PERMINOV SERGEY IGOREVICH (RU)
MOZGOVAYA IRINA NIKOLAEVNA (RU)
VUSTINA TATIANA FEDOROVNA (RU)
PERMINOV SERGEY IGOREVICH (RU)
MOZGOVAYA IRINA NIKOLAEVNA (RU)
WO2003099037A1 | 2003-12-04 | |||
WO2001097822A1 | 2001-12-27 |
RU2215028C1 | 2003-10-27 |
SHMID K. ET AL.: "Biofidoshtamm dlya ukrepleniya immunnoi sistemy", MOLOCHNAYA PROMYSHLENNOST, no. 4, 2004, pages 44, XP008094694
See also references of EP 1840205A4
КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.
Область техники.
Изобретение относится к новым штаммам бифидобактерий и их использованию в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья. Заявляемый штамм, в частности, может использоваться при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
Уровень техники.
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, длительной и, иногда, бессистемной антибиотикотерапией увеличивается количество людей и животных, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерий.
Продукты, содержащие бифидобактерий, являются эффективным средством профилактики, а также лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, а также кишечных дисбактериозов, обусловленных
перенесенными кишечными и другими заболеваниями, длительной антибиотикотерапией, лучевой и химиотерапией, стрессовыми воздействиями, неблагоприятными условиями окружающей среды и другими факторами.
Устойчивость бактерий к условиям желудочно-кишечного тракта является важным критерием для отбора штаммов, способствующих укреплению здоровья.
Качество лечебно-профилактических продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебно- профилактического питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека и животных, восстановить их нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерий видов Вifidоbасtеrium bifidum (патент FR 2336886, 29.07.1977, A23C9/12), Вifidоbасtеrium bifidum, Вifidоbасtеrium lопgum, Вifidоbасtеrium аdоlеsсепtis (патент FR 2411008, 06.07.1979, A61K35/74), Вifidоbасtеrium lопgum, Вifidоbасtеrium brеvе (патент CH 637297, 29.07.1983, A61K39/02), Вifidоbасtеrium lасtis (патент US 6379663, 14.03.2002, A01N63/00.
В нашей стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют штаммы бифидобактерий видов Вifidоbасtеrium bifidum ВКПМ Ac- 1578 (патент RU 2152993, 20.07.2000, С 12N01/20), Вifidоbасtеrium bifidum ВКПМ S-1257 (патент RU 2108383, 10.04.1998, С 12N01/20), Вifidоbасtеrium lопgum B379M, Вifidоbасtеrium bifidum 791(πaтeнт RU 2092064 10.10.1997, А 23C
09/12), Вifidоbасtеrium аdоlеsсепtis MC-42 (авторское свидетельство SU 863639, 15.09.1981, C12N15/00). В кисломолочных продуктах, обогащенных бифидобактериями, используют и зарубежные штаммы, например, Вifidоbасtеrium lасtis HN-019 (патент RU 2208632. 20.07.2003, C12 N 01/20), Вifidоbасtеrium lасtis 420 (спецификация на штамм, Вifidоbасtеrium lасtis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003) .
До настоящего времени ничего не известно об использовании отечественных штаммов Вifidоbасtеrium lасtis в вышеуказанных областях.
Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Вifidоbасtеrium lасtis 420 (прототип) (спецификация на штамм, Вifidоbасtеrium lасtis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003). Штамм обладает антагонистической активностью в отношении некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
По ряду проверенных свойств известный штамм Вifidоbасtеrium lасtis 420 уступает заявляемому штамму Вifϊdоbасtеrium lасtis 668, в частности, он более чувствителен к фенолу, желчи и менее активен в отношении некоторых патогенных микроорганизмов (см. табл. 1 и табл. 2).
Раскрытие изобретения.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Вifidоbасtеrium lасtis для использования его при изготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, косметических средств и т.п. средств, содержащих бифидобактерии.
При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм обладает высокой биологической
активностью, в частности высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью) в сравнении с информацией, имеющейся в литературных источниках, устойчивостью к условиям внешней среды, быстро размножается на искусственных питательных средах, обладает кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных.
