subunidad co-expresada CrGluCl-C:CrGluCl-B no se desensibilizó, adquiriendo en cambio la respuesta sostenida vista con CrGluCl-B por sí solo. La curva IV de la corriente dependiente de glutamato fue lineal e cambió su signo a -22 mV en comparación con un E rev en reposo de -52 mV (Fig. 10B). La relación IV medida en presencia de ivermectina no difirió marcadamente de la IV en condiciones control. La figura 10C compara la dependencia de la concentración de la respuesta de glutamato de los ovocitos inyectados con ARNc para CrGluCl-C y CrGluCl-B junto con la respuesta de aquellos que expresan las isoformas por separado. Un ajuste de la ecuación de Hill a la respuesta del receptor combinado produjo una EC50 de 53 ± 18,8 mM y n H de 1,9 ± 0,6 (medias ± SD, n = 13), lo que implica un aumento de la sensibilidad en comparación con la de CrGluCl-B, pero no así de la del CrGluCl-C ensayado por separado. Sin embargo, con respecto a la activación por ivermectina, los ovocitos que co-expresan CrGluCl-C y CrGluCl-B fueron poco sensibles en contraste con la alta sensibilidad de la isoforma CrGluCl-C y más en línea con la insensibilidad de la isoforma CrGluCl-B. Las respuestas a 3 mM glutamato e ivermectina se comparan en la Fig. 10D. CrGluCl-C y CrGluCl-B por sí solos tenían corrientes estimuladas por glutamato que no difieren entre sí, mientras que la corriente de los receptores co expresados, aunque no diferente de la de la variante C por sí sola, fue significativamente menor que la de CrGluCl-B.

Co-expresión de CrGluCl-D y CrGluCl-B. Como se vio más arriba, la expresión de CrGluCl-D en los ovocitos da lugar a grandes corrientes espontáneas que carecen de sensibilidad al glutamato o la ivermectina pero son inhibidas por la picrotoxina. Sin embargo, cuando se co-expresaron con CrGluCl-B y -C, los ovocitos mostraron solo la corriente residual consistente con la conductancia nativa de los ovocitos no inyectados. En efecto, mientras que la expresión de CrGluCl-D por sí sola dio corrientes espontáneas de 5,64 ± 0,15 mA, la co-expresión con CrGluCl-B dio una corriente espontánea de 0,38 ± 0,69 mA (medias ± SD de 9 y 6 experimentos separados respectivamente). Los ovocitos que co-expresan CrGluCl-D y CrGluCl-B respondieron a la adición de glutamato o ivermectina con aumentos rápidos en la corriente, y esta última fue sensible a PTX (Fig. 11 A). Las relaciones IV para las corrientes estimuladas fueron lineales y se invirtieron a potenciales despolarizados con respecto a la curva IV control (Fig. 11B). La figura 11C muestra una comparación de las corrientes provocadas por glutamato 3 mM o ivermectina 1 mM en ovocitos que expresan la mezcla D y B 1 : 1. La dependencia de la concentración del efecto glutamato de los receptores co-expresados (Fig. 11D) tiene una EC50 de 36,5 ± 0,08 mM y, con un n H de 0,63 ± 0,11, muestra una cooperatividad negativa.

Co-expresión de CrGluCl-E y CrGluCl-B. El CrGluCl-E parece no provocar ninguna actividad en los ovocitos de Xenopus. Probamos si la co-expresión con CrGluCl-B podría promover la actividad del receptor con propiedades diferentes de las observadas con la isoforma B por sí sola. Sin embargo, este no fue el caso, ya que los receptores co-expresados, con un EC50 para glutamato de 534 ± 239 y n H de 1,51 ± 0,08 (medias ± SDs, n = 6), no diferían del comportamiento de CrGluCl-B expresado por sí mismo. Hay que señalar, sin embargo, que la co-expresión de CrGluCl-E junto a CrGluCl-C sugiere la formación de un receptor activo con propiedades nuevas, consistente con la existencia de heteropentámeros CrGluCl-E:CrGluCl-C con características funcionales novedosas. Ejemplo 5: Ensayo de hieh throuehvut de isoformas CrGluCl-A y -B.

