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Title:
BIOCOMPATIBLE OPTICAL SLIDE INTENDED FOR TOTAL INTERNAL REFLECTION MICROSCOPY AND MICROSCOPY IMAGING SYSTEM COMPRISING SUCH A SLIDE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2023/025842
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to an optical slide (10) intended to receive a biological sample for the purposes of total internal reflection microscopy. Such an optical slide comprises a glass base substrate (11) and a stack (12) of thin layers of alternating dielectric materials which is arranged on said substrate, the free layer of the stack being biocompatible. The stack has index and layer thickness characteristics for supporting the surface waves at the interface between the free layer and the sample, such that the imaging sensitivity and resolution of total internal reflection microscopy are improved.

Inventors:
MOUTTOU ANITA (FR)
LUMEAU JULIEN (FR)
LEREU AUDE (FR)
FAVARD CYRIL (FR)
Application Number:
PCT/EP2022/073565
Publication Date:
March 02, 2023
Filing Date:
August 24, 2022
Export Citation:
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Assignee:
CENTRE NAT RECH SCIENT (FR)
UNIV AIX MARSEILLE (FR)
ECOLE CENTRALE MARSEILLE (FR)
UNIV MONTPELLIER (FR)
International Classes:
G01N21/64; G02B21/34
Foreign References:
US20160238830A12016-08-18
US20160238830A12016-08-18
Other References:
JIAN GAO ET AL: "Polarization multiplexed fluorescence enhancer using a pixelated one-dimensional photonic band gap structure", OPTICS LETTERS, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, US, vol. 37, no. 13, 1 July 2012 (2012-07-01), pages 2640 - 2642, XP001576868, ISSN: 0146-9592, [retrieved on 20120625], DOI: 10.1364/OL.37.002640
Attorney, Agent or Firm:
VIDON BREVETS & STRATÉGIE (FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Lame optique (10) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) à des fins d'imagerie microscopique à réflexion totale interne, la lame optique comprenant :

- un substrat de base optiquement transparent (11) ;

- un empilement de couches de matériaux diélectriques (12) ; la lame optique (10) étant caractérisée en ce que ledit empilement (12) est disposé directement sur le substrat de base (11) et formé d'une succession de paires de couches minces alternées d'un premier matériau diélectrique (MD1) d'indice de réfraction élevé et d'un deuxième matériau diélectrique (MD2) d'indice de réfraction faible apte à produire une résonance optique à un angle d'incidence et une longueur d'onde d'éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale.

2. Lame optique selon la revendication 1, dans laquelle :

- le premier matériau présente un indice de réfraction élevé compris entre 1,8 et 3,5 ;

- le deuxième matériau présente un indice de réfraction faible compris entre 1,2 et 1,7.

3. Lame optique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle la couche dudit empilement destinée à être contact avec l'échantillon étant à base d'un troisième matériau diélectrique biocompatible (MD3) ayant un coefficient d'absorption compris entre lxlO-8 et lxlO’2.

4. Lame optique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le premier matériau est à base de Nb2Û5, le deuxième matériau est à base de SiCh et le troisième matériau est à base de SiCh ou de SiOx.

5. Lame optique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit empilement présente une épaisseur totale inférieure à 10 micromètres, et plus particulièrement comprise entre 0,2 et 4,0 micromètres.

6. Lame optique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit empilement comprend un nombre de couches minces typiquement compris entre 4 et 20.

7. Système de microscopie à réflexion totale interne, caractérisé en ce qu'il comprend :

- une lame optique (10) définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ;

- une source de lumière (30) configurée pour émettre un faisceau d'éclairage ; - un objectif de microscope (20) configuré pour former le faisceau d'éclairage vers la lame optique (10) ; le système étant caractérisé en ce que la lame optique et l'objectif de microscope sont configurés pour que l'angle d'incidence soit : supérieur ou égal à un angle critique de réflexion totale interne, et inférieur ou égal à une valeur limite définie en fonction de l'ouverture numérique de l'objectif de microscope.

