Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
CHLOROGENIC ACID RAW MATERIAL OR ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENT AND PREPARATION METHOD THEREFOR, AND QUALITY TESTING METHOD
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2015/168964
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided is a chlorogenic acid raw material or active pharmaceutical ingredient, containing chlorogenic acid having a weight percentage content of more than 98% and impurities having a weight percentage content of less than 1.9%. The impurities contain 3-coumaroylquinic acid, accounting for 0.1-0.5% of the total weight of the raw material or active pharmaceutical ingredient. Also provided is a preparation method for the chlorogenic acid raw material or active pharmaceutical ingredient, and a quality testing method. In the preparation method for the chlorogenic acid raw material or active pharmaceutical ingredient, after crystallisation, it is not necessary to undergo re-crystallisation process treatment, thereby reducing chlorogenic acid loss caused by re-crystallisation, and increasing product yield. At the same time, reduction of a re-crystallisation process shortens the production cycle, and applicability is strong, facilitating large-scale preparation of chlorogenic acid. Product quality controllability is strong, relevant impurities are all within a controlled range, and a relevant impurity having a content of more than 0.1% can be qualitatively and quantitatively analysed. The testing method has a high testing sensitivity for chlorogenic acid and analogues thereof. A mobile phase does not significantly interfere with related substance testing, the number of plates is high, the degree of separation is good, and peak symmetry is good.

Inventors:
ZHANG JIE (CN)
ZHANG LIANG (CN)
HUANG WANG (CN)
Application Number:
PCT/CN2014/077653
Publication Date:
November 12, 2015
Filing Date:
May 16, 2014
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
SICHUAN J Z BIO CHEMICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY DEV CO LTD (CN)
International Classes:
C07C69/73; C07C67/48; C07C67/52
Foreign References:
CN1273964A2000-11-22
CN1646112A2005-07-27
CN1400199A2003-03-05
Other References:
TIAN, CHENXU ET AL.: "Separation and Identification of Chlorogenic Acid and Related Impurities by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry", CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 25, no. 4, 30 July 2007 (2007-07-30), pages 496 - 500, XP055235963
Attorney, Agent or Firm:
GAOYUNG INTELLECTUAL PROPERTY AGENCY(GENERALPARTNERSHIP) (CN)
成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) (CN)
Download PDF:
Claims:
权 利 要 求 书

1、一种绿原酸原料或原料药, 其特征在于: 它含有重量百分含量占 98% 以上的绿原酸及重量百分含量 1.9%以下的杂质,其中,杂质中含有 3-香豆酰 奎尼酸, 占原料或原药料总重量的 0.1-0.5%。

2、 根据权利要求 1 所述的绿原酸原料或原料药, 其特征在于: 它含有 5-咖啡酰奎尼酸、 4-乙烯基邻苯二酚、 咖啡酸、 4-咖啡酰奎尼酸、 绿原酸甲基 化物中的一种或几种; 其重量百分含量为: 咖啡酸的重量百分含量不超过 0.4%, 除了咖啡酸外其他相关物质中单个重量百分含量不超过 0.5%。

3、 根据权利要求 2所述的绿原酸原料或原料药, 其特征在于: 3-香豆酰 奎尼酸、 5-咖啡酰奎尼酸、 4-乙烯基邻苯二酚、 4-咖啡酰奎尼酸、 绿原酸甲基 化物的总百分含量不超过 1.5%。

4、根据权利要求 1-3任意一项所述的绿原酸原料或原料药,其特征在于: 它含有重量百分含量为 98.0-99.8%绿原酸及重量百分含量为 0.1-1.9%杂质。

5、 一种制备权利要求 1-4任意一项所述的绿原酸原料或原料药的方法, 它包括如下歩骤:

a、 母液制备: 取绿原酸含量在 20%-60%的杜仲叶提取物, 配制成绿原 酸浓度为 40mg/ml-480mg/ml, 配制温度为 10°C-60°C, pH=l. 0-3. 0;

b、 萃取: 采用乙酸乙酯萃取, 萃取次数为 3-8次, 每次萃取用量为母液 体积的 5-10倍, 每次萃取前母液 pH为 1. 0-3. 0, 萃取温度 5 °C-60°C ;

c、 脱色: 活性炭用量为粗品质量的 0.1-0.5倍, 脱色温度 50°C-70°C, 脱 色时间为 0. 5h-2. Oh;

d、 浓缩: 浓缩温度 50°C-70°C, 真空度为 -0. 06-0. 08MP, 浓缩液控制绿 原酸含量为 20mg/ml-50mg/ml ;

e、 沉降: 沉降温度 0°C-25°C, 沉降时间 12h-24h;

f、 结晶: 沉降后结晶, 结晶温度 50°C-70°C, 结晶时间 0.5h-3.0h, 结晶 后冷却至 10°C-40°C ;

g、 粉碎: 将 f歩骤的结晶物乳化或研磨粉碎, 粉碎后的晶体粒度 100 μ m-500 m, 粉碎过程可用或不用溶剂, 其溶剂种类为乙酸乙酯、水或比例为 1%-99%的乙酸乙酯和水的混合液;

h、 洗涤: 乙酸乙酯、 水或体积比为 1%-99%的乙酸乙酯和水的混合液洗 涤, 洗涤溶剂用量为物料质量的 1-10倍体积, 温度 0°C-70°C, 进行洗涤; i、 干燥: 干燥物料粒度为 120目 -20目, 干燥温度 30°C-80°C, 干燥真空 度为常压 0. 09MP。

6、根据权利要求 5所述的绿原酸原料或原料药的制备方法,其特征在于: 它包括下述歩骤制备而成:

a、 母液制备: 取绿原酸含量在 40%的杜仲叶提取物, 配制粗品水液浓 度为 60%, 绿原酸浓度为 240mg/ml, 配制温度为 25°C, pH=l. 0;

b、 萃取: 采用乙酸乙酯萃取, 萃取次数为 5次, 每次萃取用量为母液体 积的 8倍, 每次萃取前母液 pH为 1. 0, 萃取温度 25°C ;

c、 脱色: 活性炭用量为粗品质量的 0.2倍, 脱色温度 60°C, 脱色时间为 1. Oh;

d、 浓缩: 浓缩温度 60°C, 真空度为 -0. 08MP, 浓缩液控制绿原酸含量为 40mg/ml;

e、 沉降: 沉降温度 25°C, 沉降时间 12h;

f、 结晶: 沉降后结晶, 结晶温度 70°C, 结晶时间 1.0h, 结晶终止温度 25 °C ;

g、 粉碎: 乳化或研磨粉碎, 粉碎后的晶体粒度 200 μ πι -300 μ πι, 粉碎 过程用乙酸乙酯溶剂;

h、 洗涤: 用水洗涤, 其用量为物料质量的 3倍体积, 水温度 5°C ;

i、干燥:干燥物料粒度为 60目,干燥温度 60°C,干燥真空度为 -0. 08MP。 7、 一种检测权利要求 1-4任意一项所述的绿原酸原料或原料药的方法, 其特征在于: 它包括绿原酸的检测方法、 杂质检测方法:

其中绿原酸的含量检测方法为:

照高效液相色谱法(《中国药典》 2010年版二部附录 VD)测定; 色谱条件与系统适用性试验 用十八垸基键合硅胶为填充剂; 以 0.1%甲 酸溶液 -乙腈 (92:8:)为流动相; 检测波长 215nm; 理论板数按绿原酸峰计算应 不低于 3000, 绿原酸峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求;

测定法 取本品适量, 精密称定, 加流动相制成每 1ml约含 l(^g的溶 液, 作为供试品溶液, 精密量取 20μ1注入液相色谱仪, 记录色谱图; 另取绿 原酸对照品适量, 精密称定, 加流动相制成每 1ml含 l(^g的溶液, 同法测 定; 按外标法以峰面积计算, 即得;

