Composition d'huile de microorganismes enrichis en diglycérides de DHA ou d'EPA

La présente invention concerne une composition d'huile de microorganismes enrichie en acide eicosapentaénoïque ou en acide docosahexaénoïque majoritairement sous forme de diglycérides, ainsi que son procédé d'obtention.

Depuis plusieurs années déjà, il est recommandé d'enrichir son régime alimentaire en acides gras polyinsaturés en raison de leur rôle bénéfique avéré dans bon nombre de réactions physiologiques et fonctions pharmaceutiques.

Parmi les acides gras polyinsaturés d'intérêt on distingue ceux appartenant à la famille des omegas-3 tels que l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide docosahexaénoïque (DHA) et ceux appartenant à la famille des omegas-6 tels que l'acide arachidonique (ARA).

Le DHA et l'EPA ont fait l'objet de nombreuses études physiologiques et l'on connaît aujourd'hui leur rôle essentiel à la fois chez le nourrisson, l'enfant et l'adulte. Le DHA est ainsi connu pour son rôle essentiel dans le développement du cerveau et de la rétine et dans la préservation des fonctions cognitives. L'EPA, quant à lui, contribue au bon fonctionnement cardiaque et possède des propriétés anti-inflammatoires.

Une manière d'augmenter l'apport en acide eicosapentaénoïque (EPA) et en acide docosahexaénoïque (DHA) dans son régime alimentaire est de consommer des concentrés à base d'huiles, notamment d'huiles de poisson ou de microalgues. Les micro-algues appartenant au genre des Thraustochytrium ou des Schizochytrium sont, par exemple, des sources riches en acides gras polyinsaturés à longue chaîne oméga-3. La micro-algue Schizochytrium sp peut produire entre 20 % et 35 % d'acide docosahexaénoïque, en poids total d'acides gras (Hadley et al., 2017) (Hammond et al., 2001). Dans les concentrés, les teneurs en DHA ou en EPA ont été augmentées par rapport aux teneurs des huiles naturelles.

Les méthodes de concentration, ou d'enrichissement, des huiles en DHA ou en EPA font intervenir dans un premier temps la séparation des acides gras du glycérol par transestérification éthanolique à l'aide d'un catalyseur chimique ou par transestérification éthanolique enzymatique. Dans un second temps, l'enrichissement en DHA ou en EPA est réalisé par distillation moléculaire, permettant la séparation des composés en fonction de leur tension de vapeur soit usuellement de leur poids moléculaire.

A titre illustratif, on citera la demande de brevet internationale WO 2013/178936 qui décrit un procédé d'enrichissement en DHA sous forme d'esters éthyliques d'une huile de microalgues appartenant à la famille des Thraustochytriales sp.

Dans ces huiles concentrées de l'état de la technique, les acides gras polyinsaturés se trouvent sous forme de triglycérides ou sous forme d'esters éthyliques. Un autre element important qualitatif de I huile, outre la teneur en acides gras polyinsatures susceptible d'être obtenue, est sa biodisponibilité.

Ainsi, plusieurs études décrivent l'intérêt des acides gras sous forme de diglycérides par rapport à la forme de triglycérides. Les diglycérides sont constitués d'un squelette de glycérol sur lequel deux acides gras sont estérifiés. Ils peuvent se trouver sous la forme de trois stéréoisomères snl,2, sn-1,3 ou sn-2,3.

Il a été démontré que l'apport de graisse sous forme de diglycérides se montrait bénéfique dans la prise en charge de maladies telles que l'obésité, les maladies cardiovasculaires et le diabète (Yee-Ying Lee et al. ; Maki et al. ; Saito et al. ; Flickinger et Masuto ; Prabhavathi Devi et al. ) et d'une manière plus générale sur la prévention nutritionnelle du syndrome métabolique.

Spécifiquement, les diglycérides permettent :

La réduction du taux de cholestérol sanguin,

La stimulation de la bêta oxydation,

La réduction de l'accumulation de graisses et la réduction de la masse corporelle,

La modulation du métabolisme du glucose, L'amélioration de la santé osseuse par l'augmentation de la densité minérale osseuse et l'amélioration de la microstructure de l'os.

