【발명의 명칭】

진세노사이드 Rg3 , Rg5 및 Rkl을 함유하는 주름 개선용 화장료

【기술분야】

본 발명은 진세노사이드 Rg3 , Rg5, 및 Rkl을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로， 더욱구체적으로 진세노사이드 Rg3 , Rg5 , 및 Rkl을 함유하되 수용성 Rg3(S) 이성질체가 지용성 Rg3(R) 이성질체보다 더 많이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는， 자외선과 적외선에 의한 스트레스 자극에 의해 유발되는 주름 개선에 더욱 효과적인 화장료조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

외부에서부터 받는 물리적인 자극은 인체 내에서 두뇌와 cort i cotrophin— releasing hormone (CRH) , glucocort icoids , epinephr ine와 같은 스트레스 호르몬에 의해 생리적인 스트레스 반웅을 일으킨다. 피부는 외부 자극원으로부터 스트레스를 감지하는 주요 감각 기관으로, 대표적인 자극원은 자외선이며, 자외선에 자주 노출된 피부는 초기 피부 노화를 일으키게 된다. 또한, 자외선은 반복적으로 스트레스 호르몬을 활성화하여 피부에 해를 입힌다. 이는 스테로이드를 피부에 과량 도포하였을 시와 동일하게 진피 섬유 조직의 붕괴와 같은 심한 피부 부작용을 가져오게 된다. 자외선 자극은 사람 피부에서 cort i s 과 같은 glucocort i coids 활성의 주요 원인으로 알려져 있으며， 이와 동반하여 cort i s이을 활성화하는 인체 내 ^' 효소인 Ιΐβ-hydroxysteroid dehydrogenase type 1

( ΙΙβ-HSDl)의 발현을 증가시킨다. 자외선에 의한 ΙΙβ-HSDl의 활성 및 발현 증가는 피부 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 피부 노화 억제를 위한 새로운 타겟으로 주목되고 있다.

노화된 피부에서 나타나는 주름살과 피부의 탄력 감소， 피부 쳐짐 및 건조 현상 등은 대부분 진피에 존재하는 기질단백질의 변화 때문이다. 진피는 피부 내에서 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하고 있기 때문에 노화가 진행될 때 이 부분에 형태적인 변화가 일어나게 되면 주름 생성 및 피부 쳐짐에 결정적인 역할을 하게 된다. 이러한 기질단백질을 분해하는 효소로 Matr ix metal loproteinases (MMPs)가 대표적이며 한 번의 자외선 조사에도 피부 내의 MMPs 활성이 증가되고， 피부 내의 콜라겐 및 기타 기질단백질을 현저하게 분해시켜 피부 노화를촉진하는데 주요한요인으로 작용한다.

최근 광노화의 원인에 대한 새로운 관점으로 적외선으로 인해 발생한 열이 피부 노화에 영향을 미친다는 연구 결과가 발표되고 있다. 적외선의 파장 영역은 750nm ~ 1隱로， 이 중 750~3000nm를 차지하는 근적외선은 피부에 도달하였을 때 열에너지로 변환되어 피부 온도를 증가시킨다. 한 예로 피부세포에 열자극을 주면 콜라겐을 분해하는 효소인 matrix metal loproteinase (MMP)의 발현이 증가하고 콜라겐의 합성이 감소된다.

그동안 주름개선을 위한 소재로는 주로 비타민 C, α-토코페를， 레티놀 및 그의 유도체 등이 화장품 및 의약품에 배합되어 이용되어 왔으나 이들은 제형에 배합되었을 경우 변취 현상이 발생하거나 화학적 안정성이 좋지 못하다는 단점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 최근 천연물 유래 물질들을 이용한주름개선용 화장료조성물의 개발이 각광받고 있으며 이의 발굴을 필요로 한다.

이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과， 자외선과 적외선에 의해 활성된 ΙΙβ-HSDl의 역할이 광노화에 관련이 있음을 인지하고 이를 개선하는 물질을 발굴하고자, 항노화에 효능이 예상되는 진세노사이드를 바탕으로 비교， 선별하였으며， 그 중 진세노사이드 Rg3 ,

Rg5, Rkl의 흔합물의 경우， ΙΙβ-HSDl와 MMP-1 발현 증가를 억제함으로써 피부노화 예방또는 개선 가능성을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.

