Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
BIOSYNTHESIS OF DERIVATIVES OF MONACOLIN J
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2010/043748
Kind Code:
A1
Abstract:
A procedure is described for the obtainment of derivatives of monacolin J (I), wherein R1 is COR2, wherein R2 is selected from C1-C15 alkyl, C3-C15 cycloalkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, aryl and heterocyclyl, comprising the production of monacolin J through fermentation commencing from a monacolin J-producing microorganism, and the acylation of the hydroxyl group present in position C8 of the monacolin J previously obtained through the addition to the fermentation medium of an appropriate acylating agent to obtain the desired derivative of monacolin J (I).

Inventors:
CAMPOY GARCIA SONIA (ES)
ZAFRA GOMEZ ALBERTO (ES)
ADRIO FONDEVILA JOSE LUIS (ES)
VELASCO ALVAREZ JAVIER (ES)
Application Number:
PCT/ES2009/070436
Publication Date:
April 22, 2010
Filing Date:
October 14, 2009
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
NEURON BIOPHARMA SA (ES)
CAMPOY GARCIA SONIA (ES)
ZAFRA GOMEZ ALBERTO (ES)
ADRIO FONDEVILA JOSE LUIS (ES)
VELASCO ALVAREZ JAVIER (ES)
International Classes:
C07D309/30; A61K31/365; C12P17/06; C12R1/645
Domestic Patent References:
WO2005066150A12005-07-21
WO2005040107A22005-05-06
WO2007139871A22007-12-06
Foreign References:
US20040033570A12004-02-19
JPS60196183A1985-10-04
JPS55139396A1980-10-31
US6943017B22005-09-13
JPS55139396A1980-10-31
JPS60176595A1985-09-10
CA1199322A1986-01-14
US4444784A1984-04-24
US5159104A1992-10-27
US4450171A1984-05-22
US4820850A1989-04-11
US5393893A1995-02-28
US5763646A1998-06-09
Other References:
MOORE ET AL., J AM CHEM SOC, vol. 107, 1985, pages 3694 - 3701
ENDO ET AL., J ANTIBIOT, vol. 38, 1985, pages 444 - 448
HENDRICKSON ET AL., CHEM BIOL, vol. 6, 1999, pages 429 - 439
KENNEDY ET AL., SCIENCE, vol. 284, 1999, pages 1368 - 1372
HOFFMAN ET AL., J MED CHEM, vol. 29, 1986, pages 849 - 852
XIE ET AL., CHEM BIOL, vol. 13, 2006, pages 1161 - 1169
XIE, TANG, APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 73, 2007, pages 2054 - 2060
See also references of EP 2380571A4
Attorney, Agent or Firm:
ARIAS SANZ, Juan (ES)
Download PDF:
Claims:
REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para Ia obtención de un derivado de monacolina J de fórmula (I)

(I) donde R1 es COR2, donde R2 se selecciona entre alquilo C1-C15, cicloalquilo C3-C15, alquenilo C2-C15, alquinilo C2-C15, arilo y heterociclilo; que comprende las etapas de: a) producción de monacolina J por fermentación a partir de un microorganismo productor de monacolina J; y b) acilación del grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J obtenida en Ia etapa a) mediante Ia adición al medio de fermentación de un agente acilante apropiado para obtener el derivado de monacolina J de fórmula (I) deseado.

2. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , en el que dicho microorganismo productor de monacolina J es un microorganismo capaz de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L.

3. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , en el que dicho microorganismo productor de monacol ina J es un microorgan ismo perteneciente a un género seleccionado entre Aspergillus, Monascus, Penicillium, y Neosartorya.

4. Proced im iento seg ú n I a re ivi nd icación 1 , en el q u e d icho microorganismo productor de monacolina J es N. stramenia.

5. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , en el que dicho microorganismo productor de monacolina J es Ia cepa de Neosartorya stramenia CECT 20472. o un muíante de dicho microorganismo que mantiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L.

6. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , en el que dicho agente acilante es un compuesto de fórmula (II)

R2COOH (II) donde R2 tiene el significado previamente indicado en relación con Ia fórmula (I); o un derivado del mismo seleccionado entre un halogenuro, un éster, una amida, un anhídrido o una sal de dicho ácido carboxílico de fórmula (II).

7. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , en el que dicho agente acilante se selecciona entre propionato sódico, 2,2-dimetilpropionato sódico, 2,2-dimetil butirato sódico y 2-metil butirato sódico.

8. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , en el que dicho derivado de monacolina J de fórmula (I) es un compuesto de fórmula (I) en el que R1 se selecciona entre propionilo, 2,2-dimetilpropionilo, 2-metilbutihlo (lovastatina) y 2,2-dimetilbutihlo (simvastatina).

9. Procedimiento según Ia reivindicación 1 , que comprende, además, el aislamiento, y, opcionalmente, purificación, del derivado de monacolina J de fórmula (I) obtenido.

10. Un microorganismo del género Neosartorya, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L.

11. Microorganismo según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque es un microorganismo de Ia especie Neosartorya stramenia depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 20472, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración ig ual o su perior a 50 mg/L, o u n m uíante de d icho microorganismo que mantiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L.

12. Un cultivo biológicamente puro de un microorganismo según Ia reivindicación 10 ú 11.

1 3. Em pl eo d e u n m icroorg a n ismo seg ú n cua l q u iera de l as reivindicaciones 10 ú 11 , para producir monacolina J o un derivado de monacolina J de fórmula (I) según Ia reivindicación 1.

14. Un procedimiento para identificar un microorganismo productor de monacolina J, que comprende: a) incubar un cultivo de un microorganismo en una placa inoculada con un cultivo de Candida albicans bajo cond iciones que perm iten el crecimiento de dicha cepa y de C. albicans; b) analizar Ia existencia de actividad antifúngica asociada a dicho microorganismo; c) en caso de que d icho m icroorgan ismo no man ifieste actividad antifúngica o manifieste una baja actividad antifúngica, recoger una muestra del cultivo de dicho microorganismo y analizarla para detectar y/o cuantificar monacolina J en dicha muestra; y d) en caso de que dicho análisis ponga de manifiesto Ia presencia de mon acol i na J , identifica r a d icho m icroorg a n ismo como u n microorganismo productor de monacolina J.

15. Procedimiento según Ia reivindicación 14, en el que Ia existencia de actividad fungicida asociada a dicho microorganismo se analiza mediante Ia formación de halos de inhibición de crecimiento de C. albicans.

16. Procedimiento según Ia reivindicación 14 ó 15, que comprende, además, utilizar un control positivo de actividad antifúngica.

1 7. Proced im iento según Ia reivind icación 1 6 , que comprende seleccionar los microorganismos que muestran unos halos de inhibición de crecimiento de C. albicans de menor tamaño que el producido por dicho control.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el microorganismo productor de monacolina J identificado es un microorgan ismo capaz de prod ucir y acumular monacol ina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L.

