技术领域

本发明涉及一种细菌培养基， 特别是涉及一种选择性培养具有抗生素抗性的 细菌的

+立类其 背景技术

培养基是微生物发酵过程或动植物细胞培养过 程中供微生物或动、 植物细胞生长、 繁殖或累积代谢产物所必需的营养基质。 培养基的成分包括:碳源、氮源、矿物质， 以及 其他必需物质， 如某些生物自身不能合成的物质， 如某些氨基酸、 维生素或核苷酸等。 此外， 培养基中还常加入 pH缓冲剂以维持稳定的 pH。培养基按其化学成分可分为天然 培养基、 复合培养基和合成培养基。 天然培养基的成分全由天然产物组成， 如动、 植物 或微生物体包括其提取物等。复合培养基是由 部分天然产物和部分已知成分的化合物组 成。 合成培养基由已知成分的化合物所组成， 如各种纯的化合物的组合。 培养基按其物 理形态又可分为固体培养基、 半固体培养基和液体培养基等。 培养基按其用途还可以分 为基础培养基、 丰富培养基、 鉴别培养基和选择培养基。 基础培养基提供最基础的营养 成分。 丰富培养基是在基础培养基中添加了更多量的 营养物质， 以实现培养的微生物或 动植物细胞快速生长。 鉴别培养基是在培养基中加入某些试剂， 从而在培养过程中表现 出一些特殊反应， 可用作鉴别不同类型的微生物或动植物细胞。 选择培养基是根据某些 生物体的特殊营养要求或对某些化学物质具有 抗性而设计的培养基。

选择培养基是生物学和生物医药科研和生物工 程生产实践中很常用的一类培养基。 抗生素常被加入到培养基中， 以杀死或限制对抗生素敏感菌生长繁殖， 从而选择性培养 菌群中对抗生素具有抗性的细菌。 抗生素是能抑制细菌生长或能杀死细菌的化学 物质。 有些细菌天然的对某些抗生素具有抗性， 可在含该抗生素的选择性培养基中生长。 也可 使某些原本不具有抗生素抗性的细菌携带能表 达抗生素抗性的遗传元件或产生基因突 变而获得对这种抗生素的抗性， 这种抗性称为获得性抗性。 培养基中常用的抗生素抗性 基因有以下几种： 氨苄青霉素抗性基因 （Ampicillin resistance gene, ampr)、 四环素抗性 基因 ( Tetracycline resistance gene，tetr)、氯霉素抗性基因 ( chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat)、卡那毒素禾口新毒素抗性基因 ( kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor)。 氨苄青霉素抗性基因是基因工程中使用最广泛 的选择标记基因，绝大多数在大肠杆菌中 克隆的质粒载体带有该基因， 用以使表达该基因的细菌对氨苄青霉素产生抗 性， 从而能 在氨苄青霉素存在的情况下正常生长。

氨苄青霉素是一种 β -内酰胺类抗生素， 可干扰细菌细胞壁的合成， 造成细胞壁的 缺损， 使细菌失去细胞壁的渗透屏障， 对细菌起到杀灭或抑制作用。 氨苄青霉素抗性基 因实际上是一种 β -内酰胺酶基因， 其产物为 β -内酰胺酶， 可水解氨苄青霉素， 从而解 除了氨苄青霉素的毒性。 早在首次大规模使用盘尼西林 （penicillin) 前， 就已发现细菌 中有一种酶可以破坏盘尼西林， 这是第一个鉴定的 β -内酰胺酶 ^[1] 。 分子生物学、 生物工 程、生物医药和工业微生物领域中所用的氨苄 青霉素抗性基因是 bla基因，它编码 TEM-1 β-内酰胺酶 （TEM-1 fi-lactamase)。 TEM-1是细菌中最常见的 β-内酰胺酶， 于上世纪 60 年代被分离于大肠杆菌和肠道沙门氏菌中 ^[2] 。 上世纪 70年代， ！^^！^^基因在肠杆菌属 中快速扩散， 到了上世纪 80年代初， blaTEM^基因已成为临床中最普遍的抗生素抗性� � 因 ^[3] 。 按其基因序列和蛋白序列来分类， TEM-1属于 A类 β-内酰胺酶（Class A), 这是 最大的也是研究最多的一类 β-内酰胺酶， 历史上也曾称其为 "盘尼西林酶"