Para demostrar la presente invención, hemos probado la viabilidad del uso de receptores CrGluCl cuyo hallazgo y caracterización funcional se ha descrito aquí en una búsqueda futura de agentes químicos que puedan actuar en el sitio ortostérico o alostérico para modificar su actividad, proporcionando así moléculas que por sí mismas o sus derivados puedan devenir agentes farmacológicos para controlar su función y, en consecuencia, la viabilidad de los ectoparásitos que los alojan.

Esta prueba, se ha llevado a cabo mediante la adaptación de un ensayo de high throughput para analizar la actividad de los CrGluCls basado en un compuesto que incorporado a las células es capaz de generar una señal fluorescente dependiente de la magnitud del potencial de membrana y, por lo tanto, reportar cambios de dicho potencial en células en cultivo. Un ejemplo del uso de este enfoque es la selección de moléculas candidatas a fármacos con efectos sobre los receptores 5-HT3 a partir de una biblioteca de fragmentos químicos estructuralmente diversos [27] El enfoque es escalable para cualquier biblioteca grande de compuestos, es rápido, utiliza hardware disponible en el mercado y constituye una forma única de generar información clave para el hallazgo de fármacos para determinados blancos farmacológicos.

En esta prueba, hemos explorado la capacidad del método para detectar las diferencias en la respuesta de CrGluCl-A y CrGluCl-B, o de una mezcla de los mismos, al glutamato, agonista del sitio ortostérico. Para evaluar la viabilidad de detectar un fármaco que actúa en un sitio alostérico, hemos explorado la idoneidad del método para detectar el efecto de la ivermectina.

La figura 12 muestra esquemáticamente el método utilizado. Las células HEK-293 que expresan los receptores CrGluCl se obtienen por transfección con polietilenimina. Las células se siembran en placas de 96 pocilios tratadas con poli-L-lisina y se usan a ~ 100% de confluencia. Las células se cargan con el colorante FMP cuya fluorescencia se sigue durante 20 segundos para proporcionar una medición de referencia y luego se añaden los compuestos de prueba y se monitoriza la fluorescencia durante hasta 300 segundos utilizando un lector de microplacas FlexStation. La actividad de los CrGluCls se controla como un cambio en la fluorescencia, equivalente al cambio en el potencial de membrana.

Las células transfectadas con CrGluCl-A, CrGluCl-B, o una mezcla de las mismas, respondieron al glutamato con aumentos de fluorescencia (despolarizaciones) dependientes de la concentración. Esto se muestra en la Fig. 13A-C, respectivamente, que reproduce la salida de la FlexStation como gráficos del desarrollo de la fluorescencia en función del tiempo después de la adición (en la flecha) de las concentraciones de glutamato indicadas. Deben usarse concentraciones más altas del agonista para CrGluCl-B (panel B) que para CrGluCl-A (panel A) para provocar cambios significativos en la fluorescencia. Las concentraciones de glutamato que provocan aumentos en la fluorescencia en las células que expresan la mezcla de las isoformas A y B (panel C) fueron del mismo orden de las que produjeron efectos similares en CrGluCl-A expresado aisladamente.

En experimentos similares con células que expresan CrGluCl-A, la adición de concentraciones crecientes de ivermectina en los rangos nM alto y mM también provocaron aumentos en la fluorescencia consistente con la activación del receptor (Fig. 14B). Pero en experimentos con células que expresan CrGluCl-B solo o en combinación con CrGluCl-A, la ivermectina no logró provocar cambios significativos en la fluorescencia, lo que sugiere una respuesta baja o falta de respuesta a la lactona macrocíclica de estos receptores.