Description:
BIOSÍNTESIS DE DERIVADOS DE MONACOLINA J Campo de Ia Invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para Ia obtención de derivados de monacolina J, un tipo de estatinas, que son compuestos con propiedades hipocolesterolémicas.

Antecedentes de Ia Invención

Las estatinas constituyen un grupo de agentes hipocolesterolémicos que funcionan inhibiendo Ia enzima 3-hidroxi-3-metilglutahl-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, Ia cuál cataliza el paso limitante de Ia biosíntesis celular de colesterol. Estos compuestos son utilizados para disminuir los altos niveles de colesterol asociados a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) reduciendo el riesgo de infarto de miocardio y de muerte coronaria.

Las estatinas naturales (monacolina J, lovastatina, mevastatina y pravastatina) y semisintéticas (simvastatina) presentan una estructura poliquétida común, con un núcleo de hexahidronaftaleno al cual se Ie unen diferentes cadenas laterales en las posiciones C8 (R 1 ) y C6 (R 2 ), y un anillo lactónico, que en función de las condiciones aparece ciclado en forma de lactona o abierto dando lugar a los correspondientes hidroxiácidos (Fórmula A y Tabla 1 ).

Forma Lactona Forma Hidroxiácida

Fórmula A Tabla 1

Las rutas de biosíntesis de lovastatina en Aspergillus terreus y de mevastatina en Penicillium citrinum han sido descritas tanto desde el punto de vista bioquímico (Moore y col, J Am Chem Soc, 1985, 107, 3694-3701 ; Endo y col, J Antibiot, 1985, 38, 444-448) como a nivel molecular (Hendrickson y col, Chem Biol, 1999, 6, 429-439; Kennedy y col, Science, 1999, 284, 1368-1372), y en ella intervienen dos poliquétido sintasas de tipo I y numerosas enzimas. Concretamente, en el caso de Ia lovastatina, Ia lovastatina nonaquétido sintasa (LNS) codificada por el gen LovB, Ia enoil reductasa y citocromo P450 oxigenasas dan lugar a Ia monacolina J (Fórmula A, R 1 =OH, R 2 =CH 3 ). Este intermedio no se acumula sino que directamente se Ie incorpora una cadena lateral mediante Ia actividad de Ia lovastatina diquétido sintasa (LDS), codificada por el gen LovF, y una acetil transferasa (LovD). Además de A. terreus y P. citrinum se conocen otros microorganismos capaces de producir estatinas (lovastatina o mevastatina) tales como algunas especies de los géneros Monascus, Doratomyces, Eupenicillium, Gymnoascus, Hypomyces, Paecilomyces, Phoma, Trichoderma, Pleurotus, y levaduras tales como Pichia labacensis o Candida cariosilognicola (US 6.943.017). La monacolina J se puede obtener a partir de caldos de cultivo de especies productoras de lovastatina pertenecientes al género Monascus (JP

551 39396), o tam bién al añad i r monacol i na K a cepas de hongos pertenecientes a diferentes géneros (ej. Mortierella, Emerícella, Humicola, etc.) que hidrol izan Ia cadena lateral dando lugar a este intermed iario (JP

60176595). Otra estrategia consiste en Ia clonación y expresión, en una cepa no productora de lovastatina, de un fragmento que contenga los genes de A. terreus necesarios para sintetizar monacolina J (US 6.943.017). Sin embargo, en todos estos casos, los rendimientos de monacolina J son bajos por Io que su producción no resulta rentable.

La simvastatina es un análogo semisintético de Ia lovastatina más eficaz en el tratamiento de Ia hipercolesterolemia debido a Ia substitución, por vía química, de Ia cadena lateral de α-metilbutirato en Ia posición C8 (Fórmula A, R 1 ) por una de α-dimetil butirato. Existen numerosos procedimientos químicos para realizar esta modificación que incluyen pasos de hidrólisis, lactonización, protección mediante sililación y acilación de Ia monacolina J protegida con cloruro de α-dimetil butirilo (CA 1.199.322; Hoffman y col, J Med Chem, 1986, 29, 849-852), aunque el rendimiento global es inferior al 40%. Se han descrito variaciones sobre este procedimiento en las patentes US 4.444.784, US 5.159.104 y US 4.450.171 . En otro procedimiento, Ia lovastatina se hace reaccionar con una amina, y el diol de Ia amida resultante se protege y acila con yoduro de metilo y una base dando lugar a un diol que se lactoniza rindiendo simvastatina (US 4.820.850). En una variación mejorada de ese procedimiento, Ia protección de los grupos hidroxilo de Ia lovastatina se realiza con ácido fenil borónico (US 5.393.893). Otros procesos se basan en Ia obtención de nuevos intermedios al reaccionar Ia lovastatina con metoxietilamina (WO05066150), con monoalquilamidas o monocicloalquil- amidas (US 5.763.646), o al realizar una hidrólisis enzimática de Ia lovastatina, su lactonización y posteriores pasos de acilación e hidrólisis qu ímica o enzimática (WO05040107).

Todos estos procesos qu ímicos requ ieren múltiples etapas, son laboriosos, las etapas de protección presentan unos rendimientos bajos, y el producto final presenta impurezas del compuesto no acilado. Todo ello contribuye a que el precio de Ia simvastatina sea unas cinco veces más elevado que el de Ia lovastatina.

Recientemente se ha descrito Ia síntesis de simvastatina mediante un procedimiento químico-biosintético a partir de lovastatina (Xie y col., Chem Biol, 2006, 13, 1161 -1169; Xie y Tang, Appl Environ Microbiol, 2007, 73, 2054-2060; WO2007139871 ). El proceso parte de Ia obtención, por vía qu ímica, de monacol ina J y de un substrato acilado (α-dimetilbutiril-S-metil-mercapto- propionato) que se añaden a células en reposo, o en cultivo, de Escheríchia coli capaces de sobreexpresar el gen LovD de A. terreus que codifica para una aciltransferasa. De esta forma, el substrato acilado, permeable a Ia membrana citoplasmática, se une a Ia monacolina J dando lugar a Ia simvastatina. Sin embargo, este procedimiento tiene limitaciones debido al elevado coste de los substratos y reactivos necesarios en las etapas de síntesis de monacolina J y α-dimetilbutiril-S-metil-mercaptopropionato, así como Ia degradación parcial del substrato acilado durante el proceso.

En base a estos antecedentes, resultaría necesario desarrollar procesos que solucionasen, desde el punto de vista económico y técnico, Ia desventaja de utilizar materias primas que implican un precio elevado, y que fuesen compatibles con el medio ambiente al prescindir o minimizar el uso de reactivos químicos o disolventes.

