Composition comprenant un extrait de Lactobacillus rhamnosus

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne une composition comprenant un nouvel extrait de Lactobacillus rhamnosus, en particulier un lysat de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313), et ses effets bénéfiques sur les matières kératiniques, en particulier la peau.

ETAT DE LA TECHNIQUE

La peau est la première barrière du corps humain. Elle protège les organes des différences de température, d’humidité, et des agressions de l’environnement extérieur, comme les rayons UV, le stress, la pollution, les microorganismes pathogènes... Cependant, des stimulations chimiques et physiques excessives détériorent les fonctions normales de la peau et induisent ou accélèrent son vieillissement, entraînant l’apparition de rides et une perte de sa fermeté, sa souplesse et son élasticité.

La recherche de nouvelles molécules ou ingrédients actifs utilisables en cosmétique est une nécessité pour pouvoir développer des produits efficaces pour donner un aspect plus jeune à la peau, un teint homogène, sans irrégularité colonelle au niveau de la pigmentation ou de la microcirculation, un teint éclatant.

La Demanderesse a justement mis en évidence qu’un extrait de Lactobacillus rhamnosus, en particulier un lysat de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313), avait des effets bénéfiques sur des cultures de cellules de peau in vitro : elle a démontré que ce lysat avait un effet stimulant sur l’expression de plusieurs gènes impliqués notamment dans :

- la détoxification (MRP1=ABCC1 , LONP1 , GPX1),

- le fonctionnement de la chaîne respiratoire de la mitochondrie impliquée dans la production d’énergie cellulaire (MT= NADH deshydrogénase / ubiquinone),

- la sécrétion de l’acide hyaluronique (MRP5),

- le maintien de l’intégrité des structures cellulaires comme celle du noyau cellulaire (SYNE2, LM NA), et

- la formation de plusieurs collagènes et de l’élastine (COL1A1 , COL5A1 , COL13A1 ,

ELN).

Ainsi, l’extrait de Lactobacillus rhamnosus selon l’invention et en particulier un lysat de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313), est avantageux en ce qu’il présente un effet détoxifiant et antioxydant, un effet antiâge visant une diminution des rides, de la perte de fermeté et de densité (collagènes et élastine et points d’ancrage entre les cellules et ces protéines de structure), un effet de renforcement de la peau (structures cellulaires comme le noyau des cellules), un effet d’adaptation de la peau aux stress hypoxiques, un effet dépigmentant sur les taches cutanées (inhibition de la mélanogénèse) et/ou un effet de normalisation du microbiote cutané via le renforcement de l’immunité innée et de la barrière cutanée.

EXPOSE DE L'INVENTION

Un premier objet de l’invention concerne une composition pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres, comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM I- 5313), d’une de ses fractions et/ou d’un de ses métabolites et au moins un excipient choisi parmi des solvants autres que l’eau, des filtres UV, des tensio-actifs, des gélifiants, des épaississants, des charges, des matières colorantes, des polymères filmogènes, des parfums et leurs mélanges, en particulier des solvants autres que l’eau, des tensio-actifs, des gélifiants, des épaississants, des charges, des matières colorantes, des polymères filmogènes, des parfums et leurs mélanges.

L’invention porte également sur un procédé cosmétique non thérapeutique comprenant l’application sur les matières kératiniques d’au moins un extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) selon l’invention ou d’une composition en contenant, destiné à prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané et/ou à favoriser et/ou améliorer la fonction barrière. On parlera indifféremment de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) ou de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-5313, correspondant à la souche de Lactobacillus rhamnosus déposée suivant le traité de Budapest auprès de la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) à l'Institut Pasteur (28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15) le 1 1 Avril 2018 au nom de BIOVITIS, Le Bourg, 15400 SAINT-ETIENNE-DE- CHOMEIL, sous la désignation sous le numéro CNCM 1-5313.

Un autre objet de l’invention concerne l’utilisation cosmétique non thérapeutique d’un extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) pour favoriser et/ou améliorer la fonction barrière et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention porte donc notamment sur une composition pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres, comprenant, dans un

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP milieu physiologiquement acceptable, au moins un extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313), d’une de ses fractions et/ou d’un de ses métabolites et au moins un excipient choisi parmi des solvants autres que l’eau, des tensio-actifs, des gélifiants, des épaississants, des charges, des matières colorantes, des polymères filmogènes, des parfums et leurs mélanges.

Par ‘matières kératiniques’, on entend selon l’invention la peau, les muqueuses (en particulier les lèvres), et les phanères. Selon un mode particulier, la composition est destinée à une application topique sur la peau, les lèvres ou les phanères, de préférence la peau.

Les « matières kératiniques » selon l’invention sont généralement des matières kératiniques saines, c’est-à-dire ne présentant pas de troubles ou de désordres qui relèveraient d’un état pathologique (sujets ‘non sains’, atteints d’une pathologie). On parlera indifféremment de peaux et/ou lèvres saines ou de peaux et/ou lèvres dans le reste de la description.

Par‘milieu physiologiquement acceptable’, on entend un milieu compatible avec les matières kératiniques, en particulier la peau et/ou les lèvres.

Par‘excipient’ selon l’invention, on entend une substance dépourvue d’effet cosmétique en tant que telle, mais utile à l’incorporation de de l’extrait de Lactobacillus rhamnosus dans la composition de l’invention ou à la mise en forme celle-ci.

