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Patent Searching and Data


Title:
CHAMBER FOR CELL CULTURE ON BIOMATERIALS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/111605
Kind Code:
A1
Abstract:
Chamber for cell culture on biomaterials, designed especially for use in a bioreactor, which is divided into a base (1) and an upper cover (2) that complement one another and which guarantee the leaktightness of the chamber closure. In the base (1) there is a channel (2) arranged longitudinally therein and within which there are uniformly spaced wells (3) designed to accommodate culture samples (14). In the upper cover (6) there is an inlet (7) and an outlet for the fluid flowing through, such that when the chamber is closed said inlet and outlet are in communication with the channel (2) in the base (1).

Inventors:
VILABOA DÍAZ NURIA (ES)
CALZADO MARTÍN ALICIA (ES)
CRESPO GARCÍA LARA (ES)
SALDA A QUERO LAURA (ES)
MOREO CALVO PEDRO (ES)
ALASTRUÉ VERA VÍCTOR (ES)
Application Number:
PCT/ES2013/070819
Publication Date:
July 24, 2014
Filing Date:
November 26, 2013
Export Citation:
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Assignee:
FUNDACIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO LA PAZ (ES)
CT DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA EN RED EN BIOINGENIERÍA BIOMATERIALES Y NANOMEDICINA CIBER BBN (ES)
International Classes:
C12M3/00; C12R1/91
Domestic Patent References:
WO2007080600A12007-07-19
WO2010048417A22010-04-29
Foreign References:
ES2341975T32010-06-30
ES2295466T32008-04-16
Attorney, Agent or Firm:
PONS ARIÑO, Angel (ES)
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Claims:
R E I V I N D I C A C I O N E S

1. - Cámara de cultivo celular sobre biomateriales especialmente diseñada para ser empleada en un biorreactor de flujo caracterizada por que comprende una base (1 ) y una tapa supenor (6) vinculadas entre sí por unos medios de unión que permiten fijar la posición de dicha base (1 ) a dicha tapa superior (6) cuando están en contacto provocando el cierre de la cámara, y porque la base (1 ) comprende en su cara superior un canal (2) longitudinal en el que se encuentran equiespaciadamente unos pozos (3) destinados al alojamiento de unas muestras (14) de cultivo, y la tapa supenor (6) comprende una entrada (7) y una salida del fluido que son pasantes y que se comunican con el canal (2) en la posición de cierre de la cámara.

2. - Cámara de cultivo celular sobre biomateriales según la reivindicación 1 caracterizada por que comprende unas coronas (1 1 ) destinadas a ser alojadas en los pozos (3) fijando la posición de la muestra (14), y que comprenden un anillo inferior (12) del que dimanan superiormente unos dientes (13) que quedan en contacto con la superficie inferior de la tapa superior (6) en la posición de cierre de la cámara.

3. - Cámara de cultivo celular sobre biomateriales según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que la base (1 ) comprende una acanaladura (5) que se extiende alrededor del canal (2) y comprende una junta tonca (8) destinada a ser alojada en la acanaladura (5).

4. - Cámara de cultivo celular sobre biomateriales según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada por que los pozos (3) comprenden unas muescas (4) laterales destinadas a facilitar la extracción de la muestra (14).

Description:
CÁMARA DE CULTIVO CELULAR SOBRE BIOMATERIALES

D E S C R I P C I Ó N OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención propone una cámara de cultivo celular para el análisis de biomateriales, es decir un dispositivo que aloja un soporte y unas células en cultivo, permitiendo la incubación en perfusión de células adherentes sobre muestras de materiales 2D o 3D.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La investigación en biomateriales para reparación y regeneración tisular ha conducido a la búsqueda de sistemas experimentales en ambientes controlados que mimeticen estos procesos fisiológicos ex vivo. El cultivo de células sobre biomateriales se realizaba tradicionalmente de forma estática, bajo condiciones estándar de cultivo. Sin embargo, muchos de los tejidos susceptibles de ser reparados con biomateriales están expuestos a un entorno dinámico en el que la estimulación mecánica regula su organización, crecimiento, maduración y funcionalidad.

A nivel celular, el proceso de transduccion de señales celulares en respuesta a estímulos mecánicos se conoce como mecanotransducción. Este fenómeno implica la activación de mecanosensores como integrinas y canales de calcio, proteínas de adhesión célula-célula, estructuras de membrana como el cilio primario, receptores superficiales como caveolinas, constituyentes del citoesqueleto, proteínas de matriz extracelular así como proteínas localizadas en los focos de adhesión. La estimulación de los mecanosensores celulares conduce a la activación de diversas rutas de señalización intracelular y la secreción de factores solubles, que a su vez regulan la expresión de genes relacionados con crecimiento, migración, diferenciación y supervivencia celular. La respuesta celular al estímulo mecánico ha sido ampliamente estudiada en el estado de la técnica en diferentes tipos celulares. A partir de dichos estudios se sabe que los osteocitos, osteoblastos y osteoclastos controlan la remodelación adaptativa del tejido óseo en respuesta a la percepción así como a la falta de carga; las células musculares lisas modifican su morfología, tasa de crecimiento y migración tras incrementar la presión intraluminal en los vasos sanguíneos; el estrés mecánico altera la expresión de genes relacionados con la formación de matriz extracelular en fibroblastos de tendón y cornea y las células endoteliales expresan genes que codifican factores ateroprotectores en respuesta al estrés de cizallamiento que provoca el flujo sanguíneo.