(penicillinases) ^[4] 。按其功能来分类， TEM-1属于 2b类 β-内酰胺酶 (Group 2b)， TEM-1 很容易水解青霉素 （penicillins), 对早期的头孢菌素 （cephalosporins) (另一大类的 β- 内酰胺类抗生素， 即所谓的第一代头孢菌素） 也有一定的水解能力 ^6] 。

传统上，被用来选择性培养携带 bla基因的细菌的 β-内酰胺类抗生素是氨苄青霉素。 因此， bla基因常被称作为氨苄青霉素抗性基因。然而 ， bla基因所编码的 TEM-Ι β-内酰 胺酶能水解多种 β-内酰胺类抗生素， 而不仅仅是氨苄青霉素。 Novagen的科学家就曾建 议， 也可以用羧苄青霉素代替氨苄青霉素作为选择 性抗生素使用 ^[7] 。 氨苄青霉素

(ampicillin)及羧苄青霉素（carbenicillin)均为广� ��青霉素， 可有效杀灭革兰氏阳性菌， 也对包括大肠杆菌在内革兰氏阴性菌有较好的 杀灭效果。 现代生物学、 生物工程、 生物 医药以及工业微生物中大量应用的大肠杆菌属 革兰氏阴性菌。 培养基中常使用浓度为 100μ _Β /ηι1的氨苄青霉素和羧苄青霉素，可有效 杀灭不具有抗生素抗性的大肠杆菌等革兰 氏阴性菌， 而使具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌正常生长 。

β-内酰胺类抗生素为分子结构中含具有 β-内酰胺环的一大类抗生素， 包括青霉素类 抗生素、 头孢菌素抗生素以及一些非典型的 β-内酰胺类抗生素。 β-内酰胺类抗生素本身 为有机酸， 纯品溶液为酸性， ρΗ约为 2-4左右。 在实际使用于生物体时， 一般将这类 抗生素制成其盐类， 如钠盐、钾盐等， 以适应生物体所需的酸碱度， 并可提高其溶解度。 因此一般所说的 β-内酰胺类抗生素均是指其各种各样的盐类化 合物，其有效成分则仍为 抗生素本身。

β-内酰胺类抗生素的核心结构 β-内酰胺环是一个四元环，其环内张力大，容 易开环。 此外， 其酰胺键易受亲核和亲电攻击而水解开环。 因此， 尽管这类抗生素的干燥纯品较 稳定， 但其水溶液稳定性很差。 这也是 β-内酰胺类抗生素的注射剂均为粉剂， 临使用前 才溶解成注射液的原因。

氨苄青霉素（ampicillin)及羧苄青霉素也属于 β-内酰胺类抗生素。氨苄青霉素的药 品说明书表明， 溶于水或生理盐水 （0.9%氯化钠） 并保存在 4°C的氨苄青霉素， 其活性 在 2-3天内就会下降 10%， 而如果溶于葡萄糖注射液的话， 即便存放在 4°C， 氨苄青霉 素的活性在 1小时左右就会下降 10%。这说明在溶液中的氨苄青霉素稳定性相当 差。 以 此佐证， 在实践中， 含有氨苄青霉素的液体培养基和固体平板培养 基一般只能在 4°C存 放一个月左右， 只有少数时候， 存放了 2个月的含氨苄青霉素的培养基还可以使用。 羧 苄青霉素比氨苄青霉素更耐酸， 但在培养基适用的中性 pH条件下， 其稳定性相比于氨 苄青霉素并无显著增加。 含有羧苄青霉素的培养基的有效保质期仍只有 1-2 个月。 在 -20°C到 0°C的范围内， 氨苄青霉素反而更不稳定，其它 β-内酰胺类抗生素也有相似的特 性 ^[8 ' ⁹ ]。 尽管更低的保存温度能延长溶液中 β-内酰胺类抗生素的保质期， 但以琼脂为代 表的半固体培养基只能储存于冰点温度以上， 因为结冰会使半固体培养基开裂或变形， 影响使用效果。 β-内酰胺类抗生素在溶液中不稳定这一因素也 局限了预添加这一类抗生 素的培养基产品的大规模商业化。 如著名的化学试剂公司 Sigma-Aldrich曾经供应过预 添加氨苄青霉素的琼脂平板培养基， 该产品的保质期极短， 一般只有 1-2 个月。