杂质检测方法为:

取本品适量, 精密称定, 加流动相制成每 lml含 0.5mg的溶液, 作为供 试品溶液;

取供试品溶液 lml置 100ml量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 作为对照溶 液;

另取咖啡酸对照品适量, 精密称定, 加流动相制成每 lml中含 2 g的溶 液, 作为对照品溶液;

照含量测定项下的色谱条件, 取对照溶液 20μ1注入液相色谱仪, 调节检 测灵敏度,使主成分色谱峰峰高约为滿量程的 20%,再精密量取供试品溶液、 对照溶液与对照品溶液各 20μ1, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图至主成分 峰保留时间的 3倍;供试品溶液色谱图中如有咖啡酸杂质峰,按外标法计算; 如有其它杂质峰, 按自身对照法计算。

Description:
说 明 书

一种绿原酸原料或原料药及其制备方法和质量 检测方法 技术领域

本发明涉及一种绿原酸原料或原料药。

技术领域

绿原酸 (chlorogenic acid), 又名 3- 0 -咖啡酰奎宁酸 (3- 0 -caffeoylquinnic acid), 是广泛存在于植物中的一种多酚类化合物, 其中在忍冬类、 杜仲、 咖 啡等植物中的含量较高。 绿原酸具有较强的抗变态反应、 调节体内血糖、 清 除氧自由基及抗癌抗 HIV等作用, 由于其疗效显著、 毒副作用小而引起广泛 研究。 绿原酸源自于植物提取, 由于其结构不稳定,因此极易在生产和贮运过 程中引入相关杂质。为保证药物的安全有效和 质量可控,相关杂质的研究已成 为目前新药质量研究的重要环节,因此,对绿原 中相关杂质进行研究十分必 要。 (田晨煦, 等, 高效液相色谱-串联质谱法分离鉴定绿原酸及 相关杂质, 色谱, 2007年 7月)

此外, 针对绿原酸的标准, 也有相关文献报道, 如: 廖丽云, 绿原酸及 冻干制剂质量标准、稳定性的研究和绿原酸精 制品结构确证, 四川大学, 药 物分析, 2005, 硕士。 该文献对绿原酸中的杂质进行了分析, 但没有说明 哪些杂质影响绿原酸的质量。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种绿原酸原料或 原料药及其制备方法和质

、本发明提供了一种绿原酸原料或原料药, 它含有重量百分含量占 98%以 上的绿原酸及 1.9%以下的杂质, 其中, 杂质中含有 3-香豆酰奎尼酸, 占中间 体总重量的 0.1-0.5%。

本发明所述的 "绿原酸原料"系从杜仲叶中提取出的绿原酸单 , 其绿 原酸含量在 98%以上, 其他杂质在 1.9%以下。 除了来源于杜仲外, 也可指来 源于其它含有绿原酸的植物提取纯化, 如金银花等。

进一歩优选地, 它含有 5-咖啡酰奎尼酸(新绿原酸)、 4-乙烯基邻苯二酚 (咖啡酸脱羧物)、 咖啡酸、 4-咖啡酰奎尼酸 (隐绿原酸)、 绿原酸甲基化物 中的一种或几种; 其重量百分含量为: 咖啡酸的重量百分含量不超过 0.4%, 除了咖啡酸外其他相关物质中单个重量百分含 量不超过 0.5%。

其中, 3-香豆酰奎尼酸、 5-咖啡酰奎尼酸 (新绿原酸)、 4-乙烯基邻苯二 酚 (咖啡酸脱羧物)、 4-咖啡酰奎尼酸 (隐绿原酸)、 绿原酸甲基化物的总百 优选地, 它含有重量百分含量为 98.0-99.8%绿原酸及 0.1-1.9%杂质。 本发明还提供了一种制备绿原酸原料或原料药 的方法,它包括如下歩骤: a、 母液制备: 取绿原酸含量在 20%-60%的杜仲叶提取物, 配制粗品水 液浓度为 20%-80%, 绿原酸浓度为 40m g /ml-480mg/ml, 配制温度为 10 °C -60 °C, pH=l. 0-3. 0;

b、 萃取: 采用乙酸乙酯萃取, 萃取次数为 3-8次, 每次萃取用量为母液 体积的 5-10倍, 每次萃取前母液 pH为 1. 0-3. 0, 萃取温度 5°C-60°C ;

c、 脱色: 活性炭用量为粗品质量的 0.1-0.5倍, 脱色温度 50°C-70°C, 脱 色时间为 0. 5h-2. Oh;

d、 浓缩: 浓缩温度 50°C-70°C, 真空度为 -0. 06-0. 08MP, 浓缩液控制绿 原酸含量为 20mg/ml-50mg/ml ;

e、 沉降: 沉降温度 0°C-25°C, 沉降时间 12h-24h;

f、 结晶: 沉降后结晶, 结晶温度 50°C-70°C, 结晶时间 0.5h-3.0h, 结晶 后冷却至 10°C-40°C ;

g、 粉碎: 乳化或研磨粉碎, 粉碎后的晶体粒度 100 μ πΐ-500 μ πΐ, 粉碎 过程可用或不用溶剂, 其溶剂种类为乙酸乙酯、 水或一定比例的乙酸乙酯和 水的混合液, 其混合比例为 1%-99%;

h、洗涤: 乙酸乙酯、 水或一定比例的乙酸乙酯和水的混合液洗涤, 其混 合比例为 1%-99%, 洗涤溶剂用量为物料质量的 1-10倍体积, 溶剂 (液) 温 度 0°C-70°C ;

i、 干燥: 干燥物料粒度为 120目 -20目, 干燥温度 30°C-80°C, 干燥真空 度为常压 0. 09MP。

进一歩优选地, 它包括下述歩骤制备而成:

a、 母液制备: 取绿原酸含量在 40%的杜仲叶提取物, 配制粗品水液浓 度为 60%, 绿原酸浓度为 240mg/ml, 配制温度为 25°C, pH=l. 0;

b、 萃取: 采用乙酸乙酯萃取, 萃取次数为 5次, 每次萃取用量为母液体 积的 8倍, 每次萃取前母液 pH为 1. 0, 萃取温度 25°C ;

c、 脱色: 活性炭用量为粗品质量的 0.2倍, 脱色温度 60°C, 脱色时间为 1. Oh;

d、 浓缩: 浓缩温度 60°C, 真空度为 -0. 08MP, 浓缩液控制绿原酸含量为 40mg/ml;

e、 沉降: 沉降温度 25°C, 沉降时间 12h;

f、 结晶: 沉降后结晶, 结晶温度 70°C, 结晶时间 1.0h, 结晶终止温度 g、 粉碎: 乳化或研磨粉碎, 粉碎后的晶体粒度 200 μ πι -300 μ πι, 粉碎 过程用乙酸乙酯溶剂;

h、 洗涤: 用水洗涤, 其用量为物料质量的 3倍体积, 水温度 5°C ;

1、干燥:干燥物料粒度为 60目,干燥温度 60°C,干燥真空度为 -0. 08MP。 本发明还提供了一种检测所述的绿原酸原料或 原料药的方法, 它包括绿 原酸的检测方法和杂质的检测方法:

其中绿原酸的含量检测方法为:

照高效液相色谱法(《中国药典》 2010年版二部附录 VD)测定; 色谱条件与系统适用性试验 用十八垸基键合硅胶为填充剂; 以 0.1%甲 酸溶液 -乙腈 (92:8:)为流动相; 检测波长 215nm; 理论板数按绿原酸峰计算应 不低于 3000, 绿原酸峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求;

