Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
BIFIDOBACTERIUM LACTIS 668 STRAIN USED FOR AR A COMPONENT FOR FOOD PRODUCTS, STARTERS, MEDICINAL AND COSMETIC AGENTS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2006/073329
Kind Code:
A1
Abstract:
The inventive strain can be used for the food, cosmetic, biotechnological, medical industries and for veterinary sciences, in particular for preparing sour-milk, fermented and non-fermented food products, starters, cosmetic agents, biologically active additives and bacterial preparations. Said invention is based on the use of a bifidobacterium lactis 668 strain ((Ac-1673 VKPM) as a component of at least one the following products: food products, starters, medicinal and cosmetical agents etc. The invention makes it possible to increase the strain biological activity and the resistance thereof to e environmental conditions, to accelerate the reproduction of the strain on artificial nutritive media and to provided it with an acid-forming and antagonistic activity with respect to pathogenic and opportunistic microflora. The production of strains exhibiting said properties makes it possible to extend the range of probiotics for health care, in particular for normalising the microflora of a gastrointestinal and urogenital systems, cutaneous and mucous covering of a human being and animals.

Inventors:
VUSTINA TATIANA FEDOROVNA (RU)
PERMINOV SERGEY IGOREVICH (RU)
MOZGOVAYA IRINA NIKOLAEVNA (RU)
Application Number:
PCT/RU2005/000545
Publication Date:
July 13, 2006
Filing Date:
November 03, 2005
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
CHNY KOM OTKRYTOE AKTSIONERNOE (RU)
VUSTINA TATIANA FEDOROVNA (RU)
PERMINOV SERGEY IGOREVICH (RU)
MOZGOVAYA IRINA NIKOLAEVNA (RU)
International Classes:
C12N1/20; A23C9/12; A23L33/00; A61K8/99; A61K35/74; A61K35/745
Domestic Patent References:
WO2003099037A12003-12-04
WO2001097822A12001-12-27
Foreign References:
RU2215028C12003-10-27
Other References:
PRODUCT DESCRIPTION-Bf. Species 420 DIRECT FP 50 u V7. Art. No. 13581032, DANISKO. 29.04.2003
SHMID K. ET AL.: "Biofidoshtamm dlya ukrepleniya immunnoi sistemy", MOLOCHNAYA PROMYSHLENNOST, no. 4, 2004, pages 44, XP008094694
See also references of EP 1840205A4
Attorney, Agent or Firm:
Druschits, Anton Vladimirovich (Yauzsky bul. 16/1, Moscow 8, RU)
Download PDF:
Description:
ШТАММ ВIFIDОВАСТЕRШМ LACTIS 668, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В СОСТАВЕ ЗАКВАСОК, ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ, ЛЕКАРСТВЕННЫХ И

КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.

Область техники.

Изобретение относится к новым штаммам бифидобактерий и их использованию в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья. Заявляемый штамм, в частности, может использоваться при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

Уровень техники.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, длительной и, иногда, бессистемной антибиотикотерапией увеличивается количество людей и животных, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерий.

Продукты, содержащие бифидобактерий, являются эффективным средством профилактики, а также лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, а также кишечных дисбактериозов, обусловленных

перенесенными кишечными и другими заболеваниями, длительной антибиотикотерапией, лучевой и химиотерапией, стрессовыми воздействиями, неблагоприятными условиями окружающей среды и другими факторами.

Устойчивость бактерий к условиям желудочно-кишечного тракта является важным критерием для отбора штаммов, способствующих укреплению здоровья.

Качество лечебно-профилактических продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебно- профилактического питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека и животных, восстановить их нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерий видов Вifidоbасtеrium bifidum (патент FR 2336886, 29.07.1977, A23C9/12), Вifidоbасtеrium bifidum, Вifidоbасtеrium lопgum, Вifidоbасtеrium аdоlеsсепtis (патент FR 2411008, 06.07.1979, A61K35/74), Вifidоbасtеrium lопgum, Вifidоbасtеrium brеvе (патент CH 637297, 29.07.1983, A61K39/02), Вifidоbасtеrium lасtis (патент US 6379663, 14.03.2002, A01N63/00.

В нашей стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют штаммы бифидобактерий видов Вifidоbасtеrium bifidum ВКПМ Ac- 1578 (патент RU 2152993, 20.07.2000, С 12N01/20), Вifidоbасtеrium bifidum ВКПМ S-1257 (патент RU 2108383, 10.04.1998, С 12N01/20), Вifidоbасtеrium lопgum B379M, Вifidоbасtеrium bifidum 791(πaтeнт RU 2092064 10.10.1997, А 23C

09/12), Вifidоbасtеrium аdоlеsсепtis MC-42 (авторское свидетельство SU 863639, 15.09.1981, C12N15/00). В кисломолочных продуктах, обогащенных бифидобактериями, используют и зарубежные штаммы, например, Вifidоbасtеrium lасtis HN-019 (патент RU 2208632. 20.07.2003, C12 N 01/20), Вifidоbасtеrium lасtis 420 (спецификация на штамм, Вifidоbасtеrium lасtis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003) .