Compendio de Ia Invención

Los autores de Ia presente invención han desarrollado un nuevo procedimiento para Ia producción de derivados de monacolina J, tales como simvastatina, etc., a partir de un proceso sencillo, económico y favorable desde el punto de vista medioambiental. Concretamente, el procedimiento comprende

Ia obtención de monacolina J por fermentación y Ia acilación del grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J mediante Ia adición al medio de fermentación de agentes acilantes que actúan como precursores de Ia cadena lateral presente en dicha posición C8 en el derivado de monacolina J. Por tanto, en un aspecto, Ia presente invención se relaciona con un procedimiento para Ia obtención de un derivado de monacolina J de fórmula (I) [definido más adelante] que comprende Ia producción de monacolina J por fermentación a partir de un microorganismo productor de monacolina J seguido de acilación del grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J mediante Ia adición al medio de fermentación de un agente acilante apropiado para obtener el derivado de monacolina J de fórmula (I) deseado.

En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un microorganismo del género Neosartorya que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L. En una realización particular, dicho microorganismo es un microorganismo de Ia especie N. stramenia. En una real ización concreta, d icho m icroorgan ismo es un microorganismo de Ia especie Neosartorya stramenia, depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 20472, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración ig ual o su perior a 50 mg/L, o u n m uíante de d icho microorganismo que mantiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L. El empleo de dicho microorganismo para producir monacolina J y dichos derivados de monacolina J de fórmula (I) constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un cultivo biológicamente puro de dicho microorganismo.

En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un procedimiento para identificar un microorganismo productor de monacolina J. En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un polinucleótido seleccionado entre los polinucleótidos cuyas secuencias nucleotídicas se muestran en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. El empleo de dicho polinucleótido como sonda, o para diseñar cebadores o sondas para identificar cepas de Neosartorya stramenia u otras especies del género Neosartorya, constituye un aspecto adicional de esta invención. Descripción detallada de Ia Invención

Definiciones

La presente invención se relaciona con Ia producción de derivados de monacolina J de fórmula (I), tal como se define más adelante. En dichos compuestos de fórmula (I), se entienden los significados que se indican a continuación.

E l térm i no "a l q u i l o" se refi ere a u n rad i ca l d e u n a cad en a hidrocarbonada, lineal o ramificada, que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturaciones y que está unido al resto de Ia molécula por un enlace simple, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, tere-butilo, etc. El grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido.

El término "cicloalquilo" se refiere a un radical estable monocíclico o bicíclico, que está saturado o parcialmente saturado, que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, adamantilo, etc. El grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.

El térm i no "alq uen ilo" se refiere a u n rad ical de u na cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono y que está unido al resto de Ia molécula por un enlace simple, opcionalmente sustituido, por ejemplo, vinilo, alilo, etc. El grupo alquenilo puede estar opcionalmente sustituido.

El térm i no "alq u in ilo" se refiere a u n rad ica l d e u n a caden a hidrocarbonada, lineal o ramificada, que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono y que está unido al resto de Ia molécula por un enlace simple, opcionalmente sustituido, por ejemplo, etinilo, 1 -propinilo, etc. El grupo alquinilo puede estar opcionalmente sustituido.

El término "arilo" se refiere a un radical de un hidrocarburo aromático, que contiene uno o varios anillos, incluyendo anillos múltiples con radicales arilo separados o fusionados; los grupos arilo típicos contienen de 1 a 3 anillos separados o condensados y desde 6 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono, por ejemplo, fenilo, naftilo, indenilo, fenantrilo, antracilo, etc. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos.

El término "heterociclilo" se refere a un radical estable de un anillo de 3 a 15 miembros que contiene átomos de carbono y de uno a cinco heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, preferiblemente un anillo de 4 a 8 miembros con uno o más heteroátomos, más preferiblemente un anillo de 5 ó 6 miembros con uno o más heteroátomos. Para los fines de esta invención, el heterociclo puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico, que puede incluir sistemas de anillos condensados, y el átomo de nitrógeno, carbono o azufre en el radical heterociclilo puede estar opcionalmente oxidado, el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, y el radical heterociclilo puede estar parcial o totalmente saturado o ser aromático. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de tales radicales heterociclilo incluyen piridilo, pirazinilo, pirimidilo, furilo, pirrolilo, tienilo, tiazolilo, tiadiazolilo, ozaxolilo, imidazolilo, indolilo, isoxazolilo, benzofuranilo, benzotiazolilo, benzimidazolilo, isotiazolilo, piperidilo, quinolilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo, morfolino, pirrolidinilo, etc. Los grupos heterociclilo pueden estar opcionalmente sustituidos.

Como se ha indicado, los grupos anteriormente mencionados pueden estar opcionalmente sustituidos en una o varias de sus posiciones disponibles, de forma independiente, por uno o varios sustituyentes adecuados, tales como OR ' , =0, SR ' , SOR ' , SO 2 R ' , NO 2 , NHR ' , N(FT) 2 , =N-R\ NHCOR ' , N(COFT) 2 , NHSO 2 R ' , CN, halógeno, C(=O)FT, COOR ' , OC(=O)FT, arilo sustituido o no sustituido y heterociclo sustituido o no sustituido, donde R' es seleccionado independientemente entre H, OH, NO 2 , NH 2 , SH, CN, halógeno, C(=O)H, C(=O)CH 3 , COOH, alquilo C1 -C12 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C12 sustituido o no sustituido, alquinilo C2-C12 sustituido o no sustituido y arilo sustituido o no sustituido. Entre los sustituyentes halógeno que pueden estar presentes en los compuestos de fórmula (I) se incluyen F, Cl, Br y I. Los grupos funcionales, tales como hidroxilo o amino, pueden hallarse opcionalmente protegidos. Existe un gran número de grupos protectores de diferentes grupos funcionales, tales como hidroxilo y amino, y son bien conocidos por el experto en Ia materia. A modo de guía, véase "Protecting groups, Kocienski, 2004, 3 rd edition y Greene y Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999.

El término "alcohol inferior" se refiere a un compuesto que comprende un grupo -OH y de 1 a 8 átomos de carbono.

Producción de derivados de monacolina J

En un aspecto, Ia presente invención se relaciona con un procedimiento, en adelante procedimiento de Ia invención, para Ia obtención de un derivado de monacolina J de fórmula (I)

(I) donde R 1 es COR 2 , donde R 2 se selecciona entre alquilo C1-C15, cicloalquilo C3-C15, alquenilo C2-C15, alquinilo C2-C15, arilo y heterociclilo; que comprende las etapas de: a) producción de monacolina J por fermentación a partir de un microorganismo productor de monacolina J; y b) acilación del grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J obtenida en Ia etapa a) mediante Ia adición al medio de fermentación de un agente acilante apropiado para obtener el derivado de monacolina J de fórmula (I) deseado.

