Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма ризосферных бактерий p. Bacillus в качестве средства для повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.

Современное высокоэффективное сельскохозяйственное производство невозможно без применения удобрений и средств защиты растений. Так, широкое использование минеральных удобрений, в первую очередь азотных, позволило за последние 50 лет более чем в 5 раз поднять урожайность основных сельскохозяйственных культур в развитых странах. Однако процесс получения и применения минеральных азотных удобрений является наиболее энергоемким - на него расходуется до от 30 до 50% всей энергии, потребляемой в сельскохозяйственном производстве.

В настоящее время известно множество микробиологических препаратов для сельского хозяйства различного назначения: ростостимулирующих, а также подавляющих развитие фитопатогенных бактерий и грибов.

Микроорганизмы могут стимулировать их рост (Azospirillum), связывать азот (Rhizobium), предотвращать заболевания растений {Pseudomonas или Bacillus), или же уничтожать вредных насекомых (Streptomyces).

Известен «Способ обработки семян», описанный в заявке JNs 2170987 Великобритании с приоритетом от 14.02.85г. МКИ 4 А 01 С 1/06, опублико- ванный в ИСМ Ν° 10 за 1987г. Указанный способ предусматривает обработку семян составом, состоящим из микроорганизмов, носителя, например отру- бей, и клея, такого как смола гатти. Наиболее благоприятные результаты по- лучаются при обработке семян пшеницы. Известен патент РФ JVs 2140138 на группа изобретений «Способ предпо- севной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур» по заявке Ν» 98120341 с приоритетом от 13.1 1.1998г. на имя ЗАО ССПР «СОРТСЕМОВОЩ», МП А01С1/06, опубликовано 27.10.1999г.

Указанные способы осуществляются с помощью биофунгицидного пре- парата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis 4-13 (депонирован под per. номером ВНИИСХМ Д-606 в группе эпифитных микроорганизмов). Способ получения биофунгицидного препарата заключается в смешивании культуральной жидкости, содержащей штамм B.s. 4-13, который предвари- тельно культивируют в жидкой стерильной питательной среде, с эмульсией ПВА, водным разбавителем и стерильным мелом или доломитом в опреде- ленных пропорциях. Изобретения позволяют повысить эффективность защи- ты овощных культур от фитопато генных грибов путем предпосевной обра- ботки семян.

Известен патент РФ JVs 2099947 на изобретение «Биопрепарат Фитоспо- рин для защиты растений от болезней» по заявке 96121980 с приоритетом от 15.1 1.1996г. на имя Института Микробиологии и вирусологии НАН Украины (UA) и НПО «Башкирское» (RU), МПК A01N63/00; C12N1/20; C12R1 :125, публикация 27.12.1997г.

Основу биопрепарата «Фитоспорин» составляет штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 10 ⁹ - 10 ¹⁰ на 1 мл. физраствора в количестве 92-98 об. % и наполнитель в количестве 2-8 об. %. При этом штамм Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, что позволяет использовать его для защиты различных видов сельскохозяйственных (зерновых и бобовых) и декоративных древесных растений путем предпосевной обработки семян. Известен патент РФ Ν» 2478290 на изобретение «Биопрепарат для стиму- ляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и поч- венного плодородия» патенту РФ J4° 2478290 (заявка Jfe 2011145665) с прио- ритетом от 11.11.2011г. на имя ООО «Бациз», МПК A01N63/02, А01С1/06, C12N1/20, C12R1/07, публикация заявки 20.05.2012г., патента - 10.04.2013г. Биопрепарат содержит биомассу Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В- 11008 и гуматы при следующем соотношении компонентов, в об.%: биомасса веге- тативных клеток и спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В- 11008 - 1,24- ,30x 10 ¹⁰ КОЕ/мл культуральной жидкости и содержанием спор 94% от общего количества КОЕ - 99,0, гуматы - 1,0. Биопрепарат позволяет защитить растения от грибных и бактериальных болезней, улучшить фитосанитарное состояние почвы и повысить ее плодородие, увеличить урожайность культур.

Недостатком является ограниченная область применения (только зерно- вые культуры: пшеница и ячмень), а также необходимость высокого значения титра клеток и спор штамма-продуцента в составе препарата для эффектив- ного его применения.

Известен патент РФ Ν° 2528058 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами» по заявке 2013125726 с приоритетом от 04.06.2013г. на имя ФГУП «ГосНИИгенетика», МПК A01N63/02, А01С1/06, C12N1/20, C12R1/07, публикация 10.09.2014г.

Описан штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обла- дающий фунгицидным и бактерицидным действием. Также предложен био- логический препарат для защиты зерновых растений от заболеваний, вызыва- емых фитопатогенными грибами. Биологический препарат получают путём смешивания активного начала в виде культуральной жидкости указанного штамма с титром 2-3>< 10 ⁹ КОЕ/мл и носителя в виде мелкодисперсных гранул диатомита в соотношении по объёму 1 :3 с последующим высушиванием. Изобретения позволяют повысить урожайность зерновых растений и уменьшить процент их заражённости фитопатогенными грибами.

Недостатком является ограниченная область применения (только зерно- вые культуры) и отсутствие у штамма бактерицидной активности.

Известны патентная заявка Китая CN102703354 (А) от 03.10.2012г. на бак- терии штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B203, проявляюще- го фунгицидный эффект против антракноза клубники и некоторых др. болез- ней, вызываемых грибами; МПК A01N63/00, -/02; А01РЗ/00; C12N1/20; C12R1/07 и патентная заявка Китая CN104195072 (А) от 10.12.2014г. на базе нацио- нальной заявки CN20141385641 с приоритетом от 06.08.2014г. на бактерии штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B232, проявляющего фун- гицидный эффект против дотихициевого некроза тополя и некоторых других грибковых болезней; МПК A01N63/00; А01РЗ/00; C12N1/20; C12R1/07.

Недостатком описанных штаммов является ограниченная область их при- менения (клубника, тополь) и отсутствие у них бактерицидной активности. Кроме того, в патентах не указаны титры препарата, при которых они эффек- тивны для контроля грибных болезней клубники и, соответственно, тополя. Известна патентная заявка Румынии R0127468 (А2) от 29.06.2012г. на базе национальной заявки RO20100001379 с приоритетом от 21.12.2010г. на изо- бретение «Штамм Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum В 100 для роста сельскохозяйственных культур», МПК A01N63/00; C12N1/20 .