测定法 取本品适量, 精密称定, 加流动相制成每 1ml约含 l(^g的溶 液, 作为供试品溶液, 精密量取 20μ1注入液相色谱仪, 记录色谱图; 另取绿 原酸对照品适量, 精密称定, 加流动相制成每 1ml含 l(^g的溶液, 同法测 定; 按外标法以峰面积计算, 即得;

杂质的检测方法为:

取本品适量, 精密称定, 加流动相制成每 lml含 0.5mg的溶液, 作为供 试品溶液; 取供试品溶液 lml置 100ml量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 作为 对照溶液;另取咖啡酸对照品适量,精密称定 ,加流动相制成每 lml中含 2 g 的溶液, 作为对照品溶液; 照含量测定项下的色谱条件, 取对照溶液 20μ1 注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分 色谱峰峰高约为滿量程的 20%, 再精密量取供试品溶液、 对照溶液与对照品溶液各 20μ1, 分别注入液相色谱 仪, 记录色谱图至主成分峰保留时间的 3倍; 供试品溶液色谱图中如有咖啡 酸杂质峰, 按外标法计算; 如有其它杂质峰, 按自身对照法计算。 本发明绿原酸原料或原料药的制备方法, 结晶后不需经过重结晶工序处 理, 减少因重结晶带来的绿原酸损失, 提高产品得率; 同时, 减少重结晶工 序可缩短生产周期, 实用性很强, 利于大生产制备绿原酸; 产品质量可控性 较高, 相关杂质均在受控范围之内, 含量在 0.1%以上的相关杂质能够定性定 量分析; 检测方法对绿原酸及其类似物检测灵敏度较高 ; 流动相对有关物质 检测无明显干扰, 塔板数较高, 分离度较好, 主峰对称性较好。

附图说明

图 1 绿原酸原料药的水和流动相溶液紫外光谱图

图 2 绿原酸原料药高温破坏 DAD三维检测图

图 3 绿原酸原料药高温破坏 HPLC图(215nm) 图 4 绿原酸原料药高温破坏各峰 DAD检测紫外光谱图

图 5 绿原酸原料系统适应色谱图

图 6绿原酸检测限图谱

图 7 绿原酸定量限图谱

图 8 系统适用性试验 HPLC图

图 9 咖啡酸及供试品碱氧化破坏前后 HPLC图

图 10 咖啡酸定量限图

图 11 咖啡酸检测限图

图 12 其它有关物质检测色谱图

图 13 实施例 1有关物质检测色谱图

图 14实施例 2有关物质检测色谱图

图 15实施例 3有关物质检测色谱图

图 16实施例 4有关物质检测色谱图

图 17实施例 5有关物质检测色谱图

图 18 实施例 6有关物质检测色谱图

图 19实施例 7有关物质检测色谱图

图 20实施例 8有关物质检测色谱图 具体实施方式

实施例 1 本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸 =20%) 10kg, 加水至 50L于 10°C条件下搅拌溶 解, 配制成含绿原酸 40mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 1. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 8次,每次用量为 500L,每次萃取前母液 pH值调至 1. 0, 萃取温度 5°C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 5kg活性炭, 于 50°C条件下搅拌脱色 2. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 50°C,真空度为 -0. 08MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 20mg/ml (浓缩液体积约为 90L);

5、 沉降

将浓缩液于 0°C条件下静置 24h, 料液温度为 0°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 70°C, 搅拌结晶 3. 0h, 通冷却水冷却至 10°C, 过 滤, 收集滤渣, 得 3. 3kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 加 30L乙酸乙酯于乳化机中乳化至晶体粒度为 400-500 u rn, 过滤, 收集滤渣, 得 2.8kg;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 2.8L0°C冰水搅拌使物料充分分散后, 过滤, 收集滤 渣,

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 80°C、 真空度为 -0. 09MP条件下干燥, 将干燥至近干 物料粉过 120目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 1.407kg

(2 ) 含量: 99.56% (按干燥品计)

(3 ) 有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.231%、 咖啡酸 0.038%

(4 ) 绿原酸转移率: 70.04% 实施例 2 本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物 (绿原酸 =60%) 10kg, 加水至 12.5L于 60°C条件下搅拌 溶解, 配制成含绿原酸 480mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 3. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 8次,每次用量为 125L,每次萃取前母液 pH值调至 3. 0, 萃取温度 60 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 5kg活性炭, 于 70°C条件下搅拌脱色 0. 5h ;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 70°C,真空度为 -0. 06MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 50mg/ml (浓缩液体积约为 110L);

5、 沉降

将浓缩液于 25 °C条件下静置 12h, 料液温度为 25°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 70°C, 搅拌结晶 0. 5h, 通冷却水冷却至 40°C, 过 滤, 收集滤渣, 得 9. 3kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 加 10L水于乳化机中乳化至晶体粒度为 100-150 u rn, 过滤, 收集滤澄, 得 6.4kg;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 20L0°C水搅拌使物料充分分散后, 过滤, 收集滤渣,

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 80°C、真空度为 -0. 09MP条件下干燥,将干燥至近干物 料粉碎过 120目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 4.327kg

(2 ) 含量: 99.69% (按干燥品计)

(3 )有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.128%、咖啡酸 0.040%、隐绿原酸 0.016%

(4 ) 绿原酸转移率: 71.89% 实施例 3本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸 =40%) 10kg, 加水至 15L于 25°C条件下搅拌溶 解, 配制成含绿原酸 267mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 1. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 3次,每次用量为 150L,每次萃取前母液 pH值调至 1. 0, 萃取温度 25 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 1kg活性炭, 于 50°C条件下搅拌脱色 2. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 50°C,真空度为 -0. 08MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 40mg/ml (浓缩液体积约为 90L);

5、 沉降

将浓缩液于 25 °C条件下静置 12h, 料液温度 25°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 50°C, 搅拌结晶 3. 0h, 冷却至 25 °C, 过滤, 收 集滤渣, ί# 6. 8kg ;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 加 20L乙酸乙酯于乳化机中乳化至晶体粒度为 300-400 u rn, 过滤, 收集滤渣, ff 5.2kg;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 52L25°C乙酸乙酯搅拌使物料充分分散后, 过滤, 收 集滤渣, 9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 70°C、 常压条件下干燥, 将干燥至近干物料粉碎过 20 目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 2.990kg

(2 ) 含量: 99.47% (按干燥品计)

(3 )有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.215%、新绿原酸 0.009%、咖啡酸 0.043%、 隐绿原酸 0.022%

(4 ) 绿原酸转移率: 74.35% 实施例 4 本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸 =40%) 10kg, 加水至 20L于 40°C条件下搅拌溶 解, 配制成含绿原酸 200mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 3. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 8次,每次用量为 100L,每次萃取前母液 pH值调至 3. 0, 萃取温度 40 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 3kg活性炭, 于 60°C条件下搅拌脱色 1. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 60°C,真空度为 -0. 06MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 50mg/ml (浓缩液体积约为 70L);

5、 沉降

将浓缩液于 25 °C条件下静置 12h, 料液温度为 25°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 60°C, 搅拌结晶 0. 5h, 冷却至 25°C, 过滤, 收集 滤渣, 得 6. 3kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 于研磨机中研磨至晶体粒度为 500 μ πι ;

8、 洗涤

取研磨粉碎后的物料,用 63L70°C乙酸乙酯搅拌使物料充分分散后,过滤 收集滤渣,

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 30°C、真空度为 -0. 09MP条件下干燥,将干燥至近干物 料粉碎过 60目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。 10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 2.861kg

(2 ) 含量: 98.93% (按干燥品计)

(3 ) 有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.395%、 新绿原酸 0.020%、 咖啡酸脱羧物

