[001] As nanopartículas de prata (AgNPs) e o óxido nítrico têm sido explorados cada vez mais em diversas aplicações biomédicas. Estudos recentes têm apontado que as AgNPs podem possuir ação antimicrobiana e antiproliferativa. Da mesma forma, o óxido nítrico (NO) é um importante radical livre endógeno, com efeito antimicrobiano e tóxico para células cancerígenas, que desempenha papéis essenciais em vários processos.

[002] As nanopartículas de prata (AgNPs) são importantes agentes antibacterianos, com um amplo espectro de efeitos antibacterianos, antifúngicos e anti virais. Além disso, as AgNPs têm efeitos antiproliferativos contra diferentes linhas celulares de tumores. O efeito anticâncer das AgNPs é devido à capacidade de essas nanopartículas prejudicarem a cadeia respiratória mitocondrial, induzindo a formação de ATP e espécies reativas de oxigénio (ERO), levando a danos ao DNA. Assim, as AgNPs são amplamente utilizadas em diferentes aplicações e estão presentes em diversos produtos comerciais.

[003] Semelhante às AgNPs, o óxido nítrico (NO) tem efeitos antimicrobianos e anticâncer. O NO é uma molécula endógena que medeia diferentes processos fisiopatológicos e fisiológicos. O NO promove o aumento do fluxo sanguíneo, a regulação da adesão e agregação plaquetária, e a promoção e aceleração do reparo tecidual. Além disso, dependendo de sua concentração, o NO tem efeitos antimicrobianos e anticâncer. Como o NO é um radical livre, diferentes moléculas de doadores de NO foram sintetizadas e utilizadas em diversas aplicações biomédicas. Os S-nitrosotióis (RSNOs) são doadores de NO capazes de produzir espontaneamente NO.

[004] Nesse cenário, existe um interesse potencial no uso de AgNPs e de doadores de NO em várias aplicações, incluindo aplicações biomédicas. No entanto, a liberação sustentada e localizada de doadores de NO ou AgNPs é uma das principais questões que precisa ser resolvida. O aprisionamento de doadores de NO ou de AgNPs em matrizes não tóxicas pode contribuir para a liberação sustentada e localizada de quantidades terapêuticas desses compostos diretamente no local de aplicação desejado.

Fundamentos da invenção

[005] A presente invenção baseia-se no preparo de filmes poliméricos contendo nanopartículas de prata (AgNPs) e doadores de óxido nítrico (NO) para aplicações antitumorais.

[006] As AgNPs são um dos nano materiais mais estudados atualmente. As AgNPs são as nanopartículas mais utilizadas do ponto de vista industrial e comercial graças as suas propriedades características, como estabilidade química, maleabilidade, flexibilidade, elevada condutividade elétrica e térmica, atividade catalítica, relativo baixo custo de produção e principalmente potente ação antimicrobiana frente a bactérias, vírus, fungos e protozoários (KHAN et al., 2015; ROLIM et al., 2019; VAZQUEZ-MUNOZ et al., 2017). Dessa forma, as AgNPs são amplamente utilizadas em várias aplicações como agentes antibacterianos, antifúngicos, anti virais, anti- inflamatórios, antitumorais, regeneradores, biossensores e catalisadores (ZHANG et al., 2016).

[007] As AgNPs estão presentes em produtos na indústria de alimentos, têxtil, perfumaria, farmacêutica, agrícola, higiene, produtos de limpeza, tintas, eletroeletrônicos, entre outras (ROLIM et al., 2019; ZHANG et al., 2016). As mesmas possuem uma ampla aplicabilidade, como por exemplo, em medicina, cosmetologia, no recobrimento de dispositivos médicos, na confecção de nanogéis, nanoloções, na preparação de materiais para recobrimento de lesões cutâneas (LOO et al., 2012a; SONG; KIM, 2009). Além disso, podem ser usadas no combate ao câncer, no diagnóstico de doenças e como veículos liberadores de fármacos em diversas aplicações (Dl PIETRO et al. 2016).

[008] O óxido nítrico (NO) é uma das menores moléculas encontradas no meio biológico em mamíferos e atua como agente citotóxico, neurotransmissor e citoprotetor (SEABRA, 2006). O NO é uma molécula diatômica, formada pelo nitrogénio ligado covalentemente com o oxigénio, possui 11 elétrons, sendo que contém 1 elétron desemparelhado no orbital p*, podendo então ser classificado como um radical livre.

[009] Até a até a década de 80, o NO era conhecido apenas por ser um poluente atmosférico. Em 1988, Robert Furchgott, Ferid Murad e Louis Ignarro propuseram que as células endoteliais produziam uma molécula sinalizadora nomeada como fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF), mais tarde identificaram ser o NO (LOURENÇO, 2015; SEABRA, 2006). Posteriormente, descobriram que o NO está envolvido em diversos processos biológicos, que incluem neurotransmissão, inflamação, cicatrização, vasodilatação e inibição da agregação plaquetária (GUZIK; KORBUT, 2003; IGNARRO, 2000; SCHÀFFER et al., 1996; SEABRA, 2006; VINCENT, 1994).

[0010] O NO pode ser sintetizado endogenamente nos mamíferos a partir da oxidação da L-arginina a L-citrulina pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), que possui 3 isoformas: a endotelial, a neuronal e a induzível (MOWBRAY et al., 2008). A enzima óxido nítrico neuronal (nNOS) e óxido nítrico endotelial (eNOS) são dependentes de cálcio e produzem baixas concentrações de NO (concentrações entre picomolar a nanomolar), e nessas concentrações o NO possui papel importante no controle da pressão sanguínea e inibição da agregação plaquetária (MOWBRAY et al., 2008). Entretanto, a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) é independente de cálcio e produz altas concentrações de NO (na faixa micromolar) por longos períodos e nessa faixa de concentração o NO possui papel importante no sistema imunológico (SEABRA; DURÁN, 2018). [0011] Como o NO é um gás e um radical livre, possui um tempo de meia vida muito curto (10 a 100 ms), portanto o NO pode reagir rapidamente com o oxigénio e espécies reativas de oxigénio em meio biológico (SCICINSKI et al., 2015). Para aumentar o tempo de meia vida do NO no meio biológico, é necessária uma molécula mais estável que possa doá-lo espontaneamente. Esses doadores de NO apresentam grande potencial para viabilizar as aplicações com o NO. Muitos doadores de NO já têm sido utilizados clinicamente há muitas décadas.