8. Système d'imagerie microscopique selon la revendication 7, dans lequel l'angle d'incidence est compris entre 62 et 80 degrés.

9. Système d'imagerie microscopique selon l'une quelconque des revendications 7 et 8, dans lequel l'objectif de microscope présente une ouverture numérique typiquement supérieure ou égal à 1,45.

10. Système d'imagerie microscopique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel l'objectif de microscope est à ouverture numérique variable.

11. Système d'imagerie microscopique selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel l'objectif de microscope est à focale variable.

12. Procédé de fabrication d'une lame optique (10) destinée à recevoir un échantillon biologique (E) à des fins d'imagerie microscopique à réflexion totale interne, caractérisé en ce qu'il comprend :

- une étape de dépôt sur un substrat de base optiquement transparent (11) d'une pluralité de couches minces successives et alternées d'un premier matériau diélectrique et d'un deuxième matériau diélectrique de manière à former un empilement de multicouches diélectriques (12) apte à produire une résonance optique à un angle d'incidence et une longueur d'onde d'éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale.

Description:
Lame optique biocompatible destinée à la microscopie à réflexion totale interne et système d'imagerie microscopique comportant une telle lame

Domaine technique

L'invention s'inscrit dans le domaine de la microscopie optique. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouveau concept de lame optique basée sur un empilement multicouche comme support d'exaltation du champ électromagnétique adapté à la microscopie à réflexion totale interne.

L'invention s'applique notamment, mais non exclusivement, au domaine de l'imagerie d'échantillons biologiques par microscopie de fluorescence à réflexion totale interne ou microscopie TIRF (pour « Total Internal Reflection Fluorescence »). Une telle technique d'imagerie est particulièrement bien adaptée à la visualisation, l'analyse et la quantification d'évènements moléculaires s'effectuant notamment à la membrane plasmique des cellules biologiques.

Arrière-plan technologique

On s'attache plus particulièrement dans la suite de ce document à décrire la problématique existant dans le domaine de l'imagerie en microscopie de fluorescence à réflexion totale interne, à laquelle ont été confrontés les inventeurs de la présente invention. L'invention ne se limite bien sûr pas à ce contexte particulier d'application, mais présente un intérêt pour toute technique ou modalité de microscopie exploitant le principe d'imagerie en réflexion totale interne.

La microscopie de fluorescence à réflexion totale interne (TIRF) est devenue une technique de référence pour étudier la dynamique et l'organisation membranaire dans les cellules biologiques. Un de ses avantages réside dans la possibilité de confiner la lumière d'excitation dans une section ultra-mince de l'échantillon située à l'interface entre l'échantillon et la lame de microscope en verre de sorte qu'une excitation sélective de l'échantillon peut être réalisée. Une telle technique permet ainsi la faisabilité d'images de molécules uniques à l'échelle nanométrique.

La technique TIRF repose sur le principe suivant. L'échantillon biologique qui est disposé sur la lame de microscope (par exemple un substrat de verre) est illuminé à travers la lame de microscope à l'aide d'un faisceau d'excitation laser. Lorsque le faisceau d'excitation heurte l'interface entre la lame de verre et l'échantillon sous un angle d'incidence supérieur ou égal à l'angle critique de réflexion totale interne, une des composantes électromagnétiques de la lumière, appelée onde évanescente, se propage à ladite interface dans une section ultra-mince de l'échantillon, avec une intensité lumineuse qui décroît exponentiellement avec la distance à ladite interface. La profondeur de pénétration du champ évanescent est typiquement inférieure à 100 nm. Le signal de fluorescence résultant - autrement dit les ondes électromagnétiques émises par les molécules fluorescentes observées - est ensuite collecté vers un détecteur de lumière à des fins d'imagerie.

Ainsi, par cette technique connue, les images obtenues présentent de multiples qualités : elles bénéficient tout d'abord d'un faible bruit de fond (car les fluorophores situés dans les couches profondes de l'échantillon (hors du champ évanescent) ne sont que très faiblement excités) et d'une résolution axiale relativement élevée.