0.040、、 咖啡酸 0.028%、 隐绿原酸 0.017%、 绿原酸甲基化物 0.029%

(4 ) 绿原酸转移率: 70.69% 实施例 5本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸 =30%) 10kg, 加水至 30L于 25°C条件下搅拌溶 解, 配制成含绿原酸 100m g /ml的水液, 用盐酸调 pH值至 1. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 6次,每次用量为 150L,每次萃取前母液 pH值调至 1. 0, 萃取温度 25 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 3kg活性炭, 于 70°C条件下搅拌脱色 1. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 70°C,真空度为 -0. 08MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 30mg/ml (浓缩液体积约为 90L);

5、 沉降

将浓缩液于 25 °C条件下静置 24h, 料液温度为 25°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 70°C, 搅拌结晶 1. 5h, 自然冷却至 25°C, 过滤, 收集滤渣, 得 5. 8kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 加 10L乙酸乙酯混合液 (乙酸乙酯: 水 =99: 1 ) 于乳化机中乳化至晶体粒度为 200-300 μ πι, 过滤, 收集滤渣, 得 4.8k g;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 48L25°C乙酸乙酯混合液 (乙酸乙酯: 7jC=99: l ) 搅 拌使物料充分分散后, 过滤, 收集滤渣,

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 60°C、真空度为 -0. 09MP条件下干燥,将干燥至近干物 料粉碎过 60目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 2.206kg (2 ) 含量: 99.34% (按干燥品计)

(3 ) 有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.217%、 新绿原酸 0.030%、 咖啡酸脱羧物

0.058、、 咖啡酸 0.074%

(4 ) 绿原酸转移率: 73.05% 实施例 6本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸 =50%) 10kg, 加水至 25L于 25°C条件下搅拌溶 解, 配制成含绿原酸 200mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 2. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 4次,每次用量为 150L,每次萃取前母液 pH值调至 2. 0, 萃取温度 25 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 2kg活性炭, 于 60°C条件下搅拌脱色 1. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 60°C,真空度为 -0. 06MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 50mg/ml (浓缩液体积约为 90L);

5、 沉降

将浓缩液于 15 °C条件下静置 24h, 料液温度为 15°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 60°C, 搅拌结晶 2. 0h, 通水冷却至 10°C, 过滤, 收集滤渣, 得 9. 8kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 力口 10L乙酸乙酯混合液 (乙酸乙酯: 水 =1 :99 ) 于乳化机中乳化至晶体粒度为 100-150 μ πι, 过滤, 收集滤渣, 得 8.2k g;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 48L60°C乙酸乙酯混合液 (乙酸乙酯: 水 =1 :99 ) 搅 拌使物料充分分散后, 过滤, 收集滤渣,

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 60°C、 真空度为 -0. 09MP条件下干燥, 将干燥至近干 物料粉碎过 60目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 3.563kg

(2 ) 含量: 99.63% (按干燥品计)

(3 ) 有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.096%、 新绿原酸 0.043%、 咖啡酸脱羧物 0.062、、 咖啡酸 0.049%

(4 ) 绿原酸转移率: 71.00% 实施例 7本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物(绿原酸 =40%) 10kg, 加水至 20L于 25°C条件下搅拌溶 解, 配制成含绿原酸 200mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 2. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 5次,每次用量为 100L,每次萃取前母液 pH值调至 2. 0, 萃取温度 25 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 3kg活性炭, 于 50°C条件下搅拌脱色 2. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 50°C,真空度为 -0. 08MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 40mg/ml (浓缩液体积约为 90L);

5、 沉降

将浓缩液于 25 °C条件下静置 12h, 料液温度为 25°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 70°C, 搅拌结晶 1. 0h, 通水冷却至 25°C, 过滤, 收集滤渣, 得 7. 2kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 加 10L水于乳化机中乳化至晶体粒度为 100-150 u m, 过滤, 收集滤澄, 得 5.4kg;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 55L5 °C乙酸乙酯搅拌使物料充分分散后, 过滤, 收 集滤渣,

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 60°C、真空度为 -0. 08MP条件下干燥,将干燥至近干物 料粉碎过 60目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 2.811kg

(2 ) 含量: 99.52% (按干燥品计)

(3 ) 有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.239%、 咖啡酸 0.040%

(4 ) 绿原酸转移率: 69.94% 实施例 8本发明绿原酸原料或原料药的制备

1、 母液制备

取杜仲叶提取物 (绿原酸 =40%) 10kg, 加水至 16.7L于 25°C条件下搅拌 溶解, 配制成含绿原酸 240mg/ml的水液, 用盐酸调 pH值至 1. 0;

2、 萃取

用乙酸乙酯萃取 5次,每次用量为 134L,每次萃取前母液 pH值调至 1. 0, 萃取温度 25 °C ;

3、 脱色

向合并后的萃取液加入 2kg活性炭, 于 60°C条件下搅拌脱色 1. Oh;

4、 浓缩

将脱色后的萃取液进行脱碳后,于 60°C,真空度为 -0. 08MP条件下进行浓 缩, 控制浓缩液中绿原酸含量约为 40mg/ml (浓缩液体积约为 90L);

5、 沉降

将浓缩液于 25 °C条件下静置 12h, 料液温度为 25°C, 过滤, 收集滤液;

6、 结晶

将沉降后的滤液加热至 70°C, 搅拌结晶 1. 0h, 通水冷却至 25°C, 过滤, 收集滤渣, 得 6. 9kg;

7、 粉碎

取结晶过滤出的结晶体, 加 10L乙酸乙酯于乳化机中乳化至晶体粒度为 200-300 u rn, 过滤, 收集滤渣, 得 5.8kg;

8、 洗涤

取粉碎后的滤渣, 用 17.4L5°C水搅拌使物料充分分散后, 过滤, 收集滤 渣;

9、 干燥

将洗涤后的滤渣于 60°C、真空度为 -0. 08MP条件下干燥,将干燥至近干物 料粉碎过 60目筛再置同等条件下进行干燥, 直至干燥完全。

10、 产品特征

( 1 ) 产品重量: 3.204kg

(2 ) 含量: 99.78% (按干燥品计)

(3 ) 有关物质: 3-香豆酰奎尼酸 0.165%

(4 ) 绿原酸转移率: 79.92% 实施例 9 本发明绿原酸原料或原料药中杂质含量范围的 实验依据

采用 HPLC法和 LC-MS法对绿原酸原料药中存在的有关物质进行 分 离和鉴定, 共分离鉴定出奎尼酸、 咖啡酸、 新绿原酸、 隐绿原酸、 3-香豆麵 奎尼酸、 咖啡酸脱羧物和绿原酸甲基化物等 7个主要有关物质;

有关物质色谱、 质谱测定参数

Ti 名称 分子 J 结构

No

奎尼酸有法定对照品, 采用 HPLC对照品法对奎尼酸的分离检测条件、 方法学和含量进行了初歩研究, 结果绿原酸原料药中未检出奎尼酸, 故未进 行深入研究和标准收入; 咖啡酸有法定对照品, 采用 HPLC对照品法对咖啡 酸的分离检测条件和方法学进行了研究, 结果证明建立的检测条件和方法适 用于绿原酸原料药中咖啡酸的检査; 其它有关物质无法定对照品, 均为绿原 酸的类似物, 响应值与绿原酸相近, 采用 HPLC自身对照法对其它有关物质 的分离检测条件和方法学进行了研究, 结果证明建立的检测条件和检测方法 其有物

适质它关用于绿原酸原料药中其他有关物质 的检査。三批小试样品 (080801, 080802, 080803)和三批中试样品 (090101、 090102、 090103)、 三批中试样品(100101、 100102、 100103) 48月长期稳定性实验有关物质检査结果见表 1、 表 2。