[0012] Os S-nitrosotióis são uma classe de compostos caracterizados pela presença de um grupo nitroso (-SNO) ligado por uma ligação simples ao enxofre de tiol (HAYASHI et al., 2004). A S-nitrosoglutationa (GSNO) é um exemplo de um RSNO, uma molécula endógena, que pode ser sintetizada quimicamente através de tióis de baixo peso molecular que são encontrados intracelularmente, além de protegerem o NO das espécies reativas de oxigénio (RICCIO; SCHOENFISCH, 2012) (Figura 1). [0013] A síntese mais simples dos RSNOs se dá através da nitrosação do tiol com ácido nitroso. Neste trabalho realizou-se a nitrosação da glutationa (GSH). Os RSNOs são degradados na presença de íons Cu ²⁺ , termo e fotoquimicamente, assim ocorre a quebra homolítica da ligação S-N. Essa decomposição é uma reação autocatalítica, de primeira ordem, na qual o radical tiila (RS·) formado a partir da quebra de uma ligação RS-NO, provoca a quebra de outro RSNO formando a ligação dissulfeto do produto RSSR (Figura 1).

[0014] O poli(álcool vindico) (PVA) é um polímero sintético, semicristalino, biocompatível, biodegradável, atóxico e compatível com o sangue (BAKER et al., 2012). Devido à sua baixa toxicidade, o PVA é utilizado nas indústrias de cosméticos, farmacêutica, alimentícia, têxtil e de papel (BAKER et al., 2012; SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004).

Fórmula estrutural do PVA [0015] Em aplicações biomédicas, o PVA é utilizado no recobrimento de lesões, na confecção de pele artificial, no revestimento de dispositivos médicos e na fabricação de adesivos para liberação transdérmica (GALYA et al., 2008). Dados da literatura mostram que soluções de PVA são bons reservatórios para liberação de drogas, e a incorporação de drogas em matrizes de PVA aumenta a penetração das mesmas através da pele (BAKER et al., 2012). Filmes de PVA apresentam alta transparência, flexibilidade, alta hidrofilicidade e estabilidade química (EGHBALIFAM; FROUNCHI; DADBIN, 2015). Devido a sua biocompatibilidade, o PVA é um dos polímeros mais usados na preparação de materiais para aplicações biomédicas.

[0016] O polietileno glicol (PEG) utilizado nesse trabalho é um oligômero sintético, amplamente utilizado na área biomédica por apresentar propriedades interessantes, tais como: solubilidade em água e baixa toxicidade. Seu estado pode variar dependendo da sua faixa de peso molecular. Sua ampla faixa de peso molecular possibilita trabalhar com líquidos viscosos até sólidos a temperatura ambiente (SEABRA, 2006; SHISHIDO, 1998).

Fórmula estrutural do PEG.

[0017] O PEG já é encontrado em alimentos, cremes cosméticos, pomadas e loções. Soluções de PEG também são utilizadas como princípios ativos em injeções e carreadoras de drogas (SHISHIDO, 1998). Nesse trabalho, o PEG foi utilizado como aditivo. Trabalhos na literatura mostraram que a incorporação de doadores de NO em filmes de PVA permite a liberação sustentada de NO em aplicações tópicas (MARCILLI; DE OLIVEIRA, 2014; SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004). Nesse contexto, o trabalho prevê a incorporação de doadores de NO e AgNPs em filmes poliméricos para liberação sustentada de NO e AgNPs em aplicações biomédicas, destacando- se as ações antiproliferativas.

Sumário da invenção

[0018] A presente invenção apresenta uma nova proposta para tratamento de câncer. Em especial, a presente invenção apresenta uma nova proposta para o tratamento de tumores, ou cânceres sólidos. Esta nova estratégia é baseada na preparação de um filme polimérico, de baixo custo, alta compatibilidade, contendo dois princípios ativos: doador de óxido nítrico e nanopartículas de prata (AgNPs). O filme de acordo com a presente invenção é capaz de liberar quantidade terapêuticas tanto do doador de óxido nítrico quanto de AgNPs, diretamente no local de ação desejado, de forma sustentada e localizada.

[0019] Os presentes inventores descobriram que, surpreendentemente, a liberação conjunta de um doador de óxido nítrico e de AgNPs demonstra uma potente ação sinérgica anticâncer. O filme polimérico contendo doador de óxido nítrico e as AgNPs pode ser usado diretamente no local desejado, seja diretamente em um tumor sólido, ou ainda no recobrindo dispositivos médicos.

[0020] Os resultados obtidos pelos presentes inventores indicam que os filmes possuem potencial para aplicações biomédicas, com uma liberação sustentada de óxido nítrico e AgNPs por pelo menos 24 horas e em especial para o tratamento de tumores. Observou-se um efeito sinérgico do óxido nítrico com as AgNPs, na redução de pelo menos 75% da viabilidade celular das células de tumores, no tratamento com os filmes contendo AgNPs e a molécula doadora de NO.

[0021] Os filmes contendo AgNPs e o doador de óxido nítrico apresentam adicionalmente diversas vantagens, como por exemplo o baixo custo de produção. Ainda, os filmes de acordo com a presente invenção são biodegradáveis, possuem alta durabilidade e não geram subprodutos tóxicos durante o preparo do material.

Breve descrição das figuras

[0022] Figura 1 - Esquema da reação da nitrosação da GSH, levando a formação da GSNO (A); Decomposição da GSNO, levando a formação da glutationa oxidada e a liberação do radical livre NO

[0023] Figura 2 - Espectros de absorção UV-visível de filmes sólidos de (i) PVA/PEG, (ii) PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m), (iii) PVA/PEG- AgNPs (2,5% m/m), e (iv)P V A/PEG-GSNO- AgNPs (ambos 2,5% m/m).

[0024] Figura 3 - Difratograma dos filmes PVA/PEG (linha preta) e

PVA/PEG-GSNO- AgNPs (ambas com 2,5% m/m) (linha vermelha) (A). Espectros de XRD detalhados de ambos os filmes (B).

[0025] Figura 4 - Espectros de FTIR do filme de PVA/PEG (linha preta) e filme de PVA/PEG contendo GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) (linha vermelha).

[0026] Figura 5 - Morfologia do filme sólido de PVA/PEG (A) e PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) (B), avaliados por SEM. [0027] Figura 6 - Imagem SEM de GSNO contendo do filme de

PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) (A). Esta imagem foi selecionada para mapear átomos de carbono (B), oxigénio (C), enxofre (D) e prata (E). Os pontos coloridos nas Figuras (B-E) representam o mapeamento elementar EDS dos átomos de carbono, oxigénio, enxofre e prata, respectivamente.