La magnitud en la respuesta de fluorescencia es proporcional al grado de activación de los receptores y, por lo tanto, es posible extraer parámetros cinéticos a partir de los cuales se puede medir la potencia de los agonistas o fármacos alostéricos [27] Esto se hace en la Fig. 14. La respuesta al glutamato (panel A) o la ivermectina (panel B) se gráfica como respuesta normalizada a la estimulación máxima por los compuestos. Las líneas muestran el ajuste de las ecuaciones de Hill a los datos. Estos ajustes dan valores de EC50 calculados de 15,1 ± 1,9 y 568 ± 76 mM, con coeficientes de Hill de 1,1 ± 0,09 y 1,04 ± 0,12, respectivamente, para la activación por glutamato de CrGluCl-A y CrGluCl-B. El ajuste al resultado del glutamato en las células que expresan CrGluCl-A:CrGluCl-B produjo valores de EC50 y n H de 16,8 ± 1,8 mM y 1,02 ± 0,07. La ivermectina activó el CrGluCl-A con una EC50 52 ± 6,7 nM y n H 1,8 ± 0,34. Todos los datos en la Fig. 14 son medias ± SD de cuatro experimentos cada uno.

Este método, que es apto para aplicaciones de high-throughput , servirá como un sistema robusto para la detección de activadores de variantes de CrGluCl a partir bibliotecas químicas. La novedad de este método reside en el uso de las subunidades CrGluCl-B a -E recién identificadas B-E, siendo CrGluCl-B resistente a las avermectinas ivermectina y emamectina, para buscar en bases de datos químicas, fármacos novedosos, eficientes y específicos capaces de activar irreversiblemente CrGluCls y potencialmente de uso en control de la infestación de piojos de mar en acui cultura de peces.

Por tanto, los ejemplos y descripción de la invención anteriores, sustentan el método, el uso de las secuencias, la producción de vectores que co-expresen las secuencias de CrGluCls indicadas y demuestran que el presente invento posee ventajas técnicas evidentes frente a lo disponible en el estado de la técnica, ya que ningún documento previo anticipa la existencia de los receptores CrGluCl-B al -E. Por ende el uso de estos diferentes receptores (o mezclas de receptores) permite mediante su utilización en métodos de high-throughput , la identificación de nuevos fármacos que puedan ser servir para implementar formas distintas de afectar al parásito C. rogercresseyi , una necesidad evidente dada la creciente resistencia de este parásito a los fármacos tales como las avermectinas utilizados actualmente en la industria.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<11q> Centro de Estudios Científicos (CECs) .

<120> Receptores GluCls de piojos de mar, sensibles e insensibles a la avermectina y sus usos como blancos terapéuticos para detectar drogas anti parasi tari as contra Caligus rogercresseyi .

< 140>

<141>

< 160> 15

<170> Patentln Versión 3.5.1

<210> 1

< 211 > 1427

<212 > ADN

< 213 > Caligus rogercresseyi <220>

< 221 > Receptor CrGluCl-A

<400> 1 atgagatggt tctttgtcga catggagcag atgttcatca aagcctggat tctcccaatt 60 attatttgtt tatttgttat cgacatggca tcatgtcaac atcgacgacg tcaaataaat 120 taccgcctga gggaaaaaca aattctggat catgttttgg gagctctgcg ctatgacaaa 180 aggattcggc cgccggggaa tatcaatttc acagatccat ctccaaccgt ggtatccatc 240 aacatgtatc tccgagcaat agaccgcatt gatgactaca aaatggaata cagcgtacaa 300 ttgacattta gagagacttg gacggactcc cgattaatat ttgatgattt aaatggcaag 360 atcaagtact tgactctcac tgatgcagag aagatatgga tgcctgatac attctttcaa 420 aatgagaaac ttggccattt ccataacatc attctgccca atgtttatgt ccggattttt 480 ccttcgggac aagttttgta cagcattagg gtttcattga cgctcgcatg tcccatggac 540 ctaaagttat accccttgga tcggcaagtc tgtgaaatga ggattgctag ttatggatgg 600 accactgatg acctggtata catttggaag tccaaggacc ctgttcaaat cgtacaggat 660 cttaatctcc caagatttaa acttgaaagc tgccaaacgt catattgtaa ttcaaagacc 720 aatacagggg aatacagctg ccttaagatc aacttggtgt tcaaaagaga gttttcatat 780 tacctcctca cgatctatgt tccctcctgc atgttggtga tagtctcctg ggtgagtttt 840 tggctggact ccaaatctgt gccagcacgc gtggctctgg gggtcacgac cctcttgacg 900 atgtctaccc agaccgcggg agtgaataaa tccctgcctc ccgtagctta caccaaagcc 960 atcgacattt ggagcggggc ctgcgttata ttcgtcttca gtgccttact cgagtttgcc 1020 tttgtcaact atgcctccag acacgacaga agaaaaggac ggaagtcaag atccgccatg 1080 aactataaca tggacgacga tgaaattgac tatgatcaag tggcaagttt taccccaggg 1140 cttcgtcaat acggcaagga gggtggttcc tttgagatcg gagaaaatat actcctcagc 1200 tatctatccg gaggagataa gaaggctcta cgaaaaaagt catggcttgc agagaagttt 1260 ccccggaggt ccaaacggat cgatgtcata gcccgaattc tgtttccagg gatctttgct 1320 gtgtttaact taagctactg gctctactat ctctccgcag agagcaattc aagccttcaa 1380 ctgggcaaat aaagttgata aatgataaag gactggatga attaaat 1427

