短双歧杆菌及食品中甲胺磷农药残留的检测方 法 技术领域 本发明涉及甲胺磷农药的微生物检测领域， 涉及一种短双歧杆菌菌株 及以该菌株为工作菌株进行食品中甲胺磷农药 残留检测的方法。 背景技术

食品是人类赖以生存和发展的物质基础， 农药残留超标已成为我国当 前食品安全的突出问题之一。 仅 2010年以来， 我国发生"海南毒豇豆"、 "青 岛检出 1930 千克韭菜农药超标"等一系列农药残留引发的� �品安全事件； 我国每年因食品中农药残留量超标造成的中毒 事件屡屡发生， 因此， 对食 品中农药残留及时、 准确地分析检测事关重大， 建立快速、 简便、 安全、 准确的农药残留检测技术是食品安全发展的必 然需求。

甲胺磷是一种高效、 持效期长、 内吸性强的广谱性的有机磷杀虫剂， 适用于蔬菜、 茶树、 水稻、 小麦等作物， 能有效防治多种害虫。 但甲胺磷 的过量使用， 使其在蔬菜水果中高残留， 给人们的健康带来巨大的威胁， 因此我国已限量使用， 检测食品中甲胺磷残留量列为残留监控重点。

目前， 针对食品甲胺磷农药残留一般有气相色谱法 (GC)、 高效液相色 谱法 (HPLC)、 分光光度计、 化学发光法、 酶抑制法、 毛细管电泳技术 (CE) 等。 用上述方法检测存在仪器设备复杂、 样本前处理和测定搡作繁瑣的缺 陷， 设备成本大， 检测费用高， 对检测人员的要求也高， 不适合大量样本 筛检， 不利于在基层食品检测部门推广应用。 开发一种操作方便、 费用低、 可靠、 可用大量检测样品中甲胺磷的检测方法势在必 行。 而其首要一环是 筛选一种对甲胺磷普遍敏感且敏感性稳定、 检测限低、 生长迅速地指示菌。

替换页 则第 26条) 迄今为止， 尚无筛选出甲胺磷敏感性高、 特异性高的双歧杆菌工作菌株及 其在食品中甲胺磷残留检测应用的相关报道。 发明内容

有鉴于此， 本发明的目的是筛选出不易受杂菌污染影响并 对甲胺磷农 药敏感的双歧杆菌菌株， 并据此建立一种简单、 快速、 灵敏度高、 能够普 遍推广应用的以该菌株为工作菌株进行食品中 甲胺磷农药残留检测的方 法， 该方法釆用甲胺磷对发酵的抑制作用来确认食 品样品中是否含有的甲 胺磷残留， 可以有效地检测食品中残留的甲胺磷农药。

为解决上述技术问题， 本发明提供一株对甲胺磷敏感性高并应用于甲 胺磷检测的短双歧杆菌 （Bifidobacterium breve) LJM-006 CGMCC No.5418。

本发明的短双歧杆菌 （Bifidobacterium breve) LJM-006, 于 2011年 10 月 28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普� ��微生物中心， 其简称为 CGMCC (地址： 北京巿朝阳区北辰西路 1号院 3号 中国科学院微生物研究 所， 邮编 100101)保藏， 分类命名为短双歧杆菌 （Bifidobacterium breve), 保 藏编号为 CGMCC No.5418。

本发明的短双歧杆菌 LJM-006分离于一名浙江省健康青年人粪便中。 本发明的短双歧杆菌 LJM-006菌株具有下述微生物学特征：

(1)菌落形态： LJM-006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色， 不透明、 有光泽、 表面光滑、 凸起、 质地软、 边缘整齐， 直径 l-1.5mm;

(2)个体形态： 为不规则 G+无芽孢杆菌， 有直杆、 弯杆、 火柴头状、 哑 铃形状和大雁状， 其中以大雁状为主；

( ³ )生理生化特征: D-核糖（ + ); L-阿拉伯糖（ - );乳糖（ + );纤维二糖（ - ); 松三糖 ( + );棉籽糖（ + ); 山梨醇（- )； 淀粉 ( -）； 葡萄糖酸钠（-）； 木糖（-）； 甘露糖（ + ); 果糖（ + ); 半乳糖（ + ); 蔗糖（ + ); 麦芽糖（ + ); 海藻糖（- )； 密二糖（ + ); 甘露醇（ + ); 菊糖（- )； 水杨素（-）； F0PPK酶（ + ); 对氧的反