[0028] Figura 7 - Curvas cinéticas de liberação de NO da GSNO (2,5% m/m), incorporadas em filmes sólidos de PVA/PEG em (i) 25 °C, (ii)

32,5 °C, (iii) 37 °C. Os filmes foram moldados por casting em uma cubeta desmontável de quartzo.

[0029] Figura 8 - Perfil de difusão da GSNO intacta (curva i) e

AgNPs (curva ii) de filmes de PVA/PEG contendo GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m), monitorado através de uma membrana artificial em uma célula vertical de difusão Franz

[0030] Figura 9 - Viabilidade celular das células de carcinoma cervical humano (HeLa) (A) e célula de câncer de próstata humana (PC3) (B), avaliadas após o tratamento com: filmes de PVA/PEG (coluna vermelha), PVA/PEG-GSNO (2,5% massa/massa) (coluna azul), PVA/PEG-AgNPs (2,5% massa/massa) (coluna verde) e PVA/PEG-GSNO-AgNPs (ambos com 2,5% massa/massa) (coluna branca). Células sem tratamento foram utilizadas como grupo controle para 100% de viabilidade celular, como grupo controle negativo (coluna preta). Descrição detalhada da invenção

[0031] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular e imunologia são bem conhecidas de um técnico no assunto. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[0032] De acordo com a presente invenção, os termos, “câncer” e “neoplasia” devem ser entendidos como intercambiáveis e se referem, de forma geral, a uma doença na qual células do corpo se dividem de forma normal e/ou descontrolada.

[0033] De acordo com o presente pedido, os termos “tumor” e “câncer sólido” devem ser entendidos de forma intercambiável e se referem preferencialmente a crescimentos anormais de células de um tecido. De acordo com o presente pedido, os termos “tumor” e “câncer sólido” devem ser entendidos como englobando todos os tipos de câncer, com exceção daqueles de origem hematopoiética.

[0034] De acordo com a presente invenção, o tumor ou câncer sólido pode ser um câncer selecionado dentre: um tumor sólido, incluindo câncer do olho, um câncer de medula espinal, rim, boca, lábio, garganta, cavidade oral, cavidade nasal, intestino delgado, cólon, glândula paratiroideia, vesícula biliar, cabeça, gliomas, glioblas tomas, meduloblas tomas, craniofaringioma, ependimoma, um câncer do pescoço, mama, osso, canal biliar, colo do útero, coração, glândula hipofaríngea, pulmão, brônquios, fígado, pele, ureter, uretra, testículos, vagina, ânus, glândula laríngea, ovário, tireoide, esófago, glândula nasofaríngea, glândula pituitária, glândula salivar, próstata, pâncreas, glândulas supra-renais, do endométrio, oral, um melanoma, neuroblastoma, um câncer gástrico, uma angiomatose, um hemangioblastoma, um feocromocitoma, um cisto pancreático, um carcinoma de células renais, carcinoma de células escamosas, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, rabdomios sarcoma, e um carcinoma hepatocelular.

[0035] Deve ser entendido que o termo “doador de óxido nítrico

(NO)” de acordo com a presente invenção compreende compostos capazes de doar uma molécula de NO quando em um meio biológico. Dentre os doadores de óxido nítrico preferidos estão os S-nitrosotióis. Entre os S-nitrosotióis preferidos podemos citar a S-nitrosoglutationa (GSNO), a S- nitrosoacetilpenicilamina (SNAP), S-nitroso-N-cisteina (CisNO), S-nitroso- N-acetilcisteina (SNAC). Mais preferencialmente ainda, o doador de NO da presente invenção é a S-nitrosoglutationa (GSNO).

[0036] As nanopartículas de prata de acordo com a presente invenção podem ser produzidas por quaisquer métodos conhecidos do estado da técnica. Dentre os métodos preferenciais de produção das AgNPs, destacamos as rotas “verdes”. Por rotas verdes, entende-se o uso de organismos biológicos, ou partes deles (como órgãos, tecidos, células ou biomoléculas), como substituintes de alguns reagentes químicos nas reações de síntese das nanopartículas.

[0037] De acordo com a presente invenção, filmes poliméricos são considerados quaisquer filmes produzidos a partir de compostos formados a partir de reações de polimerização. Dentre os compostos preferenciais para a formação dos filmes poliméricos da presente invenção podemos destacar o poli(álcool vindico) (PVA), poli vinil acetato, polietileno glicol (PEG), e propileno glicol. Preferencialmente, os filmes poliméricos da presente invenção são formados por uma mistura de PVA/PEG. [0038] O filme polimérico de acordo com a presente invenção pode ser produzido de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Dentre os métodos de produção preferidos para os filmes poliméricos de acordo com a presente invenção podemos citar as técnicas de casting, spraying, dip- coating, spin-coating. Preferencialmente, é utilizada a técnica de casting. [0039] Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo:

(a) um filme polimérico;

(b) nanopartículas de prata; e

(c) um doador de óxido nítrico.

[0040] A composição de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para o tratamento de doenças, dentre as quais destacamos o câncer. [0041] A presente invenção refere-se também ao uso combinado de nanopartículas de prata e de um doador de óxido nítrico para a manufatura de uma composição para o tratamento de câncer.

[0042] De acordo com a presente invenção, a composição está na forma de um filme polimérico sendo composto e produzido como descrito anteriormente.

[0043] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um Kit para o tratamento de câncer, em que o referido kit compreende:

(a) um filme polimérico;

(b) nanopartículas de prata; e

(c) um doador de óxido nítrico.

[0044] Em um modo de realização preferencial, o kit de acordo com a presente invenção contém um filme polimérico formado de acordo com o descrito anteriormente.

[0045] E fornecido adicionalmente pela presente invenção, um método para tratar uma doença e/ou uma condição e/ou um distúrbio, cujo método compreende administrar a um paciente, ou indivíduo, uma composição ou uma composição obtida a partir de um kit, conforme definidos acima. O método é tipicamente um método para tratar qualquer condição de doença ou distúrbio definidos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, o método é um método para tratar um câncer. Preferivelmente, tal método compreende administrar a um indivíduo uma composição, conforme definida acima. [0046] A presente invenção é descrita também pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativos. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

[0047] Inúmeras variações incidindo no escopo de proteção do presente pedido são permitidas. Dessa forma, reforça-se o fato de que a presente invenção não está limitada às configurações / concretizações particulares acima descritas.