Extrait de Lactobacillus rhamnosus

Selon les définitions utilisées par les associations scientifiques internationales pour les probiotiques et les prébiotiques, on entend par‘probiotiques’, des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité adéquate, ont des effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. On entend par‘prébiotiques’, des ingrédients alimentaires résistant à la digestion qui induisent des changements spécifiques dans la composition et/ou l’activité du microbiote intestinal produisant ainsi un effet bénéfique sur la santé de l’hôte. On entend par ‘symbiotiques’, des produits qui contiennent à la fois des probiotiques et des prébiotiques.

L’extrait de Lactobacillus rhamnosus (microorganisme probiotique) selon l’invention peut être inclus dans une composition selon l'invention sous une forme vivante, semi-active ou inactivée, morte. Il peut être inclus sous forme de fractions de composants cellulaires ou sous la forme de métabolites. Le microorganisme, métabolite(s) ou fraction(s) peu(ven)t également être introduit(s) sous la forme d'une poudre lyophilisée, d'un surnageant de culture et/ou le cas échéant sous une forme concentrée.

Selon un mode de réalisation particulier, le microorganisme Lactobacillus rhamnosus est mis en oeuvre sous une forme inactivée voire morte, et plus particulièrement sous forme d'un lysat.

Ainsi, selon un mode particulier et préféré, l’extrait de Lactobacillus rhamnosus selon l’invention est un lysat de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) (non vivant), d’une de ses fractions et/ou d’un de ses métabolites.

On parlera indifféremment dans la description ‘d’extrait probiotique’ ou ‘d’extrait de Lactobacillus rhamnosus’ ou de‘lysat probiotique’ ou de‘lysat de Lactobacillus rhamnosus’. Par‘lysat’, on entend notamment un matériau obtenu par lyse cellulaire des cellules du microorganisme considéré provoquant ainsi la libération des constituants biologiques intracellulaires naturellement contenus dans lesdites cellules. Le lysat mis en oeuvre est formé en tout ou partie des constituants biologiques intracellulaires et des constituants des parois et membranes cellulaires. La présente invention concerne donc la mise en oeuvre d'un lysat probiotique et/ou une de ses fractions et/ou un de ses métabolites.

Au sens de l'invention, le terme‘fraction’ désigne plus particulièrement un fragment dudit microorganisme doté des mêmes effets bénéfiques sur la peau, au moins en partie, par analogie audit microorganisme entier.

En particulier, le lysat selon l’invention contient la fraction cytoplasmique cellulaire renfermant les enzymes (ex : déshydrogénases, phosphatases...) et/ou les constituants des parois cellulaires (ex : peptidoglycanes...) et/ou les constituants des membranes cellulaires (ex : glycérophospholipides...).

La lyse cellulaire peut être réalisée par différentes technologies bien connues de l’homme du métier, telles que par exemple choc osmotique, choc thermique, par ultrasons, ou encore sous contrainte mécanique (ex : centrifugation).

Selon un mode de réalisation préféré, le lysat est obtenu par centrifugation et choc osmotique (ex : ajout de soude).

Selon un mode particulier, le microorganisme est cultivé anaérobiquement dans un milieu de culture adéquat. Lorsque la phase stationnaire du développement est atteinte, le milieu de culture peut être inactivé par pasteurisation, par exemple à une température de 60 à 65 °C pendant 30 mn. Les microorganismes sont alors recueillis par une technique de séparation conventionnelle par exemple filtration membranaire, centrifugation et remis en suspension dans une solution NaCI physiologique stérile. Le lysat peut être obtenu par désintégration aux ultrasons d'un tel milieu afin d'en libérer les fractions cytoplasmiques, les fragments de paroi cellulaire et les produits issus du métabolisme. Puis tous les composants dans leur distribution naturelle sont ensuite stabilisés dans une solution aqueuse faiblement acide.

Le lysat ainsi obtenu possède généralement une concentration de l'ordre de 0,1 à 10 %, en particulier de 0,5 à 5 % et notamment de 1 à 2 % en poids en matière(s) sèche(s) (active(s)) par rapport à son poids total.

Le lysat peut être mis en œuvre sous différentes formes, sous la forme d'une solution ou sous la forme d’une poudre.

Selon un mode particulier, le lysat est sous la forme d’une solution, de préférence d’une solution aqueuse, comprenant de 0,1 à 10 %, en particulier de 0,5 à 5 % et notamment de 1 à 2 % en poids en matière(s) sèche(s) (active(s)) par rapport à son poids total.

Le microorganisme probiotique selon l’invention appartient à l’espèce Lactobacillus rhamnosus (ATCC 7469, CCM 1825, NCDO 243, NCIB 6375 ou encore WDCM 00101 suivant les collections dans lesquelles elle a été déposée), de préférence la souche Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-5313, déposée suivant le traité de Budapest auprès de la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) à l'Institut Pasteur (28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15) le 1 1 Avril 2018 au nom de BIOVITIS, Le Bourg, 15400 SAINT- ETIENNE-DE-CHOMEIL, sous la désignation CNCM 1-5313, et/ou une de ses fractions et/ou un de ses métabolites.