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替换页（细则第 26条） 应 (在好气固体培养基上不生长)； 硝酸盐还原（-）； 触酶（-）； 靛基质反应 ( - )；

(4)厌氧下生长良好， 有氧环境中不生长。 最适生长温度 37-41°C ; 最低 生长温度 25-28°C；最高 43-45°C；生长最适 pH 6.5-7.0;在 pH4.5-5.0或 8.0-8.5 不生长。

LJM-006菌株与同属同种标准菌株相比对甲胺磷� �感性提高了 100倍 以上。

本发明还提供一种食品中甲胺磷残留的检测方 法， 所述方法包括以下 步骤：

(1)菌株活化： 将上述短双歧杆菌 LJM-006菌株接种于营养琼脂斜面培 养基上， 调节该培养基的 pH值至 6.8~7.2， 于 35~37°C下进行优化培养， 并 进行转种继代培养；

(2)菌悬液制备： 取步骤 (1)所得短双歧杆菌 LJM-006接种于营养琼脂斜 面培养基， 35 ± 2°C厌氧培养 24小时， 用灭菌生理盐水将菌苔洗下， 制成 悬液， 调整其 OD ₆ oo值至 0.25~0.35， 置 2-8°C冰箱中保存；

(3)检测管制备： 以重量计， 取蛋白胨 10g, 牛肉膏 10g， 酵母膏 5g， 葡萄糖 20g， 乙酸钠 5g, K ₂ HP0 ₄ 2g, MgS0 ₄ -7 H ₂ 0 0.5g, MnS0 ₄ -4H ₂ 0 0.2g, 低聚果糖 3g, 柠檬酸二铵 2g， 吐温 -80 1mL, 蒸馏水 1L， 加热溶解校正 pH 值至 6.5, 115°C高压灭菌 15-20分钟，冷却温度为 50~65°C ,并迅速取 10 mL 上述液体， 注入 10 mL试管内， 作为检测管， 于 0~4°C下直立静置， 密封 后 0~4°C下保存、 备用；

(4)绘制标准曲线并建立回归方程： 选择浓度为 Omg L、 0.25mg L、 0.5 mg/L、 1.0 mg/L, 1.5 mg/L、 2.0 mg/L, 4.0 mg/L的甲胺磷标准品溶液，' 其中 Omg/L为阴性对照。取以上标准品溶液 20~100μL加入所述检测小管内， 37°C厌氧培养 8~12h， 测定样品反应管和阴性对照反应管的 OD _5W) 值； 测定

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替换页 (细则第 26条) 样品反应管和阴性对照反应管的 OD ₅ 。 _Q 值的具体步骤为： ①收集菌体： 取步 骤 (2)所得菌悬液 30 mL于各离心管中， 4°C、 8， 000 r/min离心 10 min， 弃 上清液、 收集菌体， 用 pH 6. 5的 PBS缓冲液洗涤菌体 2次； ②菌体破碎： 离心管中加 0.7 mL、 pH 6.5的 PBS和 0.3 mL、 0.45% (质量体积比， W/V) 的 CTAB, 混匀， 作用 10 min， 结束后放置冰上备用； ③取上述步骤②菌体 破碎后液体， 即粗酶液 0.25 mL加入各 0.25 mL的 NaF (3 g/L)、 碘乙酸钠 (5 g/L)和果糖 -6-磷酸二钠 (80 g/L)， 混匀， 置于 37'C下孵育 30 min; ④结束后， 加入 1. 5 mL的盐酸 -羟胺 (130 g/L)， 混匀， 室温静置 lO min; ⑤然后加入各 l mL的 TCA(15%, 质量体积比)、 HC1(4 mol/L)和 FeCl ₃ (5%, 质量体积比， 用 0. l mol/LHCl配制）， 混匀， 4° (：、 10， 000 r/min离心 15 min后， 用 722 分光光度计测定 OD值， 检测光的波长为 500 nm, 阴性对照反应管以蒸馏 水代替， 其余操作同上。 B/B ₀ ( B值为样品反应管的 OD ₅₀₀ 值， Bo值为阴性 对照反应管的 OD _5(K) 值）为纵坐标 Y, 甲胺磷浓度的对数值为横坐标 X (单 位是 mg/L ), 绘制标准曲线， 建立甲胺磷含量与 B/ B ₀ 的线性回归方程： Y= - 24.68Χ + 66.72 , 甲胺磷的线性范围为 0.01~100mg/L， 检测下限达到 O.lmg/L, R ² 为 0.9902;

