Konversionsreagenz sowie Verfahren und Kit zur Bestimmung des Hämoglobins

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Konver- sionsreagenz (engl, conversion reagent) sowie ein Reagenzien-Kit zur einfachen, schnellen und genauen photometrischen Bestimmung des Gehalts an Hämoglobin (Hb) im Blut, insbesondere im menschlichen Blut. Der Kit umfasst dabei zusätzlich zu dem Konversionsrea- genz noch Standardlösungen zur Kalibrierung der pho- tometrischen Messung und/oder zur überprüfung der Funktionsfähigkeit des Photometers. Weiterhin betrifft die Erfindung ebenso ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut.

Bei nahezu jeder Erkrankung wird in der Medizin der Gehalt an Hämoglobin (roter Blutfarbstoff) im menschlichen Blut bestimmt. Dieser Wert ist für die Beur-

teilung praktisch aller Erkrankungszustände von großer Bedeutung, weil das Hämoglobin den lebensnotwendigen Sauerstoff von der Lunge in jedes Gewebe transportiert. Eine Verminderung dieses Sauerstofftrans- ports ist in jedem Falle schädlich, bei starker Verminderung treten lebensbedrohliche Zustände auf.

Obwohl die Bestimmung des Hämoglobins weltweit unter allen medizinischen Parametern am häufigsten durchge- führt wird, ist sie nach einer von der WHO getroffenen Feststellung gleichzeitig eine der ungenauesten medizinischen Bestimmungsmethoden (Moharram et al . , 2005, Eastern Mediterranean Health Journal, im Druck) . An dieser Situation hat sich offenbar bis zum heutigen Zeitpunkt nichts Grundsätzliches geändert. Nach der umfangreichen Vergleichsstudie von Medina Lara et al . (2005) ist das Problem einer insbesondere für Länder der Dritten Welt uneingeschränkt anwendbaren Hämoglobinbestimmung, die gleichzeitig einfach, schnell, sicher (wenig toxisch) , genau, gegenüber Temperatur- und Feuchtigkeitseinflüsse stabil und gleichzeitig billig sein soll, bislang noch nicht gelöst (Medina Lara A, Mundy C, Kandulu J, Chisuwo L, Bates I (2005) : J Clin Pathol 58: 56-60) .

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, einen Rεagenzien-Kit zur einfachen, schnellen, sicheren, genauen und preisgünstigen Bestimmung des Hämoglobins im menschlichen Blut zu entwickeln, dessen Re- agenzien- und Standardlösungen wenig toxisch sind und auch unter den klimatischen Bedingungen subtropischer und tropischer Regionen der Erde eine so hohe Stabi-

lität besitzen, dass auch bei einer Lagerung unter Umgebungstemperaturen die Anwendbarkeit des Kits im Verlauf von 12 Monaten nach der Herstellung gewährleistet isr . Darüber hinaus soll auch die Anwendung des Kits im Tierblut, z.B. bei Haustieren und bei Weidevieh, ermöglicht werden.

Diese Aufgabe wird durch das gattungsgemäße Konversionsreagenz den kennzeichnenden Merkmalen des An- Spruchs 1, das Verfahren zur photometrischen Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut mit den Merkmalen des Anspruchs 13 und den Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 17 gelöst. Die weiteren abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß wird ein Konversionsreagenz für die photometrische Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut bereitgestellt, das mindestens eine alkalisch reagierende Substanz aus der Gruppe bestehend aus den Alkalihydroxiden, aliphatischen Aminen und bifunktionellen Polyphenolen sowie deren Derivaten mit alkalischer Funktionalität enthält. Ein weiteres wesentliches Bestandteil des Konversionsreagenz ist mindestens ein nichtionisches oder anionisches Detergens .

Das Konversionsreagenz hat die Aufgabe, das in den Erythrocyten einer Blutprobe vorhandene Hämoglobin in möglichst kurzer Zeit (im Bereich von 20 - 100 s) in ein stabiles Endprodukt umzuwandeln, dessen Konzent- ration photometrisch bei einer hierfür geeigneten Lichtwellenlänge bestimmt werden kann.