表 1 六批样品有关物质检査结果

一. . 080801 080802 080803 090101 090102 090103

]啡酸 I 0. 092 0. 091 0. 089 0. 076 0. 085 0. 081

0. 055 0. 058 0. 056 0. 099 0. 101 0. 098

0. 221 0. 226 0. 225 0. 137 0. 144 0. 140

3-香豆酰奎尼酸 0. 203 0. 215 0. 197 0. 214 0. 218 0. 205 绿原酸甲基化物 未检出 未检出 未检出 0. 049 0. 048 0. 045 其它有关物质总和 (%) 0. 480 0. 499 0. 479 0. 499 0. 511 0. 488 表 2 48月长期稳定性实验有关物质检査结果

^^比号

100101 100102 100103 项目

咖啡酸 (%) 0. 149 0. 161 0. 153 新绿原酸 0. 156 0. 161 0. 157 隐绿原酸 0. 219 0. 222 0. 218

3-香豆酰奎尼酸 0. 303 0. 309 0. 306 绿原酸甲基化物 0. 092 0. 095 0. 091 其它有关物质总和(%) 0. 770 0. 787 0. 772

六批样品中咖啡酸含量为 0.076〜0.092%, 其它有关物质总含量为 0.479〜0.511%, 单个其它有关物质含量为 0.045〜0.226%; 48月长期稳定性 实验有关物质检査结果中咖啡酸含量为 0.149〜0.161%, 其它有关物质总含 量为 0.770〜0.787%, 单个其它有关物质含量为 0.091〜0.309%。 有关文献报 道咖啡酸小鼠腹腔注射 LD50为 1583mg/kg, 家兔静脉注射 14mg/kg/天, 连 续十天, 其心、 肝、 肾功能及解剖镜检均未见病理变化, 说明咖啡酸有较好 的安全性, 考虑到生产和贮藏过程中影响因素的波动, 确定咖啡酸含量不大 于 0.40%; 其它有关物质主要为绿原酸的异构体及其类似 物, 考虑到生产和 贮藏过程中影响因素的波动, 确定其它单个有关物质含量不大于 0.50%, 总 和不大于 1.5%。 实施例 10 本发明绿原酸原料或原料药中绿原酸的检测方 法试验

1 )检测波长选择

绿原酸在流动相溶液(乙腈 -0. 1%甲酸 8 : 92)和水溶液中的紫外光谱特征 基本一致, 在 215和 323nm波长附近均有最大吸收; 在绿原酸原料药高温破 坏样品的 LC-DAD 三维检测图中, 绿原酸及其检出的有关物质在波长 215nm 和 323nm附近均有最大吸收; 其中, 323nm波长处, 绿原酸及其类似物检测 灵敏度较高; 但 215nm波长处除能够检出绿原酸及其类似物外, 还有利于检 出仅有末端紫外吸收的杂质; 在 323nm波长处, 流动相对有关物质检测无明 显干扰, 而在 215nm波长处, 溶剂峰较为明显, 但对溶剂峰附近的有关物质 检测无明显干扰; 因此, 在绿原酸原料药的质量控制中, 采用 215nm波长作 为绿原酸有关物质检査的检测波长。 光谱图和色谱图见图 1-4。

2)分离条件选择

①流动相的选择 分别考察了不同有机相(乙腈、 甲醇)、 不同酸组成的 流动相对绿原酸及其有关物质分离的色谱行为 ,以组分中难分离对 (绿原酸与 咖啡酸)的分离度和分析时间作为评价指标, 对不同流动相的分离效果进行评 价。

取本品约 25mg,加水 50ml使溶解制成相当于 0.5mg/ml的溶液作为供试 品溶液。

不同有机相的评价按下表配制含不同有机相的 流动相, 以 0DS 150mmX 4.6mm作为色谱柱, 检测波长 215nm, 流速 lml/min; 取供试品溶液 20μ 1注 入色谱仪, 记录色谱图。 结果见表 3。

表 3不同有机相难分离对的分离度与分析时间

25:75 20:80 15:85 10 :90 8:92 5:95 乙腈 0.1%甲酸 1.90/4106 1.98, /5495 2.27/5669 3.40/4916 甲醇 0.1%甲酸 1.3/3976 1.8/5484 2.6/4932 3.1/ 3631

注: *表示未分离; R为分离度; η为绿原酸的理论板数; 一表示未实验。

结果表明, 有机相比例相同时, 甲醇系统的分离度大于乙腈系统, 但甲 醇系统耗费的分析时间长, 柱效较乙腈系统差; 综合判定乙腈系统优于甲醇 系统, 乙腈 -0.1%甲酸的比例在 8:92时, 绿原酸与难分离的咖啡酸的分离度 较为理想, 实验选用乙腈 -0.1%甲酸 (8:92)为流动相。

不同酸的评价 根据绿原酸及其类似物的弱酸性特点, 设计在流动相中 加入适量的酸, 以酸抑制色谱峰的拖尾, 增加色谱峰的对称性。 选用常见的 甲酸、 乙酸和磷酸, 分别考察其对绿原酸及其有关物质的分离影响 。 以峰对 称性、 分离度、 分析时间等因素作为综合评判指标, 进行酸种类的筛选。 结 果见表 4。 pH值 2. 64 3. 20 2. 13 分离度 2. 3 3. 0 0. 7 拖尾因子(绿原酸) 1. 03 2. 02 0. 99 分析时间(min) 42 38 42 主成分理论板数 5669 3676 5843 结果表明, 用磷酸溶液作水相时, 主峰对称性较好, 但分离度较差; 用 乙酸溶液作水相时, 分离度较好, 但主峰对称性较差; 用甲酸溶液作水相时, 分离度较好, 主峰对称性较好。 故确定以 0. 1%甲酸溶液作为流动相的水相。

综合评价后确定流动相为 0. 1%甲酸 -乙腈(92 : 8)。

②色谱柱的选择: 以绿原酸主峰柱效、 绿原酸与咖啡酸的分离度为指标 进行评价, 考察了不同品牌的 C18 柱, 如 AichromBond-AQ、 Zirchrom, Kromasil, Gemini等的色谱行为。 数据见表 5。

表 5 不同色谱柱对绿原酸的分离比较

理论板数 5659 2094 557 7464 5669 分离度 2. 21 2. 65 2. 27 结果表明,在绿原酸主峰柱效达 3000以上时,不同 C18色谱柱都能较好 分离本品中难分离组分绿原酸与咖啡酸, 分离度均大于 2, 故选择 C18色谱 柱作为有关物质检査的色谱柱。

综上所述, 确定有关物质的采用 HPLC法检査, 色谱条件为: 以十八垸基 键合硅胶为填充剂; 以 0. 1%甲酸 -乙腈(92 : 8)为流动相; 流速为 lml/min; 检 测波长为 215nm; 理论板数按绿原酸峰计大于 3000, 绿原酸的主成分峰与咖 啡酸杂质峰分离度大于 1. 5, 见图 5。 含量测定方法学考察

1色谱条件的选择与系统适用性试验

绿原酸有关物质研究中确定的检测波长、 流动相、 色谱柱能使本品与有 关物质完全分离, 且理论板数按绿原酸峰计算大于 3000, 满足绿原酸含量测 定要求。 故确定以 215nm为检测波长, 以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂, 以 0. 1%甲酸 -乙腈(92 : 8)为流动相, 进行含量测定研究。