【발명의 상세한설명】 【기술적 과제】

따라서， 본 발명의 주된 목적은 자외선과 적외선에 의한 스트레스 자극에 의해 유발되는 주름을 ΙΙβ-HSDl의 발현 및 MMP-1의 발현을 억제함으로써 주름 생성을 효과적으로 개선할수 있는 진세노사이드 Rg3 , Rg5, 및 Rkl을 함유하는주름 개선용 화장료조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른목적은수용성 Rg3(S) 이성질체를 지용성 Rg3(R) 이성질체보다 선택적으로 더 많이 포함시킬 수 있는 진세노사이드의 분리 정제 방법을

제공하는데 있다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 한 양태에 따르면, 진세노사이드 Rg3, Rg5, 및 Rkl을 함유하는 화장료 조성물에 있어서， 수용성 Rg3(S) 이성질체가 지용성 Rg3(R) 이성질체보다 더 많이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서， 상기 주름은 자외선과 적외선에 의한 스트레스 자극에 의해 유발되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 상기 용어 스트레스 자극은 내 -외부 요소에 의한 유해한 자극이 피부에서 스트레스 호르몬 (글루코코르티코이드)을 증가시켜 주름을 유발하는 것을 말한다. 본 발명에서는자외선과 적외선에 의한스트레스자극에 의한 것을 의미한다.

진세노사이드는 인삼 등에서 추출되는 유효 성분을 말하는 것으로， 종래에 항암， 아토피， 항염， 항노화 등과 같은 효과가 알려져 있으나， 본원발명과 같이 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 복합물이 자외선과 적외선에 의한 스트레스 자극에 의해 유발되는주름 개선효과에 대해서는 알려진바 없다.

본 발명에 있어서， 상기 진세노사이드는 인삼 또는 흥삼 추출물을 효소분해하여 얻어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 진세노사이드를 종래 일반적으로 알려진 끓이거나 삶는 방식이 아닌 효소전환 방식으로 분리 정제하여 수용성 Rg3(S) 이성질체가 지용성 Rg3(R) 이성질체보다 3배 이상 많이 포함 시킬 수 있다. 바람직하게는， 상기 효소분해는 아스퍼질러스 (Aspergi l lus sp . ) 유래 베타-글리코시다제 ( β -glycosidase)로 분해시키는 것을특징으로 한다.

본 발명에 있어서， 상기 인삼또는흥삼추출물은 종래에 사용되어진 어떠한 용매로도 추출될 수 있으며， 바람직하게는 물， 무수 또는 함수의 메탄을， 에탄을， 프로필 알코올, 부틸 알코올, 글리세린, 프로필렌 글리콜， 부틸렌 글리콜， 또는 이들의 흔합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서， 상기 추출물은 종래에 사용되어진 어떠한 추출방법으로 추출할 수 있으며， 추출용매를 이용한 추출방법으로는 통상적인 식물의 추출방법 예를 들면， 열수 추출， 환류넁각 추출， 초음파 추출， 초임계 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 상기한 추출액은 농축액의 형태 또는 동결 건조시켜 분체화 시킨 형태일 수도 있다.

본 발명에 있어서， 상기 진세노사이드는 상기 효소분해의 결과물을 메타아크릴계 수지가 층진된 컬럼에 통과시켜 통과액을 제거한 후 에탄올로 탈착시켜 얻어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 효소분해 및 메타아크릴계 컬럼을 통한 분리 정제에 의해 진세노사이드 Rg3 , Rg5 , 및 Rkl의 복합물을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서， 상기 진세노사이드 Rg3 , Rg5 , 및 Rkl의 복합물은 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 10 중량 % 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 범위에서 0.01 중량 % 미만일 경우 광노화 억제 효과가 미약하게 될 우려가 있어 바람직하지 못하며， 역으로 10중량 %를 초과하는 것은 경제성 측면에서 바람직하지 못할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 lip-HSDl( llp-hydroxysteroid dehydrogenase type 1) 및 MMP— KMatr ix metal loproteinase-1) 활성 저해에 의해 주름 개선 효과를 갖는 것을특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면， UVB또는 IRA를조사하고 진세노사이드 Rg3 , Rg5 ,

Rkl 복합물을 처리한 군이 이를 처리하지 않은 군보다 ΙΙβ-HSDl 및 MMP-1의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때， 본 발명의 진세노사이드

Rg3, Rg5, Rkl 복합물이 ΙΙβ-HSDl 활성을 억제함으로써 피부에서의 스트레스를 완화함과 동시에 MMP-1의 발현을 저해함으로써 주름 개선 효과를 나타낼 수 있음을 알수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며， 바람직하게는 스킨로션， 스킨 소프너, 스킨토너， 아스트린젠트， 로션， 밀크로션， 모이스쳐 로션， 영양로션， 맛사지크림ᅳ 영양크림, 모이스쳐크림， 핸드크림, 파운데이션, 에센스， 영양에센스， 팩， 비누， 클렌징품, 클렌징로션， 클렌징크림， 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 제형에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다.