Exemplos

EXEMPLO 1 Preparação das nanopartículas de prata (AgNPs), S-nitrosoglutationa (GSNO) e filmes poliméricos de PVA/PEG

Preparação de nanopartículas de prata a partir do extrato de chá verde

[0048] Poderão ser utilizadas AgNPs comerciais, contudo, altemativamente as AgNPs podem ser sintetizadas a partir do extrato de chá verde. A síntese das AgNPs a partir do extrato de chá verde foi realizada como descrito por Rolim e coautores (ROLIM et al., 2019). Primeiramente, o extrato de chá verde foi preparado a partir da dissolução de 2 g de chá verde em pó em 100 mL de água Milli-Q sob agitação e temperatura de 60 °C. Após a dissolução, o extrato de chá verde foi filtrado em papel de filtro qualitativo. Em seguida, 75 mL de AgN03 (0,1 mol L ¹ ) foram adicionados em 75 mL de extrato de chá verde, e o pH da mistura foi ajustado para 10,5 com NaOH (1 mol L ¹ ). A mistura ficou sob agitação durante 15 minutos e em seguida foi centrifugada a 12000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado que contém as nanopartículas foi lavado três vezes com água Milli-Q e liofilizado durante 48 h (ROLIM et al., 2019). Preparação da GSNO pela via úmida

[0049] A GSNO foi sintetizada pela rota de via úmida, como descrito por (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). A GSNO foi obtida através da nitrosação da glutationa (GSH). Resumidamente, a glutationa reduzida (1,23 mol L ¹ ) foi reagida com uma quantidade equimolar de nitrito de sódio (NaN0 ₂ ) em HC1 (1,0 mol L ¹ ) durante 40 min. Em seguida, a GSNO obtida foi precipitada com água fria, filtrada utilizando um funil de Buchner com um papel de filtro com uma porosidade de 0,45 pm, lavado com água fria e liofilizada por 24 h. A GSNO obtida foi armazenada a -20 °C dentro de um recipiente com sílica e protegido da luz.

Preparação dos filmes de PVA, PVA/PEG, PVA/PEG-AgNPs, PVA/PEG- GSNO e PVA/PEG-AgNPs-GSNO pelo método de casting

[0050] Os filmes de PVA/PEG contendo GSNO e/ou AgNPs foram preparados por casting, conforme descrito por SEABRA et al., 2005; USMAN et al., 2016.

[0051] Grupo (i): filmes sólidos de PVA/PEG foram preparadas dissolvendo 0,56 g de PVA em 7,0 mL de água Milli-Q, sob agitação magnética a 80 °C. Após a dissolução total de PVA, adicionou-se 1,124 g de PEG à solução aquosa de PVA e a solução final foi homogeneizada sob agitação magnética à temperatura ambiente.

[0052] Grupo (ii): Filmes sólidos de PVA/PEG contendo GSNO

(2,5% m/m) foram preparados dissolvendo 0,56 g de PVA em 6,8 mL de água Milli-Q, sob agitação magnética a 80 °C. Após a dissolução total do PVA, 1,124 g de PEG foram adicionados à solução aquosa de PVA e a solução final foi homogeneizada sob agitação magnética à temperatura ambiente. Um volume de 0,2 mL de solução aquosa de GSNO (0,21 mol L ¹ ) foi adicionado à solução aquosa de PVA/PEG e a solução final foi a homogeneizada sob agitação magnética e temperatura ambiente. [0053] Grupo (iii): Filmes sólidos de PVA/PEG contendo AgNPs (2,5% m/m) foram obtidos a partir da dissolução de 0,56 g de PVA em 6,0 mL de água deionizada, sob agitação magnética a 80,0 °C. Após a dissolução total de PVA, adicionou-se 1,124 g de PEG à solução aquosa de PVA e a solução final foi homogeneizada sob agitação magnética à temperatura ambiente. Adicionou-se um volume de 1,0 mL de uma suspensão de AgNPs (14 mg mL ¹ ) à solução aquosa de PVA/PEG e a solução final foi homogeneizada sob agitação magnética à temperatura ambiente.

[0054] Grupo (iv): Filmes sólidos de PVA/PEG contendo GSNO

(2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) foram obtidos conforme descrito para os grupos (ii) e (iii), em quantidades de 0,8 mL de suspensão de AgNPs (17,5 mg mL ¹ ) e 0,2 mL de solução aquosa de GSNO (0,21 mol L ¹ ) foram adicionados solução aquosa de PVA/PEG, sob agitação magnética sob temperatura ambiente. Todas as soluções poliméricas aquosas (grupos i-iv) foram moldadas individualmente pelo método de casting. Para este fim, um volume de 300 pL de cada uma das soluções poliméricas foi transferida para a cavidade de uma cubeta de quartzo desmontável (caminho óptico de 0, 1 mm) e deixado a evaporar durante 4 h à temperatura ambiente no escuro (SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004). Altemativamente, cada uma das soluções poliméricas foi moldada num molde de silicone de 3,5 cm de diâmetro durante 8 h. Após a secagem, os filmes foram removidos do molde de silicone. Estes processos levaram à formação de filmes sólidos de PVA/PEG (relação grupo i, PVA:PEG com razão 1:2 m/m). No caso dos grupos ii, iii e iv, esses processos levaram à formação de filmes sólidos de PVA/PEG contendo 2,5% em massa de GSNO (grupo ii), 2,5% em massa de AgNPs (grupo iii), 2,5% em massa de GSNO e 2,5% em massa de AgNPs (grupo iv). [0055] A Tabela 1 apresenta os grupos experimentais estudados. Tabela 1 - Descrição da composição de cada grupo estudado

PVA PEG AgNPs GSNO

(I) PVA/PEG X X

(II) PVA/PEG-GSNO X X X

(III) PVA/PEG- AgNPs X X X

(IV) PVA/PEG-GSNO- AgNPs X X X X

EXEMPLO 2

Caracterização dos filmes poliméricos preparados

[0056] Os filmes obtidos foram caracterizados por diversas técnicas, descritas abaixo.

Espectroscopia na região UV- Visível

[0057] Os filmes sólidos de PVA/PEG, PVA/PEG-GSNO, PVA/PEG-

AgNPs e PVA/PEG-GSNO-AgNPs obtidos por casting foram caracterizados por espectroscopia na região UV-Visível utilizando um espectrofotômetro (Agilent, modelo 8453, Paio Alto, CA, EUA).