An die Eigenschaften des Konversionsreagenzes sind damit im einzelnen die folgenden Anforderungen zu stellen. Es muss in der Lage sein,

a. das in den Erythrocyten des Blut vorhandene Hämoglobin durch Zerstörung (Lyse) der Erythrocyten freizusetzen,

b. das freigesetzte Hämoglobin in seine Bestandteile Hämin und Globin zu spalten,

c. das freigesetzte Hämin, dessen Eisen in zweiwertiger Form vorliegt (2+) , zu oxidieren und damit in Hämin (3+) zu verwande1n, und

d. das Hämin (3+) zu komplexieren, so dass eine stabile Komplexverbindung erzeugt wird, deren optische Dichte sich im Verlauf von Tagen nicht relevant verändert .

e. Die Reaktionsgeschwindigkeit für die Umwandlung des Hämoglobins in das stabile Endprodukt muss in ca. 20 bis 100 s ablaufen, d.h., nach dieser Zeit muss ein Messwert erreicht werden, der vom theore- tischen Endwert der Reaktion um maximal 0,5 % abweicht .

f. Das Konversionsreagenz soll weiterhin eine so hohe Nachweisempfindlichkeit für Hämoglobin haben, dass der Messbereich, der bislang üblicherweise zwischen 1,0 und 30 g Hb/dL Blut lag, deutlich unterschritten wird. Die untere Grenze der Hämoglobin-

messung sollte bei ca. 0,05 g Hb/dL Blut liegen.

Die unter f. genannte Anforderung resultiert nicht aus einer klinischen Notwendigkeit heraus, da Hämo- globinkonzentrationen unter ca. 2 g Hb/dL Blut nicht mehr mit dem Leben eines Menschen vereinbar sind. Die Notwendigkeit, im Konzentrationsbereich unter 2 g Hb/dL zu messen, ist im Arbeitsbereich von Blutbanken gegeben, weil hier die Notwendigkeit besteht, gela- gerte Blutkonserven hinsichtlich ihrer uneingeschränkten Verwendbarkeit zu überprüfen. Während der Lagerung über mehrere Wochen tritt in diesen Konserven eine gewisse Hämolyse ein, die mit dem Auftreten von freiem Hämoglobin im Plasma verbunden ist . Wenn dieser Wert zu hoch wird, kann die Blutkonserve nicht mehr zur Blutübertragung verwendet werden. Daher ist es notwendig, diesen Anteil an freiem Hämoglobin mit einer einfachen und gleichzeitig empfindlichen Methode sicher zu erfassen.

Diese Anforderungen an das Reagenz werden dadurch erfüllt, dass das Konversionsreagenz als Basiskomponente eine alkalisch reagierende Substanz aus der Gruppe der Alkalimetallhydroxide wie Natriumhydroxid, KaIi- umhydroxid, etc., aliphatische Amine oder bifunktionelle Polyphenole und deren Derivate mit alkalischer Funktion enthält.

Weiterhin enthält das Konversionsreagenz neben dieser Grundkomponente ein nichtionisches (amphiphiles) oder ein anionisches Detergens einzeln oder in einer beliebigen Kombination, im folgenden als Detergens-Korn-

ponente (n) bezeichnet. Für diese Detergens-Komponente werden im wesentlichen die folgenden nichtionischen Detergentien bevorzugt:

Triton X-100:

4- (1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) phenylpolyethylen- glycol t-Oct-C ₆ H ₄ - (OCH ₂ CH ₂ ) _n OH n = 7-12

Tween 40:

Polyoxyethylen (20 ) sorbitan-monopalmitat; M _r : ca 1.285

Nonidet P 40:

Nonylphenyl-polyethylenglycol

Triton CF 10:

Benzy1-polyethylenglycol- tert-octyl-phenylether; Ben∑yl-polyethylenglycol- (1, 1, 3, 3-tetramethyl- butylphenyl) -ether

Triton X-45:

Polyethylenglykol-4- tert-octylphenyl -ether;

4- (1,1,3, 3-tetramethylbutyl) -phenyl-polyethylen- glycol

Triton X-705:

4- (1,1,3, 3-Tetramethylbutyl)phenylpolyethylen- glycol-Lösung

Brij 35 P:

Polyethylenglycol-dodecylether,- Polyethylen- glycol-laurylether;

Hauptkomponente : Tricosaethylenglycol-dodecyl ether, C ₅₈ HH ₈ O ₂₄

Brij 58 P:

Polyethylenglycol-hεxadecylether; Hauptkomponente : Eicosaethylenglycol-hexadecyl- ether, C ₅₆ H ₁₁₄ O _2I

n= 20

Brij 96 V:

Polyethylenglycol-oleylether;