Il est admis que ces effets sont dus à la structure même des diglycérides. Par comparaison, de nombreuses études cliniques, telles que Tomonori Nagao et al., démontrent que les triglycérides, de structure différente, ne permettent pas d'obtenir les effets mentionnés ci- dessus. En effet, du fait de leur structure, les diglycérides utilisent une voie métabolique de digestion et d'absorption différente de celle des autres graisses et notamment des triglycérides. Par exemple, les diglycérides ingérés sous forme sn-1,3 sont transformés en l-(3) monoglycérides dans le petit intestin lesquels sont très peu ré-estérifiés par la suite en triglycérides. Par comparaison, les triglycérides ingérés sont transformés en 2- monoglycérides lesquels sont convertis par la suite en triglycérides.

Il est donc clair que les diglycérides s'avèrent intéressants pour les domaines pharmaceutique, nutraceutique, et alimentaire. Dans le domaine des produits alimentaires, ils pourraient être utilisés comme substitut aux autres graisses moins bénéfiques, voire néfastes, sur le plan de la santé.

Il apparait donc nécessaire, et ceci est un but de l'invention, de pouvoir proposer des huiles concentrées en acides gras polyinsaturés DHA ou EPA, qui se présentent essentiellement sous la forme de diglycérides, et qui présentent une teneur en diglycérides élevée.

Par ailleurs, la bonne biodisponibilité des acides gras polyinsaturés à longue chaîne sous forme de monoglycérides a également été vérifiée (Valenzuleaa et al.). Cette étude montre que la supplémentation en monoglycérides de DHA permet de retrouver un contenu en DHA dans le plasma et les globules rouges plus élevé que ce qui est retrouvé lorsque le DHA est apporté sous forme d'esters éthyliques ou sous forme de triglycérides (Effect of Supplementation with Docosahexaenoic Acid Ethyl Ester and sn-2 Docosahexaenyl Monoacylglyceride on Plasma and Erythrocyte Fatty Acids in Rats, Ann Nutr Metab, 2005 ;49 :49-53).

Il apparait donc également intéressant de pouvoir proposer des huiles concentrées en acides gras polyinsaturés DHA ou EPA, qui présentent également une teneur élevée en monoglycérides.

La présente invention concerne ainsi une composition d'huile de microorganismes enrichie en acides gras polyinsaturés, qui se caractérise en ce qu'elle comprend : une teneur en acide eicosapentaénoïque et/ou en acide docosahexaénoïque supérieure ou égale à 500 mg/g de composition, et, par rapport à la quantité totale de glycérides : une quantité de diglycérides supérieure à 45%, une quantité de monoglycérides et de diglycérides supérieure à 60%.

La composition selon l'invention présente donc un excellent profil en acides gras avec une teneur en acides gras polyinsaturés DHA ou EPA sous forme de diglycérides élevée.

Au sens de l'invention, on entend par « enrichie en acides gras polyinsaturés » une composition comprenant, après mise en œuvre de procédés de concentration adaptés, une quantité plus élevée, par exemple augmentée d'un facteur de 1,5 ou 2, d'acides gras polyinsaturés que celle que présentait la composition initialement.

Également, au sens de l'invention, on entend par « quantité totale de glycérides » la somme des quantités de monoglycérides, diglycérides, triglycérides et esters éthyliques d'acides gras.

La composition d'huile peut être obtenue à partir de micro-algues du genre Thraustochytrium, Schizochytrium, Nannochloropsis, Isochrysis, Phaeodactylum, Nitzchia, Staurosira, Crypthecodinium ou Ulkenia.

Les micro-algues des genres Thraustochytrium et Schizochytrium permettront préférentiellement d'obtenir une composition d'huile enrichie en acide docosahexaénoïque (DHA).

Les micro-algues des genres Nannochloropsis, Isochrysis, Phaeodactylum ou Nitzchia permettront d'obtenir préférentiellement une composition d'huile enrichie en acide eicosapentaénoïque (EPA).