[0058] A Figura 2 mostra os espectros de absorção visível de filmes sólidos de (i) PVA/PEG, (ii) PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m), (iii) PVA/PEG- AgNPs (2,5% m/m), e (iv) PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m).

[0059] Todos os filmes sólidos foram moldados por evaporação de solvente sobre a cavidade de uma célula de quartzo desmontável. A adição de GSNO em filmes de PVA/PEG (curvas iii e iv) mostra a presença de uma banda de absorção característica em 336 nm, que é atribuída a transições p -> p* do grupo S-N, presente na GSNO, confirmando a incorporação do doador NO no filme (MARCILLI; DE OLIVEIRA, 2014; SEABRA et al., 2005; SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004). A presença da banda de absorção da GSNO a 336 nm no filme PVA/PEG-GSNO foi usada para monitorar a cinética da decomposição da GSNO com liberação de NO no filme.

[0060] Para filmes de PVA/PEG que contém AgNPs (curvas ii e iv), observa-se a presença da banda de absorção plasmônica das AgNPs (SPR), em tomo de 405 nm, confirmando a presença de AgNPs. A banda de absorção SPR é atribuída às interações da luz incidente com os elétrons na superfície de AgNPs (BADAWY, 2014). A presença da banda de absorção em 405 nm indicou a presença de AgNPs do tamanho nanométrico na matriz sólida dos filmes PVA/PEG (FATEMA et al., 2018; ROLIM et al., 2019).

Difração de raios-X (XRD)

[0061] Filmes sólidos de PVA/PEG e PVA/PEG/GSNO/AgNPs foram caracterizados por DRX. Para este fim, pedaços de 3,0 mm do diâmetro dos filmes preparados foram acomodados em um porta-amostra durante a coleta de dados. Os dados de difração de raios-X foram obtidos sob temperatura ambiente em um difratômetro STADI-P (Stoe®, Darmstadt, Alemanha) em geometria de transmissão usando um comprimento de onda MoKaI (l = 0,7093 Â) na faixa de 2,0 ° a 60,485 °. com passos de 0,015°. [0062] A Figura 3A mostra o difratograma de XRD dos filmes

PVA/PEG (linha preta) e filmes PVA/PEG-GSNO-AgNPs (linha vermelha). A Figura 3B mostra espectros de XRD detalhados de ambos os filmes.

[0063] O espectro de XRD do filme sólido de PVA/PEG exibe um amplo pico de difração a 20 = 8,71° devido ao (101) plano de reflexão da PVA semicristalino (BADAWY, 2014; EL-SHAMY et al., 2018; GAUTAM; RAM, 2010; GHANIPOUR; DORRANIAN, 2013; MUHAMMAD SALMAN SARWAR, MUHAMMAD BILAL KHAN NIAZI, ZAIB JAHAN, TAHIR AHMAD, 2018). Esse pico é devido à natureza semicristalina do PVA como resultado da forte ligação de hidrogénio intermolecular e intramolecular entre a cadeia da molécula de PVA (EL- SHAMY et al., 2018; HE et al., 2017).

[0064] O pico observado a 20 = 10,51° corresponde à presença de PEG (RAO et al., 2013). Deve-se notar que a presença de PEG nos filmes de PVA/PEG favorece a formação de ligação de hidrogénio entre cadeias de PEG e PVA, diminuindo a natureza semicristalina do PVA (MEHRA; MU; ZHU, 2017).

[0065] A presença de AgNPs em filmes de PVA/PEG levou ao aparecimento de picos de difração a 20 de 17,27°, 28,40° e 33,24°, que correspondem ao planos (111), (220) e (311), característicos de AgNPs cúbicas de face centrada (FCC) (ALHUQAIL et al., 2018; YALLAPPA; MANJANNA; DHANANJAYA, 2015).

[0066] A ampliação dos picos de XRD está relacionada à presença de tamanho pequeno de grão de AgNPs (EISA et al., 2017). Esses resultados demonstraram a incorporação bem-sucedida de AgNPs bem dispersos em matriz amorfa de PVA/PEG.

Espectroscopia por transformada de Fourier (FTIR)

[0067] A análise por FTIR foi utilizada para identificar os grupos funcionais em filmes sólidos de PVA/PEG e PVA/PEG/GSNO/AgNPs. Para este fim, pedaços de 6 mm de PVA/PEG ou PVA/PEG/GSNO/AgNPs foram colocados no porta amostras do espectrômetro Spectrum Two FT-IR (PerkinElmer, EUA). As medidas foram realizadas utilizando-se acessório de refletância total atenuada (ATR), os espectros foram registrados na faixa de 400-4000 cm ¹ com uma resolução de 2 cm ¹ .

[0068] Medidas de FTIR foram realizadas para confirmar a presença de grupos funcionais característicos do PVA, PEG, GSNO e AgNPs em filmes sólidos. A Figura 4 mostra os espectros de FTIR de película de PVA/PEG (linha preta) e película de PVA/PEG contendo GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) (linha vermelha).

[0069] A banda larga em 3325 cm ¹ é atribuída ao estiramento do grupo OH das cadeias poliméricas envolvidas nas ligações de hidrogénio inter e intramolecular (EISA et al., 2017; MATHEW et al., 2018). Como essa região é característica das vibrações de estiramento dos grupos -OH, mudanças na intensidade e posição desta banda (comparando linhas preta e vermelha na Figura 4) indicam as interações do grupo -OH entre o PVA/PEG e a GSNO/AgNPs (MATHEW et al., 2018).

[0070] No filme PVA/PEG (linha preta), a banda a 2954 cm ¹ é atribuída à presença de vibrações de estiramento assimétricas do grupo -CH ( ALKILAN Y ; BANI YASEEN; KAILANI, 2015; MATHEW et al., 2018). No entanto, no filme PVA/PEG-GSNO-AgNPs (linha vermelha), observou-se que esta faixa foi deslocada de 2954 cm ¹ a 2931 cm ¹ devido à interação de AgNPs, GSNO e matriz PVA/PEG (MATHEW et al., 2018).