Un lysat de cette souche L. rhamnosus est obtenu selon le protocole suivant du fournisseur Greentech :

1 . Culture de la souche L. rhamnosus dans un milieu de culture adéquat ;

2. Récupération de la biomasse par centrifugation ;

3. Lyse cellulaire (ajout de soude) ;

4. Ajustement du pH (ajout d’acide citrique) et de la matière sèche (ajout d’eau stérile) pour obtenir une teneur en matière active allant de 0,1 à 10% en poids de matière sèche (matière active) par rapport au poids total dudit lysat ;

5. Ajout de conservateur (phénoxyéthanol).

Un tel lysat de L. rhamnosus est dénommé Probiophyte LB par le fournisseur Greentech, et définie en nom INCI sous la dénomination WATER and LACTOBACILLUS FERMENT

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP LYSATE and PHENOXYETHANOL and SODIUM HYDROXIDE and CITRIC ACID, le phénoxyéthanol pouvant être remplacé par un autre conservateur.

Ce lysat comprend une teneur en Lactobacillus rhamnosus allant de 0 , 1 à 10%, en particulier de 0,5 à 5% en poids et notamment de 1 à 2% en poids de matière sèche (matière active) par rapport au poids total dudit lysat.

Le lysat de L. rhamnosus de l'invention peut être formulé dans une composition à raison d'au moins 0,0001 % (exprimé en poids sec ou poids de matière active), en particulier à raison de 0,0001 à 10 % et plus particulièrement à raison de 0,0001 à 5 % en poids en particulier de 0,0001 à 2 % en poids, et notamment de 0,0001 % à 1 %, voire de 0,0001 à 0,05% en poids par rapport au poids total de la composition.

Selon un mode particulier, l’extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) est présent en une teneur allant de 0,0001 à 0,05% en poids de matière active par rapport au poids total de ladite composition.

Le lysat de L rhamnosus selon l’invention pourra être utilisé seul ou associé à d’autres microorganismes probiotiques, des ingrédients prébiotiques, des ingrédients symbiotiques ou leur mélange.

Selon un mode particulier, la composition comprend en outre au moins actif cosmétique autre que des vitamines ou des extraits en contenant, en particulier choisi parmi des huiles riches en acides gras essentiels ou non, des extraits prébiotiques (qui facilitent la croissance de certaines espèces bactériennes bénéfiques de la microflore cutanée au détriment d’espèces indésirables), d’autres extraits d’autres souches de microorganismes probiotiques ou encore des ingrédients symbiotiques (extrait de probiotiques + extraits prébiotiques), des séborégulateurs (pour favoriser la biodiversité de la flore) et des agents raffermissants (pour limiter l’élargissement des pores), des agents apaisants, des actifs protecteurs en particulier des stimulateurs de défenses antioxydantes et détoxifiantes de la peau (autrement nommés agents antioxydants ou simplement antioxydants), des agents dépigmentants, des agents exfoliants, des actifs antiâge, des ingrédients hydratants, des actifs immunomodulateurs, et leurs mélanges.

Par ‘composition’ selon l’invention, on entend une composition cosmétique ou dermatologique.

Selon un mode particulier, il s’agira d’une composition cosmétique. Selon un autre mode particulier, il s’agira d’une composition dermatologique.

La composition selon l'invention peut, par exemple, être utilisée comme produit de soin et/ou de maquillage pour le visage et/ou le corps.

Les compositions selon l'invention sont destinées plus particulièrement à une application topique sur les matières kératiniques, en particulier sur la peau.

Les compositions de l’invention comprennent un milieu physiologiquement acceptable, c'est- à-dire compatible avec la peau et les phanères. Les compositions peuvent avoir toutes les formes cosmétiques, et notamment être sous la forme d’une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, d’une microémulsion, d’une solution, d’une suspension, d’une lotion, d’un gel, d’une crème, d’un lait, d’un sérum, d’une brume (solution fluide pulvérisée), d’un stick ou encore d’une poudre et adaptées à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères.

Selon un mode particulier, la composition de l’invention est destinée à une application topique sur la peau et/ou les lèvres et se présente sous la forme d’une composition cosmétique de soin et/ou de maquillage de la peau et/ou des lèvres.

La composition cosmétique de l’invention est avantageusement sous la forme d’une émulsion, d’un sérum, ou d’une brume.

La composition comprend généralement au moins une phase aqueuse et au moins une phase huileuse.

La phase aqueuse représente généralement de 1 à 99% en poids, par rapport au poids total de ladite composition.

Une phase huileuse selon l’invention peut comprendre des huiles hydrocarbonées, siliconées, fluorées ou non, et leurs mélanges. Ces huiles peuvent être volatiles ou non volatiles, végétale, minérale ou synthétique.

Avantageusement, on utilisera des huiles hydrocarbonées, notamment d’origine végétale. Comme huiles volatiles hydrocarbonées, on peut citer notamment les alcanes ramifiés en C8-C16, les esters ramifiés en C8-C16 et leurs mélanges.

Comme huiles non volatiles hydrocarbonées, on peut citer notamment les huiles hydrocarbonées, les huiles hydrocarbonées d’origine végétale, les éthers de synthèse en C10-C40, les esters de synthèse en C10-C40, les alcools gras en C12-C26, les acides gras supérieurs en C12-C22, et leurs mélanges. Les huiles pourront être présentes dans la composition de l’invention en une teneur allant de 1 à 95 % en poids par rapport au poids total de la composition.