Штамм проявляет фунгицидный (продукция липопептидных и поликетид- ных антибиотиков) и бактерицидный эффект против широкого спектра фито- патогенных грибов в почве и бактериальных болезней фруктовых деревьев, а также стимулирующий эффект за счет эндофитного производства ростовых факторов. Способен продуцировать ряд ферментов: протеазы, лактоназы, амилазы, фитазы и целлюлазы. Способен растворять неорганические соеди- нения фосфора, селена. Может использоваться для укрепления зерна зерно- вых культур (пшеницы и кукурузы) в регионах с дефицитом селена.

В данной публикации не указан титр Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum В 100, который необходим в препарате при использовании штамма этих бактерий для контроля болезней растений. Недостатком также является ограниченная область применения (зерновые культуры и плодовые деревья).

Известна также международная заявка WO2012130221 (А2) от 24.03.2012г. на базе национальной заявки Германии DE20111015803 с приоритетом от 01.04.201 1 г. на изобретение «Средство против фитопатогенных микроорга- низмов», МПК A01N63/00; С07К 14/32; C12N1 20; C12R1/07.

Описан новый штамм Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum _PS> 101 , который характеризуется высокой эффективностью против болезни корневой гнили ("черная парша") в картофеле, вызванной Rhizoctonia solani.

Разработан противогрибковый препарат Бактериоцин для лечения гриб- ных и других микробных и вирусных инфекций, который получают на осно- ве спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AB101, имеющих сильный эффект в отношении грамположительных бактерий.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum, продуцирует 10 раз- личных веществ: фунгицидных (различных групп антибиотических веществ: дипептидных, липопептидных и сидерофоров) , бактерицидных (поликетидов и бактериоцинов) и антивирусных, против широкого спектра болезней рас- тений и особенно против корневой гнили картофеля, вызываемой фитопато- генным грибом Rhizoctonia solani. Может использоваться в сельском хозяй- стве, защите растений и биотехнологии.

В данной публикации не указан титр штамма, который необходим в пре- парате при использовании этих бактерий для контроля болезней растений.

Недостатком также является ограниченная область применения— в ос- новном описан эффект против корневой гнили картофеля, вызываемой фито- патогенным грибом Rhizoctonia solani. Известен патент N°2495119 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов» по заявке JNs 2012151104 с приоритетом от 29.11.2012г. на имя ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии, который выбран в качестве прототипа.

Штамм депонирован в коллекции ГНУ ВНИСХМ Россельхозакадемии 14.11.2011г. под номером RCAM 00876 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов. Указанный штамм обладает высокой фунгицидной и бактерицидной активностью. Установлена также высокая ростостимулирующая активность штамма Bacillus subtilis 8А и биопрепарата на его основе, что приводит к повышению урожайности растений. Опытным путем подтверждено, что эффективность штамма обусловлена способностью его бактерий создавать с растениями микробно-растительную систему путем колонизирования ризосферы и корневой системы растений.

В связи с тем, что штаммы бактерий таксономической группы Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum депонированы в коллекциях, расположен- ных от заявителя территориально далеко (и даже в других государствах), а также, что в некоторых публикациях не указан титр штамма бактерий, кото- рый необходим при его использовании в биопрепарате, в качестве прототипа выбран доступный заявителю штамм бактерий Bacillus subtilis 8А, депониро- ванный в коллекции ГНУ ВНИСХМ.

Задачей изобретения является выявление штамма ризосферных бактерий, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве средства для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов, улучшения питания с/х культур, увеличения продуктивности растений, и позволяющего расши- рить арсенал подобных средств. Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов в сельском хозяйстве используется штамм ризосферных бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, позволяющий расширить арсенал подобных средств.

Штамм ризосферных бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 был выделен из корней озимой пшеницы с. Лира, произрастающей на черноземных почвах Краснодарского края Российской Федерации.

Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорга- низмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) ФГБНУ ВНИИСХМ 09.07.2015г. под номером RCAM 03458 в качестве средства повышения про- дуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов (копия справки о депонировании прилагается). Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и фи- зиолого-биохимическими признаками.

Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток (0,9-1,8) мкм. Штамм образует споры, расположенные в центре клетки, по- ложительно окрашивается по Граму. Через 24 часа роста на жидкой пита- тельной среде наблюдалось накопление поли- -оксибутирата. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхатель- ный и бродильный. На мясо-пептонном агаре образует сухие колонии кремо- вого цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний (5-12) мм. Оптимальная температура для роста 33°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значе- ние рН среды 6,8, рост происходит также при рН от 4,5 до 9,0. Штамм гид- ролизует казеин, желатину, крахмал и лакмусовое молоко. Лакмус при этом обесцвечивается. Штамм обладает сильной катал азной активностью, амилаз- ной, протеазной, липазной и фосфолипазной активностью. Штамм способен расти при 50°С, 10% NaCl и 0,001% лизоцима.

В качестве единственного источника углерода штамм использует с обра- зованием кислоты арабинозу, ксилозу, маннит, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, глицерин, декстрин, крахмал и с образованием щелочи рамнозу и дульцит. Использует преимущественно минеральные формы азота

- соли аммония и нитраты, а также аминокислоты и белки.

Опытным путем было установлено, что штамм бактерий Bacillus amylo- liquefaciens subsp. piantarum BS89 увеличивает урожай растений и проявляет антагонистические свойства по отношению к возбудителям болезней сель- скохозяйственных культур, в частности:

- пшеница озимая и яровая - против мучнистой росы ( Erysiphe graminis), бурой ржавчины {Puccinia recondita), фузариозной корневой гнили {Fusarium culmorum), базального бактериоза {Pseudomonas syringae);

- ячмень яровой - против плесневения семян (Penicillium, Alternaria), кор- невых гнилей {Bipolaris sorokiniana), темно-бурой пятнистости {Drechlera sorokiana);

- капуста белокочанная и цветная - против сосудистого бактериоза {Хап- thomonas campestris), черной ножки {Rhizoctonia solani), питиозной корне- вой гнили {Pythium irregulare);

- картофель - против фитофтороза {Phytophtora infestans), ризоктониоза {Rhizoctonia solani), фузариозного увядания {Fusarium oxysporum);

- сахарная свекла - против корнееда {Pythium debarianum, Phoma betae), церкоспороза {Cercospora beticola).