Il convient de noter qu'il est tout à fait possible de distinguer une huile de micro algues d'une huile d'une autre origine, notamment une huile de poisson, sur la base de son profil en acide gras. En effet, les huiles de microalgues contenant du DHA sont caractérisées par la presence de DPA n-6. Cet acide gras ne se trouve pas présent dans les huiles de poisson par exemple, ou très faiblement en une quantité inférieure à 0,3% des acides gras. A titre d'exemple une huile de microalgue à 400 mg de DHA /g d'huile contient environ 80 g de DPA n-6/g d'huile. Les huiles de microalgues contenant de l'EPA sont caractérisées par l'absence d'acide eicosénoique C20 :1 (C20 :1 W7 Eicosenoique et C20 :1 W9 Gadoléique) et d'acide docosénoique C22 :1 (C22 :1 W9 érucique et C22 :1 Wll cétoléique). Les C20 :1 et C22 :1 sont plus spécifiques du zooplancton et des copépodes notamment. En conséquence, via la chaine alimentaire, on les retrouve chez les huiles de poissons.

Avantageusement, la composition comprend, par rapport à la quantité totale de glycérides : une quantité de triglycérides inférieure à 30 %, une quantité de diglycérides comprise entre 45 et 75 %, une quantité de monoglycérides comprise entre 10 et 30 %.

Préférentiellement, la composition comprend, par rapport à la quantité totale de glycérides : une quantité de triglycérides comprise entre 10 et 30 %, une quantité de diglycérides comprise entre 50 et 70 %, une quantité de monoglycérides comprise entre 15 et 25 %.

Selon un premier mode de réalisation, la composition comprend une teneur en DHA supérieure ou égale à 600 mg/g de composition, plus préférentiellement supérieure à 700 mg/g de composition.

Selon un second mode de réalisation, la composition comprend une teneur en EPA supérieure ou égale à 600 mg/g de composition, préférentiellement supérieure à 700 mg/g de composition.

Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé de préparation d'une composition d'huile de microorganismes présentant les caractéristiques décrites précédemment.

L'invention concerne donc encore un procédé de préparation d'une composition d'huile enrichie en acides gras polyinsaturés oméga-3, caractérisé en ce qu'il comprend :

(a) Une étape d'obtention d'une huile de micro-organismes comprenant de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme d'esters éthyliques en une quantité supérieure ou égale à 500 mg/g de composition, (c) une étape de structuration de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme majoritaire de diglycérides par réaction entre l'huile et une ou plusieurs enzymes en présence de glycérol,

(d) une étape d'élimination du glycérol,

(e) une étape de distillation moléculaire court trajet de l'huile sous vide.

Etape a :

Une huile de micro-organismes comprenant de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme d'esters éthyliques en une quantité supérieure ou égale à 500 mg/g de composition peut par exemple être obtenue dans le commerce. On citera par exemple l'huile commercialisée sou la dénomination Omegavie Algae oils, par la société Polaris, France.

Alternativement, une huile enrichie en acide docosahexaénoïque sous forme d'esters éthyliques peut être obtenue en mettant en œuvre les étapes suivantes :

(i) une étape de réaction entre une huile de micro-organismes comprenant de l'acide docosahexaénoïque sous forme de triglycérides et un alcool en présence d'un catalyseur chimique ou enzymatique,

(ii) une étape de concentration en acide docosahexaénoïque par distillation moléculaire sous vide poussé.

L'étape (i) est une étape de transestérification qui va permettre l'obtention des acides gras sous une forme d'esters éthyliques (EE), lesquels sont ensuite concentrés à l'étape (ii).

L'huile de départ à l'étape (i) peut être par exemple une huile de micro-algues des genres Thraustochytrium ou Schizochytrium.

Une huile enrichie en acide eicosapentaénoïque sous forme d'esters éthyliques peut, quant à elle, être obtenue en mettant en œuvre les étapes suivantes :

(i) une étape de réaction entre une huile de micro-organismes comprenant de l'acide eicosapentaénoïque et un alcool en présence d'un catalyseur chimique,

(ii) une étape de concentration et purification des esters éthyliques d'acides gras dont des esters éthyliques d'acide eicosapentaénoïque par distillation moléculaire court trajet sous vide poussé.