La composition de l'invention peut également comprendre tout additif usuellement utilisé en cosmétique tels que des filtres UV, des antioxydants, des tensio-actifs, des gélifiants, des charges, matières colorantes (ex : pigments), des conservateurs, des polymères filmogènes, des parfums, des agents actifs cosmétiques, comme par exemple des émollients, des hydratants, des vitamines, des agents anti-âge, des agents éclaircissants, et leurs mélanges.

Procédé cosmétique et autres utilisations

L’invention porte également sur un procédé cosmétique non thérapeutique destiné à prévenir et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané et/ou à favoriser et/ou améliorer la fonction barrière comprenant l’application sur les matières kératiniques d’au moins un extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) en particulier un lysat de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313), d’une de ses fractions et/ou d’un de ses métabolites, ou d’une composition selon l’invention, telle que définie précédemment.

De préférence, les matières kératiniques selon l’invention sont des matières kératiniques saines.

L’extrait de Lactobacillus rhamnosus est présent généralement en une teneur allant de 0,0001 à 10% en poids de matière sèche, en particulier de 0,0001 à 5%, de préférence de 0,0001 à 2%, et notamment de 0,0001 % à 1 %, voire de 0,0001 à 0,05% en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition.

La composition mise en oeuvre dans le procédé cosmétique peut être une composition de soin et/ou de maquillage, en particulier une composition de soin de la peau du visage et/ou du corps.

En particulier, le procédé est destiné à prévenir et/ou diminuer la perte de fermeté et de densité de la peau, prévenir et/ou diminuer l’apparition de rides et/ou ridules et/ou de taches pigmentaires, améliorer l’éclat et/ou l’homogénéité de la peau, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de la peau, détoxifier la peau, favoriser et/ou stimuler ses défenses antioxydantes et/ou améliorer la résistance à l’hypoxie de la peau, et/ou contrôler la microflore de la peau, et/ou stimuler l’immunité de la peau et la formation de la barrière cutanée. Par « favoriser et/ou stimuler les défenses antioxydantes des matières kératiniques », on entend notamment favoriser l’oxygénation de la peau et ainsi diminuer les effets de l’hypoxie cutanée, favoriser la respiration cellulaire et la production d’énergie au niveau cellulaire.

Par « favoriser et/ou stimuler l’immunité de la peau », on entend maintenir l’équilibre de la microflore de la peau et favoriser l’homéstasie cutanée pour une peau plus saine et mieux protégée contre les agents externes.

Selon un mode particulier, le procédé est destiné à prévenir et/ou diminuer la perte de fermeté et de densité de la peau, prévenir et/ou diminuer l’apparition de rides et/ou ridules et/ou de taches pigmentaires, améliorer l’éclat et/ou l’homogénéité de la peau, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de la peau, et/ou améliorer la résistance à l’hypoxie de la peau, et/ou contrôler la microflore de la peau.

Selon un mode particulier, la composition de l’invention est appliquée sur une peau âgée, atone, fatiguée, ou impactée par un contexte nutritionnel défavorable ou déséquilibré, de stress émotionnel ou de manque de sommeil.

La présente invention porte également sur l’utilisation cosmétique non thérapeutique d’un extrait de Lactobacillus rhamnosus (CNCM 1-5313) pour favoriser et/ou améliorer la fonction barrière et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier prévenir et/ou diminuer la perte de fermeté et de densité de la peau, prévenir et/ou diminuer l’apparition de rides et/ou ridules et/ou de tâches pigmentaires, améliorer l’éclat et/ou l’homogénéité de la peau, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de la peau, détoxifier la peau, stimuler ses défenses antioxydantes et/ou améliorer la résistance à l’hypoxie de la peau, et/ou contrôler la microflore de la peau, et/ou stimuler l’immunité de la peau et la formation de la barrière cutanée.

Selon un mode particulier, l’extrait selon l’invention est utilisé pour favoriser et/ou améliorer la fonction barrière et/ou diminuer les signes du vieillissement cutané, en particulier prévenir et/ou diminuer la perte de fermeté et de densité de la peau, prévenir et/ou diminuer l’apparition de rides et/ou ridules et/ou de tâches pigmentaires, améliorer l’éclat et/ou l’homogénéité de la peau, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de la peau, détoxifier la peau et/ou améliorer la résistance à l’hypoxie de la peau, et/ou contrôler la microflore de la peau. L’invention porte également sur un extrait de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-5313 selon l’invention pour favoriser et/ou stimuler l’immunité de la peau.

L’invention va désormais être illustrée dans les exemples non limitatifs suivants.

Sauf indication contraire, les pourcentages sont des pourcentages pondéraux exprimés en poids par rapport au poids total de la composition.

EXEMPLES

La Demanderesse a évalué l’effet d’un lysat de souche bactérienne probiotique de L. rhamnosus: ATCC 7469, CCM 1825, NCDO 243, NCIB 6375 ou encore WDCM 00101 suivant les collections dans lesquelles elle a été déposée.

En particulier, la souche bactérienne probiotique utilisée a été déposée suivant le traité de Budapest auprès de la Collection nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) à l'Institut Pasteur (28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15) le 1 1 Avril 2108 au nom de BIOVITIS, Le Bourg, 15400 SAINT -ETIENNE-DE-CHOMEIL, sous la désignation CNCM I- 5313.