<210> 2 < 211 > 1458 <212 > ADN

< 213 > Caligus rogercresseyi <220>

< 221 > Receptor CrGluCl-B <400> 2 atgaagaccg gcattttcat tcttttaact ctattcaaca gtggacgctg tgcaagtggg 60 ctcaattctc tgtacaatat ggggcaaggc gtgatgggtc cactggataa ctttccccac 120 tctcgcttca tgccaggaaa ggaggtcaac tatcgacagg aagaaaagaa aatcctagac 180 tctgtcctgg gcccagatat ctacgataaa aggatacgtc ccagtggcct aaatagcaca 240 gactccgcaa cactggtgac ggtcaatata tttgttcgga gcttctcaaa tatcgatgac 300 gtcaaaatgg aatatagttt tcaaatcaca ctacgacagc aatggaacga tgggcgcctt 360 cgctttaagg acaagctact ctcgatggaa gcctcgtcag gaggcctctt ccataaagat 420 aagatccgat acttgaccat gacagactct agtaaggtct ggatgccgga taccttcttc 480 cgtaatgaga aaatcggtcg cttccataat attcttcagg ataatctcta tgttcgagta 540 tttccaaacg gggatgtact ctactccatt cgggtttctc tgacgtgtgc ctgctcaatg 600 catctcgctc tgtttcccct ggataaacag acatgtaact tggacgtggc aagctacgga 660 tggaccaaga atgacttaat ctaccaatgg aaggaaacga accctgttca aatggtcgcg 720 aatctctctc tccctggagg cttcaagttg gacggcttca cgaatcacaa ctgtgacgtc 780 aagacggcaa caggctccta ctcttgcctc cgcgttgagc tcacctttgc ccggcagctc 840 tctttctatg ttctcaccat ttacattccc tgcttcatga tagtccttgt gtcctggatg 900 agcttttgga tcgatcacaa ggctgttccc gcgagggtct cactgggaat cacgacactg 960 ctcgccatga gcaccacgca ggcttccatc aattcctctc ttccacccgt ggcatacatg 1020 aaggccatcg acgtttggtg cggagtttgc gtgacctttg tcttcagtgc actcctggaa 1080 tatgcccttg tcaactatgc atccaggtca gacgcgcaga gggcagccaa gcagaaggag 1140 gccaaggaac gagagttgga gcagtgcgcc ttcagcactg agcgcattga tgaaggcgga 1200 ttcccattgt caatggaccc tttgatgaga cgcatcgagg gcgctcccat gattcctcca 1260 gggggcctac ttcaaaacga aatccctcta ccggtacgcc gcaatcccat tacagaatgg 1320 tgccaaagat ttcaatttcg ggcaaagaaa attgacgtca tttcccgctt cctattccca 1380 agcacgtttg cgttcttcaa cattctatac tggtcatact atctcacgca ggaacaacag 1440 acgagcaaga agaaatag 1458