(5)样品前处理： 取待检的食品样品匀浆组织 5g， 用无菌 1%磷酸盐缓 冲液（酸度为 pH6.0~7.2 ) 20 mL稀释， 漩涡混匀， 于 80°C水洛加热 5 min， 冷却后于 5, 000 r/min离心 15 min， 取上清液作为供试样品液；

(6)样品检测： 取步骤 (5)所得供试样品液 20〜100μί加到所述检测小管 中， 密闭封口后于 35 ± 2°C厌氧培养 8〜10小时， 并测定样品反应管和阴性 对照反应管的 OD ₅₀₍₎ 值， 根据所得各样品的 B/Bo值在标准曲线上求出其对 应的甲胺磷质量浓度， 或代入步骤 (4)所得回归方程计算样品质量浓度的对 数值 X， 求其反对数， 即为样品中所含甲胺磷的质量浓度。

果糖 -6-磷酸酮解酶 (F6PPK)是双歧杆菌属的双歧代谢途径中的特征� �

替换页 (细则第 26条) 酶， 通过特异的"果糖 -6-磷酸支路" (又称为双歧支路)对葡萄糖进行发酵， 这 与其它细菌利用醛缩酶和葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶明显不同。 该酶催化果糖 6- 磷酸盐分解为乙酰磷酸盐和 4-磷酸赤藓糖。 葡萄糖不经过糖酵解途径而经 过 F6PPK酶进行双歧代谢途径最终生成乳酸和醋酸� �� 即双歧支路、 果糖 -6- 磷酸支路， 该酶已广泛应用于双歧杆菌的鉴定与活菌计数 。

本发明的工作菌株为短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)LJM-006, 已于 2011年 10月 28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微� ��物中心保藏， 保藏编号为 CGMCC No.5418。

本发明所述的食品样品包括： 白菜、 茄子、 黄瓜、 南瓜、 冬瓜、 苹果、 梨子、 桃子等蔬菜水果。

本发明使用的标准曲线回归方程是通过下述的 方法得到的:利用甲胺磷 的标准储备液配置浓度分别为 0.25mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L, 1.5mg/L、 2.0mg/L、 4.0 mg/L的标准溶液， 其中 Omg/L为阴性对照。 取以上标准品溶 液 20 L加入检测小管内， 37°C厌氧培养 8~12h， 测定样品反应管和阴性对 照反应管的 OD ₅ Q()值（F6PPK酶活）， 以 F6PPK酶活抑制率 B/Bo ( B值为 样品反应管的 OD ₅ 。。值， B。值为阴性对照反应管的 OD ₅ 。 _Q 值）为纵坐标 Y， 甲胺磷浓度的对数值为横坐标 X, 绘制标准曲线， 得到了标准曲线回归方 程 Υ= - 24.68χ + 66.72 ( Υ: Β/ Β。比值， Β值为样品反应管的 OD ₅₀₀ 值， B ₀ 值为阴性对照反应管的 OD ₅₀₀ 值， X： 食品中所含有甲胺磷的对数浓度， 其 单位是 mg/L )， 线性范围为 0.01~100mg/L， R ² 为 0.9902。

本发明方法中， 重复四次测定甲胺磷含量己知的蔬菜或水果样 品， 计 算其相对标准偏差为 7.80， 表明本发明方法的检测精确度较高。

考察本发明方法的回收率， 加入 4(^L、 100mg/L的甲醛标准溶液于甲 胺磷含量己知的蔬菜或水果样品中， 重复分析四次， 经计算得到的回收率 为 85. 94。

替换页（细则第 26条） 通过测定甲胺磷最低浓度的定量溶液， 得到本发明方法的最低检测限 为 0.1mg/L。

本发明具有以下优点及效果：

(1)本发明短双歧杆菌 LJM-006具有以下特点： ①对甲胺磷敏感性高、 特异性好； ②菌株稳定性好； ③专性厌氧菌， 发酵过程中不易受杂菌污染 影响；

(2)本发明方法的原理是基于甲胺磷农药对双歧 杆菌具有抑制作用， 并 利用特性， 双歧杆菌对样品进行发酵处理， 跟踪发酵过程， 根据其发酵特 性来判断样品中有无甲胺磷农药的残留； 该检测判断方法经济、 简便、 快 捷、 准确， 适合食品质量安全控制， 实用性非常强；