Hauptkomponente : Decaethylenglycol-oleylether ;

C ₃₈ H ₇₅ On

Thesit :

Polyethylenglycol -dodecylether ; Dodecylpoly (echylenglycolether) _n (n = 9]

Polyvinylpyrrolidon :

Polyvinylpyrrolidon K 15 M _r : 10.000 Polyvinylpyrrolidon K 90 M _r : 360.000

Anionische Detergentien, die als Komponenten für das Hämoglobin-Konversionsreagenz bevorzugt sind, sind z.3. die folgenden Verbindungen:

Alkylsulfonsäuren (Natriumsalze, Monohydrate) , insbesondere :

1-Propansulfonsäure (Natriumsalz, Monohydrat)

C ₃ H ₇ NaO ₃ S-H ₂ O R = CH ₃ CH ₂ CH ₂ - 1-Pentansulfonsäure (Natriumsalz, Monohydrat)

C ₅ H ₁₁ NaO ₃ S-H ₂ O R = CH ₃ (CH ₂ ) ₃ CH ₂ - 1- Hexansulf onsäure (Natriumsalz, Monohydrat) :

C ₆ H ₁₃ NaO ₃ S-H ₂ O R = CH ₃ (CH ₂ ) ₄ CH ₂ - 1-Heptansulf onsäure (Natriumsalz, Monohydrat) C ₇ H ₁₅ NaO ₃ S-H ₂ O R = CH ₃ (CH ₂ ) ₅ CH ₂ - l-0ctansulf onsäure (Natriumsalz, Monohydrat) :

C ₈ H ₁₇ NaO ₃ S-H ₂ O R = CH ₃ (CH ₂ ) _e CH ₂ -

Alkylsulfate (Natriumsalze) , insbesondere:

Octylsulfat (Natriumsalz) :

C ₈ H ₁₇ NaO ₄ S R = CH ₃ (CH ₂ ) ₆ CH ₂ - Decylsulfat (Natriumsalz) :

C ₁₀ H ₂₁ NaO ₄ S R = CH ₃ (CH ₂ ) ₈ CH ₂ -

Dodecylsulf at (Natriumsalz) :

C ₁₂ H ₂₅ NaO ₄ S R = CH ₃ (CH ₂ ) ₁₀ CH ₂ -

4- (2-Hydroxyethyl) -piperazin-1-ethansulf onsäure :

C ₈ H ₁₈ N ₂ O ₄ S

3- (N,N-Dimethyldodecylamino) -propansulf onat : Ci ₇ H ₃₇ NO ₃ S

4-Sulfo-calix [4] aren (Natriumsalz) :

C ₂₈ H ₂₄ - _X Na _x O ₁₆ S ₄ (x = 0-4)

25,26,27, 28-Tetrahydroxy-calix[4] aren- 5, 11, 17,23 ^■ tetrasulfonsäure (Natriumsalz)

-0-Sulfo-ß-cy-clodextrin (Natriumsalz) C ₄₂ H ₆₃ Na ₇ O ₅₆ S ₇

3- [ (3-Cholamidopropyl) -dimethylamino] -propan- sulf onat : C ₃₂ H ₅₈ N ₂ O ₇ S

Cholsäure (Natriumsalz) : C ₂₄ H ₃₉ NaO ₅ -H ₂ O

Dodecylglykosid: C ₁₈ H ₃₆ O ₆

Lauryl - ß-D-maltosid :

Darüber hinaus ist es vorteilhaft, dem Konversionsreagenz weitere Wirkstoffe hinzuzufügen, die eine Reaktionsbeschleunigung der Umwandlung des Hämoglobins in das Endprodukt und/oder eine Stabilisierung des ent- stehenden Komplexes aus Hämin und Detergens bewirken. Dies sind im Einzelnen die folgenden Substanz (grupp) εn:

• anorganische Salze (z.T. sog. chaotrope Salze) wie Ammoniumbromid, Ammoniumchlorid, Natriumjodid, Na- triumchlorat , Natriumjodat , Natriumdisulfid und

Kaliumtetrafluoroborat ;

β Amine wie Triethanolamin, N-substituiertes Dietha- nolamin;

• Sulfonsäuren (und ihre Alkalimetallsalze) wie z.B. Propan- , Pentan-, Hexan-, Heptan-, Octan- , Dode- cylsulfonsäure, 4- (2-Hydroxyethyl) -pipazin-1- ethansulfonsäure, 3- (2-Pyridyl ) -5 , 6-diphenyl- 1,2, 4-triazin-4' , 4 ' ' -disulfonsäure ;