<210> 3 < 211 > 1554 <212 > ADN

< 213 > Cal i gus rogerc resseyi <220>

< 221 > Receptor C rGluCl-C

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<213> Caligus rogercresseyi 220

<221> Receptor CrGluCl-D

<400> 4 atgagccttt taaagatccc tttaaaggct catctcctct tagatgccgt cattctcctg 60 cttctcctgg atcgatccgc ctggtctaga atagagaaaa tcaattatcg tcagaaggaa 120 aagcaagtct tggactctat actcgggaca ggctatgata aaaggattag gccatctgga 180 aaaaacgata cagatgggcc tgccactatc aatgttaaca tttatctacg aaccatctca 240 cgtatagatg acgtcaaaat ggagtacagt gttcaagtca cgtttcggga gcaatggaat 300 gaccaaaggc ttcaatatta cgacgatacg cacggtcatt taaagtactt aaccctcacg 360 gatcccacca aggtctggat gcccgatact ttcttccgca acgaaaaaga agctcgaaag 420 catgaaatca tcgtgccaaa cgtctacgtt agaatatttc caaatggaga aatcttgtat 480 agcatacgaa tttccctcac cctagcttgc ccaatggacc ttcggttata tccactggac 540 aaacaagtct gcgttctaca aattgccagt tatggatggg ccaaagacga cttgatatac 600 ttgtggaaag agaaagatcc tgtacaagtt gtaccaggcc ttcaccttcc aagatttact 660 ctagaacaat ataaaagtgc ttactgtgac gtaacaacca acacaggcga atatagctgt 720 ttgaaagtgg agctcatttt caaaagagag ttttcttatt accttatcac catttacgtc 780 ccctgctgta tgctcgtcat agtgtcctgg gtcagctttt ggttggatca aaatgctatc 840 ccggcccgcg tttcccttgg ggtgaccact cttctcacca tgtccactca aacctctggg 900 atcaacgcac aactgccgcc cgtctcatat accaaagcca ttgatgtttg gactggggtt 960 tgtcaaggct ttgttttctg tgccctcctg gagtttgctt tggtgaatta cgcttcccgc 1020 tccgacatgc agagggatcg caaccgtgag aggatggaga gagctcgacg tcaatgggag 1080 ctggagcacg cagacgccct ggatccagat aatccagaga cctcatctgc tcaagcccac 1140 gggaacagca ccagtacgct tgacaggaat cacgtgggcc aaatggacgg agggtttact 1200 ctgacaaaac gaaactccga ctaccgcaac aatattcgtg cagaccccct cgcagacttg 1260 gtctacaagt ccaccacctc atatccccac cagtacaata gtctgtatcc ccatcacaac 1320 tcccacggtg ggaactacct atcaaccaca gccggaggag ttccatgtga aatccacatt 1380 ccctcggacc acctccgatc cttctcagtc gccaatggac ttagagctga tgagctagac 1440 gaaaaaaact gcgattggta ttgctgtaaa acgcggggac tcctcgcaaa gttcccctcc 1500 agagcaaaga ggattgatgt catttcccgc ttcattttcc cgctcatttt cgccattttc 1560 aaccttgtct actggctcta ctatctcttc gcaaagagca agagtcccca gttggagtca 1620 taagaacaac attcctccaa ctacttctag 1650