En Ia primera etapa [etapa a)], el proced imiento de Ia invención comprende Ia producción de monacolina J por fermentación a partir de un microorganismo productor de monacolina J. Aunque prácticamente cualquier microorganismo productor de monacolina J puede ser utilizado para producir el derivado de monacol ina J de fórmula (I) según el proced imiento de Ia inven ción , desde el pu nto d e vista de su a pl icación i nd u strial , el microorganismo productor de monacolina J utilizado en Ia etapa a) es capaz de producir una elevada cantidad de monacolina J; ventajosamente, dicho microorganismo productor de monacolina J, además de producir una elevada cantidad de monacolina J, no debería producir derivados de monacolina J con el grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 acilado, e.g., lovastatina, etc., o, en caso de que los produzca, debería producirlos en cantidades muy pequeñas. En este sentido, en caso de que dicho microorganismo productor de monacolina J produjese, además de monacolina J , otros derivados de monacolina J, por ejemplo, lovastatina, etc., Ia producción de monacolina J debe ser, ventajosamente, superior a Ia producción de dicho derivado de monacolina J; a modo ilustrativo, si el microorganismo productor de monacolina J produce también lovastatina, Ia producción de monacol ina J será, preferentemente, al menos 10 veces superior a Ia producción de lovastatina.

En una real ización particular, el m icroorgan ismo productor de monacolina J utilizado para producir el compuesto de fórmula (I) según el procedimiento de Ia invención, es un microorganismo capaz de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L, ventajosamente igual o superior a 100 mg/L, preferentemente igual o superior a 250 mg/L, más preferentemente igual o superior a 500 mg/L, aún más preferentemente igual o superior a 750 mg/L, y todavía más preferentemente igual o superior a 1 .000 mg/L de caldo de cultivo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de microorganismos productores de monacolina J susceptibles de ser util izados en el proced i m iento de Ia invención incl uyen cepas pertenecientes a los géneros Aspergillus, Monascus, Penicillium, y, ahora, Neosartorya. En una realización concreta, el microorganismo productor de monacolina J utilizado para producir el derivado de monacolina J de fórmula (I) según el procedimiento de Ia invención, es un hongo filamentoso perteneciente al género Neosartorya, tal como un hongo de Ia especie N. stramenia. En una realización preferida, dicho microorganismo productor de monacolina J utilizado para prod ucir el derivado de monacol ina J de fórmu la (I ) segú n el procedimiento de Ia invención, es una cepa de Neosartorya stramenia depositada en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 20472, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L, o un muíante de dicho microorganismo que mantiene Ia capacidad de producir y acumular monacol ina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L, cuyas características se describirán más delante de forma detallada, en ocasiones identificado en esta descripción como "microorganismo de Ia invención".

Para Ia producción de monacolina J por fermentación, el microorganismo productor de monacolina J se cultivará bajo condiciones apropiadas que permitan Ia producción de monacolina J. En general, dichas condiciones, tales como el medio de cultivo, Ia fuente de carbono, Ia fuente de nitrógeno, Ia temperatura, etc., se elegirán en función de Ia naturaleza del microorganismo productor de monacolina J elegido.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fuentes de carbono incluyen glucosa, maltosa, sacarosa, manitol, glicerol, melazas, polietilenglicol, almidón, ácidos grasos, aceites, etc. Asimismo, ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fuentes de nitrógeno incluyen tanto fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura, peptona, licor de macerado de maíz ("corn steep liquor'), urea, leche peptonizada, glutamato sódico, etc., como fuentes de nitrógeno inorgánico tales como diferentes sales de amonio, etc.

En una realización particular, el cultivo del microorganismo productor de monacolina J se realiza durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 15 días a una temperatura comprendida entre 2O 0 C y 35 0 C, preferentemente entre 28 0 C y 32 0 C, en función del microorganismo, con ag itación constante, generalmente bajo condiciones de aerobiosis.

La monacolina J producida por el microorganismo productor de monacolina J puede encontrarse en forma de lactona (más estable), en forma de hidroxiácido (más abundante) o en ambas formas como una mezcla de Ia forma cerrada (lactona) y abierta (hidroxiácido). A continuación, una vez alcanzada Ia cantidad de monacolina J deseada, por ejemplo, Ia máxima cantidad de monacolina J, se adiciona al medio de cultivo un agente acilante apropiado con el fin de acilar el grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J y obtener el derivado de monacolina J de fórmula (I) deseado [etapa b)].

De acuerdo con Ia invención, Ia acilación química de Ia monacolina J consiste en Ia transformación del hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J en un éster. Esta transformación, que da lugar a Ia formación de diferentes cadenas laterales en Ia posición C8 de Ia monacolina J, se consigue mediante Ia adición al medio de cultivo del agente acilante apropiado. Aunque no se desea estar vinculado por ninguna teoría, se cree que dicha reacción de acilación se produce en el interior celular, probablemente con Ia colaboración de una enzima, tal como una aciltransferasa codificada por el gen lovD o un ortólogo del mismo, por Io que, en una realización particular, el microorganismo productor de monacolina J utilizado para producir el derivado de monacolina J de fórmula (I) según el procedimiento de Ia invención codifica dicha aciltransferasa, bien de forma nativa o bien de forma recombinante.

Aunque los agentes acilantes más habituales son los ácidos carboxílicos y sus derivados, tales como sus halogenuros (en particular, los cloruros), esteres, amidas, anhídridos o sales, en Ia presente invención se puede utilizar como agente acilante cualquier compuesto apropiado capaz de acilar el grupo hidroxilo presente en Ia posición C8 de Ia monacolina J y formar un éster en dicha posición C8 monacolina J para obtener el derivado de monacolina J de fórmula (I) deseado. Dichos agentes acilantes pueden ser fácilmente identificados por el experto en Ia materia. No obstante, en una realización particular, dicho agente acilante es un compuesto de fórmula (II)