El estímulo mecánico generado por el flujo de fluido influye de manera determinante en la reparación y regeneración tisular. Para investigar el comportamiento celular bajo condiciones dinámicas se han desarrollado biorreactores, habiendo permitido el estado de la técnica el desarrollo de sustitutos funcionales de tejidos y órganos como hueso, cartílago, músculo, hígado o riñon que se consiguen mediante el uso combinado de células troncales, materiales sintéticos y factores de crecimiento. Los biorreactores incorporan un sistema de perfusión que permite impulsar flujo de fluido a velocidades controladas a través de cámaras de cultivo, que en su mayoría están diseñadas para garantizar el paso de caudal a través de los poros de materiales 3D. También se conocen dispositivos de cultivo celular que permiten el paso de fluido sobre superficies dispuestas en dirección perpendicular a la del flujo. La tecnología disponible se basa en el cultivo de células sobre el espacio confinado por canales con diversas geometrías bajo condiciones de perfusión y se emplea para la realización de ensayos de adhesión, migración y formación de acúmulos celulares. El problema técnico que surge a partir de la tecnología conocida es que dicha tecnología solamente permite el cultivo de células sobre el matenal con el que se han fabricado los dispositivos y no sobre muestras de matenal proporcionadas por el usuario.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve el problema técnico planteado mediante una cámara de cultivo celular sobre biomateriales que permite cultivar células en condiciones de perfusión sobre muestras con diferentes propiedades físicas y químicas, y con diferentes geometrías y espesores. La cámara comprende un alojamiento interior que permite inmovilizar muestras de materiales 2D y 3D con distintas propiedades físicas, químicas y mecánicas, en cuya superficie se incuban células adherentes. En la cámara de cultivo las células son sometidas a fuerzas tangenciales provocadas por el paso del fluido que mimetizan los estímulos mecánicos que actúan en condiciones fisiológicas. Los elementos esenciales que comprende la presente cámara de cultivo son una base en la que se dispone un canal, por el que pasa el fluido para realizar la incubación en perfusión, en cuyo interior se ubican unos pozos destinados a alojar las muestras objeto de estudio. Cuando se abre el paso del fluido, éste pasa por el canal y baña las muestras que están en los pozos. En la tapa superior hay una entrada de fluido y una salida de fluido que son pasantes.

La base y la tapa superior están vinculadas entre sí por unos medios de unión que permiten fijar su posición relativa cuando están en contacto. El cierre de la cámara se produce cuando la base y la tapa superior están en contacto y su posición queda fijada por los medios de unión. Cuando la cámara está cerrada, la entrada y la salida de fluido de la tapa superior quedan conectadas con el canal de la base.

Es necesario garantizar la estanqueidad del cierre de la cámara y por eso la cámara puede disponer de una junta de estanqueidad. En este caso, la base comprende una acanaladura destinada a alojar dicha junta y que se extiende alrededor del canal. La cámara de la presente invención puede comprender también unas coronas que se colocan en los pozos con el objeto retener las muestras cuando éstas tienen una baja rigidez mecánica y un pequeño espesor. Cuando la cámara de cultivo está abierta se pueden alojar muestras en los pozos, no siendo necesario colocar muestras en todos ellos. Una vez cerrada, la cámara es estanca.

La distancia que hay entre la entrada de fluido y el pozo más cercano a ella es suficiente como para que el flujo se encuentre totalmente desarrollado a la altura de dicho primer pozo. Esta distancia puede ser estimada para el rango habitual de caudales de trabajo en cultivos celulares mediante métodos convencionales de mecánica de fluidos para el cálculo de longitudes de entrada en conductos.

Las dimensiones y geometría del canal y los pozos, así como el número de estos últimos, pueden ser definidas por el usuario en función del tamaño y número de muestras.