До настоящего времени ничего не известно об использовании отечественных штаммов Вifidоbасtеrium lасtis в вышеуказанных областях.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Вifidоbасtеrium lасtis 420 (прототип) (спецификация на штамм, Вifidоbасtеrium lасtis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003). Штамм обладает антагонистической активностью в отношении некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

По ряду проверенных свойств известный штамм Вifidоbасtеrium lасtis 420 уступает заявляемому штамму Вifϊdоbасtеrium lасtis 668, в частности, он более чувствителен к фенолу, желчи и менее активен в отношении некоторых патогенных микроорганизмов (см. табл. 1 и табл. 2).

Раскрытие изобретения.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Вifidоbасtеrium lасtis для использования его при изготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, косметических средств и т.п. средств, содержащих бифидобактерии.

При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм обладает высокой биологической

активностью, в частности высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью) в сравнении с информацией, имеющейся в литературных источниках, устойчивостью к условиям внешней среды, быстро размножается на искусственных питательных средах, обладает кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных.

Поставленная задача реализуется путем использования штамма Вifidоbасtеriшп lасtis 668 (Ac- 1673 ВКПМ) в составе заквасок, продуктов питания, лекарственных, бактериальных, косметических средств и т. д.

Штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 может быть использован в моно- или композиционной пробиотической концепции при получении или изготовлении различных заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов, косметических средств.

Штамм Вifidоbасtеriшп lасtis 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) под JN° Ac- 1673.

Заявляемый штамм выживает в условиях iп vitrо, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности, в присутствии 40% желчи, 0,4% фенола, ферментов ЖКТ и при низких значениях рН.

Заявляемый штамм Вifidоbасtеriшп lасtis 668 может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов таких как: квас и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п., заквасок и биологически активных добавок к пище. Так же штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 может широко

использоваться для производства косметических средств, например: кремов, лосьонов, питательных масок, гелей, косметического молочка и т.д.

Кроме того, штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.

Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668.

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, каталазоотрицательные, анаэробные, полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-x концах; в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза; при росте на агаризованной среде ГМК в анаэробных условиях образуют мелкие (до lмм в диаметре) круглые бесцветные колонии.

Оптимальная температура выращивания 37-39 0 C.

Штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, ксилозу, арабинозу, раффинозу с образованием уксусной и молочной кислот, без образования газа; сквашивает молоко к 32 ч с образованием сгустка; активно наращивает микробную массу при росте на кукурузно- лактозной среде (ГMK-1) (состав ГMK-1: кукурузно-молочная смесь- 15г; пептон- 15г; лaктoзa-9г; аскорбиновая киcлoтa-0,5г; натрий лимоннокислый трёхзамещенный-О.бг; магний cepнoкиcлый-0,12г; калий фосфорнокислый oднoзaмeщeнный-2г; натрий фосфорнокислый двузамещенный-lг; агар-Зг; дистиллированная вода- 1 л), бифидум среде (БФ) (состав бифидум среды: глюкoзa-7,5г; лaктoзa-2,5г; панкреатический гидролизат казеина-ЗОг; натрий xлopиcтый-2,5г; магний cepнoкиcлый-0,5г; L-циcтeин-0,5г; аскорбиновая киcлoтa-0,5г; дрожжевой экcтpaкт-5г; ацетат нaтpия-0,3; aгap-0,75г; дистиллированная вода- 1 л);

максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 мл Ig КОЕ (колониеобразующие единицы) равного 8-9; проявляет антагонистические свойства в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (таблицы 1 и 2 приведены в конце описания), а именно более, чем в 100 раз угнетают рост Сапdidа аlbiсапs и Рrоtеus vulgаris, более, чем в 10000 раз угнетают рост Рrоtеus mirаbilis, Кlеbsiеllа рпеumопiае, более, чем в 100000 раз угнетают рост SЫgеllа sоrmеi, Сitrоbасtеr frеuпdii, Васillus subtilis при совместном культивировании в условиях iп vitrо.

Таким образом, предлагаемый штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией микробных клеток (Ig КОЕ ~ 9); обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью, СОД-активность равна 95,0 ±0,1 в ед/мг белка).

Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам выявило, что штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 обладает природной устойчивостью к: азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму; чувствителен к левомицетину, ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, доксициклину, карбенициллину, линкомицину, меропенему, оксациллину, олеандомицину, офлоксацину, пиперациллину, рифампицину, фурагину, фурадонину, фуразолидону, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефуроксиму.