[0071] A banda a 1438 cm ¹ é atribuída à vibração do grupo C-H

(EISA et al., 2017). A faixa em 1095 cm ¹ (curva preta) é atribuída ao alongamento do C-O, presente nas cadeias poliméricas (ALKILANY; BANI YASEEN; KAILANI, 2015; MATHEW et al., 2018). Quando comparado com o espectro do filme PVA/PEG-GSNO-AgNPs (curva vermelha), é possível observar um descolamento para 1067 cm ¹ . Esta banda foi deslocada para um número de onda mais baixo, com maior intensidade em comparação com o filme PVA/PEG puro. Isso pode ser resultado de fortes interações moleculares, como a ligação hidrogénio entre grupos O-H de cadeias PVA/PEG (MATHEW et al., 2018; NGUYEN; LIU, 2014). A banda a 1431 cm ¹ é atribuída à vibração dos grupos C-H (EISA et al., 2017). Bandas vibratórias características da função carbonila (originalmente nas porções de PVA devido à hidrólise incompleta) são encontradas em 1644 cm ¹ , como relatado anteriormente (ALKILANY; BANI YASEEN; KAILANI, 2015).

Estudo da morfologia e composição química

[0072] A morfologia dos filmes sólidos PVA/PEG e

PVA/PEG/ GSNO/ AgNPs foi estudada por microscopia eletrónica de varredura (SEM, Quanta 250 SEM-FEI, Thermo Fisher Scientific, EUA), com uma tensão de aceleração de 2,0 e 5,0 kV. A amostra de filme foi montada no porta amostras e recoberta com ouro em alto vácuo (Balt-Tec MED 020, Liechtenstein). A composição elementar dos filmes foi obtida por análise EDS (EDS, JEOL, JSM-6010LA). A técnica de EDS foi utilizada para mapear a distribuição dos átomos de carbono, enxofre, oxigénio e prata no filme de PVA/PEG/GSNO/AgNPs.

[0073] A Figura 5 mostra a morfologia da película sólida de PVA/PEG (Fig. 7 A) e GSNO contendo PVA/PEG (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) (Fig. 7B), avaliada por SEM.

[0074] Como esperado, filmes de PVA/PEG têm uma morfologia superficial homogénea, uma textura lisa com a ausência de poros, devido às interações positivas das cadeias de PVA e PEG, e nenhuma formação significativa de agregados e separação de fases (Fig. 5 A). Resultados semelhantes foram relatados anteriormente para filmes sólidos de PVA (MARCILLI; DE OLIVEIRA, 2014; MATHEW et al., 2018; SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004). Em contrapartida, a morfologia do filme de PVA/PEG- GSNO-AgNPs mostra um número de partículas distribuídos homogeneamente com tamanhos menores (em nanoescala) atribuídos a AgNPs de forma quase esférica (Fig. 5B). Durante a evaporação do solvente fundido, um grau de migração e agregação de AgNPs menores por meio de uma solução menos viscosa de PVA/PEG pode levar à formação de agregados de nanopartículas (MATHEW et al., 2018). Resultados semelhantes foram relatados para filmes à base de PVA contendo AgNPs (EL-SHAMY et al., 2018; FATEMA et al., 2018; MUHAMMAD SALMAN SARWAR, MUHAMMAD BILAL KHAN NIAZI, ZAIB JAHAN, TAHIR AHMAD, 2018).

[0075] A análise de EDS é uma técnica usada para identificação da composição elementar de um espécime. Além disso, a análise de EDS é capaz de gerar um mapa de um ou mais elementos químicos selecionados de interesse em uma amostra. A análise do filme de PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m) através do espectrômetro EDS confirmou a presença de sinais elementares de carbono, oxigénio, enxofre e prata. Como esperado, carbono e oxigénio no filme são atribuídos à matriz polimérica de PVA/PEG e GSNO. O enxofre é devido à presença do doador de NO, GSNO, enquanto a prata é devido à presença de AgNPs nos filmes. A Figura 6 A mostra a imagem MEV do filme de PVA/PEG-GSNO-AgNPs (ambas com 2,5% m/m)

[0076] Esta imagem foi selecionada para mapear átomos de carbono

(Fig. 6B), oxigénio (Fig. 6C), enxofre (Fig. 6D) e prata (Fig. 6E). Os pontos coloridos nas Figuras 6 (B-E) representam o mapeamento elementar EDS dos átomos de carbono, oxigénio, enxofre e prata, respectivamente. Em todos os casos, uma distribuição homogénea de pontos pode ser observada na área mapeada. Nossos resultados estão de acordo com relatórios anteriores para AgNPs contendo filmes baseados em PVA (EISA et al., 2017; EL-SHAMY et al., 2018; MUHAMMAD SALMAN SARWAR, MUHAMMAD BILAL KHAN NIAZI, ZAIB JAHAN, TAHIR AHMAD, 2018).

EXEMPLO 3

Cinética da decomposição de GSNO com liberação de NO em filmes de PVA/PEG contendo GSNO

[0077] A cinética de difusão in vitro da GSNO intacta e AgNPs dos filmes PVA/PEG contendo GSNO (2,5% massa/massa) e AgNPs (2,5% massa/massa) foi realizada usando uma célula vertical de difusão de Franz (célula padrão, 15 mm de diâmetro, 7 mL, Hanson Research Corporation) (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). A célula consiste de câmaras doadoras e receptoras que foram separadas por uma membrana de nitrocelulose hidrofílica, com porosidade de 50 nm e 25 mm de diâmetro (Merck Millipore Ltd.). Filmes sólidos de PVA/PEG-GSNO-AgNPs com 3,5 cm de diâmetro foram montados no compartimento doador, enquanto a câmara do receptor foi preenchida com 7 mL de tampão fosfato salino (PBS) a 32,5 °C (temperatura da pele humana) sob agitação constante. A célula inteira foi protegida da luz ambiente. Um volume de 500 pL foi retirado do compartimento do receptor em intervalos de 30 minutos, e substituído por um volume equivalente de solução de PBS fresco. Para a detecção da difusão do GSNO a partir dos filmes, as amostras retiradas foram imediatamente analisadas por espectrofotometria UV-Vis. A quantidade de GSNO intacta difundida através da membrana a partir do filme polimérico foi determinada pela monitoração das mudanças espectrais em 336 nm (e = 980 L mol ¹ cm ¹ ), que foi atribuído à presença de GSNO (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). A quantidade de AgNPs que se difundiu através da membrana a partir do filme polimérico foi monitorada utilizando um espectrofotômetro de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) (Agilent 7900, Hachioji, Japão). Para a análise em ICP-MS, alíquotas de 50 pL de cada amostra foram diluídas em 1,0 mL de uma solução aquosa de ácido nítrico (HN03) a 2% (v/v). Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD) dos três experimentos independentes e expressos em termos da porcentagem de GSNO e AgNPs difundidos ao longo do tempo. [0078] A Figura 7 mostra as curvas cinéticas de liberação de NO da

GSNO (2,5% m/m), incorporada no filme sólido de PVA/PEG. [0079] Essas curvas cinéticas correspondem à decomposição espontânea de GSNO, levando à liberação de NO (Eq. 1) (SEABRA et al., 2005; SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004). As curvas cinéticas foram monitoradas a 25 °C (temperatura ambiente), a 32,5 °C (temperatura da pele), e 37 °C (temperatura fisiológica) por 24 h, no escuro. Em todas as temperaturas, uma liberação sustentada de NO foi observada por pelo menos 24 horas.