Un lysat de cette souche L rhamnosus est obtenu selon le protocole suivant du fournisseur Greentech :

1 . Culture de la souche L. rhamnosus dans un milieu de culture adéquat ;

2. Récupération de la biomasse par centrifugation ;

3. Lyse cellulaire (ajout de soude) ;

4. Ajustement du pH (ajout d’acide citrique) et de la matière sèche (ajout d’eau stérile) pour obtenir une teneur en matière active allant de 0,01 à 10% en poids de matière sèche (matière active) par rapport au poids total dudit lysat ;

5. Ajout éventuel de conservateur (ex : phénoxyéthanol).

Un tel lysat de L rhamnosus est dénommé Probiophyte LB par le fournisseur Greentech, et définie en nom INCI sous la dénomination WATER and LACTOBACILLUS FERMENT LYSATE and PHENOXYETHANOL and SODIUM HYDROXIDE and CITRIC ACID, le phénoxyéthanol pouvant être remplacé par un autre conservateur.

Ce lysat comprend une teneur en Lactobacillus rhamnosus allant de 0 ,1 à 10%, en particulier de 0,5 à 5% en poids et notamment de 1 à 2%, voire de 1 ,75% en poids de matière sèche (matière active) par rapport au poids total dudit lysat.

Un tel lysat (mais sans conservateur phénoxyéthanol) est testé à une teneur de 0,05, 0,1 et 0,2 % dans les tests sur des cultures cellulaires de cellules de peau et utilisé dans les

FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP compositions cosmétiques pour application topique illustrées ci-après à des teneurs allant de

I à 2% en poids de matière première.

II est nommé indifféremment Probiophyte LB ou lysat de Lactobacillus rhamnosus dans les exemples suivants.

Exemple 1 : Effet de l’extrait de L rhamnosus sur des cultures de kératinocytes

Le test mis en œuvre ici a permis de comparer deux extraits de souches bactériennes probiotiques afin de sélectionner l’extrait le plus efficace à stimuler les cellules cutanées. On a utilisé une méthodologie RT-qPCR qui permet d’observer la stimulation ou l’inhibition ou encore l’absence de stimulation de gènes impliqués dans des processus cutanés clés du soin en particulier sur des kératinocytes, cellules majoritaires de l’épiderme.

Des kératinocytes humains normaux (KHN sont mis en culture puis traités avec l’extrait probiotique de L rhamnosus décrit ci-dessus ou l’extrait de Lactococcus lactis.

Après traitement des KHN, une étude par qPCR (réaction en chaîne par polymérase) sur les gènes étudiés est effectuée à partir des ADNc obtenus après transcription inverse des ARN totaux extraits.

Cellules utilisées et conditions de culture :

Cellules : kératinocytes épidermiques humains normaux au 3ème passage (NHEK)

Milieu de culture : Kératinocyte-SFM complémenté avec EGF 0,25 ng/ml, extrait pituitaire 25 pg/ml et gentamycine 25 pg/ml à 37°C et avec 5% de C02

Milieu d’essai : Kératinocyte-SFM complémenté avec gentamycine 25 pg/ml

Composés testés :

Probiophyte LB sans conservateur : extrait de Lactobacillus rhamnosus CNCM I- 5313 selon l’invention

Extrait de Lactococcus lactis : extrait de Lactococcus lactis fourni par Greentech (réf produit 001 1 19, n° lot LYCC1204E1 -BY de Mars 2012) et comprenant un lysat de Lactococcus lactis, de l’acide citrique et de l’hydroxyde de sodium. La teneur en matière sèche (active) de L lactis est de 5 à 6% en poids de matière première.

Doses testées : 0,05 ; 0,1 et 0,2 %

Temps de traitement : 24h

N=3 cultures par conditions expérimentales Analyses effectuées :

Mesure de l’expression génique par RT-qPCR sur les ARN messagers extraits des tapis cellulaires non traités (témoins) et traités avec les différentes concentrations d’extrait probiotique. Plusieurs gènes ont été évalués ; sont présentés dans les tableaux ci-dessous les gènes et résultats correspondants pour lesquels des résultats différentiels ont été observés entre l’extrait selon l’invention (Probiophyte LB : extrait de Lactobacillus rhamnosus) et l’extrait comparatif (extrait de Lactococcus lactis).

Technologie RT -gPCR (RT-PCR quantitative )

• Obtention des ARN totaux

Les ARN totaux de chaque échantillon ont été extraits à l’aide de TriPure Isolation Reagent® selon le protocole préconisé par le fournisseur. La quantité et la qualité des ARN ont été évaluées par électrophorèse capillaire (Bioanalyzer 2100, Agilent).

Les traces d’ADN potentiellement contaminant ont été éliminées par traitement avec le système DNA-free (Ambion).

• Synthèse des ADN complémentaires

Les ADN complémentaires (ADNc) ont été synthétisés par transcription inverse des ARN totaux en présence d’oligo(dT) et de l’enzyme « Transcriptor First strand cDNA synthesis » (Roche Diagnostics). L’ADNc obtenu a été quantifié par spectrophotométrie (Nanovue ; GE Healthcare), puis les quantités ADNc ont été ajustées à 5 ng/mI.

• PCR quantitative

Les réactions de PCR (polymerase chain reactions) ont été réalisées par PCR quantitative (Light Cycler ; Roche Molecular Systems Inc.) et selon les procédures recommandées par le fournisseur.