(3)本发明样品前处理简单， 能同时筛检大量食品样品；

(4)本发明检测方法简便易行， 具有灵敏度高， 精确度高等特点， 回收 率均大于 70%, 变异系数在 10%以内， 符合食品甲胺磷残留筛检的准确度 和精密度要求， 完全适合食品中甲胺磷残留的检测。 附图说明

图 1为甲胺磷检测的标准曲线。 具体实施方式

应该指出， 以下具体说明都是例示性的， 旨在对本发明提供进一步的 发明。 除非另有说明， 本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明 所属 技术领域人员通常理解的相同含义。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 但所举实施例不作为对 本发明的限定。 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人 员所熟知的常规手段，

实施例 1: 短双歧杆菌 LJM-006菌株的分离与鉴定 替换页 (细则第 26条) 以一名浙江省健康青年人的粪便作为分离样品 ，在 MRS琼脂培养基上， 37Ό厌氧条件下， 48h 涂布分离培养， 获得本发明所述的短双歧杆菌 LJM-006, 鉴定为短双歧杆菌， 该菌株已于 2011年 10月 28日在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (地址： 北京巿朝阳区北辰西路 1号 院 3号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)保藏， 分类命名为短双歧 杆菌 （Bifidobacterium breve), 保藏号为 CGMCC No.5418。

MRS琼脂培养基的配方： 蛋白胨 10g, 牛肉膏 10g， 酵母膏 5g， 葡萄 糖 20g， 乙酸纳 5g， K ₂ HP0 ₄ 2g， MgS0 ₄ · 7 H ₂ 0 0.5g, MnS0 ₄ · 4H ₂ 0 0.2g, 低聚果糖 3g， 柠檬酸二铵 2g， 吐温 -80 1mL， 琼脂 15g， 蒸馏水 1L， 调 pH 至 7.0， 115°C灭菌 15分钟。

本发明的 LJM-006菌株具有下述微生物学特征：

(1)菌落形态： LJM-006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，� �透明、 有光泽、 表面光滑、 凸起、 质地软、 边缘整齐， 直径 l-1.5mm;

(2)个体形态： 为不规则 G+无芽孢杆菌， 有直杆、 弯杆、 火柴头状、 哑 铃形状和大雁状， 其中以大雁状为主；

(3)生理生化特征: D-核糖（ + ); L-阿拉伯糖（ + );乳糖（ + );纤维二糖（ - ); 松三糖（ + );棉籽糖（ + ); 山梨醇（-）； 淀粉 ( - )； 葡萄糖酸钠（-）； 木糖（ + ); 甘露糖（-）； 果糖（ + ); 半乳糖（ + ); 蔗糖（ + ); 麦芽糖（ + ); 海藻糖（- )； 密二糖（ + ); 甘露醇（ + ); 菊糖（- )； 水杨素（- )； F0PPK酶（ + ); 对氧的反 应 (在好气固体培养基上不生长)； 硝酸盐还原（-）； 触酶（-）； 靛基质反应

( - )；

(4)厌氧下生长良好， 有氧环境中不生长。 最适生长温度 37-41 'C ; 最低 生长温度 25-28°C；最高 43-45Ό；生长最适 pH 6.5-7.0;在 pH4.5-5.0或 8.0-8.5 不生长。

试验 1: 敏感性试验

替换页 (细则第 26条） 采用纸片琼脂扩散 (K-B)法， 选取不同浓度的甲胺磷标准液， 以改良 MRS琼脂培养基， 培养基配方见实施例 1， 以本发明短双歧杆菌 LJM-006 为测试菌， 置于 37°C培养箱中厌氧培养 24h后观察 LJM-006菌株的生长情 况， 用纸片琼脂扩散法做甲胺磷敏感性试验， 测定甲胺磷对 UM-006菌株 的抑菌性能。

上述试验做 3 次重复， 以同属同种的短双歧杆菌标准菌株为对照， 见 表 1。

表 1 : 敏感性试验

试验结果： 本发明短双歧杆菌 LJM-006对甲胺磷具有高度的敏感性， 其与同属标准菌株相比， 对甲胺磷的敏感性提高了 100倍以上， 短双歧杆 菌 LJM-006的甲胺磷敏感度< 0.1111^， 低于国家标准的残留量， 完全可以 作为筛检甲胺磷残留的工作菌株。