Sigma-Aldrich现已不再供应这些产品了。也有� �些小规模的国外公司生产和供应预添加 抗生素的半固体琼脂平板培养基， 但都明确说明这些产品的保质期最长不超过 2个月， 因而其产量也极为有限。 如果能使预加了 β-内酰胺类抗生素的培养基可以长期稳定保 存， 就可以是这一产品实现大规模商业化， 大大节约操作人员的时间和效率。 但目前， 尚无这方面的研究和报道。

为克服 β-内酰胺类抗生素在溶液中稳定性差的不足， 人们研究开发了具有相对长效 的 β-内酰胺类抗生素品种， 这些长效抗生素大多通过降低药物溶解度， 从而实现较长时 间的缓释作用， 常见的有普鲁卡因青霉素 （Procaine penicillin ) , 苯明青霉素 ( Benethamine Penicillin )、 苄星青霉素、 苄星邻氯青霉素 ( Cloxacillin benzathine) 和苄 星头孢匹林 （Cephapirin benzathine) 等。 普鲁卡因青霉素 （CAS: 54-35-3 ) 为青霉素的 普鲁卡因盐， 在水中微溶， 溶解度约为 4mg/ml。 苯明青霉素 （C \S 751 -84-8 ) 又称苄胺 青霉素， 是青霉素的苯乙苄胺盐， 在水中的溶解度约为 lmg/ml。 苄星青霉素 （CAS : 1538-09-6)、 苄星邻氯青霉素 （C \S 23736-58-5 ) 和苄星头孢匹林 （CAS : 97468-37-6 ) 分 别为青霉素、 邻氯青霉素和头孢匹林的二苄基乙二胺盐， 它们溶解度更低， 约为 50-200 g/ml。 由于这些药物的溶解度极低， 因而以悬浊液的形式注射到体内后， 未溶解的药 物就好像药物的储蓄池， 随着抗生素药物的缓慢溶解而释放， 实现长时间保持一定血药 浓度的目的。 在这类低溶解度药物的悬浊液中， 溶解部分的药物已达饱和浓度， 浓度等 于药物的溶解度。 在人体内， 普鲁卡因青霉素的药效可达 48小时； 苄星青霉素的药效 可达 3-4周； 而苄星邻氯青霉素和苄星头孢匹林常用在兽医 领域， 药效也可达 3-4周。 而一般的 β-内酰胺类抗生素在生物体内的药效只能维持 几个小时。此外， 通过降低了药 物溶解度， 也可使药物在液体环境中的稳定性大为增加。 商品名为 Bicillin的即用型注 射用悬液剂型成分即是苄星青霉素和普鲁卡因 青霉素。 数据显示， 苄星头孢匹林 ( benzathine cephapirin)的悬液制剂在低于 25 °C的条件下， 可稳定保存长达 36个月 ^[1Q] ， 这说明这类低溶解度药物的悬液制剂是可以稳 定保存的。而一般的 β-内酰胺类抗生素注 射剂只能做成粉针剂的形式。 长久以来， 在培养细菌用的培养基中， 仅使用溶解度高的 可溶性抗生素用作培养基的选择性试剂，至今 没有研究将这类低溶解度的长效 β-内酰胺 类抗生素作为培养基的选择性抗生素使用，也 未有数据显示预加了这类长效青霉素类抗 生素的培养基是否具有较长的储存时间。

参考文献：

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发明内容

针对现有技术 β-内酰胺类抗生素或其盐添加到培养基中后稳 定性差，选择性培养具 有 β-内酰胺类抗生素抗性细菌的培养基保质期短 的问题， 设计了本发明的技术方案， 具 体实施方式为：