β Phenol, Phenol -Verbindungen sowie Resorcin- Verbindungen wie z.B. bifunkeionelIe Phenole, Re- sorcin, Polyphenole, Polyresorcine, cyclische Phenol- und Resorcinverbindungen wie Calix [4] arene, SuIfocalix [4] arene, ^" Imidazöylcalix [4] arene, Amino- calix [4] arene, 1, 3 -substituierte Imidazoylca- lix[4]arene, 1 , 3 -substituierte Aminocalix [4] arene, substituierte Resorcin [n] arene und Calix [4] aren- Krone 6 ;

* Heterocyclen, insb . N-, S- und O-Heterocyclen mit aliphatischer und aromatischer Struktur wie z.B.

Imidazol, Methylimidazol , Histidin und 1,10- Phenanthrolin;

β Makrocyclen wie Cyclodextrine, insb. α, ß- und γ~ Cyclodextrine , Kronenether, insb. 15 -Krone-5, 18- Krone- 6.

Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut bereitgestellt, bei dem ein Konversionsreagenz, wie es zuvor beschrieben wurde, eingesetzt wird. Vorzugs- weise wird zur externen und internen Qualitätskontrolle eine bestimmte Anzahl Standardlösungen mit definierten Konzentrationen an Chlorhämin eingesetzt, so dass eine Kalibrierung über den relevanten Konzentrationsbereich durchgeführt werden kann.

Erfindungsgemäß wird ebenso ein Kit zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut bereitgestellt, der das zuvor beschriebene Konversionsreagenz und mindestens zwei Standardlösungen mit definiertem Gehalt an Hämin enthält.

Der Hämoglobin-Bestimmungs-Kit besteht z.B.

1. aus ein bis fünf Flaschen mit je ca. 250 bis 2.500 mL des Konversionsreagenzes

und

2. aus zwei bis sechs Standardlösungen mit unter- schiedlicher Konzentration an alkalischem Hämatin, vorzugsweise gelöst in dem Konversionsreagenz nach

1., in Fläschchen mit 1,0 bis 10,0 mL Inhalt.

Der Hämoglobin-Bestimmungs-Kit enthält vorzugsweise sechs Standardlösungen zur Kalibrierung des Messsys- cems .

Diese Standardlösungen enthalten Chlorhämin, gelöst in einem Konversionsreagenz wie unter 1. beschrieben, in solchen Konzentrationen, die den folgenden Hämog- lobin-Konzentrationen entsprechen:

1. 30 g Hämoglobin/L

2. 60 g Hämoglobin/L

3. 90 g Hämoglobin/L 4. 120 g Hämoglobin/L

5. 150 g Hämoglobin/L

6. 180 g Hämoglobin/L

Die Bereitstellung von sechs Standardlösungen mit un- terschiedlichen Hämoglobin-Konzentrationen entspricht: den Empfehlungen der Federal Drug Administration (FDA) der USA zur Kalibrierung und Kontrolle medizinisch-diagnostischer Systeme nach den Erfordernissen der internen und externen Qualitätskontrolle.

Vorzugsweise enthälu der Kit zur Hämoglobin-Bestimmung noch ein Photometer, das die folgenden Eigenschaften aufweist :

• Es handelt sich um ein mobiles, leichtes, robustes Photometer, dessen Bauweise auch den Einsatz in Regionen der Erde mit feucht -heißem Klima erlaubt.

• Die Energieversorgung des Photometers erfolgt wahlweise über einen (wieder aufladbaren) Akku oder über das Netz oder über eine Solarzelle.

β Das Photometer kann im Wellenlängenbereich von 400 bis 650 nm messen.

» Es kann mit Hilfe von bis zu sechs Standardlösun- gen entsprechend bis zu sechs unterschiedlichen

Hämoglobin-Konzentrationen gemäß den Empfehlungen der Federal Drug Administration (USA) geeicht werden.

* Die mit bis zu sechs Standardlösungen erstellte Eichkurve kann im Gerät gespeichert werden und dient als Basis für die Umrechnung der Absorptionswerte der zu untersuchenden Blutproben in Hämoglobin-Konzentrationswerte .