R 2 COOH (II) donde R 2 tiene el significado previamente indicado en relación con Ia fórmula (I); o un derivado del mismo seleccionado entre un halogenuro, un éster, una amida, un anhídrido o una sal de dicho ácido carboxílico de fórmula (II). Los compuestos de fórmula (II), e.g., ácido propanoico, 2,2- dimetilpropanoico, 2-metilbutanoico, 2,2-dimetilbutanoico, etc., son compuestos conocidos o pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los técnicos en Ia materia. Los halogenuros del ácido carboxílico de fórmula (II) pueden ser obtenidos por métodos convencionales, por ejemplo, por reacción de dicho ácido carboxílico con SOCI2, PCI 5 , PBr 3 , CICOCOCI, etc. Los esteres del ácido carboxílico de fórmula (II) pueden ser fácilmente obtenidos por métodos convencionales, por ejemplo, por reacción de dicho ácido carboxílico, o un anhídrido o cloruro del mismo, con el alcohol correspondiente, o por reacción de Ia sal sódica de dicho ácido carboxílico (II) con un halogenuro de alquilo, etc. Las amidas del ácido carboxílico de fórmula (II) también pueden obtenerse fácilmente por métodos convencionales, por ejemplo, por reacción de un éster, anhídrido o halogenuro de dicho ácido carboxílico con amoníaco o con una amina, o mediante Ia hidrólisis del nitrilo correspondiente, etc. Los anhídridos del ácido carboxílico de fórmula (II) pueden obtenerse fácilmente por métodos convencionales, por ejemplo, por reacción de un halogenuro de dicho ácido carboxílico con un carboxilato, etc. Entre las sales del ácido carboxílico de fórmula (II) se encuentran las sales metálicas, e.g., Ia sal sódica, potásica, amón ica, etc. , las cuales pueden obtenerse fácilmente por métodos convencionales, por ejemplo, por reacción de dicho ácido carboxílico con Ia base apropiada.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos agentes acilantes incluyen acetatos, propionatos, tales como propionato sódico, 2,2-dimetilpropionato sódico, etc., butiratos, tales como 2-metilbutirato, 2,2-dimetilbutirato, etc. En caso de presentar centros qu irales, los agentes acilantes estarán , preferentemente, en Ia forma enantiopura deseada, por ejemplo, (S)-2- metilbutirato sódico, etc.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de derivados de monacolina J de fórmula (I) obtenidos según el procedimiento de Ia invención incluyen aquellos compuestos de fórmula (I) en los que R 1 se selecciona entre propionilo, 2,2- dimetilpropionilo, 2-metilbutihlo (lovastatina) y 2,2-dimetilbutirilo (simvastatina). En una realización particular, Ia reacción de acilación se lleva a cabo con agitación, durante un periodo de tiempo comprendido entre 24 y 72 horas, a una temperatura comprendida entre 2O 0 C y 4O 0 C, preferentemente entre 25 0 C y 3O 0 C. El derivado de monacolina J de fórmula (I) obtenido, si se desea, puede ser aislado y purificado por métodos convencionales. Para ello, dicho compuesto de fórmula (I) puede ser extraído del caldo de cultivo y, si se desea, se concentra, y, opcionalmente, se recristaliza.

La extracción del compuesto de fórmula (I) obtenido tiene por finalidad separarlo del resto de los compuestos presentes en el caldo de cultivo (medio de fermentación). Dicho compuesto de fórmula (I) puede ser extraído del cultivo por métodos convencionales, por ejemplo, por extracción con un disolvente apropiado en medio ácido. Para ello, el caldo de cultivo que contiene el compuesto de fórmula (I) se acid ifica mediante el empleo de un ácido apropiado, orgánico o inorgánico, típicamente inorgánico. En una realización particular, dicho medio de cultivo se acidifica a un valor de pH comprendido entre 2,5 y 5, preferentemente entre 3 y 4. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichos ácidos que pueden ser utilizados para acidificar dicho medio de cultivo incluyen cualquier ácido capaz de acidificar dicho medio de cultivo hasta un valor de pH apropiado, por ejemplo, entre 2,5 y 5, por ejemplo, ácido clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, etc.

Dicha extracción, en una realización particular, puede real izarse utilizando un disolvente apropiado, tal como un disolvente orgánico, por ejemplo, un éster, tal como acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de butilo, etc. La cantidad de disolvente a añadir puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, dicho disolvente se añade en una cantidad comprendida entre 0,5 y 2 veces el volumen de cultivo. La extracción puede llevarse a cabo, si se desea, con agitación, durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 2 horas, a velocidad regulada. Las fases resultantes pueden ser separadas posteriormente por métodos convencionales, por ejemplo, por decantación o centrifugación.

Una vez separado, el compuesto de fórmula (I) aislado, que puede encontrarse en forma cerrada (lactona), abierta (hidroxiácido) o mixta, es decir, en una mezcla de dichas formas cerrada y abierta, si se desea, puede ser concentrado por métodos convencionales, por ejemplo, mediante lactonización simultánea de Ia forma hidroxiácida con vacío y posterior cristalización, por ejemplo, mediante enfriamiento a una temperatura comprendida entre -2O 0 C y - 3O 0 C. Adicionalmente, si se desea, el compuesto de fórmula (I) puede ser sometido a una etapa de recristalización con el fin de incrementar su pureza. En una realización particular, los cristales del compuesto de fórmula (I) previamente obtenidos se filtran y se secan bajo vacío a una temperatura comprendida entre 4O 0 C y 6O 0 C, preferentemente entre 45 0 C y 5O 0 C. Dichos cristales pueden ser solubilizados añadiendo un disolvente apropiado, por ejemplo, un éster, tal como un acetato de alcohol inferior, por ejemplo, acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de propilo o acetato de butilo, y se cristalizan por enfriamiento a una temperatura comprendida entre -2O 0 C y - 3O 0 C, tal como se ha descrito previamente.

Microorganismo de Ia invención

En un aspecto, Ia invención se relaciona con un microorganismo, en adelante microorganismo de Ia invención, del género Neosartorya, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L. En una realización particular, dicho microorganismo, es un microorganismo de Ia especie N. stramenia. En una realización concreta, dicho m icroorgan ismo de Ia invención es un m icroorgan ismo de Ia especie Neosartorya stramenia depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 20472, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L, o un muíante de dicho microorganismo que mantiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L. Tal como aquí se utiliza, Ia expresión "capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L", aplicado a un microorganismo, significa que dicho microorganismo, bajo condiciones adecuadas, es capaz de producir monacolina J alcanzando una concentración superior a 50 miligramos (mg) de monacolina J por litro (L) de caldo de cultivo. Dichas condiciones adecuadas implican el cultivo en un medio de cultivo y temperatura apropiados. En una realización particular, el microorganismo de Ia invención es capaz de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L, ventajosamente igual o superior a 100 mg/L, preferentemente igual o superior a 250 mg/L, más preferentemente igual o superior a 500 mg/L, aún más preferentemente igual o superior a 750 mg/L, y todavía más preferentemente igual o superior a 1.000 mg/L.

La capacidad de un microorganismo de producir y acumular monacolina J (e.g., en una concentración igual o superior a 50 mg/L) puede determinarse por cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, inoculando un cultivo de dicho microorganismo en un medio de cultivo apropiado, incubando bajo condiciones apropiadas y midiendo Ia cantidad de monacolina J producida, tal como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 1 que acompaña a Ia presente descripción. En una realización particular, el microorganismo de Ia invención, es Ia cepa N. stramenia CECT 20472. En otra realización particular, el microorganismo de Ia invención, es un muíante de dicha cepa N. stramenia CECT 20472 que mantiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L. Tal como aquí se utiliza, el término "muíante" incluye a cualquier individuo u organismo resultaníe de una muíación o cambio en el ADN de un gen de un organismo que da como resulíado un carácíer (fenoíipo) que no se encueníra en el íipo salvaje ("wild-íype") así como a cualquier individuo u organismo resulíaníe de una muíación en el ADN de un gen de un organismo que no produce un efecío fenoíípico deíecíable (muíación silenciosa); ejemplos ilusíraíivos, no limiíaíivos, de dichas muíaciones o cambios en el ADN incluyen Ia inserción o deleción de nucleóíidos así como Ia susíiíución de unos nucleóíidos por oíros; en una realización concreía, dicho muíaníe es un muíaníe de N. stramenia CECT 20472 que maníiene esencialmeníe las mismas características que las de Ia cepa parental [N. stramenia CECT 20472], y, además, tiene Ia capacidad de no producir, o producir cantidades muy pequeñas de, lovastatina. Los mutantes pueden ser obtenidos mediante técnicas convencionales conocidas por los técnicos en Ia materia, tales como mutagénesis clásica o dirigida, manipulación genética, recombinación, etc.