一种细菌培养基， 在普通的细菌培养基中预先加入 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类 中的一种或几种， 所述的预加入细菌培养基中的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类为在

25 °C条件下水中溶解度大于 0mg/ml， 小于 10mg/ml的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类。

进一步， 所述的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类为普鲁卡因青霉素、 苯明青霉素、 苄星青霉素、 苄星邻氯青霉素或苄星头孢匹林。

进一步， 加入到培养基中的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类的浓度大于该 β-内酰胺 类抗生素和 /或其盐类在 25 °C条件下的水中的溶解度， 且小于 100 mg/ml。

所述的细菌培养基用于选择性培养具有 β-内酰胺类抗生素抗性的细菌。

本发明公开了能长期保存的预加 β-内酰胺类抗生素的培养基。 能长期保存的预加 β-内酰胺类抗生素的培养基在现代生物学、 生物工程、 生物医药以及工业微生物等领域 中可用于选择性地培养具有的 β-内酰胺类抗生素抗性的细菌。所述的能长期 保存或具有 较长的保质期是指经过较长时间保存后，培养 基中的 β-内酰胺类抗生素的浓度仍处于有 效工作浓度范围内。 所述的 β-内酰胺类抗生素的有效工作浓度是指， 在此浓度范围内， 培养基中的 β-内酰胺类抗生素可有效抑制无 β-内酰胺类抗生素抗性的细菌生长，或有效 杀灭无 β-内酰胺类抗生素抗性的细菌， 或两种效应兼之， 从而可实现筛选培养具有 β- 内酰胺类抗生素抗性的细菌。 本发明中的培养基的保质期是指在这种培养基 的冰点温度以上， 40°C以下的保存条 件下的保质期。 培养基中， 由于加入了各种盐类及矿物质， 其冰点一般低于 0°C。 实际 应用中， 便于操作的保存温度为 0-30°C， 进一步为 0-16°C， 最常用的保存温度为 2-8°C。 在上述存放温度下，本发明中的培养基的保质 期远大于目前传统使用的含氨苄青霉素和 羧苄青霉素的培养基在相同温度下的保质期， 一般地这种培养基的保质期大于 6个月， 更优地大于 12个月， 更优地大于 24个月。

本发明中的培养基经长期储存后， 不影响正常使用。 即预加 β-内酰胺类抗生素的培 养基存放 6个月、 12个月和 24个月后， 对细菌的生长速度， 形态， 性状， 遗传稳定性 等没有显著改变， 不影响实验或生产的进行和效率。 具体地， 是在相同培养条件下的培 养过程的任一时间点上，具有 β-内酰胺类抗生素抗性的细菌在经上述时间储 存后的本发 明中的培养基中的生长速度及活菌体数目不小 于在新鲜配制培养基中的 70%，更优地不 小于 90%， 更优地为在新鲜配制培养基中的 100%。

本发明中的培养基即为在现有各种类型的细菌 培养基中预添加 β-内酰胺类抗生素。 抗生素是能抑制细菌生长或能杀死细菌的化学 物质。 β-内酰胺类抗生素是含有 β-内酰胺 环， 并以 β-内酰胺环为杀菌抑菌活性中心的抗生素及其 盐类， 包括青霉素类抗生素及其 盐类、 头孢菌类抗生素及其盐类以及任何其它非典型 β-内酰胺类抗生素及其盐类。