• Es kann mit Hilfe von vorzugsweise zwei Standardlösungen entsprechend zwei unterschiedlichen Hämoglobin-Konzentrationen in seiner Funktionsfähigkeit kontrolliert werden. . . . - . . . . ^β Das Photometer kann mindestens 100 Hämoglobin- Konzentrationswerte unter Kennzeichnung mit fortlaufender Nummerierung speichern.

» Es verfügt über eine Programmierung, die den Benutzer auf eine in regelmäßigen Zeitabständen

durchzuführende Kontrolle der Photometerfunktion und, alternativ, eine durchzuführende Kalibrierung des Photometers mit Hilfe von 6 Standardlösungen hinweist .

In einer der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der anmeldungsgemäße Gegenstand ^~ näher ^=:= eri-ätitert—wenden, ohne diesen auf die hier gezeigten speziellen Ausführungsformen einschränken zu wollen.

Als Beispiele für Rezepturen des Konversionsreagenzes, welche die erforderlichen Kriterien - Stabilität des Konversionsreagenzes, Stabilität des Endprodukts aus Konversionsreagenz und Hämoglobin, hohe Re- aktionsgeschwindigkeit - seien die im Folgenden beschriebenen Zusammensetzungen angegeben.

Anmerkung: Während der ersten 10 s nach Zusammengeben der Konversionsreagenzien mit der Blutprobe ist aus technischen Gründen eine Messung nicht möglich.

Vergleichsbeispiel 1

0,1 mol/L Alkalimetallhydroxid, vorzugsweise Natriumhydroxid

Beispiele mit einem nichtionischen Detergens :

Beispiel 2:

1,25 % (w/v) Triton X-100 0,05 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 2. Die Reaktion erreicht nach 90 - 100 s einen stabilen End- wert .

Beispiel 3 :

2,5 % (w/v) Tricon X-100

0,1 mol/L Natriumhydroxid Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 3. Die Reaktion erreicht nach 90 - 100 s einen stabilen Endwert .

Beispiel 4 :

2,5 % (w/v) Triton CF 10

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 4. Die Reaktion erreicht _, nach 60 - 70 s einen stabilen Endwert .

Beispiel 5:

2,5 % (w/v) Triton CF 10

0,04 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 70 - 80 s erreicht.

Beispiel 6 :

1,25 % (w/v) Triton X-705 0,05 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 6. Die Reaktion erreicht nach 40 - 50 s einen stabilen Endwert .

Beispiel 7:

2,5 % (w/v) Triton X-705

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 30 - 40 s erreicht.

Beispiel 8 :

0,05 % (w/v) Triton X-45

0,05 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 5 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 8. Die

Reaktion erreicht nach 60 - 7O s einen stabilen Endwert .

Beispiel 9:

2,5 % (w/v) Brij 35 P

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 60 - 70 s erreicht.

Beispiel 10 :

1,25 % (w/v) Brij 35 P

0,05 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 10. Die Reaktion erreicht nach 80 - 9O s einen stabilen Endwert .

Beispiel 11: 2,5 % (w/v) Nonidet 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 80 - 90 s erreicht.

Beispiel 12 : 0,05 % (w/v) Nonidet

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 7 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 12. Die Reaktion erreicht nach 60 - 7O s einen stabilen Endwert .

Beispiel 13 : 0,05 % (w/v) Thesit 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. .8 zeigt den zeit.licheji Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 13. Die Reaktion erreicht nach 50 - 6O s einen stabilen End- wert.

Beispiel 14 : 2,5 % (w/v) Thesit 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 80 - 9O s erreicht.

Beispiel 15 :

2,5 % (w/v) PVP K 15 0,1 mol/L Natriumhydroxid Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 40 s erreicht.

Beispiel 16 : 2,5 % (w/v) PVP K 90

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 60 - 70 s erreicht.

Beispiel 17:

0,05 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon K 90

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. ^' 9 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 16. Die

Reaktion ^' erreicht nach ^' (2O ^' s ^" ) 70-90 ^" s ^' einen stabilen ^{" "}

Endwert .

Rezeptur-Beispiele mit einem anionischen Detergens :

Beispiel 18 :

1,0 % (w/v) Cholsäure (Natriumsalz) 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 10 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konvεrsionsreagenz nach Beispiel 17. Die Reaktion erreicht nach 40 s einen stabilen Endwert.

Beispiel 19 :

1,0 % (w/v) Cholsäure (Natriumsalz)

0,04 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 11 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 19. Die Reaktion erreicht nach 80-90 s einen stabilen Endwert .