El microorganismo de Ia invención puede ser utilizado para producir monacolina J mediante un procedimiento microbiológico (fermentación) y, a partir de dicho compuesto, producir un derivado de monacolina J de fórmula (I), e.g., simvastatina, lovastatina, etc. Desde el punto de vista de Ia aplicación industrial del procedimiento de Ia invención, se prefiere que el microorganismo productor de monacolina J sea capaz de producir una elevada cantidad de monacolina J, y no produzca, o produzca en cantidades minoritarias, otros derivados de monacolina J, e.g., lovastatina. En una realización preferida, el microorganismo de Ia invención es capaz de producir monacolina J en una cantidad igual o superior en 10 veces a Ia cantidad de lovastatina producida (en caso de que produzca dicho compuesto).

El microorganismo de Ia invención ha sido aislado a partir de un screening de microorganismos productores de monacolina J. Para ello, brevemente, se extrajeron tacos de cultivos de distintos microorganismos crecidos en placas y se depositaron sobre otras placas previamente inoculadas con un cultivo de Candida albicans y, tras incubación, se determinó Ia existencia de actividad fungicida mediante Ia formación de halos de inhibición del crecimiento de C. albicans seleccionándose entre las cepas que manifestaron actividad fungicida aquéllas que mostraron halos de inhibición de crecimiento de C. albicans de menor tamaño que el producido por Ia cepa Aspergillus terreus ATCC 20542 utilizada como control. Posteriormente, se extrajeron los derivados de monacolina y se analizaron por UPLC-PDA-MS/MS frente a patrones puros de lovastatina, mevastatina y monacolina J, tal como se indica en el Ejemplo 1. Operando de este modo, se aisló un cepa que producía de forma muy mayoritaha monacolina J y una pequeña cantidad de lovastatina que fue identificada mediante secuenciación de Ia región D1/D2 de Ia subunidad 28S del ADN ribosómico (ADNr) (SEQ ID NO: 1 ) y de un fragmento de Ia región ITS (espaciador interno de transcripción, del inglés "Internal Transcribed Spacer") total situada entre las subunidades 18S y 28S (SEQ ID NO: 2), como Neosartorya stramenia y que fue depositada en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), correspondiéndola el número de acceso CECT 20742.

Dichos polinucleótidos cuyas secuencias nucleotídicas se muestran en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, pueden utilizarse como sondas, o para diseñar cebadores o sondas a partir de ellos, para identificar otras cepas de N. stramenia u otras especies del género Neosartorya; por tanto, d ichos polinucleótidos, así como sus aplicaciones, constituyen aspectos adicionales de Ia presente invención.

La región D1/D2 de Ia subunidad 28S del ADNr (SEQ ID NO: 1 ) de N. stramenia CECT 20742 puede ser amplificada mediante reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), utilizando los oligonucleótidos iniciadores universales de hongos cuyas secuencias nucleotídicas se muestran en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Asimismo, Ia región ITS total situada entre las subunidades 18S y 28S (SEQ ID NO: 2) puede ser amplificada mediante PCR usando los ol igonucleótidos iniciadores universales de hongos cuyas secuencias nucleotídicas se muestran en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Un cultivo biológicamente puro de un microorganismo de Ia invención constituye un aspecto adicional de Ia presente invención.

Como se ha mencionado previamente, el microorganismo de Ia invención puede ser utilizado para producir monacol ina J mediante un procedimiento microbiológico (fermentación) y, a partir de dicho compuesto, producir un derivado de monacolina J de fórmula (I), e.g., simvastatina, lovastatina, etc. Por tanto, en otro aspecto, Ia invención se relaciona con el empleo de dicho microorganismo de Ia invención para producir monacolina J o un derivado de monacolina J de fórmula (I). En una realización particular, el microorganismo de Ia invención es un hongo de Ia especie N. stramenia; en una realización concreta, dicho microorganismo de Ia invención es Ia cepa N. stramenia CECT 20472. Procedimiento para identificar microorganismos productores de monacolina J

En otro aspecto, Ia invención se relaciona con un procedimiento para identificar un microorganismo productor de monacolina J (como producto de biosíntesis), que comprende: a) incubar un cultivo de un microorganismo en una placa inoculada con un cultivo de Candida albicans bajo cond iciones que perm iten el crecimiento de dicha cepa y de C. albicans; b) analizar Ia existencia de actividad antifúngica asociada a dicho microorganismo; c) en caso de que d icho m icroorgan ismo no man ifieste actividad antifúngica o manifieste baja actividad antifúngica, recoger una muestra del cultivo de dicho microorganismo y analizarla para detectar y/o cuantificar monacolina J en dicha muestra; y d) en caso de que dicho análisis ponga de manifiesto Ia presencia de monacolina J, identificar a dicho microorganismo como un microorganismo productor de monacolina J.

El procedimiento comprende poner en contacto un cultivo de un microorganismo con un cultivo de C. albicans depositado sobre una placa bajo condiciones que permiten el crecimiento de dicha cepa y de C. albicans. Dichas condiciones son conocidas por los técnicos en Ia materia; no obstante, en una realización particular, un cultivo del microorganismo a ensayar se deposita sobre placas de un med io que contienen extracto de malta, glucosa, micopeptona y agar previamente inoculadas con un cultivo de C. albicans (e.g.,

C. albicans CECT 1002); a continuación, se mantienen las placas a 4 0 C durante 1 hora y posteriormente se incuban a 28 0 C durante una noche.

A continuación, se procede a analizar Ia existencia de actividad antifúngica asociada a dicho microorganismo, Io que puede realizarse por cualquier método convencional apropiado, con el fin de seleccionar aquellos microorganismos con nula o baja actividad antifúngica; no obstante, en una realización particular, Ia existencia de actividad antifúngica asociada a dicho microorganismo se analiza mediante Ia formación de halos de inhibición de crecimiento de C. albicans. Para evaluar si un microorganismo no manifiesta actividad antifúngica o manifiesta una baja actividad antifúngica puede resultar conveniente comparar dicha eventual actividad antifúngica con Ia de un control positivo de actividad antifúngica y se seleccionan aquellos microorganismos que manifiestan menor actividad antifúngica que el control o que no manifiestan actividad antifúngica. Por tanto, en una realización particular, se utiliza un control positivo de actividad antifúngica que se inocula sobre una placa inoculada con C. albicans bajo condiciones apropiadas que permiten el crecimiento tanto de dicho microorganismo control como de C. albicans; aunque prácticamente cualquier microorganismo productor de compuestos antifúngicos puede ser utilizado, en Ia práctica resulta interesante utilizar microorganismos productores de estatinas (e.g., lovastatina), ya que Ia forma β-hidroxiácida de Ia lovastatina tiene propiedades antifúngicas, y seleccionar los microorganismos que muestran unos halos de inhibición de menor tamaño que el producido por dicho control; en una realización concreta se utiliza como control Ia cepa de Aspergillus terreus ATCC 20542 (Ejemplo 1 ).