实施例 2: 青菜样品甲胺磷残留的检测

(1)菌株活化： 将上述短双歧杆菌 LJM-006菌株接种于营养琼脂斜面培 养基上， 调节培养基的 pH值 6.8〜7.2， 于 35~37°C下进行优化培养， 并进行 转种继代培养；

(2)菌悬液制备： 取步骤 (1)所得短双歧杆菌 LJM-006接种于营养琼脂斜 面培养基， 35 ± 2°C厌氧培养 24小时， 用灭菌生理盐水将菌苔洗下， 制成 悬液， 调整其 OD ₆₀₀ 值至 0.25~0.35， 置 2-8°C冰箱中保存；

(3)检测管制备： 以重量计， 取蛋白胨 10g， 牛肉膏 10g, 酵母膏 5g, 葡萄糖 20g， 乙酸钠 5g, K ₂ HP0 ₄ 2g, MgS0 ₄ '7 H ₂ 0 0.5g， MnS0 ₄ -4H ₂ 0 0.2g, 低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，吐温 -80 lmL,蒸馏水 1L，加热溶解校正 pH6.5，

替换页 (细则第 26条) 115°C高压灭菌 15-20分钟， 冷却温度为 50~65°C， 取 10 mL上述液体， 注 入 10 mL试管内，作为检测管，于 0~4°C下直立静置，密封后 0~4°C下保存、 备用；

(4)绘制标准曲线并建立回归方程： 选择浓度为 Omg/L、 0.25mg/L、 0.5 mg L, 1.0 mg/L、 1.5 mg/L, 2.0 mg/L、 4.0 mg/L的甲胺磷标准品溶液， 其中 Omg/L为阴性对照。取以上标准品溶液 20ML加入检测小管内， 37°C厌 氧培养 8-12h， 测定样品反应管和阴性对照反应管的 0D ₅₍₎ 。值； 测定样品反 应管和阴性对照反应管的 0D _5Q 。值的具体步骤为： ①收集菌体： 取 30 mL 于各离心管中， 4°C、 8， OOO r/min离心 10 min， 弃上清液、 收集菌体， 用 pH 6.5的 PBS缓冲液洗涤菌体 2次； ②菌体破碎： 离心管中加 0.7 mL、 pH 6.5的 PBS和 0.3 mL、 0.45% (质量体积比， W/V)的 CTAB, 混匀， 作用 10 min,结束后放置冰上备用；③取上述步骤②菌� �破碎后液体，即粗酶液 0.25 mL加入各 0.25 mL的 NaF (3 g/L)、 碘乙酸钠 (5 g/L)和果糖 -6-磷酸二钠 (80 g/L)， 混匀， 置于37 下孵育30 1^1； ④结束后， 加入 1. 5 mL的盐酸-羟 胺 (130 g/L)， 混匀， 室温静置 10 min; ⑤然后加入各 1 mL的 TCA(15%, 质量体积比)、 HCl(4 mol/L)和 FeCl ₃ (5%， 质量体积比， 用 0.1 mol/L HC1配 制）， 混匀， 4°C、 10， OOO r/min离心 15 min后， 用 722分光光度计测定 OD 值， 检测光的波长为 500 nm, 阴性对照反应管以蒸馏水代替， 其余操作同 上。 B/B _Q ( B值为样品反应管的 0D ₅ 。 _Q 值， B。值为阴性对照反应管的 0D ₅ 。。 值）为纵坐标 ¥， 甲胺磷浓度的对数值为横坐标 X， 绘制标准曲线， 建立 甲胺磷含量与 B/ B ₀ 的线性回归方程： Y= - 24.68x + 66.72, 甲胺磷的线性 范围为 0.01~100 mg/L, 检测下限达到 0.1 mg/L, R ² 为 0.9902;

(5)样品前处理： 取待检的青菜匀浆组织 5g， 用无菌 1%磷酸盐缓冲液 20 mL稀释， 漩涡混匀， 于80°(：水浴加热5 1^11， 冷却后于 5， OOO r/min离 心 15 min， 取上清液作为供试样品液；