Beispiel 20:

0,50 % (w/v) Octansulfonsäure

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 12 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 ^' mL Konversionsreagenz nach Beispiel 20. Die

Reaktion erreicht nach 120 s einen stabilen Endwert.

Dieses Rezeptur-Beispiel zeichnet sich im Gegensatz zu den anderen hier beschriebenen Rezeptur-Beispielen durch eine sehr geringe Reaktionsgeschwindigkeit aus, die annähernd vergleichbar mit den gegenwärtig weltweit in Gebrauch befindlichen Konversionsreagenzien

zur Hämoglobinbestimmung auf der Basis von Detergen- tien ist. Zum Vergleich mit den Reaktionskurven der hier beschriebenen Konversionsreagenzien mit mittlerer bis hoher Reaktionsgeschwindigkeit sei zusätzlich die Reaktionskurve des Konversionsreagenzes nach Beispiel 20 unter Einschluss der 10-s-Werte angegeben.

In Fig. 13 ist der zeitliche Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 20 dargestellt unter gleichen Bedingungen wie in Abb. 12, jedoch unter Einschluss der 10-s-Werte in die graphische Darstellung (Absorptionsbereich von 0,3 bis 1,9) .

Rezeptur-Beispiele mit 2 Detergentien (nichtio- nisch/nichtionisch oder nichtionisch/anionisch) :

Beispiel 21: 2,5 % (w/v) Triton X-100 2,5 % (w/v) Tween 40 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 14 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 21. Die Reaktion erreicht nach 40 - 60 s einen stabilen Endwert .

Beispiel 22 : 2,5 % (w/v) Triton X-100 2,5 % (w/v) Tween 40 0,04 mol/L Natriumhydroxid

Fig. 15 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μh Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 22. Die Reaktion erreiche nach 80 - 9O s einen stabilen Endwert .

Beispiel 23:

2,5 % (w/v) Triton X-100 2,5 % (w/v) Triton X-705 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 70 - 80 s erreicht.

Beispiel 24:

2,5 % (w/v) Triton X-100

2,5 % (w/v) Brij 96 V

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 80 - 9O s erreicht.

Beispiel 25:

2,5 % (w/v) Triton X-100 2,5 % (w/v) Thesit 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 90 - 100 s erreicht.

Beispiel 26: 2,5 % (w/v) Triton X-100

2,5 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon K 15 0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkt der Reaktion wird nach 80 - 100 s erreicht.

Beispiel 27: 2,5 % (w/v) Triton X-100

2,5 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon K 90

0,1 mol/L Natriumhydroxid

Ergebnis: Ein stabiler Endpunkc der Reaktion wird nach 70 - 80 s erreicht.

Beispiel 28:

1,25 % (w/v) Triton X-100 0,5 % (w/v) Octansulfonsäure 0,05 mol/L Natriumhydroxid Fig. 16 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 23. Die Reaktion erreicht nach 30 - 40 s einen stabilen Endwert .

Beispiel 29:

1,25 % (w/v) Triton X-100 0,5 % (w/v) Cholsäure 0,04 mol/L Natriumhydroxid Fig. 17 zeigt den zeitlichen Verlauf der Absorption nach dem Zusammenfügen der Blutprobe (20 μL Vollblut) mit 3,00 mL Konversionsreagenz nach Beispiel 29. Die Reaktion erreicht nach 40 - 5O s einen stabilen Endwert .

Neben den bisher diskutierten vorteilhaften Eigenschaften der vorgeschlagenen Konversionsreagenzien

wie Geschwindigkeit der Konversion des Hämoglobins in das Endprodukt und Stabilität des Endprodukts spielt auch die Empfindlichkeit des Konversionsreagenzes eine entscheidende Rolle. Wie oben bereits ausgeführt, sollte die untere Grenze der Nachweisempfindlichkeit für die HämoglobinbeStimmung bei ca. 0,05 g Hb/dL Blut liegen.

Wie in Fig. 18 gezeigt wird, wird auch diese Forde- rung durch das Konversionsreagenz erfüllt, wobei im vorliegenden Beispiel die Zusammensetzung nach Beispiel 3 gewählt wurde. Der Bereich der Lineariuät der Optischen Dichte als Funktion der Hämoglobin-Konzentration reicht bis zu einem Wert von 0,05 g Hämoglo- bin/dL. Dieser Wert stellt somit die untere Grenze der Nachweisbarkeit von Hämoglobin mit dem hier beschriebenen Kit dar.