[0080] A matriz polimérica viscosa aumenta a estabilização térmica do doador de NO (SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004). As taxas iniciais de liberação de NO de filmes de PVA/PEG-GSNO foram de 0,44 pmol cm ² h ¹ , 0,59 mpioΐ cm ² h ¹ e 0,92 mpioΐopi ² .^ a 25 °C, 32,5 °C e 37 °C, respectivamente. Como esperado, as taxas iniciais de liberação de NO da GSNO aumentam com o aumento da temperatura (PELEGRINO et al., 2018; SEABRA; DE OLIVEIRA, 2004).

[0081] Como mostrado na Figura 7, a quantidade de libertação de NO dos filmes poliméricos está na faixa de 4 - 7 pmol de NO por cm ² de área do filme polimérico. Nessa faixa de concentração, espera-se que o NO tenha efeitos biológicos, como citotoxicidade para células tumorigênicas e efeitos antibacterianos (SEABRA, 2017). Foi relatado que, para aplicações tópicas, a quantidade de liberação de NO de outras formulações está na faixa de pmol NO por 100 gramas da matriz, permitindo uma entrega transdérmica de NO (SEABRA et al., 2004).

[0082] Em outro trabalho, foi preparado filmes sólidos modificados de PVA contendo RSNO para liberação tópica de NO (MARCILLI; DE OLIVEIRA, 2014). Os autores relataram que esses filmes que liberam 0,3 pmol de NO por cm ² e foram capazes de aumentar a vasodilatação dérmica em mais de 5 vezes em seres humanos (MARCILLI; DE OLIVEIRA, 2014). Em uma abordagem semelhante, foi observada liberação de NO da membrana de PVA (64-101 nmol de NO liberado por cm ² ) para produzir vasodilatação dérmica (LOURENÇO; DE OLIVEIRA, 2017). Além disso, Seabra e coautores relataram a preparação de filmes sólidos poliméricos de poliéster polinitrosado misturado com poli (metacrilato de metila) para liberação tópica de NO. O filme obtido liberou 4,6 nmol de NO por cm ² h ¹ . Nessa concentração, o filme polimérico apresentou potente atividade antimicrobiana contra as cepas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (SEABRA et al., 2010). Portanto, os filmes de PVA/PEG contendo GSNO podem ter aplicações biomédicas importantes devido à capacidade de liberar quantidades terapêuticas de NO.

EXEMPLO 4 Ensaio de difusão da GSNO e AgNPs dos filmes de PVA/PEG contendo GSNO e AgNPs

[0083] A cinética de difusão in vitro da GSNO intacta e AgNPs dos filmes PVA/PEG contendo GSNO (2,5% massa/massa) e AgNPs (2,5% massa/massa) foi realizada usando uma célula vertical de difusão de Franz (célula padrão, 15 mm de diâmetro, 7 mL, Hanson Research Corporation) (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). A célula consiste de câmaras doadoras e receptoras que foram separadas por uma membrana de nitrocelulose hidrofílica, com porosidade de 50 nm e 25 mm de diâmetro (Merck Millipore Ltd.). Filmes sólidos de PVA/PEG-GSNO-AgNPs com 3,5 cm de diâmetro foram montados no compartimento doador, enquanto a câmara do receptor foi preenchida com 7 mL de tampão fosfato salino (PBS) a 32,5 °C (temperatura da pele humana) sob agitação constante. A célula inteira foi protegida da luz ambiente. Um volume de 500 pL foi retirado do compartimento do receptor em intervalos de 30 minutos, e substituído por um volume equivalente de solução de PBS fresco. Para a detecção da difusão do GSNO a partir dos filmes, as amostras retiradas foram imediatamente analisadas por espectrofotometria UV-Vis. A quantidade de GSNO intacta difundida através da membrana a partir do filme polimérico foi determinada pela monitoração das mudanças espectrais em 336 nm (e = 980 L mol ¹ cm ¹ ), que foi atribuído à presença de GSNO (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). A quantidade de AgNPs que se difundiu através da membrana a partir do filme polimérico foi monitorada utilizando um espectrofotômetro de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) (Agilent 7900, Hachioji, Japão). Para a análise em ICP-MS, alíquotas de 50 pL de cada amostra foram diluídas em 1,0 mL de uma solução aquosa de ácido nítrico (HNO3) a 2% (v/v). Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD) dos três experimentos independentes e expressos em termos da porcentagem de GSNO e AgNPs difundidos ao longo do tempo. [0084] A difusão de GSNO e AgNPs intactos do filme de PVA/PEG-

GSNO-AgNPs (ambas com 2,5% m/m) foi monitorada através de uma membrana artificial em uma célula de difusão Franz vertical (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). O compartimento doador-receptor foi monitorado quanto a difusão livre de GSNO e AgNPs por 24 h. A quantidade de GSNO difundida do filme através da membrana para o compartimento do receptor foi avaliada pela detecção da banda de absorção de GSNO a 336 nm (e = 980 L mol ¹ cm ¹ ), enquanto a difusão de AgNPs foi avaliada por a detecção de prata total usando ICP-MS.

[0085] A Figura 8 mostra o perfil de difusão de GSNO e AgNPs dos filmes poliméricos e a Tabela 2 mostra os parâmetros de liberação para difusão da GSNO e AgNPs a partir dos filmes de PVA/PEG.

[0086] Pode-se observar um burst inicial (liberação rápida) de 32% de

GSNO difundido e 37% de AgNPs difundidos dos filmes após 4 horas de monitoramento. Além disso, após 24 h de monitorização, as quantidades de GSNO e AgNPs difundidas dos filmes foram de 38% e 41% (dados não mostrados). Como pode ser observado na Figura 8, os perfis de difusão de GSNO e AgNPs são compreendidos ou duas fases sequenciais. Uma burst inicial nas difusões de GSNO e AgNPs, durante as primeiras 2 horas de monitoramento e uma difusão sustentada que continuou por pelo menos 24 horas (dados não mostrados).