Le mélange réactionnel (10 pl final) pour chaque échantillon contenait :

2.5 mI d’ADNc à 5 ng/mI,

les amorces des différents marqueurs utilisés,

le mélange réactionnel contenant l’enzyme taq DNA polymérase, le marqueur SYBR Green

Traitem

Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel ^® . L’incorporation de fluorescence dans l’ADN amplifié est mesurée en continu au cours des cycles de PCR. Ces mesures permettent d’obtenir des courbes d’intensité de la fluorescence en fonction des cycles de PCR et d’évaluer ainsi une valeur d’expression relative (ER) pour chaque marqueur.

Le nombre de cycles est déterminé à partir des points de « sortie » des courbes de fluorescence. Pour un même marqueur analysé, plus un échantillon sort tard (nombre de cycles élevé), plus le nombre initial de copies de l’ARNm est faible.

La valeur d’ER (expression relative) est exprimée en unités arbitraires (UA) selon la formule suivante : l/2 ^{nombre de} cycles) x 10 ⁶

Tableau 1 :

Gènes étudiés Tableau 2 :

Résultats montrant l’effet stimulant du probiophyte LB selon l’invention sur plusieurs gènes kératinocytaires comparativement à l’extrait de Lactococcus lactis.

Le tableau ci-dessus montre l’effet stimulant du Probiophyte LB sur plusieurs processus cutanés importants :

la formation de la barrière cutanée avec la stimulation du gène de la transglutaminase (TGM1) qui permet la formation des enveloppes cornées des cornéocytes qui assurent la résistance mécanique et chimique et l’hydrophobicité de la surface de la peau ainsi que l’organisation des lipides de la surface de celle- ci ;

l’immunité innée avec la stimulation de plusieurs gènes de peptides antimicrobiens qui permettent de contrôler le développement de la microflore cutanée : DEFB4A, S100A7, PI3, RNASE7, et

le renforcement de la jonction dermo-épidermique avec la stimulation du gène du collagène de type 7 (COL7A1) un collagène de cohésion entre le derme et la jonction épidermique. Ce collagène diminue au cours du vieillissement.

Exemple 2 : Effet de l’extrait de L rhamnosus sur des cultures de kératinocytes, de mélanocytes et de fibroblastes

Cette deuxième expérience permet d’approfondir les effets biologiques du Probiophyte LB, par la méthodologie TLDA (TaqMan Low Density Array) sur un répertoire de gènes plus important et sur les trois types cellulaires principaux de la peau : les kératinocytes, les mélanocytes, et les fibroblastes.

Cellules utilisées :

Cellules : kératinocytes épidermiques humains normaux au 5 ^eme passage (KHN), Fibroblastes humains normaux de derme au 6 ^eme passage, mélanocytes humains normaux au 7 ^eme passage (MHN)

Composés testés :

Probiophyte LB sans conservateur) : extrait de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-5313

Doses testées : 0,1 et 0,2 pg/ml

Temps de traitement : 24h

N=3 cultures par conditions expérimentales

Analyses effectuées :

Mesure de l’expression génique par RT-qPCR à partir les ARN messagers extraits des tapis cellulaires non traités (témoins) et traités avec les différentes concentrations de Probiophyte LB.

Technologie TLDA ( TaqMan Low Density Array)

• Obtention des ARN totaux Le milieu de culture des cellules est éliminé, et 250 pL de tampon de lyse RLT (fourni dans le kit Nucleospin RNA trace, Macherey-Nagel) sont ajoutés. Les cellules sont raclées à l’aide d’un Cell Sera per puis, le lysat cellulaire est récupéré dans une deepwell 1 ,2 mL (fournie dans le kit Nucleospin RNA). Les ARN totaux sont extraits selon les protocoles définis.

Les solutions d’ARN totaux obtenues sont dosées, et leur qualité vérifiée, à l'aide d'un lecteur de microplaques, le spectrostarNANO (BMG Labtech) couplé au MicrolabSTAR. Cet appareil est relié à l'ordinateur pilotant la plateforme robotique et possède le logiciel spécifique d'analyse des résultats (logiciel MARS). La technique nécessite une microplaque de 384 puits (LoBase), un contrôle positif (RNA 250, AM7155, Thermofisher) permettant de valider les pipetages réalisés par le robot ainsi que les valeurs générées par le lecteur spectrostarNANO.

• Synthèse des ADN complémentaires

Le kit de reverse transcription (RT) utilisé est le High Capacity Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher). Il a été utilisé selon le protocole fourni. 500 ng d’ARN totaux sont dilués dans de l’eau pour un volume final de 25 pL. Ils sont ensuite incubés pendant 10 minutes à 25°C puis 2 heures à 37°C en présence de 25 pL de mélange réactionnel de High Capacity Reverse Transcription Kit 2X préalablement préparé comme indiqué ci-dessous. Les différentes incubations sont faites au sein du TRobot (Biométra).

Tableau 3 :

Mélange réactionnel High Capacity Reverse Transcription Kit 2X pour 1 réaction

• PCR-TaqMan Low Density Array

15 pL de chaque RT sont mélangés à 60 mI d’eau puis 75 pL de TaqMan Gene Expression master mix (ThermoFisher), contenant l’ADN polymerase, sont ajoutés. Après homogénéisation, 100 pL sont déposés sur les cartes microfluidiques contenant les sondes correspondant aux gènes testés, ces dernières sont centrifugées puis scellées. Le CD Rom correspondant au profil des gènes déposés sur les plaques est chargé dans le logiciel SDS 2.3, précisant l’emplacement de chaque gène sur la carte. Le gène contrôle (ou « endogenous gene ») à utiliser pour la normalisation des résultats est à indiquer avant le lancement de la PCR. Cette dernière est réalisée selon le protocole fourni par Applied Biosystems dans l’appareil ABI Prism 7900HT Sequence détection System. Les étapes de la qPCR sont 2 min à 50°C, 10 min à 94,5°C puis 30s à 97°C et 1 min à 59,7°C pour 40 cycles.