(iii) une étape de concentration en acide eicosapentaénoïque par distillation moléculaire sur colonne de rectification. Là encore, l'étape (i) est une étape de transestérification qui va permettre l'obtention des acides gras sous une forme d'esters éthyliques (EE).

L'huile de départ à l'étape (i) peut être par exemple une huile de micro-algues des genres Nannochloropsis, Isochrysis, Phaeodactylum ou Nitzchia.

Alternativement encore, il est possible, en mettant en œuvre un même procédé, d'obtenir d'une part, une huile enrichie en acide docosahexaénoïque et, d'autre part, une huile enrichie en acide eicosapentaénoïque, sous forme d'esters éthyliques, en mettant en œuvre les étapes suivantes :

(i) une étape de réaction entre une huile de micro-organismes comprenant à la fois de l'acide docosahexaénoïque et de l'acide eicosapentaénoïque, sous forme de triglycérides, et un alcool en présence d'un catalyseur chimique ou enzymatique,

(ii) une première étape de distillation moléculaire sous vide poussé de l'huile issue de l'étape (i), dans un évaporateur à film raclé couplé à une colonne de rectification comportant au moins sept plateaux théoriques, et récupération d'un premier résidu et d'un premier distillât,

(iii) une seconde étape de distillation moléculaire sous vide poussé du résidu récupéré à l'étape (ii), dans ledit évaporateur à film raclé couplé à la colonne de rectification comportant au moins sept plateaux théoriques, et récupération d'un second résidu et d'un second distillât.

En effet, certaines variétés de micro-algues, telles que celles du genre Thraustochytrium et Schizochytrium, bien que contenant majoritairement de l'acide docosahexaénoïque, peuvent également contenir des quantités non négligeables d'acide eicosapentaénoïque. Le procédé ci-dessus permet la séparation et la concentration de l'acide eicosapentaénoïque et de l'acide docosahexaénoïque. Le second distillât obtenu contient l'EPA et le second résidu contient le DHA.

Etape c :

L'étape (c) est mise en œuvre à partir des huiles concentrées en DHA ou en EPA obtenues à l'étape (a).

Préférentiellement, l'étape (c) de structuration est réalisée selon un rapport molaire entre l'acide docosahexaénoïque ou l'acide eicosapentaénoïque et le glycérol de 1.

Préférentiellement encore, dans le procédé selon l'invention, l'étape (c) comprend :

- le mélange, dans un réacteur sous vide, sous agitation et à une température de 35 à 40°C., de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque et de la ou des enzymes, et, - des ajouts du glycerol en plusieurs fois par portions, les ajouts étant espaces d une duree comprise entre lh et 3h.

Le paramètre d'agitation peut être compris entre 300 et 400 RPM et le paramètre de vide peut être inférieur à 15mBar.

De très bons résultats en termes de teneur en diglycérides sont obtenus lorsque le glycérol est ajouté progressivement.

La quantité totale de glycérol sera donc divisée en trois ou quatre portions de quantité identique. La première portion sera ajoutée lors du mélange des acides gras et de la ou des enzymes, puis les autres portions seront ajoutées l'une après l'autre par ajouts successifs espacés de 1 à 3h, préférentiellement 2h.

La réaction peut ainsi durer au total entre 4 et lOh.

Selon un premier mode de réalisation, l'enzyme utilisée lors de l'étape (c) est une lipase B produite par Candida antartica. Cette enzyme est, par exemple, disponible commercialement sous la dénomination Lipozyme 435®.

Selon un second mode de réalisation, l'étape (c) est réalisée à l'aide d'un mélange de deux enzymes, le mélange étant composé pour 70 - 80 % d'une lipase B produite par Candida antartica et pour 30- 20 % d'une lipase produite par Thermomyces lanuginosus.

De très bons résultats sont notamment obtenus avec un mélange composé pour 75 % de lipase B produite par Candida antartica et pour 25 % de lipase produite par Thermomyces lanuginosus.

Une lipase produite par Thermomyces lanuginosus est, par exemple, disponible commercialement sous la dénomination Lipozyme TL IM®.