- подсолнечник - против белой гнили {Sclerotinia sclerotiorum), фомопсиса {Phomopsis helianthi);

- лен - против фузариоза {Fusarium avenaceum Sacc, Fusarium oxysporum v. orthoceros f. lini (Boll) Bilai), бактериоза (Clostridium macerans Schard). Опытным путем было также установлено, что штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 обладает фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium sporotrichioid.es, Erysiphe graminis, Phytophtora infestans, Rhizoctonia solani, Pythium irregular, Plasmopara viticola, Uncinula necator, Botrytis cinerea, а также бактерицидной активностью против фитопатогенных бакте- рий Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae, Clavibacter michiganense.

В таблицах 1 , 2 представлены результаты проверки антагонистической активности против фитопатогенных микроорганизмов 3-х штаммов ризо- сферных бактерий: Pseudomonas fluorescens АР-33 (микробный препарат Планриз), Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (микробный препарат Фитоспорин), Bacillus subtilis 8А (прототип), Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 (заявляемый штамм).

Бактерицидную активность проверяли на 5 штаммах фитопатогенных бактерий: Pseudomonas syringae 8300, Pseudomonas syringae 2314, Erwinia carotovora A-l, Erwinia carotovora 3391, Clavibacter michiganense 17-1.

Вначале высевали бактерии бактериологической петлей сплошным газо- ном на поверхности питательного агара и культивировали 48 часов при 28°С. В день проверки на бактерицидную активность высевали сплошным газоном на голодном картофельном агаре штаммы указанных фитопатогенных бак- терий. Затем переносили на поверхность только что засеянной среды выре- занные стерильным пробочным сверлом агаровые блочки со зрелой культу- рой тестируемых бактерий. Перенос осуществляли с помощью стерильного скальпеля и прокаленного пинцета. Чашки с блочками культивировали в те- чение 24 часов при температуре 28°С, после чего замеряли диаметр зоны ин- гибирования вокруг блочков.

Результаты измерений представлены в Таблице 1. Таблица 1. Антагонистическая активность штаммов ризосферных бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям

Из данных, приведенных в Таблице 1 видно, что заявленный штамм бакте- рий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 обладает большей анта- гонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению с прототипом - штаммом Bacillus subtilis 8 А. Фунгицидную активность проверяли в отношении 5 фитопатогенных гри- бов: Phytophtora infestans, Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Pythium ultimum с использованием метода «колодцев».

В разогретый и остывший до температуры 37°С картофельно-декстрозный агар добавляли суспензию спор грибов (10 ⁵ КОЕ/мл) из расчета 1мкл суспен- зии на 1мл среды. Полученную смесь разливали по чашкам Петри, после за- стывания в ней делали прокаленным пробочным сверлом 4 ровных сквозных отверстия, расположенных квадратом. В эти отверстия заливали по 100 мкл бактериальной суспензии с титром клеток 10 ⁸ КОЕ/мл. Одна чашка была оставлена с пустыми «колодцами» как контрольный вариант. Все чашки с «ко- лодцами» культивировали в течение 72 час. при температуре 28°С. Фунгицид- ную активность определяли как зоны ингибирования роста фитопатогенного гриба вокруг «колодцев». Результаты измерений представлены в Таблице 2. Таблица 2. Антагонистическая активность штаммов ризосферных бактерий по отношению к фитопатогенным грибам

Из данных, приведенных в Таблице 2 видно, что заявленный штамм бак- терий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 обладает большей ан- тагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8А. Как показал анализ полногеномного секвенирования, такая активность штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 обусловлена нали- чием в его геноме генов, кодирующих продукцию фунгицидных и бактери- цидных веществ: сурфактинов, фенгицинов, бацилломицина Д, циклических липопептидов, бациллобактина, бациллолизина, бациллена, макролактина, плантазолицина, амилоциклизина (Таблица 3).

Нерибосомные синтезированные пептиды (НСП) включают в себя широ- кий круг структурно неоднородных антибиотических соединений. Наиболее известные и изученные НСП включают сурфактины, фенгицины и итурины.

Итурины и фенгицины известны как основные факторы, определяющие антифунгальную активность различных бацил. [1].

Фенгицины особенно активны в отношении мицелиальных грибов [2]. Сурфактины необходимы для формирования биопленки и распростране- ние бактерий в окружающей среде, тем самым способствуя их колонизации в корнях и тканях растений и проявлению их биоконтрольной активности [3]. Кроме того, сурфактины и, в меньшей степени, фенгицины способны запус- кать защитные механизмы растений [1].

Таблица 3. Кластеры генов, вовлеченные в синтез антибиотических метаболитов штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89

Кроме липопептидов, кластер генов dhb вовлечен в синтез сидерофора бациллибактина. Бактериальные сидерофоры имеют высокое сродство для трехвалентного железа и способны эффективно связывать его в железо- дефицитных средах, например в грунтах, в результате чего ионы железа ста- новятся менее доступны фитопатогенам и тем самым способствуют биокон- трольной деятельности сидерофор-продуцирующих бактерий [4]. Оперон dhb, управляющий синтезом бациллибактина сходен с таким же опероном у грамотрицательных бактерий, продуцирующих энтеробактин.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 имеет три боль- ших кластера генов, кодирующих поликетиды: дифицидин, бациллен и мак- ролактин (Таблица 3). Все три метаболита обладают широкой антибактери- альной активностью в отношении патогенов растений и человека и могут быть потенциально использованы в медицине [5,6].