本发明所述的预加入培养基中的 β-内酰胺类抗生素及其盐类具有较低的溶解度 这 一物理特性。 本发明所述的较低的溶解度， 是指在 25 °C条件下的水中的溶解度小于 lOmg/ml, 更优地小于 lmg/ml， 最优地小于 0.25mg/ml。 应用者可通过饱和浓度法测定 抗生素在水中的溶解度， 具体地， 在 25°C条件下， 取一定质量 （W1 ) 的抗生素加入到 100ml的水中， 恒温充分搅拌溶解 1小时以上， 用滤纸滤出未溶解的抗生素， 干燥后称 重 （W2)， 该抗生素的溶解度即为 Wl-W2。 应用者也可以通过测定抗生素过滤液中的 抗生素浓度来确定该抗生素的饱和溶液浓度即 溶解度。测定溶液中 β-内酰胺类抗生素可 运用 HPLC法和比色法等，此类方法被广泛应用于检� �牛奶等食物中残留的 β-内酰胺类 抗生素含量， 这些方法所使用的试剂、 仪器和操作流程等均有公开的资料可查， 应用者 可以轻易获得。 本发明中的培养基含有上述较低溶解度的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐 类的一种或几种组合。 加入到培养基中的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类的浓度大于该 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类在 25°C条件下的水中的溶解度， 且小于 100 mg/ml， 更优 地且小于 10 mg/ml， 最优地且小于 lmg/ml， 由于 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类的溶解 度不同， 选择的最大的添加量也不同， 添加量要保证 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类要 有一部分不溶的存在于培养基中， 随着物质消耗逐渐溶解， 使得培养基具有较长的保质 期， 但添加量过大也会使得培养基过于粘稠， 且增加成本。 在本发明的培养基中， 具有 较低溶解度这一物理特性的 β-内酰胺类抗生素和 /或其盐类在培养基中大部分以未溶的 固体形式存在， 并缓慢溶解释放， 使培养基能保持含有有效工作浓度的 β-内酰胺类抗生 素达 24个月以上。 β-内酰胺类抗生素在培养基中能发挥长时间缓 释作用， 保持其长时 间处于有效工作浓度的基础为这些 β-内酰胺类抗生素及其盐类在培养基中具有较 低的 溶解度这一物理特性。 因此， 在培养基中具有所述较低溶解度的 β-内酰胺类抗生素或其 盐类均可作为适用的 β-内酰胺类抗生素加入到培养基中，而使预加 这些 β-内酰胺类抗生 素的培养基具有较长的保质期， 可以长期发挥作用。

具体实施方式

实施例 1 培养基中氨苄青霉素或羧苄青霉素的保质期测 试

LB液体培养基 （含 1%的胰蛋白胨、 0. 5%的酵母抽提物和 0. 5%的氯化钠， ρΗ=7. 0 ) 及 LB琼脂平板培养基（LB液体培养基中加 1. 5%琼脂， ρΗ=7. 0 )中分别加入 100 μ g/ml、 lmg/ml , lOmg/ml和 lOOmg/ml的氨苄青霉素或羧苄青霉素。 于 4°C储存 2个月， 3个月 和 4个月后取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含 lOO g/ml和 lmg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在 2个月时已不能完全抑制大 肠杆菌的生长，含 lOmg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在 3个月时已不能完全 抑制大肠杆菌的生长， 而含 100 mg/ml的氨苄青霉素和羧苄青霉素的培养基在 4个月时 也已不能完全抑制大肠杆菌的生长，说明传统 使用的含 100 μ g/ml氨苄青霉素和羧苄青 霉素的培养基的保质期不超过 2个月，而增加这两种抗生素的浓度也并不能� �著延长培 养基中抗生素的有效期。

实施例 2 LB培养基中普鲁卡因青霉素的保质期测试

在 LB液体培养基 （含 1%的胰蛋白胨 0. 5%的酵母抽提物和 0. 5%的氯化钠， pH=7. 0 ) 和 LB琼脂平板培养基 （LB液体培养基中加 1. 5%琼脂， pH=7. 0 ) 中分别加入 10 mg/ml , 40 mg/ml 和 80 mg/ml的普鲁卡因青霉素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24 个月后取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述 浓度普鲁卡因青霉素的培养基在储存上述时间 后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的 生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范 围。 实施例 3 SOC培养基中普鲁卡因青霉素的保质期测试

在 S0C液体培养基（含 2%的胰蛋白胨， 0. 5%的酵母抽提物和 0. 05%的氯化钠， 2. 5 mM 的氯化钾和 10 mM的氯化镁， pH=7. 0 )和 S0C琼脂平板培养基（S0C液体培养基中加 1. 5% 琼脂， pH=7. 0 )中分别加入 10 mg/ml 、 40 mg/ml和 80 mg/ml的普鲁卡因青霉素。于 4°C 储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 a菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度普鲁卡因青霉素的培养基在储存上 述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度 范围。