Cette enzyme, régio selective, est avantageuse car elle permet d'augmenter le taux de diglycérides et, en particulier, les diglycérides en snl-3. En effet, si de l'EPA ou du DHA, molécules ayant un fort encombrement spatial, se fixe en position Sn-2 du glycérol en cours de réaction initiée par l'enzyme Candida antartica, par exemple sous forme de monoglycérides en Sn-2, le greffage d'un deuxième acide gras devient plus difficile, d'autant plus pour des formes hautement concentrées en EPA ou DHA. L'ajout de l'enzyme Thermomyces lanuginosus Sn-l,n -3 spécifique, en complément de la lipase B de Candida antartica permet de faciliter le greffage d'un second acide gras sur le glycérol.

La quantité totale d'enzymes utilisée au cours de l'étape © est de l'ordre de 6 à 8%, préférentiellement 7,5%, par rapport à la quantité d'esters éthyliques de l'huile.

Etape d :

L'étape (d) vise à éliminer le glycérol résiduel. Elle peut être mise en œuvre par décantation. Etape e :

L'étape (e) est une étape de distillation moléculaire court trajet de l'huile sous vide qui permet la séparation des molécules en fonction de leur poids moléculaire et, ainsi, la concentration de l'EPA ou du DHA majoritairement sous forme de diglycérides.

De préférence, cette étape a lieu dans un distillateur à court trajet à une température des parois supérieure à 150°C, par exemple entre 160 et 220 °C, et un vide inférieur à 0,02 mBar.

Etape b :

Selon un mode particulier de réalisation, le procédé comprend, entre l'étape (a) et l'étape (c) : une étape (b) de structuration de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme d'acides gras libres.

Cette étape de structuration est une réaction de saponification qui aboutit à la formation d'acides gras libres lesquels sont ensuite utilisés lors de l'étape ultérieure (c).

Ce mode de réalisation permet avantageusement d'obtenir à l'issue du procédé selon l'invention, des teneurs en diglycérides et en monoglycérides plus élevées que les modes de réalisation dans lesquels l'étape (b) n'est pas mise en œuvre.

Avantageusement, selon ce mode de réalisation particulier, le procédé comprend, à la suite de l'étape (e) de distillation moléculaire court trajet : une étape (f) de récupération d'une fraction comprenant de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme libre et sous forme de monoglycérides et de réintroduction de cette fraction à l'étape (c).

L'invention concerne encore une composition d'huile, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'une composition d'huile telle que définie précédemment, ou obtenue par un procédé tel que décrit précédemment, et au moins une autre huile.

Une composition d'huile selon l'invention pourra en effet être mélangée à d'autres huiles telles que des huiles végétales ou des microorganismes, présentant d'autres caractéristiques qualitatives. Par exemple, il sera possible de mélanger une huile enrichie en EPA essentiellement sous forme de glycérides et obtenue selon l'invention avec une huile enrichie en DHA sous forme majoritaire de triglycérides ou d'esters éthyliques. D'autres mélanges sont naturellement possibles.

L'invention concerne encore un complément alimentaire caractérisé en ce qu'il comprend une huile telle que définie précédemment ou obtenue par un procédé tel que décrit précédemment. Un complement alimentaire peut se presenter sous n importe quelle forme, telle qu une gélule, un comprimé, un liquide, un gel.

L'invention concerne encore un produit alimentaire caractérisé en ce qu'il comprend une composition d'huile telle que définie précédemment ou obtenue par un procédé tel que décrit précédemment.

Un produit alimentaire peut être n'importe quel produit destiné à l'alimentation, sous n'importe quelle forme. Cela peut être, notamment, une formulation nutritionnelle telle qu'une préparation infantile ou diététique.

L'invention concerne encore une composition pharmaceutique ou nutraceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une composition d'huile telle que définie précédemment ou obtenue par un procédé tel que décrit précédemment.

Enfin, l'invention concerne une composition d'huile telle que définie précédemment ou obtenue par un procédé tel que défini précédemment, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l'obésité, du surpoids, des maladies osseuses, dans la réduction du taux de cholestérol et la modulation du métabolisme du glucose.

L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples de réalisation qui suivent.