Геном штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 содержит кластер генов для производства двух рибосомно продуцируемых небольших пептидов: плантазолицина и амилоциклизина (Таблица 3). Плантазолицин является новым типом рибосомально продуцируемых небольших пептидов с узким спектром антимикробной активности в отношении других бацилл, особенно В. anthracis (возбудитель сибирской язвы) [7]. Кроме того, этот метаболит способен подавлять нематоды, образующие галлы (новообразо- вания) на корнях растений. Несколько других грамположительных бакте- рий, включая Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Corynebacterium urealyticum DSM7109 and Brevibacterium linens BL2 также имели похожий биосинтетический кластер в своих геномах [8]. Амилоциклизин - это циклический пептид, принадлежащий к группе бактериоцинов. Он обладает высокой антибактериальной активностью в отношении тесно связанных грамположительных бактерий- это преимущество может использоваться для подавления бактериальных конкурентов в ризосфере [7]. Кластер генов асп, управляющий синтезом этого бактериоцина широко распространен среди видов рода Bacillus/Paenibacillus таксономи-ческих групп. Еще один небольшой пептид мерасцидин был найден в нескольких видах Bacillus ату- loliquefaciens subsp. Plantarum [9], но штамм BS89 содержит лишь фрагмен- тарные части всего кластера генов и может быть не в состоянии синтезиро- вать мерасцидин.

Экспериментально установлено, что штамм бактерий Bacillus amylolique- faciens subsp. plantarum BS89 обладает не только фунгицидной активностью против фитопатогенных бактерий и фитопатогенных грибов, но и фито- стимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйст- венным культурам (например, редис, пшеница).

Анализ ростостимулирующей активности штаммов бактерий проводили по оригинальной методике с использованием растений редиса сорта «Дуро» и пшеницы сорта «Веда». Для этого семена сначала стерилизовали в течение

2-х минут в 70% этаноле и отмывали в стерильной водопроводной воде. За- тем семена замачивали на 30 мин в суспензии бактерий с титром клеток

10 ⁷ ОЕ/мл и раскладывали в стерильные влажные камеры по 20 шт. в 3-х кратной повторности. Контрольные семена замачивали в стерильной водо- проводной воде. Далее растения инкубировали в фитотроне 72 ч при t=28°C.

После инкубирования, измеряли длину корешков и побегов, а ростостимули- рующую активность тестируемых штаммов бактерий рассчитывали по отно- шению к контрольным проросткам. Результаты представлены в таблицах 4, 5.

Таблица 4. Ростостимулирующая активность штаммов ризосферных бактерий на проростках редиса

Из данных, приведенных в Таблице 4 видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 обладает более сильной ростостимулирующей активностью на проростках редиса по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8А. Таблица 5. Ростостимулирующая активность штаммов

ризосферных бактерий на проростках пшеницы

Из данных, приведенных в Таблице 5 видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 обладает более сильной ростостимулирующей активностью на проростках пшеницы по срав- нению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8А. Высокая ростостимулирующая активность штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 предположительно вызвана способ- ностью продуцировать целый ряд витаминов: тиамина (В1), рибофлавина (В2), никотинат (ВЗ), пантотенат (В5), биотин (В7), фолат (В9), кобаламин (В 12), менакуинон (К2) (Таблица 6). Витамины-незаменимые элементы пи- тания, произведенные с помощью различных растений и бактерий 10]. Основная физиологическая роль витаминов состоит в том, чтобы служить в качестве кофакторов в многочисленных метаболических процессах и в ка- честве антиоксидантов. Из восьми известных витаминов группы В, шесть из них были обнаружены в геноме Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 аннотации онтологии KEGG (используя KAAS сервер) и интеллекту- ального анализа генома (Таблица 6). Это: тиамин (В1), рибофлавин (В2), пан- тотенат (В5), витамин В6 (пиридоксин), биотин (В7) и фолат (В9). Кроме того, был обнаружен белок, синтезирующий кобаламин CobW (Ргокка ООЗЮ), который участвует в синтезе витамина В 12, и двух ферментов, участвующих в метаболизме никотината (витамин ВЗ), а именно никотинат-фосфори- бозилтрансфераза (Prokka_02867) и никотинат-нуклеотид-пирофосфори лаза (Prokka_02473). Кроме того, в геноме штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 была обнаружена диметилметакуинонметилтрансфе- раза (Prokka_02063), фермент, который катализирует последний шаг в био- синтезе витамина К2. Эти результаты позволяют предположить, что Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 может быть также способен произво- дить витамины ВЗ, В 12 и К2.

Таблица 6. Витамины в геноме штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 и их биологическая роль

*На основании Учебника бактериологии он-лайн

(http ://textbookofbacteriology .net/nutgro_2.html)

**Ha основании обзора Palacios et al. (2014) Ниже приведен пример получения биопрепарата на основе штамма бакте- рий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 в жидкой форме.

Маточная культура

Для получения маточной культуры штамма бактерий Bacillus amyloliquefa- ciens subsp. plantarum BS89 использовали жидкую питательную среду КСБ (картофельно-сахарозный бульон), для чего сначала готовили картофельный отвар, нарезав 200г очищенного картофеля ломтиками и отварив его в 800мл дистиллированной воды в течение 20 минут, затем отвар отфильтровали через ватно-марлевый фильтр, добавили в него Юг сахарозы и довели значение рН смеси до 7,0.

Полученную жидкую питательную среду разлили в 750 мл - качалочные колбы по 100 мл и стерилизовали 30 минут при 1 атм. Затем провели иноку- ляцию питательной среды в колбах из расчета: 1 пробирка со скошенным пи- тательным агаром (ПА), содержащим чистую культуру Bacillus amyloliquefa- ciens subsp. plantarum BS89 на 1 колбу. После этого колбы поместили на ка- чалку (180 об/мин) и культивировали в течение 48 час. при температуре 2>8°С. Таким образом, в колбах получили маточную культуру Bacillus amyloliquefa- ciens subsp. plantarum BS89 с титром бактерий около 4· 10 ⁹ КОЕ/мл, которая может храниться в холодильнике до 1 месяца при температуре 4-6 °С для по- следующего засева в ферментеры.

Рабочая культура

Рабочую культуру штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. planta- rum BS89 для промышленного культивирования получают в ферментерах на среде с мелассой и кукурузным экстрактом. Норма инокуляции маточной куль-турой 1-3%, продолжительность культивирования - 72 часа при

температуре 33°С. При выращивании рабочих культур допускается

повышение темпе-ратуры до 37°С. Так получили концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 с титром бактерий не менее 1 · 10 ⁹ КОЕ/мл. Жидкая форма микробного препарата на основе штамма Bacillus

amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89

Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 развели стерильной водой в соотношении 1 :10 или 1 :20, в зависимости от получаемого титра концентрата бактериальной суспензии. Полученную жидкую форму выдерживали в тече- ние 3-5 дней при температуре 20-25°С до получения титра бактерий не менее 1 * 10 ⁸ КОЕ/мл препарата, после чего микробный препарат готов к использо- ванию в сельском хозяйстве. Жидкий препарат стерильно разливали в поли- этиленовые бутылки или канистры, предварительно ополаскивая их спиртом.