Des lames de microscope à structure plus complexe, comme celles basées sur une métallisation en surface ont été par ailleurs conçues pour exalter localement le champ électromagnétique. De telles lames optiques, qui reposent sur le principe de la résonance plasmonique de surface, permettent d'améliorer la sensibilité de l'imagerie de microscopie. Toutefois, cette solution connue reste limitée en termes de valeur d'exaltation du champ et dans le choix des matériaux, i.e. métaux nobles, qui limitent les conditions d'illumination utilisables ainsi que la biocompatibilité, ce qui n'est pas optimal.

Une autre technique connue, décrite dans le document de brevet US 2016/0238830, repose sur un guide d'onde multicouches dont les épaisseurs de couche et les indices de réfraction sont choisis pour supporter un mode de fuite guidé. Or les expériences d'imagerie de microscopie effectuées avec cette technique demeurent encore limitées du point de vue sensibilité et résolution notamment.

En conséquence, il existe un besoin de fournir une technique de microscopie haute résolution capable d'imager des échantillons biologiques dans des conditions d'éclairage stables et reproductibles avec un rapport signal à bruit amélioré.

Exposé de l'invention Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est proposé une lame optique destinée à recevoir un échantillon biologique à des fins d'imagerie microscopique à réflexion totale interne, la lame optique comprenant un substrat de base optiquement transparent et un empilement de couches de matériaux diélectriques. L'empilement est tel qu'il est disposé directement sur le substrat de base et formé d'une succession de paires de couches minces alternées d'un premier matériau diélectrique d'indice de réfraction élevé et d'un deuxième matériau diélectrique d'indice de réfraction faible apte à produire une résonance optique à un angle d'incidence et une longueur d'onde d'éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale.

Ainsi, l'invention repose sur une nouvelle conception d'une lame optique pour réaliser de la microscopique à réflexion totale interne. Un tel empilement de multicouches diélectriques couplé au substrat de base permet d'assurer une exaltation significative du champ électromagnétique évanescent se propageant à l'interface entre la lame et l'échantillon au niveau de la couche de contact. Cette sorte de « résonateur diélectrique » est donc conçue pour amplifier par résonance optique l'intensité lumineuse des ondes évanescentes confinées en surface de la lame optique en contact avec l'échantillon. Grâce à cette approche, la sensibilité de l'imagerie microscopique ainsi que la résolution spatiale s'en trouvent améliorées. Il apparaît de plus, comparativement aux lames à résonance plasmonique existantes, que ce type de lame optique proposé est plus facilement exploitable car elle s'adapte à une plus grande gamme de paramètres d'imagerie de microscopie TIR.

Selon une caractéristique particulière, la couche dudit empilement destinée à être contact avec l'échantillon (dite couche de contact ou d'extrémité), est à base d'un troisième matériau diélectrique biocompatible ayant un coefficient d'absorption compris entre lxlO’ 8 et lxlO’ 2 . Cette plage de valeurs permet un fonctionnement optimal de la lame. Les inventeurs ont en effet découvert que le coefficient d'absorption de la couche d'extrémité est un paramètre clé pour contrôler l'amplitude du champ électromagnétique évanescent à l'interface avec l'échantillon.

Selon une mise en œuvre particulière, le premier matériau diélectrique présente un indice de réfraction élevé compris entre 1,8 et 3,5 et le deuxième matériau diélectrique présente un indice de réfraction faible compris entre 1,2 et 1,7. Le troisième matériau, quant à lui présente un indice de réfraction faible ou élevé selon l'indice de réfraction de la couche mince précédent la couche d'extrémité (afin de respecter l'alternance d'indices de l'empilement). Ainsi, l'invention offre un choix relativement large d'indices de réfraction pouvant être utilisés pour concevoir le résonateur diélectrique.

Plus particulièrement, les couches minces présentent chacune une épaisseur qui est fonction de la longueur d'onde d'éclairage, de l'angle d'incidence et de l'indice de réfraction du matériau pour lesquels elle est constituée. Il est ainsi possible de concevoir aisément une lame optique quels que soient les paramètres d'imagerie imposés par le système de microscopie TIR.