Analyses statistiques

La PCR quantitative en temps réel peut être exploitée si son efficacité est comprise entre 90% et 1 10%. Pour chaque échantillon, le nombre de cycles auquel apparaît le signal est déterminé par le logiciel SDS 2.3. Pour un même essai, les niveaux d’expression des transcrits d’intérêt obtenus sont normalisés par rapport à la valeur obtenue pour le gène de ménage Beta-2-microglobuline. Ce gène dont l’expression est constitutive et invariante permet de s’affranchir toutes variations induites au cours de l’expérience (dosage des ARNs totaux, pipetages, étape de réverse transcription, PCR dans l’appareillage).

Dans la méthode de RT-PCR TLDA, la quantification est effectuée en utilisant la méthode comparative de AACt. Les valeurs de quantification relative (RQ) obtenues correspondent au niveau d’amplitude (x fois plus ou moins que le contrôle) de l’expression par rapport à notre contrôle ici le non irradié. Le RQ est obtenu par le calcul suivant où le contrôle est égal à 1 : Q = 2 ^DD = 2 (^ ^t traité - ACt non traité)

ACt traité = Ct gène cible traité - Ct gène de ménage traité

ACt non traité Ct gène cible non traité - Ct gène de ménage non traité

Afin d’évaluer des variations d’activité transcriptionnelle statistiquement significative, nous utiliserons le test t de Student. Chaque condition est réalisée en triplicate (3 non traités et 3 traités dans les mêmes conditions). Le test-F de Fischer est tout d’abord appliqué en comparant les deux matrices de données. Lorsque la valeur est supérieur à a = 0,05 alors la variance pour le test t de Student est de 2, lorsque le test-F de Fischer est inférieur à a =

0,05 alors la variance sera égale à 3. Les variations transcriptionnelles retenues seront celles qui ont un test t de Student inférieur à a = 0,05.

Les résultats sont présentés en moyenne sur n=3. Le test t de Student a été utilisé pour comparer l’effet entre les cellules traitées et non traitées.

Les résultats sont considérés comme significatifs pour p<0,05(*) ou p<0,01 (**).

Ci-dessous les tableaux des résultats montrant l’effet du Probiophyte LB sur plusieurs gènes kératinocytaires (KHN) complémentaires à ceux de l’étude précédente, et sur plusieurs gènes mélanocytaires (MHN) et fibroblastiques (FHN). Les valeurs inférieures à 1 correspondent à un effet inhibiteur sur l’expression desdits gènes et les valeurs supérieures à 1 correspondent à un effet stimulant sur l’expression desdits gènes. Tableau 4 :

Résultats sur l’expression génique des mélanocytes

Tableau 5 :

Résultats sur l’expression génique des kératinocytes

Tableau 6

Résultats sur l’expression génique des fibroblastes

Ces résultats montrent que les fibroblastes dermiques sont beaucoup plus sensibles à la modulation de leurs gènes par le Probiophyte LB (n=22 gènes modulés) que ne le sont les kératinocytes (n=2 gènes modulés) et les mélanocytes (n=1 gène modulé). L’extrait a donc une activité très importante au niveau des cellules du derme.

Pour les fibroblastes dermiques on a observé en particulier une activation, par le lysat de Lactobacillus rhamnosus de l’invention, des gènes impliqués dans :

l’accroche et la cohésion cellules-matrice qui permet au fibroblaste de densifier et de contracter la matrice avec les effets positifs de ce processus sur la fermeté (ITGB1) ;

le maintien de l’intégrité des structures cellulaires comme le noyau et donc de la résistance des cellules de la peau (SYNE2, LMNA) ;

la formation de plusieurs collagènes et d’élastine qui sont les constituants majeurs du derme et dont la stimulation s’oppose aux effets du vieillissement (COL1A1 , COL5A1 , COL13A1 , ELN) ;

l’équilibre hydrique du derme qu’il s’agisse des mouvements d’eau (AQP1) ou des réserves d’eau avec la formation (HAS2 et 3), la fixation (CD44) et la sécrétion (ABCC5) d’acide hyaluronique qui peut capter jusqu’à 1000 fois son poids en eau ;

la régénération des cellules dermiques (Ki67) ;

les défenses antioxydantes des cellules (GPX1) et détoxifiantes (ABCC1 =MRP1). Ce dernier gène code pour une protéine qui va permettre d’expulser hors de la cellule des composés qui peuvent lui être toxiques ;

l’adaptation des cellules à des conditions d’hypoxie (HIF1a) qui augmentent avec l’âge dans la peau (cf marqueurs de l’hypoxie comme l’anhydrase carbonique 9 dans la peau âgée) et qui peut s’expliquer par la réduction du réseau vasculaire dermique avec l’âge ;

l’énergétique et la nutrition avec l’entrée de glucose dans les cellules (SLC2A1) ;

la production d’énergie au niveau de la mitochondrie (MT= NADH déshydrogénase ou ubiquinone) ;

la détoxification et donc la protection de la mitochondrie par la dégradation et le recyclage des protéines mitochondriales endommagées (LONP1).