Срок хранения полученного препарата составляет не менее 24 мес.

Экспериментально установлено, что для эффективного использования штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 в составе различных микробных препаратов, концентрация (количество жизнеспособных клеток и спор) его бактерий должна составлять 10 ⁴ - 10 ⁹ клеток в 1 мл культуральной жидкости, так как использование штамма в концентрации менее 10 ⁴ кл/мл ведет к снижению антагонистического и ростостимулирующего эффекта, а увеличение концентрации свыше 10 ⁹ кл/мл не приводит к его увеличению.

Эффективность микробного препарата, полученного указанным выше способом на основе заявляемого штамма ризосферных бактерий Bacillus ату- loliquefaciens subsp. plantarum BS89, была проверена в вегетационных опытах на озимой пшенице сорта «Веда» и редисе сорта «Дуро Краснодарское»

Для проведения этих опытов сосуды объемом по Зл (для пшеницы и ре- диса) набивали почвой до веса 3,4 кг. Перед посадкой семян почву проливали до полной полевой влагоемкости водопроводной водой объемом 200 мл. Се- мена редиса и пшеницы были предварительно отобраны по размеру, просте- рилизованы и пророщены в стерильных чашках Петри со стерильной филь- тровальной бумагой. Одинаковые по размеру ростки растений поделили на три части. Одну часть ростков в течение 30 мин инокулировали в жидком препарате на осно- ве штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А с титром 10 ⁷ КОЕ/мл, другую часть - в препарате, полученном указанным выше способом на основе заявляемого штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 с титром 10 ⁷ КОЕ/мл, а третью часть проростков обработали стерильной водой (контроль). Через 25 дней провели измерение биомассы растений редиса, а через 30 дней - измерение биомассы растений пшеницы.

Результаты опытов приведены в Таблицах 7 и 8.

Таблица 7. Эффективность штаммов ризосферных бактерий

в вегетационных опытах на пшенице с.«Веда»

Таблица 8. Эффективность штаммов ризосферных бактерий в вегетационных опытах на редисе с.«Дуро Краснодарское»

Вариант опыта : обработка Биомасса Масса плода

биопрепаратом на основе

г % прибавки мм % прибавки штамма бактерий

к контролю к контролю

Контроль (без обработки) 42,5 18,0

Bacillus subtilis 8А (прототип) 50,2 18,1 29,1 61,7

Bacillus amyloliquefaciens subsp. 65,3 53,6 38,5 113,9 plantarum BS89 (заявляемый) Сравнение данных, полученных по результатам вегетационных опытов на пшенице сорта «Веда» и редисе сорта «Дуро Краснодарское», приведенных в таблицах 7 и 8, позволяют сделать вывод, что микробный препарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus ату- loliquefaciens subsp. plantarum BS89, является более эффективным при воздействием на пшеницу и редис по сравнению с микробным препаратом на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А.

Опытным путем было установлено, что для обработки семян сельско- хозяйственных растений оптимальным является применение 10% раствора микробного препарата на основе заявляемого штамма ризосферных бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, а для вегетирующих растений - ( 0,1-3)% его раствор.

Эффективность использования штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 для увеличения продуктивности и качества продукции была проверена в полевых опытах на зерновых, овощных и технических культурах (яровой, озимой пшенице, ячмене, картофеле, капусте, льне, подсолнечнике, сахарной свекле) с применением трех микробных препаратов: Фитоспорина на основе штамма бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128), микробного пре- парата на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А и микробного пре- парата на основе заявленного штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, полученного указанным выше способом.

Полевой опыт с яровой пшеницей районированного сорта «Лада» проводи- ли в Краснодарском крае на почве: чернозем мощный,

среднесуглинистый среднегумусный, гумус по Тюрину - 3,24%, нитратный азот - 8,3 мг/кг, фосфор - 64 мг/кг, калий - 150 мг/кг, рН водная 6,46.

Полевой опыт проводили согласно методике проведения исследований в Географической сети опытов ВИУА (Оценка эффективности микробных препаратов в земледелии / Под ред. Завалина А. А. - М: Россельхозакадемия, 2000г. - 82 с). Посевная площадь делянки 40м ² , учетная - 30 м ² . Повторность опыта четырехкратная. Посев пшеницы проводили на участке, предшествен- ником которой был пар. Фон удобрения - Ν ₆ Ρ ₅ 2 (аммофос). Предпосевная об- работка - культивация на глубину 5-7 см, норма высева яровой пшеницы 5,0 млн. всхожих зерен на гектар.

В день посева часть семян пшеницы ничем не обрабатывали (контроль), другую часть семян обрабатывали жидким биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третью часть се- мян - жидким биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis 8 А (прото- тип), а последнюю часть семян - жидким препаратом на основе штамма бак- терий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, полученным описан- ным выше способом. При этом обработку семян пшеницы проводили из рас- чета на 1 т семян - 1л соответствующего биопрепарата на 9л воды с добавле- нием 20-30г Na-КМЦ - натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Перед посевом проводили культивацию почвы, для чего в нее дополни- тельно вручную вносили минеральные удобрения в виде аммофоса (N ₆ Ps2) согласно схеме опыта, после чего осуществляли посев семян пшеницы с вы- делением определенных посевных зон согласно обработке соответствующим биопрепаратом и зоны контроля.

Некорневую обработку растений проводили в фазу 3-5 листьев и в фазу конца кущения начала выхода в трубку путем их опрыскивания вручную с помощью ранцевого опрыскивателя из расчета 1л соответствующего биопре- парата на 300л воды на гектар.