Поставленная задача реализуется путем использования штамма Вifidоbасtеriшп lасtis 668 (Ac- 1673 ВКПМ) в составе заквасок, продуктов питания, лекарственных, бактериальных, косметических средств и т. д.
Штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 может быть использован в моно- или композиционной пробиотической концепции при получении или изготовлении различных заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов, косметических средств.
Штамм Вifidоbасtеriшп lасtis 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) под JN° Ac- 1673.
Заявляемый штамм выживает в условиях iп vitrо, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности, в присутствии 40% желчи, 0,4% фенола, ферментов ЖКТ и при низких значениях рН.
Заявляемый штамм Вifidоbасtеriшп lасtis 668 может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов таких как: квас и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п., заквасок и биологически активных добавок к пище. Так же штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 может широко
использоваться для производства косметических средств, например: кремов, лосьонов, питательных масок, гелей, косметического молочка и т.д.
Кроме того, штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668.
Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, каталазоотрицательные, анаэробные, полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-x концах; в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза; при росте на агаризованной среде ГМК в анаэробных условиях образуют мелкие (до lмм в диаметре) круглые бесцветные колонии.
Оптимальная температура выращивания 37-39 0 C.
Штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, ксилозу, арабинозу, раффинозу с образованием уксусной и молочной кислот, без образования газа; сквашивает молоко к 32 ч с образованием сгустка; активно наращивает микробную массу при росте на кукурузно- лактозной среде (ГMK-1) (состав ГMK-1: кукурузно-молочная смесь- 15г; пептон- 15г; лaктoзa-9г; аскорбиновая киcлoтa-0,5г; натрий лимоннокислый трёхзамещенный-О.бг; магний cepнoкиcлый-0,12г; калий фосфорнокислый oднoзaмeщeнный-2г; натрий фосфорнокислый двузамещенный-lг; агар-Зг; дистиллированная вода- 1 л), бифидум среде (БФ) (состав бифидум среды: глюкoзa-7,5г; лaктoзa-2,5г; панкреатический гидролизат казеина-ЗОг; натрий xлopиcтый-2,5г; магний cepнoкиcлый-0,5г; L-циcтeин-0,5г; аскорбиновая киcлoтa-0,5г; дрожжевой экcтpaкт-5г; ацетат нaтpия-0,3; aгap-0,75г; дистиллированная вода- 1 л);
максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 мл Ig КОЕ (колониеобразующие единицы) равного 8-9; проявляет антагонистические свойства в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (таблицы 1 и 2 приведены в конце описания), а именно более, чем в 100 раз угнетают рост Сапdidа аlbiсапs и Рrоtеus vulgаris, более, чем в 10000 раз угнетают рост Рrоtеus mirаbilis, Кlеbsiеllа рпеumопiае, более, чем в 100000 раз угнетают рост SЫgеllа sоrmеi, Сitrоbасtеr frеuпdii, Васillus subtilis при совместном культивировании в условиях iп vitrо.
Таким образом, предлагаемый штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией микробных клеток (Ig КОЕ ~ 9); обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью, СОД-активность равна 95,0 ±0,1 в ед/мг белка).
Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам выявило, что штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 обладает природной устойчивостью к: азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму; чувствителен к левомицетину, ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, доксициклину, карбенициллину, линкомицину, меропенему, оксациллину, олеандомицину, офлоксацину, пиперациллину, рифампицину, фурагину, фурадонину, фуразолидону, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефуроксиму.
Таким образом, по ряду свойств и их совокупности штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 обладает большей биологической активностью по сравнению с известными штаммами Вifidоbасtеrium lасtis.
Штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 обладает устойчивостью к фенолу и желчи; устойчивостью к низким значениям рН и ферментам ЖКТ; выраженной антагонистической активностью в отношении Рrόtеus vulgаris, Рrоtеus mirаbilis, Кlеbsiеllа рпеumопiае, Shigеllа sоппеi, Сitrоbасtеr frеuпdii, Васillus subtilis; природной устойчивостью к : азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму ; хорошей технологичностью (способностью штамма вырастать в большом титре равном Ig KOE-9 на подобранных средах и хорошо сохраняться в кисломолочных продуктах в течение необходимого продолжительного срока годности); выраженной антиоксидантной активностью.