Selon une mise en œuvre particulière, le substrat optiquement transparent est à base d'un matériau appartenant au groupe suivant : Verre sodocalcique, Saphir, Quartz, Fluorure de calcium.

Selon une mise en œuvre particulière, le premier matériau diélectrique est à base de Nb 2 O 5 et le deuxième matériau diélectrique est à base de SiO 2 et le troisième matériau diélectrique est à base de SiO 2 ou SiO x .

De manière générale, conforme à l'invention, l'épaisseur de chaque couche mince est comprise entre 1 et 300 nanomètres, et plus particulièrement entre 75 et 150 nanomètres, tandis que l'épaisseur du substrat de base est comprise entre 50 et 2000 micromètres. L'empilement présente une épaisseur totale inférieure à 10 micromètres, et plus particulièrement comprise entre 0,2 et 4,0 micromètres. L'empilement comprend un nombre de couches minces typiquement compris entre 4 et 20.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est proposé un système de microscopie à réflexion totale interne, comprenant :

- une lame optique définie dans l'un quelconque de ses modes de réalisation précitée ;

- une source de lumière configurée pour émettre un faisceau d'éclairage ;

- un objectif de microscope configuré pour former le faisceau d'éclairage vers la lame optique ; la lame et l'objectif de microscope étant configurés pour que l'angle d'incidence soit supérieur ou égal à un angle critique de réflexion totale interne. On rappelle que l'angle d'incidence correspond à l'angle compris entre l'axe du faisceau d'éclairage et l'axe d'empilement de la lame optique. A noter que, plus les valeurs d'angle d'incidence choisies se rapprochent de la borne haute de la plage précitées, et plus la résolution axiale du système s'en trouve augmentée.

Selon une caractéristique avantageuse, l'angle d'incidence est inférieur ou égal à une valeur limite définie par l'ouverture numérique de l'objectif de microscope. Plus précisément, l'angle d'incidence est compris entre 62 et 80 degrés.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, il est proposé un procédé de fabrication d'une lame optique destinée à recevoir un échantillon biologique à des fins d'imagerie microscopique à réflexion totale interne. Le procédé est tel qu'il comprend :

- une étape de dépôt sur un substrat de base optiquement transparent d'une pluralité de couches minces successives et alternées d'un premier matériau diélectrique et d'un deuxième matériau diélectrique de manière à former un empilement de multicouches diélectriques apte à produire une résonance optique à un angle d'incidence et une longueur d'onde d'éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale, la couche dudit empilement destinée à être contact avec l'échantillon étant à base d'un matériau diélectrique biocompatible.

Il est ainsi possible de concevoir une lame optique à exaltation du champ électromagnétique configurable quels que soient les paramètres d'imagerie imposés par le système de microscopie.

Liste des figures

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, donnée à titre d'exemple indicatif et non limitatif, et des dessins annexés, dans lesquels :

- la figure 1 est un schéma simplifié d'un système de microscopie à réflexion totale interne selon un mode de réalisation particulier de l'invention ;

- la figure 2 présente un premier exemple de lame optique selon l'invention pouvant être utilisée dans le système d'imagerie de la figure 1 ;

- la figure 3 présente un deuxième exemple de lame optique selon l'invention pouvant être utilisée dans le système d'imagerie de la figure 1.

Description détaillée de l'invention Sur toutes les figures du présent document, les éléments et étapes identiques sont désignés par une même référence numérique.

La figure 1 représente de manière simplifiée un système de microscopie à réflexion totale interne 100, selon un mode de réalisation particulier de l'invention. Un tel système comprend une lame optique 10, un objectif de microscope 20, une source de lumière 30 et un détecteur de lumière 40.

La lame optique 10 est une lame biocompatible destinée à recevoir un échantillon biologique E à des fins d'imagerie de microscopie selon une configuration en réflexion totale interne. Un exemple de structure de lame optique conforme à l'invention est décrit plus loin en relation avec la figure 2.