Агротехника выращивания пшеницы соответствовала зональной технологии. Учет урожая сплошной, поделяночный, произведен комбайном САМПО-130. Урожай приведен к 100% чистоте и 14% влажности. Количество клейковины определяли по ГОСТу 13586.1/68, количество белка - по ГОСТу 10846/91. Статистическая оценка достоверности полученных результатов проведена на основе дисперсионного анализа при 95% уровне значимости. Результаты опыта с яровой пшеницей приведены в Таблице 9. Таблица 9. Влияние штаммов ризосферных бактерий

на урожай и качество зерна яровой пшеницы с. «Лада» (Краснодарский край)

Полевой опыт с озимой пшеницей сорта «Мироновская 808» проводили в Ульяновской области на почве: чернозем выщелоченный среднемощный су- глинистый, среднегумусный, гумус по Тюрину - 2,89%, нитратный азот - 9,5 мг/кг, фосфор - 79 мг/кг, калий - 140 мг/кг, рН водная 6,62.

Посевная площадь делянки 30м ² , учетная - 25 м ² . Повторность опыта че- тырехкратная. Посев пшеницы проводили на участке, предшественником ко- торой был пар. Фон удобрения— N ₆ P ₅₂ (аммофос). Предпосевная обработка— культивация на глубину 5-7 см, норма высева озимой пшеницы 4,8 млн. всхожих зерен на гектар.

В день посева часть семян пшеницы ничем не обрабатывали (контроль), другую часть семян обрабатывали жидким биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третью часть се- мян - жидким биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis 8А (прото- тип), а последнюю часть семян - жидким препаратом на основе штамма бак- терий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, полученным описан- ным выше способом.

При этом обработку семян пшеницы проводили из расчета на 1т семян - 1л соответствующего биопрепарата на 9л воды с добавлением 20-ЗОг Na- КМЦ - натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Во всех вариантах опыта посев проводили при дополнительном внесении минерального удобрения в виде аммофоса (N6P52), который вносили вручную под предпосевную культивацию согласно схемы опыта, после чего осу- ществляли посев семян пшеницы с выделением определенных посевных зон согласно обработке соответствующим биопрепаратом и зоны контроля.

Некорневую обработку растений проводили в фазу кущения и в фазу на- чала выхода в трубку путем их опрыскивания вручную ранцевым опрыскива- телем из расчета 1л соответствующего биопрепарата на 200л воды на 1га.

Агротехника выращивания озимой пшеницы соответствовала зональной технологии. Уборку урожая проводили комбайном САМПО-130. Урожай приведен к 100% чистоте и 14% влажности. Количество клейковины определяли по ГОСТу 13586.1/68.

Статистическая оценка достоверности полученных результатов проведена на основе дисперсионного анализа при 95% уровне значимости.

Результаты опыта с озимой пшеницей приведены в Таблице 10.

ТаблицаЮ. Влияние штаммов ризосферных бактерий на

урожай и качество зерна озимой пшеницы

с. «Мироновская 808» (Ульяновская область)

Полевой опыт с яровым ячменем, сорт «Прерия» проводили в Краснодарском крае на почве: чернозем мощный среднесуглинистый, средне- гумусный, гумус по Тюрину - 3,24%, нитратный азот - 8,3 мг/кг, фосфор - 64 мг/кг, калий - 150 мг/кг, рН водная 6,46. Посевная площадь делянки 40м ² , учетная - 30 м ² . Повторность опыта че- тырехкратная. Посев ячменя проводили на участке, предшественником кото- рой был пар. Фон удобрения - N ₆ P52 (аммофос). Предпосевная обработка - культивация на глубину 5-7 см, норма высева - 4,0 млн всхожих зерен на 1га.

В день посева часть семян ячменя ничем не обрабатывали (контроль), другую часть семян обрабатывали жидким биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третью часть се- мян - жидким биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis 8А (прото- тип), а последнюю часть семян - жидким препаратом на основе штамма бак- терий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, полученным описан- ным выше способом. При этом обработку семян ячменя проводили из расче- та на 1т семян - 1л соответствующего биопрепарата на 9л воды с добавлени- ем 20-30г Na-КМЦ - натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Перед посевом проводили культивацию почвы, для чего в нее дополни- тельно вручную вносили минеральные удобрения в виде аммофоса (N ₆ Ps2) согласно схеме опыта, после чего осуществляли посев семян ячменя с выде- лением определенных посевных зон согласно обработке соответствующим биопрепаратом и зоны контроля.

Некорневую обработку растений проводили в фазу 3-5 листьев и в фазу конца кущения начала выхода в трубку путем их опрыскивания вручную с помощью ранцевого опрыскивателя из расчета 1л соответствующего биопре- парата на 300л воды на 1 гектар.

Агротехника выращивания ярового ячменя соответствовала зональной технологии. Учет урожая сплошной, поделяночный, произведен комбайном САМПО-130. Урожай приведен к 100% чистоте и 14% влажности.

Количество белка определяли по ГОСТу 10846/91.

Статистическая оценка достоверности полученных результатов проведена на основе дисперсионного анализа при 95% уровне значимости.

Результаты опыта с яровым ячменем приведены в Таблице 11. Таблица 11. Влияние штаммов ризосферных бактерий на урожай и качество зерна ярового ячменя с. «Прерия» (Краснодарский край)

Из данных, приведенных в таблицах 9, 10 и 11 следует, что микробный препарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus ату- loliquefaciens subsp. plantarum BS89, оказывает более сильное воздействие на урожайность и качество зерновых сельскохозяйственных культур по сравне- нию с биопрепаратом на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8 А.

Полевой опыт с картофелем сорта «Невский» проводили в Ленинградской области на почве: слабоподзолистая суглинистая, гумус по Тюрину - 2,30%, нитратный азот- 22,1 мг/кг, фосфор- 315 мг/кг, калий- 52 мг/кг, рН водная 5,6

Посадочный материал: отобранные от одной прогретой и перебранной семенной партии картофеля клубни. Масса посадочных клубней 60-70 грамм, глазки наклюнулись. Предшественник: однолетние травы на зеленый корм. Фон удобрений: органические удобрения под картофель не вносили, мине- ральные удобрения вносили под нарезку гребней из расчета Ν ₁₀₀ Ρ _Π0 Κ ₁₃₀ .