2测定方法 供试品溶液的制备: 取绿原酸原料药适量, 精密称定, 加流动相溶解并 稀释制成每 1ml中含约 10 μ g的溶液, 作为供试品溶液。

对照品溶液的制备: 取绿原酸对照品适量, 精密称定, 加流动相制成每 lml中约含 10 μ g的溶液, 作为对照品溶液。

精密量取供试品溶液和对照品溶液各 ΙΟ μ Ι , 分别注入液相色谱仪, 记 录色谱图, 按外标法计算绿原酸的含量。

3线性

取绿原酸对照品约 12mg, 精密称定, 加流动相溶解稀释成 125、 75、 50、 25、 12. 5、 2. 50、 0. 25 μ g/ml的系列溶液。 精密量取系列溶液各 10 μ 1分别 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以绿原酸峰面积为纵坐标, 相应浓度为横坐 标, 进行线性回归, 得线性方程。 结果见表 6。

表 6 绿原酸线性数据

C ( g/ml) 125 75 50 25 12. 5 2. 50 0. 25 峰面积 (A) 5543189 3413085 2134979 1077985 545767 100506 7138 线性范围 0. 25 μ g/ml~ 125 μ g/ml

线性方程 y=44629x- -18687, (r=0. 9994)

结果绿原酸在浓度 0. 25〜125 g/ml的范围内, 呈良好的线性关系, 相 关系数为 0. 9994。

4检测限和定量限

取线性研究中低浓度溶液(0. 25 μ g/ml)逐渐稀释进样, 按信噪比法, 在 S/N^3测得绿原酸检出量为 0. 625ng ; 在 S/N 10测得绿原酸检出量为

2. 5ng, 故确定绿原酸的检测限为 0. 625ng, 定量限为 2. 5ng, 色谱图见图 6、

7。

5加样回收实验

取本品适量,加流动相溶解稀释成每 ml约含绿原酸 78. 00 μ g的储备液。 分别取储备液 1. 0ml于 9只 10ml量瓶中, 均分成三组, 按低、 中、 高组分别 加入浓度为 50 μ g/ml, 62. 5 μ g/ml, 75 μ g/ml的绿原酸对照品溶液 1. 0ml 加流动相稀释至刻度, 作为供试品溶液, 精密量取该供试品溶液各 ΙΟ μ Ι分 别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按以下公式计算加样回收率, 结果见表 7。 n 0/

^回收率 /Q —— ¾^ x l00%

W加人 加样回收率结果

w W w ί RSD 组别

(mg) ( g) (%)

20. 04 78. 0 75. 0 153. 6 100. 8

20. 04 78. 0 75. 0 154. 7 102. 2 101. 1 1. 06 20. 04 78. 0 75. 0 153. 1 100. 1

20. 04 78. 0 62. 5 141. 6 101. 8

中 20. 04 78. 0 62. 5 141. 6 101. 7 101. 1 1. 24

20. 04 78. 0 62. 5 140. 3 99. 61

20. 04 78. 0 50. 0 128. 4 100. 7

低 20. 04 78. 0 50. 0 128. 1 100. 2 100. 7 0. 51

20. 04 78. 0 50. 0 128. 6 101. 2

结果表明, 本法加样回收率平均值为 100. 9% RSD为 0. 88%, 说明该方 法测定结果准确度良好。

6重复性

取本品适量, 精密称定, 加流动相分别制成高、 中、 低(约 10 12 15 μ g/ml)三种浓度的供试品溶液各 3份,分别精密量取供试品溶液与对照品溶 液(12. 5 g/ml)各 ΙΟ μ Ι注入液相色谱仪, 记录色谱图, 计算各组含量的相 对标准偏差(RSD%), 结果见表 8

表 8重复性结果

组别 取样量 (mg) C C RSD (%)

18. 37 99. 80

18. 25 99. 59 99. 71 0. 12

18. 27 99. 76

15. 18 99. 14

中 15. 22 99. 20 99. 23 0. 12

15. 08 99. 36

12. 36 99. 62

低 12. 32 99. 17 99. 51 0. 31

12. 41 99. 74

测得结果的平均值为 99. 49%, RSD为 0. 27%, 说明该方法重复性良好。

7范围

由以上重复性实验结果可知, 本品 3个浓度梯度的精密度均良好, 证明 供试品溶液浓度在 9. 6 14. 4 g/ml之间, 按拟定的方法测定, 检测结果均 能达到良好的精密度。 8中间精密度

于不同时间、 不同人员、 不同设备条件下进行中间精密度实验。 取本品 适量, 精密称定, 加流动相制成高、 中、 低三种浓度的供试溶液 (共 18份样 品)。分别精密量取各供试品溶液 10 μ ΐ注入液相色谱仪, 记录色谱图, 分别 计算高、中、低浓度组含量的相对标准偏差 (RSD%)和总相对标准偏差 (RSD%)。 结果见表 9。

表 9 中间精密度结果

^ I^员 LC-6A/甲 LC- 8A/乙

- 平均 RSD (%) 含醫 第 1天 第 2天 第 3天 第 4天 第 5天 第 6天

低 (%) 100. 5 99. 38 99. 57 99. 11 99. 45 99. 25 99. 54 0. 50 中(%) 99. 90 99. 70 99. 65 99. 33 99. 91 99. 64 99. 69 0. 20 高 (%) 99. 37 100. 0 99. 18 100. 2 99. 82 98. 71 99. 55 0. 57 含量平均值为 99. 59%, 总平均相对标准偏差为 0. 43%, 表明本品在不同 时间、 不同人员、 不同设备条件下检测结果的中间精密度良好。

9溶液稳定性实验

取同一份供试品溶液, 间隔一定时间分别进样, 记录峰面积, 测定结果见 表 10, RSD=2. 30%, 表明被测溶液在 24小时内稳定。

表 10 溶液稳定性实验

时间 峰面积 平均值 RSD (%)

Oh 486218

2h 485023

4h 481089

477378 2. 30

8h 479093

12h 476647

24h 456198

10耐用性

根据《中国药典》 2000年版二部附录 XIX A "药品质量标准分析方法验证" 要求, 考察了色谱柱品牌和批号、 流动相组成、 柱温、 波长等变化条件下, 对方法测定的影响。

(1)不同品牌色谱柱

将上述供试品溶液, 分别用同一类型不同厂家的色谱柱测定含量, 结果 见表 11。 表明用不同品牌的 C18柱(150mm X 4. 6mm, 5μηι)测定, 保留时间略 有差异, 理论板数均达到要求, 含量结果无明显差异。

表 11 不同品牌色谱柱的比较实验 色谱柱 保留时间 (min ) 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

GEMINE 12. 897 7282 1. 001 99. 24

AQ 12. 745 6461 1. 414 99. 37

AGIELENT 13. 151 5609 1. 118 99. 25

(2)不同比例流动相

将上述供试品溶液, 分别在不同比例流动相下测定含量, 结果见表 12。 表明: 在不同比例的流动相条件下, 理论板数均达到要求, 含量结果无明显 的差异。 因此流动相比例的微小变化对含量测定影响不 大。

表 12不同比例流动相比较实验

流动相 保留时间 (min ) 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

0. 1%甲酸-乙腈 (92 : 8) 12. 897 7282 1. 001 99. 24

0. 1%甲酸-乙腈(90 : 10) 9. 992 7446 1. 013 99. 13

0. 1%甲酸 -乙腈(94 : 6) 22. 690 5306 0. 943 99. 04

(3)不同柱温

将上述供试品溶液, 分别在不同的柱温下测定含量, 结果见表 13。 表明: 在不同的柱温条件下, 理论板数均达到要求, 含量结果无明显的差异。 因此 柱温对含量测定影响不大。