Pour les kératinocytes on a observé :

une activation d’un gène impliqué dans l’immunité innée (TLR1) et qui est un récepteur de surveillance immunitaire aux constituants bactériens de type lipopeptides

une inhibition d’un gène impliqué dans dégradation des collagènes (MMP9), processus qui augmente avec le vieillissement.

Pour les mélanocytes, on a observé :

une baisse d’un facteur stimulateur de la mélanogénèse dans ces cellules (PPARG) ce qui contribue à un effet dépigmentant.

L’ensemble de ces résultats montre donc que l’extrait de Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-5313 selon l’invention appliqué sur les matières kératiniques, en particulier la peau, permet de prévenir et/ou diminuer la perte de fermeté et de densité de la peau, prévenir et/ou diminuer l’apparition de rides et/ou ridules et/ou de tâches pigmentaires, améliorer l’éclat et/ou l’homogénéité de la peau, favoriser et/ou améliorer l’hydratation de la peau, détoxifier la peau, stimuler ses défenses antioxydantes et/ou améliorer la résistance à l’hypoxie de la peau, et/ou contrôler la microflore de la peau, et/ou stimuler l’immunité de la peau et la formation de la barrière cutanée.

Exemple 3 : Formulations

Les formulations suivantes sont préparées selon les méthodes classiques de formulation du domaine cosmétique.

Sérum régénérant antiâge

Eau qsp 100% Alcool 5%

Glycols 8%

Isononanoate d’isotridecyle 4%

Squalane 2%

Triglycéride d’acides caprylique/caprique 2%

Methyl gluceth-20 : 2%

Steareth-2 : 0,5%

Steareth-21 : 0,5%

Carbomer 0,3%

Hyaluronate de sodium 0,2%

Gomme de xanthane 0, 1 %

Hydroxide de sodium 0, 1 %

Adénosine 0,04%

Lysat de L rhamnosus 2%

Appliquée sur la peau, la composition permet de d’améliorer la fermeté de la peau, diminuer les rides.

Masque purifiant

Eau qsp 100%

Kaolin 18%

Acide stéarique 3,5%

Acide palmitique 3,5%

Glycols 6%

Dioxyde de titane 3%

Acide laurique 2%

Glyceryl stéarate 1 ,5%

PEG-100 stéarate 1 ,5%

Hydroxide de potassium 1 ,4%

Phenoxyethanol 0,7%

Polymère acrylique 0,5%

Gomme de xanthane 0,05%

Lysat de L rhamnosus 1 %

Gluconate de zinc 0,05% Appliquée sur la peau, la composition permet de diminuer le taux de sébum, diminuer la taille des pores, améliorer le grain de peau.

Lotion détoxifiante antipollution

Eau qsp 100%

Glycols 15%

Alcool 5%

Phenoxyéthanol 0,8%

PEG-60 huile de ricin hydrogénée 0,5%

Hyaluronate de sodium 0, 1 %

Lysat de L rhamnosus 0,5%

Extrait prébiotique 0,5%

Appliquée sur la peau, la composition permet de conférer à la peau un effet bonne mine, un teint éclatant, homogène.

Essence blanchissante

Eau qsp 100%

Glycols 1 1 %

Propanediol 5%

Dimethicone 2%

Alcool 1 %

Tromethamine 1 ,5%

Phenoxyethanol 0,9%

Copolymère acrylique 0,6%

Citrate de sodium 0,5%

Lysat de L rhamnosus 2%

Glucoside d’ascorbyle (vitamine CG) 0,5%

Appliquée sur la peau, la composition permet d’améliorer l’homogénéité du teint.

Fond de teint éclat

Eau qsp 100%

Huiles hydrocarbonées 12%

Dioxyde de titane 10% Propanediol 5%

Glycérine 5%

Oxyde de zinc 3%

Tensioactifs 3%

Polymère filmogène 1 %

Sorbate de potassium 0, 1 %

Lysat de L rhamnosus 1 %

Appliquée sur la peau, la composition permet de conférer un effet bonne mine, un teint éclatant, homogène.

Sérum vitaminé

Glycérol 4%

Butylène glycol 3%

Carbomer 0,5%

Acide lactique 1 %

Lysat de L rhamnosus 2%

Hydroxyde de sodium 0,7%

Gomme de xanthane 0, 1 %

Gélifiant acrylique 0,2%

Alcool 3%

Glucoside d’ascorbyle (vitamine CG) 0,5%

Phenoxyéthanol 0,5%

Colorants qs%

Eau qsp100%

Appliquée sur la peau, la composition permet d’améliorer la fermeté de la peau et lui conférer un effet bonne mine.

Brume

Glycérol 2%

Glycol s 4%

Gélifiants 2%

Lysat de L rhamnosus 1 %

Triclycéride d’acides caprylic/capric 0,25% Emulsionnants 0,6%

Phénoxyéthanol 0,5%

Tocopherol (vitamine E) 0,02%

Eau qsp 100%

Appliquée sur la peau, la composition permet de favoriser et/ou améliorer la nutrition de la peau et lui conférer un effet bonne mine, un teint éclatant et homogène.

PCT

(original sous forme électronique)

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FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)