Площадь опытной делянки - 50 м ² , площадь учетной делянки - 25 м ² . По- вторность в опыте - четырехкратная. Схема посадки 75 х 30 см, что означает густоту посадки - 44000 штук клубней на 1 гектар. К периоду уборки - гу- стота стояния растений в среднем составляла 43 500 штук на гектар. В день посева часть клубней картофеля ничем не обрабатывали (кон- троль), другую часть клубней обрабатывали жидким биопрепаратом Фито- спорин на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (стандарт), третью часть - жидким биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis 8А (прото- тип), а последнюю часть клубней - жидким препаратом на основе штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, полученным опи- санным выше способом. При этом, предпосадочную обработку клубней кар- тофеля проводили из расчета 1л соответствующего биопрепарата на 9л воды на 1 тонну клубней картофеля.

Посадку картофеля проводили клоновой сажалкой с шириной междуря- дий 75 см и густотой посадки 400 шт. на 100 м ² с выделением посевных зон согласно обработке соответствующим биопрепаратом и зоны контроля.

Уход за растениями: междурядные обработки - две довсходовые и одна послевсходовая; опрыскивание растений гербицидом: Титус (0,03 кг/га) + Тренд (0,2 кг/га) и инсектицидом Актара, ВДГ (0,06 кг/га), штанговой аппа- ратурой ОН-600 с нормой расхода рабочей жидкости 300 л/га. Опрыскивание растений в каждой из выделенных зон проводили вручную с помощью ран- цевого опрыскивателя раствором соответствующего биопрепарата из расчета - 1л биопрепарата на 300л воды на гектар: первое - в фазе полных всходов, второе - в фазе бутонизации. Предуборочное скашивание ботвы: БД-4-7.

Уборка урожая: картофелекопателем ТН-2Б с подбором клубней вручную.

Результаты опыта с картофелем приведены в Таблице 12.

Таблица 12. Эффективность применения штаммов ризосферных бактерий в полевых опытах с картофелем

с. «Невский» (Ленинградская область)

Вариант Урожай Прибавка

картофеля, ц/га ц/га %

Контроль 191 - -

Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128

(Фитоспорин - стандарт) 217 26 13,6

Bacillus subtilis 8 А (прототип) 225 34 17,8

Bacillus amyloliquefaciens subsp.

plantarum BS89 (заявляемый) 251 60 31,4 Полевой мелкоделяночный опыт с капустой белокочанной сорта «Пода- рок» проводили в Ленинградской области на почве: подзолистая суглини- стая, гумус по Тюрину -3,50%, нитратный азот- 30,5мг/кг, фосфор- 280 мг/кг, калий- 40 мг/кг, рН водная 6,0.

Для получения рассады семена капусты белокочанной сорта «Подарок» высевали в ящики с торфо-минеральным субстратом. Субстрат для набивки ящиков готовили следующим образом: дерново-подзолистую супесчаную по- чву опытного поля ГНУ ВНИИСХМ (30%) смешали с торфяным грунтом мар- ки «Терравита», производства ЗАО МН1111 «Фарт» (50%) и отмытым кварце- вым песком (20%), куда добавили раствор азофоски из расчета 100% NPK. Полученный субстрат перемешали и набили в 4 ящика по 10кг в каждый.

Для капусты в опыте использовали 0,1% раствор биопрепаратов: на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (Фитоспорин - стандарт); на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А; на основе заявляемого штамма бак- терий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, полученного описан- ным выше способом. В каждый из трех ящиков вносили по 1л 0,1% раствора одного из указанных биопрепаратов, в четвертый ящик - воду (контроль).

«Школку» капусты выращивали в теплице при температуре 15-20°С. Пи- кировку растений проводили в фазе 2-3 настоящих листьев в торфяные гор- шочки объемом 0,5 литра с грунтом.

При этом, одновременно с посадкой растений капусты из определенного ящика в торфяные горшочки, в лунки вносили 0,1% раствор того же препара- та, который прежде вносили в его субстрат (в контроле - воду), в количестве 1мл раствора на растение. Повторность выращивания рассады - 30-кратная. Затем рассаду в фазе 4-5 настоящих листьев вместе с комом грунта выса- живали на постоянное место в почву с выделением зон посадки в соответ- ствии с обработкой одним из указанных биопрепаратов или водой. Размер де- лянок 5м ² , расстояние между рядками 50см, между растениями в рядке 35см. Агротехника выращивания капусты общепринятая. Для борьбы с вредителя- ми растения дважды обрабатывали 0,15% раствором инсектицида димофоса (40% эмульсия), а также проводили подкормку минеральными удобрениями: через 3 нед. после высадки рассады N35P20K30 и в фазу розетки листьев зоР2оКз ₅ .

В процессе вегетации в каждой выделенной зоне посева согласно способу предыдущей обработки одним из биопрепаратов, дважды проводили опрыс- кивание растений 0,5% раствором соответствующего биопрепарата из расчета 2 л/га (2л на 400л воды на 1га) ручным ранцевым опрыскивателем SOLO-456. Контроль - без опрыскивания. Повторность опыта четырехкратная.

Результаты опыта с капустой представлены в Таблице 13. Таблица 13. Эффективность применения штаммов ризосферных бактерий в полевых опытах с капустой белокочанной с. «Подарок» (Ленинградская область)

Из данных, приведенных в таблицах 12 и 13 следует, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus amyloliquefa- ciens subsp. plantarum BS89, оказывает более сильное воздействие на урожайность (продуктивность) овощных сельскохозяйственных культур по сравнению с биопрепаратом на основе штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А.

Полевые опыты на сахарной свекле сорта «Рамонская односеменная 47» проводили в учебно-опытном хозяйстве Башкирского государственного аг- рарного университета, Республика Башкортостан на почве: выщелоченный чернозем. Содержание гумуса в почве - 5,8%, реакция среды рН 6,5, содер- жание фосфора по Чирикову - 91,1 мг/кг, содержание калия по Чирикову - 130,8 мг/кг. Сумма поглощенных оснований достаточно высокая 54-56 мг/экв., степень насыщенности основаниями - 96-98 %. Норма высева семян - около 5,5 кг/га. Густота стояния растений к уборке 80 тыс. шт/га. Способ посева сахарной свеклы - широкополосный, ширина междурядий - 45 см, стыковых - 50 см. Оптимальная глубина посева семян в почву 3-4 см. Площадь опытной делянки - 50 м ² , площадь учетной делянки - 25 м ² . Повторность опыта четырехкратная.