En caso de que el m icroorgan ismo en cuestión man ifieste una prácticamente nula o baja actividad antifúngica, se recoge una muestra del cultivo de dicho microorganismo y se analiza para detectar y/o cuantificar monacolina J en dicha muestra. Prácticamente cualquier análisis apropiado para detectar monacolina J o para cuantificarla puede ser utilizado; no obstante, en una realización particular, Ia detección y cuantificación de monacolina J se lleva a cabo mediante Cromatografía Líquida de Ultra Alta Presión-Masas/Masas (UPLC-PDA-MS/MS) frente a patrones pu ros de monacolina J. Adicional y opcionalmente pueden analizarse otros compuestos relacionados, e.g., lovastatina o mevastatina (Ejemplo 1 ). Para ello, se procede previamente a extraer Ia monacolina J mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante extracción con un disolvente apropiado (e.g., un éster, tal como acetato de etilo, etc.) en medio ácido (e.g., HCI, etc.), tal como se describe en el Ejemplo 1. En una realización particular, el microorganismo productor de monacolina J es un microorganismo capaz de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L, ventajosamente igual o superior a 100 mg/L, preferentemente igual o superior a 250 mg/L, más preferentemente igual o superior a 500 mg/L, aún más preferentemente igual o superior a 750 mg/L, y todavía más preferentemente igual o superior a 1 .000 mg/L. En caso de que dicho análisis ponga de manifiesto Ia presencia de monacolina J, se identifica a dicho microorganismo como un microorganismo productor de monacolina J. En caso necesario, se procede a caracterizar dicho microorganismo productor de monacolina J por métodos apropiados en función de su naturaleza, e.g., mediante métodos clásicos de microbiología, análisis de regiones del genoma específicas de género, especie o cepa (e.g., regiones específicas de Ia subunidad 28S del ADN ribosómico, regiones ITS específicas, etc.) mediante el empleo de técnicas convencionales, e.g., amplificación en cadena de Ia polimerasa (PCR), etc.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de microorganismos productores de monacolina J identificados según el procedimiento proporcionado por esta invención incluyen cepas pertenecientes a los géneros Aspergillus, Monascus, Penicillium, y , a h o ra , Neosartorya. En u na real ización particu la r, el microorgan ismo productor de monacol ina J identificado según d icho procedimiento es Ia cepa N. stramenia CECT 20472, que tiene Ia capacidad de producir y acumular monacolina J en una concentración igual o superior a 50 mg/L.

Los siguientes ejemplos ilustran Ia invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de Ia misma.

EJEMPL0 1

Selección de microorganismos capaces de producir v acumular monacolina J

A partir de cultivos de distintos hongos aislados a partir de muestras de tierras crecidos en placas con medio M2 (conteniendo por litro: 45 g de glucosa, 2,5 g de polietilenglicol P2000, 24 g de leche peptonizada y 2,5 g de extracto de levadura) se extrajeron tacos de 0,6 cm de d iámetro y se depositaron sobre placas de medio MA (conteniendo por litro: 20 g de extracto de malta, 20 g de glucosa, 1 g de micopeptona y 10 g de agar) previamente inoculadas con un cultivo de Candida albicans CECT 1002. Las placas se mantuvieron a 4 0 C durante 1 hora y posteriormente se incubaron a 28 0 C durante toda Ia noche. La existencia de actividad antifúngica se determinó mediante Ia formación de halos de inhibición del crecimiento de C. albicans. Entre las cepas que manifestaron actividad fungicida se seleccionaron aquellas cepas que mostraron halos de inhibición de menor tamaño que el producido por Ia cepa Aspergillus terreus ATCC 20542 (cepa productora de lovastatina) utilizada como control. A partir de las placas de las cepas seleccionadas se extrajeron unos tacos de 0,6 cm de diámetroque se introdujeron en un tubo Eppendorf de 2 mL; seguidamente se adicionó 1 mL de acetato de etilo acidificado (con HCI) y el tubo se colocó en un baño de ultrasonidos durante 10 minutos. A continuación se centrifugó a 12.000 rpm durante 3 minutos y el sobrenadante se separó a un tubo nuevo y se llevó a sequedad bajo corriente de nitrógeno. El precipitado se resuspendió en 1 mL de metanol, se filtró y se analizó por UPLC-PDA-MS/MS frente a patrones puros de lovastatina, mevastatina y monacolina J.

Mediante este procedimiento se aislaron 197 cepas de distintos microorganismos capaces de producir compuestos con actividad fungicida de las cuáles 186 mostraron halos de inhibición de menor tamaño que Ia cepa A. terreus ATCC 20542 (control). El análisis mediante UPLC-PDA-MS/MS permitió identificar 3 cepas que producían lovastatina, 2 cepas que producían mevastatina y 1 cepa que producía de forma muy mayoritaria monacolina J y una pequeña cantidad de lovastatina. Esta última se identificó mediante secuenciación de Ia región D1/D2 de Ia subunidad 28S del ADN ribosómico (ADNr) y de un fragmento de Ia región ITS (espaciador interno de transcripción, del inglés "Internal Transcribed Spacer") total situada entre las subunidades 18S y 28S, como Neosartorya stramenia, que no presentaba ninguna similitud frente a las secuencias de esta especie depositadas en las bases de datos existentes. La cepa Neosartorya stramenia ha sido depositada en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia (España), el 16 de enero de 2008, correspondiéndola el número de acceso CECT 20742. La amplificación de Ia región D1/D2 de Ia subunidad 28S del ADNr de dicho microorganismo se llevó a cabo mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), utilizando los oligonucleótidos iniciadores cuyas secuencias nucleotídicas se muestran en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las condiciones para Ia PCR fueron las siguientes: (i) 96 0 C durante 5 minutos; (ii) 30 ciclos (94 0 C, 30 segundos; 6O 0 C, 40 segundos; 72 0 C, 1 minuto); y finalmente, (iii) un ciclo de elongación a 72 0 C durante 10 minutos. Asimismo, Ia región ITS total situada entre las subunidades 18S y 28S también se amplificó mediante PCR, usando los oligonucleótidos iniciadores cuyas secuencias nucleotídicas se muestran en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. Las condiciones para Ia PCR fueron las mismas que las utilizadas para Ia amplificación de dicha región D1/D2.