L'objectif de microscope 20 est un objectif à grande ouverture, typiquement supérieure ou égal à 1,45. Il comprend une optique ou un assemblage plus ou moins complexe de lentilles optiques apte à permettre la formation du faisceau d'éclairage en direction de la lame optique et collecter le faisceau réfléchi et/ou rétrodiffusé issu de la lame optique suivant un axe optique OA. L'objectif de microscope 20 peut être à focale variable et à ouverture numérique variable (supérieure à 1,45).

La source de lumière 30 est une source laser configurée pour émettre un faisceau d'éclairage laser de longueur d'onde prédéterminée X (typiquement égale à 561 nm, mais plus généralement comprise entre 350 et 1300 nm), apte à exciter les molécules contenues dans l'échantillon.

Le détecteur de lumière 40 est une caméra CCD ou CMOS dont la bande spectrale est adaptée à la détection de la lumière par fluorescence réémise en provenance de l'échantillon E (cette lumière par fluorescence étant à une longueur d'onde différente de la longueur d'onde d'excitation X). Il convertit l'intensité lumineuse reçue en un signal électrique à destination d'une unité de traitement (non représentée sur les figures). L'unité de traitement est raccordée électriquement à la source de lumière 30, au détecteur de lumière 40 et à l'objectif de microscope 20 de manière à pouvoir piloter ces éléments à des fins d'acquisition d'images de l'échantillon E en régime de réflexion totale interne.

Le système de microscopie 100 présenté ici repose sur le principe d'épifluorescence dont l'observation de la fluorescence est effectuée dans une configuration par réflexion au moyen d'une lame ou d'un miroir dichroïque 50 par exemple. Cette configuration particulière permet de dissocier le chemin optique emprunté par la lumière d'excitation, du chemin optique emprunté par la lumière réfléchie et/ou rétrodiffusée. On s'attache à décrire ci-après avec plus de détails la structure de la lame optique selon l'invention, telle que celle représentée à la figure 2.

La lame optique 10 possède une première face, dite face libre Fl, et une deuxième face, opposée à la première, dite face d'incidence Fi, et définit un axe d'empilement Z s'étendant entre ces deux faces opposées. La face libre Fl est destinée à recevoir l'échantillon biologique E à observer et la face d'incidence Fi est la face d'incidence de la lumière d'éclairage. Fl constitue l'interface libre où une exaltation du champ électromagnétique peut être supportée par la lame optique 10.

Dans ce mode de réalisation particulier, la lame optique 10 et l'objectif de microscope 20 sont agencés de sorte que l'axe d'empilement Z de la lame soit confondu avec l'axe optique OA. Autrement dit, la lame optique 10 et l'objectif de microscope 20 sont orientés l'un par rapport à l'autre de manière à ce que l'interface optique formée entre la lame optique 10 et l'échantillon E soit perpendiculaire à l'axe optique OA. L'objectif de microscope 20 est configuré pour que l'angle d'incidence 0 du faisceau d'éclairage (défini entre l'axe du faisceau d'éclairage et l'axe d'empilement Z), soit supérieur ou égal à l'angle critique de réflexion totale interne, typiquement un angle d'incidence compris entre 62 et 80 degrés pour un environnement biologique d'indice de réfraction compris entre 1,33 et 1,35.

Selon l'invention, la lame optique 10 comprend un substrat de base en matériau optiquement transparent 11, tel que par exemple une lamelle de microscope en verre sodocalcique d'indice 1,5 (ou tout autre support optiquement transparent calibré en épaisseur), sur lequel est agencé un empilement de couches minces diélectriques 12 servant de support à l'exaltation du champ électromagnétique en régime de réflexion totale interne. Comme illustré sur la figure 2, cet empilement 12 est formé d'une succession de plusieurs couches minces alternées d'un premier matériau diélectrique à indice de réfraction élevé (couche minces référencées MD1) et d'un second matériau diélectrique à indice de réfraction faible (couche minces référencées MD2). Dans l'exemple de réalisation illustré ici, l'empilement se présente globalement sous forme planaire de huit couches minces couvrant tout ou partie du substrat de base 11.