Способность штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 вырастать в большом титре в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая, антиоксидантная активности, способность сохраняться в течение длительного времени в кисломолочной продукции и другие полезные свойства делают возможным использование штамма в составе различных продуктов питания и средств лечебно- профилактического назначения.
Осуществление изобретения.
Пример 1. Использование штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 в составе биологических веществ, в частности, в составе биологически активных добавок.
1 пассаж: лиофилизированный штамм Вifϊdоbасtеrium lасtis 668 в количестве - 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной
бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10 "9 . Инкубируют при температуре 37-38 0 C до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37- 38 0 C в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 0 C до получения о биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10 КОЕ/мл.
В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой суспензию клеток бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 с титром не менее 10 8 КОЕ/мл, при необходимости можно получить концентрат клеток бифидобактерий с более высоким титром.
Пример 2. Использование штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 для приготовления неферментированных пищевых продуктов.
1 пассаж: лиофилизированный штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 в количестве ~ 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10 "9 . Инкубируют при 37-38 0 C до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10 "7"9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37- 38 0 C в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 0 C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10 8 КОЕ/мл.
Получение неферментированного пищевого продукта: выросшую и, при необходимости, сконцентрированную биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10 б КОЕ/мл.
Пример 3. Приготовление кисломолочного продукта лечебно- профилактического назначения с использованием штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 в качестве компонента заквасочных культур для приготовления ферментированных кисломолочных продуктов.
1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в бифидум среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10 "9 . Инкубируют при 37-38 0 C до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 из последних разведений вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38 0 C до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10 8 КОЕ/мл.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 0 C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10 8 КОЕ/мл.
Получение кисломолочного продукта: полученную биомассу штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 в объеме до 10% вносят в пастеризованную молочную смесь при температуре 37-38 0 C вместе с другими заквасочными культурами, используемыми по норме, культивируют до образования сгустка (pH=4,5-4,6). Продукт, с концентрацией живых бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 не менее 10 б КОЕ/мл, охлаждают до 22 0 C , разливают в тару и доохлаждают до 6 0 C. Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства.
Пример 4. Использование штамма бифидобактерий Вifϊdоbасtеriшп lасtis 668 для получения бактериальных препаратов.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38 0 C до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 8 КОЕ/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, или флаконы, или другие емкости, замораживают при температуре минус 40-45 0 C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10 8 живых клеток бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 в Ir. Формируя дозы адекватного уровня потребления пробиотических микроорганизмов в сутки равные не менее 5x10 8 - 5x10 10 КОЕ (для бифидобактерий) можно использовать полученный препарат в качестве бактериального препарата пробиотика.
Пример 5. Использование штамма бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 для получения косметических средств.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38 0 C до получения биомассы бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 с содержанием живых клеток не менее 10 8 KOE/мл. Получение косметических средств: выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма 668 бифидобактерий вводят в состав косметического средства.
Пример 6. Использование штамма бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 для получения ферментированного продукта.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду (бифидум), культивируют при температуре 37-38 0 C до
получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 8 KOE/мл.
Для получения ферментированного продукта типа кваса выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 вводят в подготовленную основу (вода, сахар, мёд, сусло, аскорбиновая кислота) совместно с Lасtоbасillus рlапtашm и Lасtоbасillus fеrmепtum, перемешивают и культивируют при 37 0 C до получения напитка с титруемой кислотностью 65-85 0 T. Затем напиток охлаждают и разливают по бутылкам. В результате получают готовый лечебно-профилактический продукт с содержанием в lмл не менее 10 7 живых пробиотических микроорганизмов.
Антагонистическая активность штаммов Вifϊdоbасtеrium lасtis 668 (заявляемый) и Вifidоbасtеrium lасtis 420 (прототип) в отношении патогенных микроорганизмов
ТАБЛИЦА 1
ТАБЛИЦА 2