Вся площадь посева сахарной свеклы выла поделена на четыре зоны. В каждой выделенной зоне обработку посевов сахарной свеклы проводили 0,5% раствором одного из биопрепаратов: на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ (Фитоспорин - стандарт); на основе штамма - прототипа Bacil- lus subtilis 8А; на основе заявляемого штамма бактерий Bacillus amyloliquefa- ciens subsp. plantarum BS89, полученного описанным выше способом, в кон- троле - без обработки.

Обработку проводили путем опрыскивания растений в каждой из выде- ленных зон посева 0,5% раствором одного из указанных биопрепаратов из расчета 2л биопрепарата на 400л воды на гектар с помощью ручного ранцевого опрыскивателя SOLO-456 дважды: в фазе 4-6 настоящих листьев и в фазе смыкания ботвы в рядках. Контроль без опрыскивания. Повторность четырехкратная.

Результаты опыта с сахарной свеклой представлены в Таблице 14.

Таблица 14. Эффективность применения штаммов ризосферных бактерий в полевых опытах с сахарной свеклой с. «Рамонская односеменная 47» (Башкортостан)

Вариант опыта Урожай сахарной Прибавка урожая

(штамм бактерий)

свеклы, ц/га Ц %

Контроль (без обработки) 290 - -

Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин) 322 32 11,0

Bacillus subtilis 8 А (прототип) 331 41 14,1

Bacillus amyloliquefaciens subsp. 355 65 22,4 plantarum BS89 (заявляемый) Полевые опыты на подсолнечнике масличном и льне масличном проводили в Ставропольском крае на почве: чернозем среднемощный, среднесуглинистый, среднегумусный, гумус по Тюрину - 3,71%, нитратный азот - 6,2 мг/кг, фосфор -75 мг/кг, калий - 180 мг/кг, рН водная 7,15. Агротехника: предшественник яровой ячмень, подсолнечник и лен высевали сеялкой точного высева СКС-610 с порционным высевающим агрегатом.

Варианты опыта предполагали посев семян льна и подсолнечника без обработки (контроль) и с обработкой семян биопрепаратами: Фитоспорином (на основе штамма Bacillus subtilis 128), препаратом на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8 А и препаратом на основе заявляемого штамма Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 из расчета 2,0 л/т, а также с обработкой этими биопрепаратами растений по вегетации из расчета 1 ,0 л/га.

Опыт мелкоделяночный, посевная площадь делянки 30м ² , учетная - 25 м ² . Повторность опыта четырехкратная. Уборку семян льна и подсолнечника проводили малогабаритным комбайном «Винтерштайгер» и определяли урожай во всех вариантах опыта.

Результаты опытов приведены в Таблицах 15 и 16.

Таблица 15. Эффективность применения штаммов ризосферных бактерий в полевых опытах с масличным льном (Ставропольский край)

Вариант опыта (препараты на Урожай семян Прибавка урожая основе штамма бактерий) льна, ц/га

Ц %

Контроль (без обработки) 7,0 - -

Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин) 8Д 1,1 15,7

Bacillus subtilis 8А (прототип) 8,5 1,5 21,4

Bacillus amyloliquefaciens subsp. 1 1 ,3 4,3 61,4 plantarum BS89 (заявляемый) Таблица 16. Эффективность применения штаммов ризосферных бактерий в полевых опытах с масличным

подсолнечником (Ставропольский край)

Из данных, приведенных в таблицах 14, 15 и 16 следует, что биопрепарат, полученный на основе заявленного штамма бактерий Bacillus amyloliquefa- ciens subsp. plantarum BS89, обладает более сильным воздействием на урожайность (продуктивность) технических сельскохозяйственных культур: сахарной свеклы, льна, подсолнечника по сравнению с биопрепаратом на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А.

Т.е. результаты испытаний биопрепарата, созданного на основе штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89, подтвердили в по- левых опытах эффективность его применения для повышения урожая при воз- делывании таких сельскохозяйственных культур, как: пшеница, ячмень, кар- тофель, капуста, сахарная свекла, лен, подсолнечник, что доказывает перспек- тивность его использования в сельском хозяйстве. Таким образом, штамм ризосферных бактерий Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 является пригодным для использования в сельском хозяйстве в качестве эффективного средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микро- организмами, и расширяет арсенал подобных средств. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ongena М, Jourdan Е, Adam A, Paquot М, Brans A, Joris В, Arpigny JL, Thonart P. 2007. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environ Microbiol 9: 1084-1090.

2. Malfanova N, Franzil N, Lugtenberg B, Chebotar V, Ongena M. 2012. Cyclic lipopeptide profile of the plant-beneficial endophytic bacterium Bacillus subtilis C8.Arch Microbiol 194: 893-899.

3. Bais HP, Fall R, Vivanco JM. 2004. Biocontrol of Bacillus subtilis against infec- tion of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol 134:307-319.

4. Kloepper J, Leong J, Teintze M. and Schroth MN. 1980. Pseudomonas sideropho- res: a mechanism explaining disease suppressive soils. Current Microbiology 4: 317-320.

5. Chen X.-H., R. Scholz, M. Borriss, H. Junge, G. Mogel, S. Kunz, and R. Borriss. 2009. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease. J. Biotechnol. 140:38-44.

6. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, et al. 2007.

Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat Biotechnol 25: 1007-1014.

7. Scholz R, Molohon KJ, Nachtigall J, Vater J, Markley AL, Sussmuth RD, Mitchell DA, BorrissR. 201 1. Plantazolicin, a novel microcin B17/streptolysin S-like natural product from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. J Bacteriol.193: 215-224.

8. Molohon, K.J.; Melby, J.O.; Lee, J.; Evans, B.S.; Dunbar, K.L.; Bumpus, S.B.; Kelleher, N.L.; Mitchell, DA. "Structure determination and interception of biosynthetic intermediates for the plantazolicin class of highly discriminating antibiotics." ACS Chem. Biol., 6:1307-1313 (2011). doi:10.1021/cb200339d

9. He P, Hao K, Blom J, Riickert C, Vater J et al. 2013. Genome sequence of the plant growth promoting strain Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum B9601-Y2 and expression of mersacidin and other secondary metabolites. J Biotechnol 164: 281-291

10. Palacios OA., Bashan Y, de-Bashan LE. 2014. Proven and potential involvement of vitamins in interactions of plants with plant growth-promoting bacteria: an overview.

Biol. Fertil. Soils 50: 415-432.