Dans cet exemple également, le matériau diélectrique MD1 retenu est à base de Nb 2 O 5 et le matériau diélectrique MD2 est à base de SiO 2 .

La couche mince destinée à être contact avec l'échantillon E, dite couche libre CL, est à base d'un matériau diélectrique biocompatible, tel qu'à base de Nb 2 Os comme dans l'exemple illustré ici, ou bien à base de SiO 2 typiquement. La face supérieure de cette couche libre CL correspondant à ladite face libre Fl discutée ci-dessus. Quant à la face d'incidence Fi, elle correspond à la face inférieure du substrat de base 11.

L'épaisseur des couches minces MD1 et MD2 est choisie en fonction de la longueur d'onde d'éclairage X, de l'angle d'incidence du faisceau d'éclairage et de l'indice de réfraction du matériau dont elle est constituée. L'épaisseur des couches minces est généralement comprise entre 1 et 300 nanomètres. L'épaisseur du substrat de base 11 est comprise entre 50 et 2000 micromètres et l'épaisseur totale de l'empilement diélectrique 12 est généralement inférieure à 10 micromètres. L'épaisseur totale de l'empilement diélectrique 12 est de préférence comprise entre 0,2 et 4 micromètres.

A noter que l'épaisseur, le nombre et la nature des couches minces dudit empilement peuvent être adaptés au cas par cas, en fonction notamment des conditions d'imagerie du système, tels que la longueur d'onde d'éclairage X et l'angle d'incidence e.

Par exemple, pour une longueur d'onde de 561 nm, un angle d'incidence de 68 degrés et une ouverture numérique de 1,49, un empilement de 8 couches minces successives et alternées d'indices de réfraction 2,25 et 1,46 et d'épaisseur totale 842 nm, a montré de bonnes performances du point de vue sensibilité et résolution spatiale.

Plus généralement, un nombre de couches minces compris entre 4 et 20 peut être envisagé sans sortir du cadre de l'invention. Le nombre de couches minces diélectriques est choisi en fonction de l'application visée, de la nature des matériaux, des conditions d'éclairage imposées par le système de microscopie utilisé et du facteur d'exaltation de champ voulu. Lorsque le système de microscopie 100 est en fonctionnement, l'échantillon biologique E qui est disposé sur la couche libre CL est illuminé à travers la lame optique à l'aide du faisceau d'éclairage de longueur d'onde X. Plus précisément, le faisceau d'éclairage traverse le substrat de base 11, puis l'empilement diélectrique 12 jusqu'à atteindre l'interface entre la couche libre CL et l'échantillon E sous l'angle d'incidence 0 pour respecter les conditions d'imagerie en réflexion totale interne. L'onde évanescente créée par le substrat de base 11 et qui se propage à ladite interface voit son intensité lumineuse amplifiée grâce à l'empilement diélectrique 12. En effet, les inventeurs ont observé que la présence d'une telle structure multicouche apposé directement sur un substrat de verre induit, par résonance optique, une exaltation du champ électromagnétique évanescent en surface de ladite lame optique (c'est-à-dire à l'interface libre Fl), permettant d'augmenter significativement les performances d'imagerie de microscopie TIRF, en particulier en termes de sensibilité et de résolution spatiale.

La lumière de fluorescence issue de l'échantillon E est ensuite captée par le détecteur de lumière 40 via le miroir dichroïque 50, puis traitée à des fins d'imagerie.

De plus, il convient de noter que plus la valeur d'angle d'incidence 0 choisie est proche de la borne haute de la plage précitées (80 degrés pour une ouverture numérique à 1,49), et plus la résolution axiale du système s'en trouve augmentée (la profondeur de champ évanescent diminuant). La valeur de l'angle d'incidence 0 peut donc être optimisée en fonction des performances souhaitées et des contraintes imposées par le système. La borne basse de la plage précitée (62 degrés) est donnée par la valeur d'indice de réfraction de l'échantillon étudié. Quant à la borne haute de la plage précitée (80 degrés), elle est définie en fonction de la valeur de l'ouverture numérique utilisée pour l'observation de microscopie.