Exemple 1 : Obtention d'huiles de micro-algues enrichies en DHA ou en EPA majoritairement sous forme de diglycérides

Etape (a) Obtention d'huiles de micro-algues comprenant du DHA ou de l'EPA majoritairement sous forme d'esters éthyliques.

1) Obtention d'huile de micro-alque comprenant du DHA : huile Hl(DHA)

L'huile de départ est une huile brute produite par la souche de micro-algues Schizochytrium sp T18 commercialisée par la société Mara Renewables Corporation. Elle contient initialement 329 mg/g de DHA.

Etape (i) : transestérification

Une réaction de transestérification est réalisée sur une biomasse de 1800 kg d'huile de micro-algues à l'aide de 450 kg d'éthanol et de 21,6 kg d'éthylate de sodium, dans un réacteur approprié.

La température de réaction est de 50°C et le temps de réaction est de lh. A l'issue de la réaction, l'excès d'éthanol est évaporé sous vide, puis le mélange est refroidi à une température d'environ 30°C puis soumis à décantation durant lh. La phase légère est recuperee puis le glycerol est vidange. Une seconde decantation est realisee durant 30 sec. Le glycérol et les monoglycérides résiduels sont vidangés.

Un lavage à l'eau acide est ensuite réalisé en ajoutant 17% d'eau déminéralisée contenant 2,5% d'acide phosphorique (75%) sous agitation durant 20 sec. Le mélange est décanté durant 20 sec et la phase aqueuse est vidangée. Il s'ensuit un séchage sous vide (pression < 90 mbar) à 60°C durant un temps supérieur à 2h.

A l'issue de cette étape, l'huile contient 329 m/g de DHA sous forme d'esters éthyliques.

Etape (ii) : concentration en DHA par distillation moléculaire

L'huile est ensuite conduite dans un dégazeur puis traverse un évaporateur à film raclé. Les vapeurs sont ensuite distillées au travers d'une colonne de rectification qui est couplée à l'évaporateur fourni par la société UIC GmbH. Un reflux du distillât, c'est-à-dire une réintroduction du distillât dans la colonne peut permettre d'augmenter l'efficacité séparative de cette dernière. La colonne utilisée contient environ sept plateaux théoriques. Le résidu de distillation est récupéré et représente la fraction enrichie en DHA.

Les conditions opérationnelles sont les suivantes : T° de l'évaporateur : 225°C ; Vide de la colonne de rectification : 0,1 mbar ; Taux de reflux 75%, T° (haut de colonne) : 195°C.

La quantité de DHA sous forme d'esters éthyliques est de 758 mg/g.

2) Obtention d'huile de micro-alque comprenant de l'EPA : huile H2(EPA)

L'huile de départ est une huile brute produite par la souche Nannochloropsis sp obtenue après une culture de la biomasse une huitaine de jours en condition photoautotrophique. L'extraction de la matière grasse de la biomasse s'effectue par macération éthanolique. Après séparation de la phase solide restante, l'éthanol est évaporé sous vide.

L'EPA produit par photoautotrophie se retrouve incorporé dans les lipides membranaires, soit sous forme de Glycolipides, soit sous forme de Phospholipides, soit sous forme d'acides gras libres. La forme triglycéride est peu représentée.

Etape (i) : transestérification

Une réaction de transestérification est réalisée sur une biomasse de 100 kg d'huile de microalgues à l'aide de 200 kg environ d'éthanol et de 10 kg d'acide sulfurique, dans un réacteur approprié (reflux 60°C > lOh). La transestérification est réalisée par voie acide, avec de l'acide sulfurique.

Etape (ii) : concentration en EPA par distillation moléculaire à court trajet sous vide

Les conditions sont une température des parois de l'évaporateur comprise entre 175 et 180° C et un vide inférieur à 0,1 mbar.

Etape (iii) : concentration en EPA par distillation moléculaire sur colonne de rectification Les conditions opérationnelles sont les suivantes : T° de I evaporateur : 230°C ; Vide de la colonne de rectification : 0,07 mbar ; Taux de reflux 65%, T° (haut de colonne) : 107°C, T° (bas de colonne) : 147°C.