EJEMPLO 2 Producción de monacolina J por fermentación

A partir de una suspensión de esporas de N. stramenia CECT 20742 se inocularon placas de medio Power (conteniendo por litro: 15 g de sacarosa, 2,5 g de peptona bacteriológica, 2,5 g de lactosa, 0,5 g de licor de macerado de maíz ("corn steep liquor"), 2 g de NaCI, 1 g de NaNO 3 , 26,1 g de KCI, 0,25 g de K 2 HPO 4 , 0,25 g de MgSO 4 -7H 2 O, 0,03 g de KH 2 PO 4 , 0,005 g de FeSO 4 -7H 2 O, 0,0015 g de FeCI 3 -6H 2 O y 0,0005 g de CuSO 4 -5H 2 O) y se incubó a 28 0 C durante 5 días. Las esporas de cada placa se recogieron en 5 mL de glicerol al 20% y se utilizaron para inocular matraces conteniendo 30 mL de medio M2 (Ejemplo 1 ). Los matraces se incubaron a 28 0 C y 200 rpm de agitación durante 48 horas.

Estos cultivos se utilizaron para inocular matraces conteniendo medio M2 y se incubaron a 28 0 C, 200 rpm durante 2-5 días. A continuación, los caldos se mezclaron obteniéndose un contenido en monacolina J de 310 mg, en una concentración de 70 mg/L, determinado mediante UPLC-PDA que se purificó de Ia manera que se indica a continuación. El caldo se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos y se separaron el sobrenadante del caldo y el micelio. Este último se resuspendió en 150 mL de agua y se sometió a fuerte agitación durante 1 hora. El proceso se repitió 2 veces. Los filtrados se mezclaron con el sobrenadante del caldo y el pH se ajustó a 3,5 con ácido sulfúrico diluido. La extracción se realizó con 3 x 300 mL de acetato de etilo en constante agitación durante 30 minutos cada vez. Los extractos de acetato de etilo combinados se secaron con sulfato sódico anhidro y se concentraron a vacío hasta obtener un volumen de 100 mL. A continuación, se realizó Ia lactonización mediante Ia adición de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente y con agitación constante. La formación de las lactonas se confirmó mediante UPLC-MS/MS. Después de completar Ia formación de las lactonas se lavó con 2 x 20 mL de hidrógeno carbonato de sodio acuoso al 5% y después con 20 mL de agua, se secó con sulfato sódico anhidro y se evaporó a vacío. A continuación, el residuo obtenido se resuspendió en 40 mL de acetato de etilo y n-hexano (20:80) y se pasó a través de una columna de gel de sílice de 1 ,2 cm de diámetro y una altura de lecho de 20 cm . La elución se realizó mediante mezclas de acetato de etilo y n-hexano incrementándose Ia concentración de acetato de etilo de forma gradual. Las fracciones conteniendo Ia lactona de Ia monacolina J se eluyeron de Ia columna a una mezcla de acetato de etilo al 45% y n-hexano al 55%. Las fracciones se combinaron y se evaporaron al vacío. El residuo obtenido se disolvió en 10 mL de acetona y se guardó a 4 0 C durante una noche. El precipitado se filtró, se lavó con 2 mL de acetona y con 2 mL de n-hexano secándose a vacío a temperatura ambiente. La monacolina J obtenida se resuspendió en 20 mL de metanol, se decoloró añadiendo 10 g de carbón activo y se cristalizó a -2O 0 C con una mezcla de etanol-acetato de etilo. Por último los cristales se secaron a vacío a temperatura ambiente.

EJEMPLO 3

Producción de simvastatina

Una suspensión de esporas de N. stramenia CECT 20742 preparada como se indica en el Ejemplo 2, se utilizó para inocular matraces conteniendo 25 mL de medio MEB (conteniendo por litro: 15 g de extracto de malta, 1 g de peptona bacteriológica y 20 g de glucosa). Los matraces se incubaron a 28 0 C y 250 rpm de agitación durante 48 horas. Estos cultivos se utilizaron para inocular (10% v/v) matraces conteniendo 50 ml_ de medio M2 (Ejemplo 1 ) y se incubaron a 28 0 C, 250 rpm durante 48 horas. Transcurrido ese tiempo se añadió a los cultivos 2,2-dimetil butirato sódico (0,1 %) (p/v) manteniendo las mismas condiciones de incubación. Los cultivos se crecieron durante 72-96 horas más.

La presencia de simvastatina en el caldo de cultivo se comprobó mediante Ia toma de muestras del caldo, que se extrajeron con acetato de etilo, se concentraron a vacío y se resuspendieron en metanol antes de analizarlas mediante UPLC. Finalmente, el caldo de cultivo se sometió al proceso de lavado, extracción y purificación que se indica en el Ejemplo 2.

EJEMPLO 4 Producción del compuesto de fórmula (I) en el que R 1 es propionilo

Matraces conteniendo 50 mL de medio M2 se inocularon (10% v/v) con inóculos crecidos en medio MEB tal como se indica en el Ejemplo 3 y se incubaron a 28 0 C, 250 rpm durante 48 horas. Transcurrido ese tiempo se añadió a los cultivos propionato sódico (0,1 %) (p/v) manteniendo las mismas condiciones de incubación. Los cultivos se crecieron durante 72-96 horas más. La presencia del compuesto de fórmula (I) en el que R 1 es propionilo,

[(1 S,3R7R,8S,8aR)-8-[2-[(2R,4R)-4-hidroxi-6-oxo-oxan-2-il]etil] -3,7-dimetil- 1 ,2,3,7,8,8a-hexahidro-naftalen-1 -il]propionato, en los caldos de cultivo se comprobó mediante Ia toma de muestras del caldo, que se extrajeron con acetato de etilo, se concentraron a vacío y se resuspendieron en metanol antes de analizarlas mediante UPLC. Finalmente, el caldo de cultivo se sometió al proceso de lavado, extracción y purificación que se indica en el Ejemplo 2.

EJEMPLO 5

Producción del compuesto de fórmula (I) en el que R 1 es 2,2- dimetilpropionilo Matraces conteniendo 50 ml_ de medio M2 se inocularon (10% v/v) con inóculos crecidos en medio MEB tal como se indica en el Ejemplo 3 y se incubaron a 28 0 C, 250 rpm durante 48 horas. Transcurrido ese tiempo se añadió a los cultivos 2,2-dimetil propionato sódico (0,1 %) (p/v) manteniendo las mismas condiciones de incubación que se indican en el Ejemplo 3 durante 72- 96 horas más.

La presencia del compuesto de fórmula (I) en el que R 1 es 2,2- dimetilpropionilo, [(1 S,3R,7R,8S,8af?)-8-[2-[(2R,4R)-4-hidroxi-6-oxo-oxan-2- il]etil]-3,7-dimetil-1 ,2,3,7,8,8a-hexahidro-naftalen-1 -il]-2,2-dimetilpropionato, en los caldos de cultivo se comprobó mediante Ia toma de muestras del caldo, que se extrajeron con acetato de etilo, se concentraron a vacío y se resuspendieron en metanol antes de analizarlas mediante UPLC. Finalmente, el caldo de cultivo se sometió al proceso de lavado, extracción y purificación que se indica en el Ejemplo 2.