表 13 不同的柱温比较实验

柱温 保留时间 (min ) 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

35 °C 14. 892 6281 1. 137 99. 45

38 °C 13. 227 4146 1. 110 99. 41

40 °C 12. 897 7282 1. 001 99. 24

42 °C 11. 620 6254 1. 288 99. 07

(4)不同检测波长

将上述供试品溶液, 分别在 215nm和 323nm波长处测定含量, 结果见表 14。 两个检测波长条件下, 理论板数均达到要求, 含量结果无明显的差异。

表 14不同检测波长比较实验

波长 保留时间 (min ) 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

323nm 12. 720 6180 1. 348 99. 22

215nm 12. 897 7282 1. 001 99. 24 综上所述, 该方法系统适用性、 专属性、 线性、 准确度、 精密度、 耐用 f生方面符合方法学验证要求。 说明本方法测定绿原酸含量准确、 可行。

11样品含量测定结果 根据上述方法分别对实施例中各个样品进行绿 原酸含量测定, 结果见表

15 '

表 15 本品含量测定结果

结果 实施例

M曰 实施例 1 实施例 2 实施例 3 实施例 4 实施例 5 实施例 6 实施例 7 实施例 8 绿原酸(%) 99. 56 99. 69 99. 47 98. 83 99. 34 99. 63 99. 52 99.78 实施例 11本明绿原酸原料或原料药中有关物质的分离 鉴定

以上述色谱条件对绿原酸原料药的有关物质进 行分离与鉴定, 以便深入 了解和研究本品的有关物质。

(1)咖啡酸的检査

1)仪器与试药

LC-6A高效液相色谱仪, SPD-lOAvp紫外可见检测器、 N2000色谱工作站。 色谱柱- AichromBond AQ、 Gemini C18柱(150mm X 4. 6mm, 5 μ m)。

对照品: 咖啡酸对照品(批号 114930050)。

试剂: 乙腈为色谱纯; 甲酸为分析纯; 水为自制二次蒸馏水。

2)色谱条件及系统适用性实验

咖啡酸在上述确定的有关物质分离和检测条件 中, 保留时间适中, 与相 邻组分 (绿原酸)完全分离, 能够满足咖啡酸定量测定的要求, 故以上述确定 的有关物质分离和检测条件作为咖啡酸检査的 色谱条件。

色谱条件及系统适用性: 十八垸基键合硅胶柱(150mm X 4. 6mm, 5 μ m)为 色谱柱; 以 0. 1%甲酸 -乙腈(92 : 8)为流动相; 流速为 lml/min, 理论板数按咖 啡酸峰计算大于 3000, 检测波长为 215nm, 绿原酸的主成分峰与咖啡酸杂质 峰分离度大于 1. 5。系统适用性试验图见图 8。 由图可知, 流动相对测定结果 无干扰, 绿原酸与咖啡酸分离度大于 1. 5, 相对保留时间在 0. 35之前应为溶 剂峰和系统峰, 故此色谱条件适用于咖啡酸的检査。

3)对照品溶液的制备

精密称取咖啡酸对照品适量, 加流动相并定量稀释制成每 1ml中含 2 g 的溶液, 作为对照品溶液。

4)供试品溶液的制备

取本品适量, 精密称定, 加流动相制成每 lml含 0. 5mg的溶液, 作为供 试品溶液。 5)测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20 μ 1, 注入液相色谱仪, 测 定峰面积, 按外标法计算, 即得。

6)方法学考察

①专属性考察

考察上述确定的色谱条件能否有效地检出本品 的有关物质, 以证实该检 验方法的专属性, 故对原料药进行强制破坏实验, 对原料药的降解产物进行 考察。

破坏实验 取原料药水溶液(lmg/ml) lml, 加 30%过氧化氢溶液 3ml, 0. 01mol/L NaOH溶液 0. lml, 70°C水浴加热 30min,作为供试品溶液(破坏后); 另取原料药水溶液加水稀释至 0. 25mg/ml的溶液, 作为对照溶液 (破坏前)。 分别精密量取供试品溶液和对照溶液各 20 μ ΐ注入液相色谱仪,记录色谱图。 结果绿原酸主峰与各杂质峰均能有效分离, 各杂质峰彼此基本分离; 咖啡酸 峰显著升高, 新绿原酸峰明显升高, 说明该色谱条件能充分地分离检出原料 药碱氧化破坏后的有关物质, 具有较好的专属性。 色谱图见图 9。

上述实验结果表明该色谱条件具有较好的专属 性。

②线性

取咖啡酸对照品适量,精密称定,加流动相制 成每 1ml含 0. Olmg的储备 液。 分别取储备液适量, 用流动相稀释成浓度为 4. 0、 3. 0、 2. 0、 1. 0、 0. 5、

0. 05 μ g/ml的系列溶液。 分别精密量取上述溶液各 20 μ 1注入液相色谱仪, 记录色谱图。 以咖啡酸的峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标, 回归得直线方程。 结果见表 16。

表 16咖啡酸线性数据

浓度( μ g/ml) 0. 05 0. 5 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 峰面积 (A) 4399 25860 56619 112650 171384 224752 线性范围 0. 05〜4. 0 μ g/ml

线性方程 y=56473x- 21. 225, (r=0. 9996)

结果表明,咖啡酸在浓度 0. 05〜4. 0 g/ml范围内,呈良好的线性关系, 相关系数为 0. 9996。

③检测限和定量限

取线性研究中低浓度溶液(0. 05 μ g/ml)逐渐稀释进样, 按信噪比法, 在 S/N 3时, 确定为咖啡酸的检测限, 为 0. 3ng; 在 S/N 10时, 确定为咖啡 酸的定量限, 为 lng, 色谱图见图 10, 11。 ④加样回收实验

取绿原酸原料药 (含咖啡酸 0. 09%)适量, 精密称定, 加流动相制成每 ml 含绿原酸约 500 μ g的储备液, 取储备液 1. 0ml于 9只 10ml量瓶中, 分别加 入 2、 4、 6 g/ml的咖啡酸对照品溶液 1. 0ml , 加流动相稀释至刻度, 作为 供试品溶液。另取线性研究项下咖啡酸对照品 溶液 (0. 5 g/ml),作为对照品 溶液。 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各 20 μ ΐ注入液相色谱仪, 记 录色谱图, 由标准曲线方程计算测定量并计算回收率, 结果见表 17。

表 17加样回收率数据

綱 样品量 di e) fra入量(lie) 掄屮景( 冋 iHr景( 平 ¾ι冋 iHr (%)

0. 4968 2. 0 2. 54 2. 04 102. 0

低 0. 4968 2. 0 2. 52 2. 02 101. 2 101. 2 0. 83

0. 4968 2. 0 2. 50 2. 00 100. 3

0. 4968 4. 0 4. 54 4. 04 101. 0

中 0. 4968 4. 0 4. 52 4. 02 100. 5 100. 7 0. 24

0. 4968 4. 0 4. 52 4. 02 100. 6

0. 4968 6. 0 6. 61 6. 11 101. 9

0. 4968 6. 0 6. 57 6. 07 101. 2 101. 4 0. 36

0. 4968 6. 0 6. 57 6. 07 101. 2

结果表明, 本法加样回收率平均值为 101. 1%, RSD为 0. 57%, 说明该方 法测定结果准确度良好。

⑤重复性

取绿原酸原料药约 0. 35、 0. 50、 0. 65g各 3份, 精密称定, 置 100ml量 瓶中, 加流动相溶解并稀释至刻度, 再精密量取 lml于 10ml容量瓶中, 用流 动相稀释至刻度作为供试品溶液。 另取咖啡酸对照品适量, 精密称定, 加流 动相制成每 ml含 0. 5 g的溶液, 作为对照品溶液。 分别精密量取供试品溶 液和对照品溶液各 20 μ ΐ注入液相色谱仪, 记录色谱峰面积, 按外标法计算 含量和相对标准偏差(RSD%), 结果见表 18。