La quantité d'EPA sous forme d'esters éthyliques est de 735 mg/g.

L'huile de départ est une huile brute produite par la souche de micro-algues Schizochytrium sp commercialisée par la société DSM sous la marque Life's DHA 60. Elle contient initialement 360 mg/g de DHA et 184 mg/g d'EPA. i) : transestérification

Une réaction de transestérification est réalisée sur une biomasse de 19 kg d'huile de microalgues à l'aide de 4,75 kg d'éthanol et de 222 g d'éthylate de sodium, dans un réacteur approprié.

La température de réaction est de 50°C et le temps de réaction est de lh. A l'issue de la réaction, l'excès d'éthanol est évaporé sous vide, puis le mélange est refroidi à une température d'environ 30°C puis soumis à décantation durant lh. La phase légère est récupérée puis le glycérol est vidangé. Une seconde décantation est réalisée durant 30 sec. Le glycérol et les monoglycérides résiduels sont vidangés.

Un lavage à l'eau acide est ensuite réalisé en ajoutant 3,2 kg d'eau déminéralisée contenant 76,4 g d'acide phosphorique (75%) sous agitation durant 20 sec. Le mélange est décanté durant 20 sec. et la phase aqueuse est vidangée. Il s'ensuit un séchage sous vide (pression < 90 mbar) à 60°C durant un temps supérieur à 2h.

A l'issue de cette étape, l'huile contient de l'EPA et du DHA sous forme d'esters éthyliques.

Etape (ii) : première étape de distillation moléculaire

L'huile est ensuite conduite dans un dégazeur puis traverse un évaporateur à film raclé. Les vapeurs sont ensuite distillées au travers d'une colonne de rectification qui est couplée à l'évaporateur fourni par la société UIC GmbH. Le but est ici d'éliminer les acides gras les plus légers en conservant le DHA et l'EPA. La colonne utilisée contient sept plateaux théoriques. Le résidu de distillation est récupéré et représente la fraction enrichie en EPA et DHA.

Les conditions opérationnelles sont les suivantes : T° de l'évaporateur : 225°C ; Vide de la colonne de rectification : moins de 0,1 mbar ; Taux de reflux 70%, T° (bas de colonne) : 190°C., T° (haut de colonne) : 135°C.

A l'issue de cette étape, on obtient une fraction de résidu et une fraction de distillât. La fraction de résidu contient de l'EPA et du DHA. Etape (iii) : seconde étape de distillation moléculaire

L'opération de l'étape (II) est reconduite sur le résidu. Celui-ci est donc reconduit dans le dégazeur puis traverse l'évaporateur à film raclé. Les vapeurs sont ensuite distillées au travers de la colonne de rectification couplée à l'évaporateur comme dans le cas de l'étape (ii) précédente. Le but est ici de séparer le DHA et l'EPA.

Les conditions opérationnelles sont les suivantes : T° de l'évaporateur : 235°C ; Vide de la colonne de rectification : moins de 0,05 mbar ; Taux de reflux 60%, T° (bas de colonne) : 202°C., T° (haut de colonne) : 160°C.

A l'issue de cette étape, on obtient une fraction de distillât contenant 733 mg/g d'EPA et une fraction de résidu contenant 706 mg/g de DHA.

Les huiles Hl(DHA), H2(EPA), H3(DHA) et H4(EPA) contiennent ainsi toutes une teneur en EPA ou en DHA supérieure à 700 mg/g d'huile et sont prêtes à être utilisées dans les étapes suivantes.

Etape (c) structuration de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme majoritaire de diglycérides par réaction entre l'huile et une ou plusieurs enzymes en présence de glycérol.

Option 1 : Réaction en présence d'une seule enzyme

Matières premières et enzyme :

180g d'une huile obtenue à l'étape (a),

4 portions chacune de 12,5 g de glycérol (100%), soit 50 g de glycérol au total,

13,5 g de lipase B de Candida antartica (Lipozyme 435®),

Rapport molaire entre l'acide docosahexaénoïque ou l'acide eicosapentaénoïque et le glycérol de 1.