替换页 (细则第 26条) (6)样品检测： 取步骤 (5)所得供试样品液 20〜100 L加到所述检测小管 中， 密闭封口后于 35 ± 2°C厌氧培养 8~10小时， 并测定样品反应管和阴性 对照反应管的 OD ₅ 。。值， 根据各样品的 B/B。值在标准曲线上求出其对应的 甲胺磷质量浓度， 或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值 X, 求其反 对数， 即为样品中所含甲胺磷的质量浓度； 其中， X也是食品中所含有甲 胺磷质量浓度的对数值， 其单位是 mg L， 抑制率为 50%时对应的甲胺磷质 量浓度是 5.2mg/L。 甲胺磷的线性范围为 0.01~100 mg/L, 检测下限达到 0.1 mg/L, R ² 为 0.9902。

试验 1 : 假阴性率试验

称取均质的农药空白食品样品各 5g， 加入甲胺磷标准液， 使食品中甲 胺磷浓度 lmg L， 测定方法同实施例 2， 重复测定 100次， 观察阴性结果出 现的概率， 计算假阴性率。

试验结果： 黄瓜中甲胺磷残留为 lmg L时， 假阴性率为 0; 冬瓜中甲 胺磷残留为 lmg L时， 假阴性率为 2%。

试验 2: 稳定性试验

按实施例 2中的方法制备好检测小管于 4°C下依次保存 1周、 2周、 3 周、 4周， 分别进行检测并记录其阴性检测时间， 10小时、 10小时、 10小 时、 10.5 小时， 阴性检测时间会随着时间的延长有所变化， 阴性检测时间 变化较小， 说明稳定性好。 为了保证试验的准确性， 每次试验应做一阴性 对照， 其准确地检测判定时间以阴性对照为准。 本发明方法检测食品中甲 胺磷农药残留的稳定性前 3周都稳定在 10小时， 到第 4周为 10.5小时，所 以此方法的检测稳定性为一个月。

试验 3: 检测限的确定

分别用含不同浓度 (0.1 mg/L、 0.25 mg/L, 0.5 mg/L、 l mg/L, 1.5 mg/L, 2 mg/L、 4 mg/L)甲胺磷标准品的 PBS溶液作为待测样品液， 滴加于测试管

替换页 (细则第 26条) 中， 进行样品检测， 分析检测结果， 确定本发明检测方法的检测限为

0.1mg/L。

试验 4: 线性相关性研究

选择浓度为 0 mg/L、 0.25 mg/L、 0.5 mg/L、 1.0 mg/L、 1.5 mg/L、 2.0 mg/L、 4.0 mg/L 的甲胺磷标准品溶液， 按以上步骤， 进行处理后再按步骤， 制作 标准曲线， 得回归方程 Y= - 24.68x + 66.72 ( Y是 B/ B ₀ 比值， B值为样品 反应管的 OD ₅₍₎₍₎ 值， Bo值为阴性对照反应管的 OD ₅₀₍₎ 值， X是食品中所含有 甲胺磷的对数浓度， 其单位是 mg/L)， 其线性相关系数 r = 0.9902， 完全满 足对精密度的要求。 具体标准曲线如图 1 所示。 经过研究， 甲胺磷样品在 0.01~100mg/L的浓度范围内保持较高的相关线性。

试验 5: 回收率测定

将甲胺磷标准品以终浓度分别为 0.5 mg/L、 1.5 mg/L、 2 mg/L添加到青 菜样品和小白菜样品、 按以上实施例 2步骤测定其含量， 测定结果如表 2， 青菜样品的回收率在 78.5%~91.2%， 平均 82.5%， 变异系数在 3.6%~9.3%， 平均 7.7%; 小白菜样品的回收率在 81.5%~105.7%， 平均 89.5%， 变异系数 在 4.2%~9.4%， 平均 8.1%; 平均变异系数均小于 15%， 表明本发明检测方 法具有较高的准确度。 其平均回收率为 99.11%， 相应的回收率的标准偏差 ^80)>为 0.23, 其完全符合定量分析方法的精密度要求。

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替换页 (细则第 26条) 表 2 甲胺磷添加回收试验

试验 6: 精密度测定

将甲胺磷标准品以终浓度分别为 0.5 mg/L、 1.5 mg/L、 2 mg/L添加到青 菜样品和小白菜样品、 按以上实施例 2步骤测定其含量， 结果见表 3， 青菜 样、 小白菜样的平均批内变异系数分别为 9.08%、 9.03%, 平均批间变异系 数分别为 6.54%、 5.71%, 平均批间变异系数均小于平均批内变异系数， 且 不超过 15%， 表明本发明检测方法具有较高的精密度。