En una realización preferente la cámara está fabricada en un material transparente en cuyo caso se pueden visualizar las muestras mediante distintos tipos de microscopía. Por ejemplo, en un ensayo de cultivo la cámara se puede extraer periódicamente del sistema que le proporciona flujo y controla las condiciones de cultivo y se puede disponer en un microscopio para la observación de las células y las muestras. Este proceso lleva varios minutos, durante los cuales las células permanecen vivas, puesto que se encuentran alojadas en el interior de la cámara, sumergidas en medio de cultivo y sin entrar en contacto con la atmósfera exterior, que no es estéril. Posteriormente, la cámara se devuelve al sistema de flujo y el cultivo continúa. También puede utilizarse un sistema de microscopía con una cámara de ambiente controlado en la que pueda disponerse el medio de impulsión de flujo, en cuyo caso se puede realizar microscopía en tiempo real de forma continua a lo largo de todo el proceso de cultivo.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1.- Muestra una vista explosionada de la cámara de cultivo celular sobre biomateriales de la invención.

Figura 2 - Muestra una sección longitudinal de la cámara de cultivo cuando está cerrada.

Figura 3.- Muestra una vista de la corona que se emplea cuando se analizan muestras de materiales de baja rigidez mecánica y pequeño espesor. Figura 4.- Muestra una sección longitudinal similar a la anterior pero en este caso se han dispuesto en la cámara de cultivo muestras de baja rigidez mecánica o pequeño espesor por lo que se emplean unas coronas como la mostrada en la figura 3. REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Seguidamente se describe, con ayuda de las figuras 1 a 4 anteriormente referidas, una realización preferente de la invención. La cámara de cultivo celular sobre biomateriales de la presente invención permite el cultivo celular sobre biomateriales en un biorreactor de flujo. La cámara comprende esencialmente una base (1 ) y una tapa superior (6) vinculadas entre sí por unos medios de unión que permiten fijar la posición de dicha base (1 ) a dicha tapa superior (6) cuando están en contacto. En una realización preferente los medios de unión son unos tornillos (9) y unas tuercas

(10) . Los tornillos (9) se introducen desde la cara inferior de la base (1 ) hasta sobresalir por la cara superior de la tapa superior (6) donde se fijan con las tuercas (10). El cierre de la cámara se produce cuando la base (1 ) y la tapa superior (6) están en contacto y su posición queda fijada con los medios de unión. La base (1 ) comprende en su cara superior un canal (2) longitudinal en el que se encuentran equiespaciadamente unos pozos (3) destinados al alojamiento de las muestras (14) que se van a cultivar.

La tapa superior (6) comprende una entrada (7) y una salida del fluido que son pasantes y que se comunican con el canal (2) en posición de cierre de la cámara.

Para garantizar la estanqueidad del cierre, la cámara de cultivo puede comprender en la base (1 ) una acanaladura (5) que se extiende alrededor del canal (2) en la base (1 ), en el interior de la que se coloca una junta tonca (8). En la figura 1 se muestra una vista explosionada de la cámara de cultivo de la invención y en la figura 2 se muestra la cámara ya cerrada con las muestras (14) objeto de estudio colocadas en los pozos (3). La entrada y la salida del fluido pueden tener un acabado en espiga que permite una conexión rápida de un tubo flexible.

La cámara de cultivo comprende, en una realización preferente, unas coronas

(1 1 ) , que se aprecian en la figura 3, destinadas a ser alojadas en los pozos (3) sobre la muestra (14), fijando la posición de ésta. Las coronas (1 1 ) comprenden un anillo inferior (12), cuya superficie inferior queda en contacto con la muestra (14). Esta realización permite trabajar con muestras de baja rigidez mecánica y de pequeño espesor. De la superficie superior del anillo inferior (12) dimanan unos dientes (13) que quedan en contacto con la superficie inferior de la tapa superior (6) cuando se produce el cierre de la cámara.

Al producirse el cierre de la cámara, los dientes (13) quedan en contacto con la tapa superior (6) y la posición de la corona (1 1 ) y la muestra (14) quedan fijadas al pozo (3). En la figura 4 se aprecia una cámara de cultivo celular de la invención en la que se están analizando muestras con estas características y se observan las coronas (1 1 ).

En una realización preferente de la invención la base (1 ) y la tapa superior (6) son de un material transparente tal que se puede visualizar el cultivo celular realizado sobre las muestras (14) mediante técnicas convencionales de microscopía.

Los elementos que pueden quedar en contacto directo con el medio de cultivo y con las células son la base (1 ), la tapa superior (6), las coronas (1 1 ) y la junta tóhca (8). Así pues, estos elementos deben ser de material biocompatible y esterilizable mediante métodos convencionales, como por ejemplo con un autoclave.

En una realización preferente de la invención los pozos (3) comprenden unas muescas (4) que facilitan la extracción de las muestras (14) mediante pinzas u otras herramientas equivalentes.

Para proceder a la realización del cultivo celular se deben colocar las muestras (14) en los pozos (3) de la base (1 ) de la cámara, posteriormente se debe colocar la junta (8) en la ranura (5), si la comprende, y cerrar la cámara con los tornillos (9) y las tuercas (10). Por último se debe introducir el fluido por la entrada (7) de forma que circula por el canal (2) bañando a las muestras (14) hasta salir por la salida de fluido en la tapa superior (6).