180g d'huile et 12,5g de glycérol ont été mélangés dans un réacteur, avec l'enzyme. Le mélange a été chauffé à 37°C, agité à 330rpm et placé sous vide. Le reste du glycérol a été ajouté en quatre fois, soit 12,5g toutes les deux heures. Le vide était modéré pendant les huit premières heures de la réaction, c'est à dire d'environ 15mbar, puis poussé, c'est-à-dire inférieur à 5mbar.

Option 2 : Réaction en présence d'un mélange d'enzymes L'étape (c) se déroule de la même manière que décrit précédemment à l'exception du fait que le mélange ci-dessous d'enzymes est utilisé.

10,1 g de lipase B de Candida antartica (Lipozyme 435®),

3,4 g de lipase de Thermomyces lanuginosus (Lipozyme TL IM®).

Etape d) élimination du glycérol

Le glycérol est éliminé par décantation.

Etape (e) distillation moléculaire court trajet de l'huile sous vide

Les conditions sont une température des parois de l'évaporateur comprise entre 160 et 220' C et un vide inférieur à 0,02 mbar.

Résultats

A l'issu du procédé, on obtient des huiles présentant plus de 700 mg/g de DHA ou d'EPA selon le profil glycéridique suivant, exprimé en pourcentage par rapport à la quantité de glycérides totaux (analyse réalisée par chromatographie en phase gazeuse) (Tableau 1) :

Tableau 1

En pourcentage de la quantité totale de monoglycérides, diglycérides, triglycérides et esters éthyliques d'acides gras ; MG : monoglycérides ; DG : diglycérides ; TG : triglycérides Dans tous les cas, les acides gras EPA ou DHA sont majoritairement sous forme de diglycerides. On note que l'utilisation de la combinaison d'enzymes permet d'augmenter la teneur en diglycérides si l'on compare les résultats obtenus avec les huiles de départ H2(EPA) et H4(EPA) en utilisant à l'étape c) une enzyme versus un mélange de deux enzymes. En outre, la réaction a été plus rapide, ce qui est avantageux.

Les teneurs totales en diglycérides et monoglycérides sont élevées, avec, pour chaque huile, une quantité supérieure à 70%.

Exemple 2 : autre exemple d'obtention d'une huile de micro-algues enrichie en DHA majoritairement sous forme de diglycérides

Cet exemple se déroule de la même manière que l'exemple 1, en partant à l'étape a) d'une huile Hl(DHA) ou H3(DHA), à l'exception du fait que le procédé met en œuvre, entre l'étape (a) et l'étape (c), une étape (b) et une étape (f) après l'étape (e).

Etape b) structuration de l'acide docosahexaénoïque ou de l'acide eicosapentaénoïque sous forme d'acides gras libres.

Pour chaque huile issue de l'étape a), une réaction de saponification destinée à obtenir les acides gras sous forme libre est réalisée.

Etape c) : se déroule de manière identique à ce qui est décrit dans l'exemple 1.

A l'issu de l'étape c) l'huile contient 57% de diglycérides, 24% de monoglycérides, 8% de triglycérides et 11% d'acides gras libres.

Etape d) : se déroule de manière identique à ce qui est décrit dans l'exemple 1.

Etape e) : se déroule de manière identique à ce qui est décrit dans l'exemple 1.

Etape f) : la mise en œuvre de l'étape e) permet la récupération d'une fraction contenant du DHA sous forme de monoglycérides et sous forme libre qui est réacheminée et réintroduite à l'étape c).

Résultats

A l'issu du procédé, on obtient des huiles présentant plus de 700 mg/g de DHA ou d'EPA selon le profil glycéridique suivant, exprimé en pourcentage par rapport à la quantité de glycérides totaux (analyse réalisée par chromatographie en phase gazeuse) (Tableau 2) :

Tableau 2

En pourcentage de la quantité totale de monoglycérides, diglycérides, triglycérides et esters éthyliques d'acides gras ; MG : monoglycérides ; DG : diglycérides ; TG : triglycérides

Les acides gras DHA sont majoritairement sous forme de diglycérides.

Les teneurs totales en diglycérides et monoglycérides sont très élevées, avec, pour chaque huile, une quantité de 90%.