Таким образом, по ряду свойств и их совокупности штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 обладает большей биологической активностью по сравнению с известными штаммами Вifidоbасtеrium lасtis.

Штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 обладает устойчивостью к фенолу и желчи; устойчивостью к низким значениям рН и ферментам ЖКТ; выраженной антагонистической активностью в отношении Рrόtеus vulgаris, Рrоtеus mirаbilis, Кlеbsiеllа рпеumопiае, Shigеllа sоппеi, Сitrоbасtеr frеuпdii, Васillus subtilis; природной устойчивостью к : азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму ; хорошей технологичностью (способностью штамма вырастать в большом титре равном Ig KOE-9 на подобранных средах и хорошо сохраняться в кисломолочных продуктах в течение необходимого продолжительного срока годности); выраженной антиоксидантной активностью.

Способность штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 вырастать в большом титре в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая, антиоксидантная активности, способность сохраняться в течение длительного времени в кисломолочной продукции и другие полезные свойства делают возможным использование штамма в составе различных продуктов питания и средств лечебно- профилактического назначения.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Использование штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 в составе биологических веществ, в частности, в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Вifϊdоbасtеrium lасtis 668 в количестве - 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной

бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10 "9 . Инкубируют при температуре 37-38 0 C до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37- 38 0 C в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 0 C до получения о биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10 КОЕ/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой суспензию клеток бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 с титром не менее 10 8 КОЕ/мл, при необходимости можно получить концентрат клеток бифидобактерий с более высоким титром.

Пример 2. Использование штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 для приготовления неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Вifidоbасtеrium lасtis 668 в количестве ~ 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10 "9 . Инкубируют при 37-38 0 C до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10 "7"9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37- 38 0 C в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 0 C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10 8 КОЕ/мл.

Получение неферментированного пищевого продукта: выросшую и, при необходимости, сконцентрированную биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10 б КОЕ/мл.

Пример 3. Приготовление кисломолочного продукта лечебно- профилактического назначения с использованием штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 в качестве компонента заквасочных культур для приготовления ферментированных кисломолочных продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в бифидум среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10 "9 . Инкубируют при 37-38 0 C до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 из последних разведений вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38 0 C до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10 8 КОЕ/мл.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 0 C до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10 8 КОЕ/мл.

Получение кисломолочного продукта: полученную биомассу штамма Вifidоbасtеrium lасtis 668 в объеме до 10% вносят в пастеризованную молочную смесь при температуре 37-38 0 C вместе с другими заквасочными культурами, используемыми по норме, культивируют до образования сгустка (pH=4,5-4,6). Продукт, с концентрацией живых бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 не менее 10 б КОЕ/мл, охлаждают до 22 0 C , разливают в тару и доохлаждают до 6 0 C. Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма бифидобактерий Вifϊdоbасtеriшп lасtis 668 для получения бактериальных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38 0 C до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 8 КОЕ/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, или флаконы, или другие емкости, замораживают при температуре минус 40-45 0 C и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10 8 живых клеток бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 в Ir. Формируя дозы адекватного уровня потребления пробиотических микроорганизмов в сутки равные не менее 5x10 8 - 5x10 10 КОЕ (для бифидобактерий) можно использовать полученный препарат в качестве бактериального препарата пробиотика.

Пример 5. Использование штамма бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 для получения косметических средств.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38 0 C до получения биомассы бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 с содержанием живых клеток не менее 10 8 KOE/мл. Получение косметических средств: выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма 668 бифидобактерий вводят в состав косметического средства.

Пример 6. Использование штамма бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 для получения ферментированного продукта.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду (бифидум), культивируют при температуре 37-38 0 C до

получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 8 KOE/мл.

Для получения ферментированного продукта типа кваса выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма бифидобактерий Вifidоbасtеrium lасtis 668 вводят в подготовленную основу (вода, сахар, мёд, сусло, аскорбиновая кислота) совместно с Lасtоbасillus рlапtашm и Lасtоbасillus fеrmепtum, перемешивают и культивируют при 37 0 C до получения напитка с титруемой кислотностью 65-85 0 T. Затем напиток охлаждают и разливают по бутылкам. В результате получают готовый лечебно-профилактический продукт с содержанием в lмл не менее 10 7 живых пробиотических микроорганизмов.

Антагонистическая активность штаммов Вifϊdоbасtеrium lасtis 668 (заявляемый) и Вifidоbасtеrium lасtis 420 (прототип) в отношении патогенных микроорганизмов

ТАБЛИЦА 1

ТАБЛИЦА 2