实施例 4 ΤΒ培养基中苯明青霉素的保质期测试

在 ΤΒ液体培养基 （含 1. 2%的胰蛋白胨、 2. 4%的酵母抽提物、 0. 5%甘油， 17 mM的 磷酸二氢钾和 72 mM的磷酸氢二钾） 和 TB琼脂平板培养基 （液体 TB培养基中加 1. 5% 琼脂） 中分别加入 5 mg/ml和 25 mg/ml的苯明青霉素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试 显示， 含上述浓度苯明青霉素的培养基在储存上述时 间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范 围。

实施例 5 Μ9基本培养基中苯明青霉素的保质期测试

在 Μ9基本液体培养基 （含 48 mM的磷酸氢二钠、 22 mM的磷酸二氢钾、 0. 05%的氯 化钠、 0. 1%氯化铵、 2 mM的硫酸镁、 0. 1 mM的氯化钙和 0. 2%的葡萄糖） 和 M9基本琼脂 平板培养基（M9基本液体培养基中 1. 5%琼脂， pH=7. 0 )中分别加入 5 mg/ml和 25 mg/ml 的苯明青霉素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培养基， 接种上 大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度苯明青霉素的培养基在 储存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 a菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍 处于有效工作浓度范围。

实施例 6 YT培养基中苄星邻氯青霉素的保质期测试

YT液体培养基（含 0. 8%的胰蛋白胨， 0. 5%的酵母抽提物和 0. 25%的氯化钠， pH=7. 0 ) 和 YT琼脂平板培养基 （YT液体培养基中加 1. 5%琼脂， pH=7. 0 ) 中分别加入 0. 5 mg/ml 和 2. 5 mg/ml和的苄星邻氯青霉素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后 取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度的 苄星邻氯青霉素的培养基在储存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范 围。 实施例 7 YPD培养基中苄星邻氯青霉素的保质期测试

YPD液体培养基 （含 2%的胰蛋白胨， 1%的酵母抽提物和 2%的葡萄糖， pH=7. 0 ) 和 YPD琼脂平板培养基 （YPD液体培养基中加 1. 5%琼脂， pH=7. 0 ) 中分别加入 0. 5 mg/ml 和 2. 5 mg/ml和的苄星邻氯青霉素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后 取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度的 苄星邻氯青霉素的培养基在储存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范 围。

实施例 8 LB培养基中苄星青霉素的保质期测试

LB液体培养基 （含 1%的胰蛋白胨， 0. 5%的酵母抽提物和 0. 5%的氯化钠， ρΗ=7. 0 ) 和 LB琼脂平板培养基 （LB液体培养基中 1. 5%琼脂， pH=7. 0 ) 中分别加入 0. 5 mg/ml和 2. 5 mg/ml的苄星邻氯青霉素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培 养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度的苄星青 霉素的培养基在储存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 a菌株的生长， 说明培养 基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。

实施例 9 S0C培养基中苄星青霉素的保质期测试

在 S0C液体培养基（含 2%的胰蛋白胨， 0. 5%的酵母抽提物和 0. 05%的氯化钠， 2. 5 mM 的氯化钾和 10 mM的氯化镁， pH=7. 0 )和 S0C琼脂平板培养基（S0C液体培养基中加 1. 5% 琼脂， pH=7. 0 ) 中分别加入 0. 5 mg/ml和 2. 5 mg/ml的苄星邻氯青霉素。 于 4°C储存 6 个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 a菌株， 于 37 °C 培养过夜。 测试显示， 含上述浓度的苄星青霉素的培养基在储存上述 时间后， 均能完全 抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范 围。