表 18重复性实验结果

含景 (%) 平 ¾1含景 (%) 咖啡酸浓 f ( u p/iiil

0. 3571 0. 092

350 (低) 0. 3577 0. 092 0. 092 0. 32 0. 66

0. 3592 0. 093

0. 5128 0. 093

500 (中;) 0. 5119 0. 093 0. 093 0. 46 0. 17

0. 5125 0. 093

0. 6650 0. 094

650 (高) 0. 6684 0. 094 0. 094 0. 61 0. 14

0. 6648 0. 094

测得结果总相对标准偏差为 0. 77%,说明咖啡酸检测结果的重复性较好。 ⑥范围

由以上重复性实验结果可知, 本品 3个浓度梯度的精密度均良好, 证明 供试品溶液中咖啡酸浓度在 0. 32〜0. 61 μ g/ml之间,按拟定的方法测定,检 测结果均能达到良好的精密度。

⑦中间精密度实验

照重复性项下配制低、 中、 高供试品溶液。 另取咖啡酸适量, 加流动相 制成含咖啡酸 0. 5 μ g/ml的溶液作为对照品溶液。 照咖啡酸色谱条件, 由不 同人员在不同时间于不同色谱仪上检测, 记录色谱峰面积, 由一点法计算测 定量, 并计算相对标准偏差 RSD。 结果见表 19。

中间精密度结果

低 0. 092 0. 093 0. 092 0. 092 0. 092 0. 092 0. 092 0. 22 中 0. 092 0. 092 0. 093 0. 092 0. 092 0. 092 0. 092 0. 16

0. 093 0. 094 0. 093 0. 094 0. 094 0. 094 0. 094 0. 51 测得结果的平均含量为 0. 093%, 总相对标准偏差为 0. 80%, 说明该方法 中间精密度良好。

⑧耐受性

根据 《中国药典》 2000年版二部附录 XIX Α "药品质量标准分析方法验 证"要求, 考察了色谱柱品牌和批号、 流动相组成、 柱温等变化条件下, 对 方法测定的影响。

不同品牌色谱柱将同一供试品溶液, 分别用同一类型不同厂家的色谱 柱测定含量, 结果见表 20。

不同品牌色谱柱的比较实验

色谱柱 t R (min) 分离度 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

GEMINE 14. 120 2. 542 9246 1. 005 0. 093

AQ 14. 120 2. 492 8267 1. 110 0. 093

Agielent HC 2. 650 10976 0. 989 0. 093 表明: 用不同品牌的 C18柱(150mm X 4. 6mm, 5μηι)测定, 保留时间略有差 分离度、 理论板数均达到要求, 测得咖啡酸含量无明显差异。

流动相不同比例 将上述供试品溶液, 分别在不同比例流动相下测定含 结果见表 21。

表 21不同比例流动相比较实验 流动相 t R (min) 分离度 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

0. 1%甲酸-乙腈 (92 : 8) 14. 120 2. 542 9246 1. 005 0. 093

0. 1%甲酸-乙腈(90 : 10) 9. 648 2. 256 20639 2. 147 0. 091

0. 1%甲酸 -乙腈(94 : 6) 14. 987 2. 752 11177 0. 937 0. 093 结果表明, 在不同比例的流动相条件下, 分离度、理论板数均达到要求, 测得咖啡酸含量无明显差异。 因此流动相比例的微小变化对含量测定影响不 不同柱温将上述供试品溶液, 分别在不同的柱温下测定含量, 结果见 表 22。 表明: 在不同的柱温条件下, 理论板数均达到要求, 含量结果无明显 的差异。 因此柱温对咖啡酸测定影响不大。

表 22 不同的柱温比较实验

柱温 t R (min) 分离度 理论板数 拖尾因子 含量 (%)

38 °C 16. 585 2. 773 11359 1. 149 0. 093

40 °C 14. 120 2. 542 9246 1. 005 0. 093

42 °C 13. 680 2. 407 8141 1. 094 0. 094 综上所述, 该方法系统适用性、 专属性、 线性、 准确度、 精密度、 耐用 f生方面符合方法学验证要求。 说明本方法测定咖啡酸含量准确、 可行。

7)检测和结果

照上述检査法对供试品进行咖啡酸的检査, 结果见表 23:

表 23 咖啡酸检测结果

批号 1# 2# 3#

0. 093 0. 089 0. 087

含量 (%)

0. 092 0. 093 0. 090

平均值 0. 092 0. 091 0. 089

(3)其它有关物质的检査

绿原酸原料药中其它有关物质包括新绿原酸、 隐绿原酸、 3-香豆酰奎尼 酸和绿原酸甲基化物及其它未鉴定的有关物质 ,这些有关物质无法定对照品, 故均采用绿原酸主成分自身对照法进行研究。

1)仪器与试药

LC-6A高效液相色谱仪, SPD-lOAvp紫外可见检测器、 N2000色谱工作站。 色谱柱 - AichromBond AQ ft (150mm X 4. 6mm, 5 μ m) 试剂: 乙腈为色谱纯; 甲酸为分析纯; 水为自制二次蒸馏水。

2)色谱条件及系统适用性实验

咖啡酸的色谱条件及系统适用性试验能充分分 离和检测其它有关物质, 故确定其它有关物质的检测条件与咖啡酸一致 。

3)供试品溶液的制备

取绿原酸原料药适量, 精密称定, 加流动相制成每 1ml中含 0. 5mg的溶 液, 作为供试品溶液。

4)对照溶液的制备

精密量取供试品溶液 1. 0ml置 100ml量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 作 为对照溶液。

5)测定法

精密量取对照溶液 20 μ ΐ注入液相色谱仪, 调节检测器灵敏度, 使绿原 酸主成分峰为满量程的 10〜20%, 再精密量取上述供试品溶液和对照溶液各 20 μ 1注入液相色谱仪, 记录色谱图至绿原酸峰保留时间的 3倍以上。 供试 品溶液的色谱图中如显现除咖啡酸以外的其它 杂质峰, 则计算其它各杂质峰 面积与对照溶液主峰面积的比值, 得其它有关物质含量, 计算其他有关物质 总和。

6)方法学考察

①专属性考察 同咖啡酸专属性考察结果。

②检测限

取绿原酸原料药适量, 加流动相配制成每 lml含 lmg的溶液, 作为供试 品溶液。 取供试品溶液逐渐稀释进样, 记录色谱图, 将峰面积最小的有关物 质作为考察对象, 以信噪比 (S/N) 3时注入样品的浓度作为其它有关物质的 检测限。

结果表明, 样品中其它有关物质的检测限以供试品溶液浓 度计为 0. 125mg/ml。 为使绿原酸原料中的其它有关物质能被充分检 测, 设定供试品 溶液浓度为 0. 5mg/ml。 色谱图见图 12。

7)检测结果

根据上述有关物质检测方法分别对实施例中各 产品进行有关物质检测, 结果见表 24, 图 13-图 20。 表 24其它有关物质检测结果

新绿原酸 咖啡酸脱羧 咖啡酸 隐绿原酸 3-香豆酰奎尼酸 绿原酸甲基 实施例 总和 (%)

(%) 物 (%) (%) (%) (%) 化合物 (%) 实施例 1 0. 038 0. 231 0. 231 实施例 2 0. 040 0. 016 0. 128 0. 144 实施例 3 0. 009 0. 043 0. 022 0. 215 0. 246 实施例 4 0. 020 0. 040 0. 028 0. 017 0. 395 0. 029 0. 501 实施例 5 0. 030 0. 058 0. 074 0. 217 0. 305 实施例 6 0. 043 0. 062 0. 049 0. 096 0. 201 实施例 7 0. 040 0. 239 0. 239 实施例 8 0. 165 0. 165