<210> 5 <211> 1479 <212> ADN

<213> Caligus rogercresseyi 220

<221> Receptor CrGluCl-E

<400> 5 atgactccaa cgcccttcca tttatttttc atcttgcttc tacacagtgg actcgtggac 60 tttgtgagac caacccgctt tcgacatcga ggccatcaga aaattcgtcc tacactcatc 120 aattatcgac aagaggaaaa gagaatcctg gatcgcatct tagatagcga agtgtacgac 180 cgtcgaatga ggccatcggg tattaatact actgatgatc caaccatcgt caatgtgaat 240 ctttatgtcc ggagttttga aaaaatagac gatgtcaaaa tggaatatag cgttcaaatc 300 acttttcgcc agcaatggaa cgacaatcgc ctttcttttg atgatatgga gggacgaata 360 aaatacctca ccatgacgga ctcaaagaaa gtttggatgc cggacacttt cttccgaaac 420 gaaaaggagg gaaaatttca caatatcatt caacccaatc tttatatcag ggtattcccc 480 aacggagaca ttctctatag catcagaata tctctaacat tatcatgtcc tatgagtctg 540 gaactctttc cgctagacac tcaaacgtgt tacctccgag tggctagtta tggttggacc 600 atggacgacg ttgtatataa ttggaaagta cctgagcccg ttcaatttgt tcccaactta 660 tggctaccag gtggattcgg ccttgataca ttcagagatg cctactgcaa tgtcaaaaca 720 gccacaggtg agtatagctg cctgaccgta atcatgacct tcagacgcca gctctcctac 780 tatatcatta ctatttacat tccaacgttc atgatcgtca tggtctcctg gatgtccttt 840 tggctggatc ataaatccgc tccggctcgg gtatccctga ctgtcacgac cctcctcgcc 900 atgtcaacaa cgacttcctc catcaacaac tctctgcctc cagtagccta cacgaaggcc 960 attgacgtct ggacgaacct ctgcgttact ttcgtgttcc ttgcactact agaatatgct 1020

5 ttggtcaact acgctgcaag ggccgaagca cgagcaaatg ccaatcgagt ttcgatggaa 1080 agacgtatgg agagcgacag agagcgcatc atcgatcctg ccaataattt tctcatcaag 1140 gaagaaccag atccacggca atataatcat attcaactca tgtcaaggga tcccctaatt 1200 cgtcgcattg agggctccag catagttcga gagaacaata agctcctttt ctctgagctg 1260 cctcgggatc gctttggacg cttccgtgtg gacggcccag agctcactca gagccaaccc 1320

10 ctaaatgttc gaagtgttct aagctccatc aacagtcggg ttcagtccga ggctaagagg 1380 attgacgtca tttcccgcgt tattttccct ctctcctttg tgggattcaa cgtcatgtac 1440 tggtcatact acctgacaag aagccactta aagtcctag 1479 210 6 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <22q>

<221> Partidor Forward Receptor CrGluCl-A <400> 6 tggatgagat ggttctttgt c 21

<210> 7 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial 220

<221> Partidor Reverse Receptor CrGluCl-A <400> 7 tccagtcctt tatcatttat caac 24 210 8 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial 220

<221> Partidor Forward Receptor CrGluCl-B <400> 8 ggatcctttc ataatttgca gccagg 26

55 <210> 9 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

60 220

<221> Partidor Reverse Receptor CrGluCl-A

<400> 9 tctagaaatg tatgaagatt attaatage 29

<210> 10 < 211 > 26 <212 > ADN

< 213 > Secuencia Artificial

<22q>

< 221 > Partidor Forward Receptor CrGluCl-C <400> 10 ggatccgggc ctgagcgatt ctgagc 26

<210> 11 < 211 > 28 <212 > ADN

< 213 > Secuencia Artificial <220>

< 221 > Partidor Reverse Receptor CrGluCl-C <400> 11 tctagaaata tcatccggag ggagttcc 28

<210> 12 < 211 > 18 <212 > ADN

< 213 > Secuencia Artificial <220>

< 221 > Partidor Forward Receptor CrGluCl-D <400> 12 agagggtctc cggaatcg 18

<210> 13 < 211 > 22 <212 > ADN

< 213 > Secuencia Artificial <220>

< 221 > Partidor Reverse Receptor CrGluCl-D <400> 13 agtagttgga ggaatgttgt te 22

<210> 14 < 211 > 22 <212 > ADN

< 213 > Secuencia Artificial <220>

< 221 > Partidor Forward Receptor CrGluCl-E <4QQ> 14 atggcgattg gaaacatatt cg 22

<210> 15 < 211 > 20 <212 > ADN < 213 > Secuencia Artificial

<22q>

< 221 > Partidor Reverse Receptor CrGluCl-E <400> 15 gtcaaaccat ggaaaagagg 20