表 3 甲胺磷的精密度测定

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替换页 (细则第 2 6条) 甲胺磷抑制双歧杆菌 LJM-006 的抑制率为 50%时对应的浓度是 5.2mg/L ( IC ₅₍₎ =5.2 mg/L )， 甲胺磷对双歧杆菌 LJM-006可特异性抑制， 与 其他有机磷类农药对的双歧杆菌 LJM-006交叉反应率％均小于 0.5%， 结果 见表 4。

表 4 甲胺磷与其他有机磷类农药的交叉反应

检测的食品样品为黄瓜， 取待检的黄瓜匀浆组织 5g， 将甲胺磷标准品 以终浓度为 100 mg/L添加到 10个黄瓜样品中、 按以上实施例 2步骤测定 其含量，根据各样品的 B/Bo值在标准曲线上求出其对应的甲胺磷质量� �度， 或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值 X， 求其反对数， 即为样品中 所含甲胺磷的质量浓度，得到甲胺磷的含量测 定值为 117.26 ± 0.79mg/L，加 标回收率为 82.3°/。~115.0%。

实施例 4: 茄子样品甲胺磷残留的检测

检测的食品样品为茄子， 取待检的茄子匀浆组织 5g， 将甲胺磷标准品 以终浓度为 0.1 mg/L添加到 10个茄子样品中、按以上实施例 2步骤测定其 含量， 根据各样品的 B/B。值在标准曲线上求出其对应的甲胺磷质量 浓度， 或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值 X， 汆*反对数， 即为样品中

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替换页 (细则第 26条） 所含甲胺磷的质量浓度，得到甲胺磷的含量测 定值为 0.11 ± 0.29mg/L，加标 回收率为 89.3%~105.7%。

实施例 5: 苹果样品甲胺磷残留的检测

检测的食品样品为苹果， 取待检的苹果匀浆组织 5g， 将甲胺磷标准品 以终浓度为 50mg/L添加到 10个苹果样品中、 按以上实施例 2步骤测定其 含量， 根据各样品的 B/B。值在标准曲线上求出其对应的甲胺磷质量 浓度， 或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值 X， 求其反对数， 即为样品中 所含甲胺磷的质量浓度， 得到甲胺磷的含量测定值为 52.11 ± 0.59mg/L， 加 标回收率为 83.3%~108.3%。

实施例 6: 梨子样品甲胺磷残留的检测

检测的食品样品为梨子， 取待检的梨子匀浆组织 5g, 将甲胺磷标准品 以终浓度为 10mg/L添加到 10个梨子样品中、 按以上实施例 2步骤测定其 含量， 根据各样品的 B/Bo值在标准曲线上求出其对应的甲胺磷质量� �度， 或代入回归方程计算样品质量浓度的对数值 X， 求其反对数， 即为样品中 所含甲胺磷的质量浓度， 得到甲胺磷的含量测定值为 11.16 ± 0.52mg/L， 加 标回收率为 89.3%~104.2%。

实施例 7: 方法显著性差异分析（采用 F值判断法）

按本发明实施例 2 的方法， 对购买于巿场的不含甲胺磷（经高效液相 色谱法证实不含甲胺磷） 的青菜样品进行不同浓度的甲胺磷添加试验， 称 取同一批次 4个平行样品， 用本发明方法按以上步骤进行测定， 同时采用 气相色谱法对同一批次样品进行测定， 对比结果并釆用 F检验法对两种方 法所得结果进行计算分析， 以判定两方法间是否存在显著性差异。 检测结 果见表 5。

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替换页 (细则第 26条) 表 5 本发明检测方法与高效液相色谱法检测结果比 较

F算 =2.16， 查 F表得到 F表 = 9.28(置信度 95%)， 可见？算^表， 表 明气相色谱法和本发明微生物法这两种检测方 法之间无统计学差异， 两种 方法之间可以互相替换而不会产生显著性差异 。

本发明的微生物法， 在可见光区即可进行测定， 本方法准确度和精密 度均很好， 符合农药残留检测要求。 本发明操作过程简单方便， 检测结果 准确、 重复性好， 经济实用， 方法可直接准确、 快速地应用于食品的甲胺 磷含量分析和质量控制， 因此本发明有实际的推广经济价值。

以上所述， 仅为本发明的优选实施例， 应当指出， 对于本技术中的普 通技术人员来说， 在不脱离本发明的核心技术特征的前提下， 还可以做出 若干改进和润饰， 这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范 围。

替换页 Γ细则第 26条)