On s'attache à décrire ci-après un deuxième exemple de lame optique 20 selon l'invention, telle que celle représentée à la figure 3. A la différence de la structure de lame illustrée à la figure 2, la couche d'extrémité d'empilement 12' destinée à être en contact avec l'échantillon E est à base d'un matériau diélectrique biocompatible MD3 présentant un indice de réfraction complexe caractéristique, dont la valeur de la partie imaginaire est choisie pour maximiser l'intensité lumineuse du champ évanescent à l'interface lame/échantillon. Cet indice de réfraction complexe (n) comprend une partie réelle à faible indice (n' compris entre 1,2 et 1,7 pour poursuivre le contraste d'indice dans l'empilement) et une partie imaginaire, aussi appelée coefficient d'absorption (k), tel que : n = n' + k x i. Typiquement, la couche d'extrémité MD3 est à base de dioxyde de silicium SiCh d'indice complexe n si02 = n sio2 ' + 10 -5 x i ou bien à base d'oxyde de silicium SiO x (silice partiellement oxydée) d'indice complexe n siOx = 1,602 + 3,2 x 10“ 3 x i.

Plus généralement, la valeur du coefficient d'absorption est comprise entre lxlO -8 et lxlO -2 , le principe étant de privilégier un coefficient d'absorption le plus faible possible pour la couche d'extrémité. Une telle approche permet, en jouant sur l'absorption de la couche d'extrémité, de contrôler l'amplitude du champ évanescent, et donc l'intensité du signal de fluorescence arrivant sur le détecteur (et ainsi d'améliorer les performances d'imagerie en microscopie TIRF).

On décrit ci-après les étapes principales du procédé de fabrication d'une lame optique selon un mode de réalisation particulier de l'invention. Le procédé consiste à procéder au dépôt, sur une plaque de substrat en verre, telle qu'une lamelle de microscopie par exemple, d'une pluralité de couches minces successives et alternées d'un premier matériau diélectrique et d'un deuxième matériau diélectrique de manière à constituer un empilement de multicouches diélectriques (tel que l'empilement diélectrique 12 par exemple).

On rappelle que la nature, l'épaisseur et le nombre de couches minces pour chacun des deux matériaux diélectriques sont préalablement déterminés pour que le résonateur ainsi obtenu soit en mesure de supporter un mode de résonance optique de surface (selon le principe évoqué plus haut) à la longueur d'onde d'éclairage X et l'angle d'incidence 0 en régime de réflexion totale interne.

Le dépôt de chaque couche mince est réalisé au moyen d'une des techniques suivantes (sans être exhaustif) : évaporation sous vide, pulvérisations sous vide, procédé sol-gel, enduction centrifuge, dépôt chimique en phase vapeur, dépôt par plasma.

L'invention offre ainsi la possibilité d'une production de lames optiques à exaltation de champ électromagnétique dont les caractéristiques peuvent être aisément adaptées en fonction des paramètres d'imagerie requis par le système de microscopie. Comme indiqué plus haut, l'épaisseur, le nombre et le type de matériau sont des caractéristiques de l'empilement selon l'invention qui peuvent être adaptées au cas par cas, en fonction notamment des paramètres d'imagerie du système et des conditions d'éclairage souhaitées ou imposées. On privilégiera des matériaux optiquement transparents dans la bande spectrale utilisée pour mener l'étude, dont les valeurs de dispersion de l'indice de réfraction et du coefficient d'absorption sont connues et maîtrisées. De telles caractéristiques doivent permettre, à un angle d'incidence et une longueur d'onde d'éclairage prédéterminés de la lame optique en régime de réflexion totale, une absorption optique dans la couche libre de l'empilement exaltant le champ électromagnétique évanescent à l'interface libre de l'empilement.