实施例 10 ΥΤ培养基中苄星头孢匹林的保质期

ΥΤ液体培养基（含 0. 8%的胰蛋白胨， 0. 5%的酵母抽提物和 0. 25%的氯化钠， ρΗ=7. 0 ) 和 ΥΤ琼脂平板培养基（ΥΤ液体培养基中加 1. 5%琼脂， ρΗ=7. 0 ) 中分别加入 0. 25 mg/ml 和 1 mg/ml的苄星头孢匹林。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培 养基， 接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株， 于 37 °C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度的苄星头 孢匹林的培养基在储存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 a菌株的生长， 说明培 养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范围。

实施例 11 M9基本培养基中苄星头孢匹林的保质期

在 M9基本液体培养基 （含 48 mM的磷酸氢二钠、 22 mM的磷酸二氢钾、 0. 05%的氯 化钠、 0. 1%氯化铵、 2 mM的硫酸镁、 0. 1 mM的氯化钙和 0. 2%的葡萄糖） 和 M9基本琼脂 平板培养基 (M9基本液体培养基中 1. 5%琼脂， pH=7. 0)中分别加入 0. 25 mg/ml和 1 mg/ml 的苄星头孢匹林。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培养基， 接种 上大肠杆菌 DH5 a菌株， 于 37°C培养过夜。 测试显示， 含上述浓度的苄星头孢匹林的培 养基在储存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 a菌株的生长， 说明培养基中的抗 生素仍处于有效工作浓度范围。

实施例 12培养基中普鲁卡因青霉素和苄星邻氯青霉素� ��保质期测试

LB液体培养基（含 1%的胰蛋白胨， 0. 5的酵母抽提物和 0. 5的氯化钠， pH=7. 0)和 LB琼脂平板培养基 （含 1%的胰蛋白胨， 0. 5的酵母抽提物， 0. 5的氯化钠和 1. 5%琼脂， pH=7. 0) 中同时加入 25m _g /ml的普鲁卡因青霉素和 2. 5 mg/ml的苄星邻氯青霉素两种抗 生素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18个月， 24个月后取出培养基， 接种上大肠杆菌 DH5 _a 菌株， 于 37°C培养过夜。测试显示， 上述含混合 β _内酰胺类抗生素的培养基在储 存上述时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 a菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处 于有效工作浓度范围。

实施例 13培养基中普鲁卡因青霉素、 苯明青霉素、 苄星青霉素和苄星头孢匹林的 保质期

LB液体培养基（含 1%的胰蛋白胨， 0. 5的酵母抽提物和 0. 5的氯化钠， pH=7. 0)和

LB琼脂平板培养基 （含 1%的胰蛋白胨， 0. 5的酵母抽提物， 0. 5的氯化钠和 1. 5%琼脂， pH=7. 0) 中同时加入 50mg/ml的普鲁卡因青霉素、 5 mg/ml的苯明青霉素、 1 mg/ml的 苄星青霉素和 0. 5 mg/ml的苄星头孢匹林四种抗生素。 于 4°C储存 6个月， 12个月， 18 个月， 24个月后取出培养基，接种上大肠杆菌 DH5 ct菌株，于 37°C培养过夜。测试显示， 上述含混合 β -内酰胺类抗生素的培养基在储存上述时间后� �均能完全抑制大肠杆菌 DH5 α菌株的生长， 说明培养基中的抗生素仍处于有效工作浓度范 围。

实施例 14伽马射线辐照灭菌过程对含 β_内酰胺类抗生素的培养基保质期影响测试 用高剂量的钴 60伽马射线对实施例 2-13中预加 β-内酰胺类抗生素的液体培养基和 琼脂平板培养基进行辐照灭菌处理。 使用的剂量为 30KGy， 该剂量已超过医用级别灭菌 所需的 25KGy剂量， 足以保证灭菌确保水平小于 10— ⁶ ( SA1 10— ⁶ )。 经伽马射线照射后的 培养基于 4°C储存 6个月， 12个月和 18个月， 24个月后取出测试。 测试结果显示， 所 有经伽马射线照射的培养基和未照射培养基中 的抗生素保质期并无差异。经照射过的培 养基在上述储存时间后， 均能完全抑制大肠杆菌 DH5 a菌株的生长， 说明培养基中的抗 生素仍处于有效工作浓度范围