[0087] Resultados semelhantes foram relatados para a difusão de

GSNO a partir de hidrogéis poliméricos (PELEGRINO; DE ARAÚJO; SEABRA, 2018). Assim, estes resultados indicam que os filmes de PVA/PEG podem promover uma difusão sustentada de GSNO e AgNPs.

[0088] A fim de investigar o mecanismo de difusão de GSNO e

AgNPs de filmes PVA/PEG, dois modelos matemáticos foram aplicados aos dados coletados (dados registrados na Figura 8): Higuchi e Kosmeyer-Peppas. A Tabela 2 mostra os coeficientes de correlação (R2) e as constantes de liberação para os dois modelos aplicados às curvas cinéticas obtidas na Figura

8.

Tabela 2 - Parâmetros de liberação para difusão de GSNO e AgNPs a partir de filmes PVA/PEG de acordo com os modelos matemáticos de Higuchi e Kosmeyer-Peppas

Modelos matemáticos

Higuchi Korsmeyer-Peppas r2 KH (%.h ^1/2 ) r2 n Kk (%.h ⁿ )

GSNO 0,941 5,512 0,932 0,2 0,258

AgNPs 0,951 21,142 0,947 0,309 1,264

[0089] Ambos os modelos matemáticos exibem um bom coeficiente de linearidade. O modelo de Higuchi apresentou linearidade de 0,941 para GSNO e 0,951 para AgNPs, indicando uma difusão fickiana (PELEGRINO et al., 2017). Além disso, o modelo de Korsmeyer-Peppas demonstrou um coeficiente de linearidade adequado de 0,932 para GSNO e 0,947 para AgNPs. O modelo de Korsmeyer-Peppas também indica difusão fickiana clássica com n valores de 0,2 para GSNO e 0,309 para AgNPs (COSTA, P., & LOBO, 2001; NACHIMUTHU ; SADHASIVAM; VEERICHETTY, 2018). Em conjunto, é possível observar que esses dois modelos matemáticos corroboram o mecanismo de difusão fickiana tanto de GSNO como de AgNPs em filmes de PVA/PEG.

EXEMPLO 5

Ensaio de viabilidade celular

[0090] Avaliou-se a viabilidade de células de carcinoma cervical humano (HeLa), câncer de próstata humana (PC3) e fibroblastos do prepúcio humano (HFF-1), frente aos filmes poliméricos contendo AgNPs e/ou GSNO. As células HeLa, PC3 foram cultivadas a 37°C em meio RPMI 1640 ou Dulbecco’s DMEM high glicose, respectivamente, suplementadas com 10 % (v/v) de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. Para células HFF-1, o Dulbecco’s DMEM high glucose foi suplementado com 15 % (v/v) de FBS e 1 mmol/L de piruvato de sódio. As culturas foram mantidas a 37°C em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5 % de CO2. Os efeitos dos filmes poliméricos sobre a viabilidade de células HeLa, PC3 e HFF-1 foram avaliados pelo ensaio de redução de MTT. Os filmes sólidos analisados foram: (i) PVA/PEG, (ii) PVA/PEG-GSNO (2,5 % m/m), (iii) PVA/PEG-AgNPs (2,5 % m/m), e (iv) PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m) e AgNPs (2,5% m/m). As células foram incubadas em uma placa de 24 poços a uma densidade de 3xl0 ⁴ células/poço (HFF-1) ou 6x10 ⁴ células/poço e incubadas durante 24 h a 37 °C para fixação. No final do período de incubação, o meio foi substituído por 900 pL de meio fresco e 14 mm ² pedaços de cada filme polimérico sólido foram adicionados a cada poço e incubados durante 24 h a 37 °C sob atmosfera umidificada contendo 5 % de CO2. Após o tempo de incubação, os filmes poliméricos e o meio foram removidos dos poços e as células foram lavadas três vezes com PBS. Depois, foram adicionados 600 pL de solução de MTT (0,3 mg/mL) preparada no meio isento de FBS a cada poço e as placas foram incubadas durante 50 min (HeLa) ou 2 h (PC3, HFF-1, a 37 °C. Finalmente, a solução de MTT foi removida dos poços e os cristais de formazan foram dissolvidos em 500 pL de dimetilsulf óxido (DMSO). A placa foi agitada suavemente sob temperatura ambiente durante 20 min e a absorbância foi medida a 570 nm utilizando um leitor de placas (Asys Expert Plus Microplate Reader, Biochrom, EUA). Células sem tratamento foram utilizadas como controle e foram consideradas com 100 % de viabilidade celular. As análises foram realizadas em quadruplicatas e os resultados foram expressos como média ± DP. As diferenças estatísticas entre os grupos foram avaliadas usando análise de variância one-way (ANOVA) seguida pelo teste post-hoc de Tukey. Um valor de P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

[0091] A viabilidade celular de duas linhagens celulares carcinogênicas, célula de carcinoma cervical humano (HeLa) e célula de câncer de próstata humana (PC3) foi avaliada após tratamento com filmes de PVA/PEG, filmes de PVA/PEG-GSNO (2,5% m/m), PVA/PEG-AgNPs (2,5% m/m), filmes de PVA/PEG-GSNO-AgNPs (ambos com 2,5% m/m), como indicado na Figura 9. As células sem tratamento foram utilizadas como um grupo controle para 100% de viabilidade celular.

[0092] Como pode ser observado na Figura 9, para ambas as linhas celulares, os filmes sólidos de PVA/PEG não diminuíram a viabilidade celular. Além disso, a presença de GSNO (2,5% m/m) nos filmes poliméricos diminui a viabilidade celular para ambas as linhas celulares. A viabilidade de células HeLa não foi afetada após o tratamento com filmes de PVA/PEG contendo AgNPs (2,5% m/m) (Figura 9A), enquanto que as células PC3 foram significativamente afetadas pelo mesmo tratamento (Figura 9B). Estes resultados indicam uma sensibilidade seletiva de filmes poliméricos contendo AgNPs a células PC3. Curiosamente, a combinação de GSNO e AgNPs nos filmes PVA/PEG reduziu significativamente a viabilidade de ambas as linhas celulares (Figura 9). Estes resultados sugerem um efeito sinérgico de GSNO e AgNPs para estas duas linhas celulares de câncer.

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