【발명의 효과】

전술한 바와 같이， 본 발명에 따르면 진세노사이드를 일반적인 끓이거나 삶는 방식이 아닌 효소전환 방식으로 분리 정제하여 수용성 Rg3(S) 이성질체가 지용성 Rg3(R) 이성질체보다 3배 이상 많이 포함시킬 수 있다. 또한， 본 발명의 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 자외선과 적외선에 의해 과발현된 ΙΙβ-HSDl 및 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제시킴으로써 피부에서의 스트레스를 완화하고 주름을 개선하는 데 우수한 효과를 나타낸다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 UVB에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 처리 시

ΙΙβ-HSDl 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 1의 결과이다.

도 2는 UVB에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3 , Rg5 , Rkl 처리 시 Cort i sol 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 1의 결과이다.

도 3은 UVB에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3 , Rg5, Rkl 처리 시 MMP-1 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 1의 결과이다. 도 4는画에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 처리 시 type 1 procollagen 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 1의 결과이다.

도 5는 IRA에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 R _g 3, Rg5, Rkl 처리 시

ΙΙβ-HSDl 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 2의 결과이다. 도 6은 IRA에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 처리 시 Cortisol 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 2의 결과이다.

도 7은 IRA에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 처리 시 MP-1 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 2의 결과이다.

도 8는 IRA에 노출된 사람 섬유아세포에 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 처리 시 type 1 procollagen 발현에 미치는 영향을 측정한 실험예 2의 결과이다.

도 9는 실시예 1의 시료를 HPLC법에 따라 시험하여 얻는 크로마토그래프이다.

【발명을 실시하기 위한 형태】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 실시예 1: 시료의 제조

인삼 또는 흥삼 1kg을 50% 주정 (에탄을)용액 10L에 넣고 추출 (80 ^o C,

48시간)한 후 추출용액을 별도로 취하고 감압농축기를 이용하여 주정을 제거한 후 수분 함량 35%, 총 492g으로 농축한다. 농축액 (492g)을 10L 완층용액 (Acetic aicd-Na ₂ HP0 ₄ buffer, H 3.0, lOOmM)에 녹인 후 Aspergillus sp. 유래 β-glycosidase를 첨가하여 70°C에서 반웅시킨 후， 상징액을 메타아크릴계 수지 (다이아이온 HP2MG) 2L가 충진된 컬럼에 통과시켜 통과액을 제거한 후 10L 에탄을로 탈착시켜 주정 (에탄을) 층을 감압농축하여 표 1과 같은분말 (진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl 등) 51g을 얻었다. 상기의 얻어진 추출 분말을 용해제로서 DMSOCDimethyl sul foxide)에 0.1 Mg/ml 및 1 g/ml의 농도로 용해시켜 이하의 실험예에 사용하였다.

【표 1】

또한， 상기 분말을 메탄을에 녹인후 옥타데실실릴화한 실리카겔로 층전한 스테인레스 칼럼에 물:아세토니트릴 =18 :20-15:85 Gradient 이동상으로 l .OmL/분의 유량으로 HPLC법에 따라 시험하여 도 9와 같은 크로마토그래프를 얻었으며， 이를 아래와 같이 계산하여 표 2과 같은각 진세노사이드의 함량 ( 를 구하였다.

[계산과정]

I 각진세노사이드의양 (%) = X ^ ^Τ X x 100 P j 검제의양 (9)

각진 A노사여 = a 품의양 (g)

AT 검^의각진세노사 o| c피 a면적

A _S S쭌 «!의각진세노사아드피크연적

25/2! 검¾의 ¾석¾¾/¾^액의

상기 표 2에서 보여지듯이， 실시예 1에 따른 시료는 진세노사이드 R _g 3 , Rg5, 및 Rkl을 포함하나， 진세노사이드 Rg3(S)가 진세노사이드 Rg3(R)보다 함량 (%)가 3배 이상 많은 것을 알수 있다. 실험예 1 : 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl의 画에 의한 광노화 스트레스 억제 효과

상기 제조한 실시예 1을 사용하여 사람 섬유아세포에서 진세노사이드 Rg3 , Rg5, Rkl의 UVB로 유도된 ΙΙβ-HSDl과 MMP-1 메신저 RNA 발현저해 효과를 확인하기 위해 사람섬유아세포를 6 wel l 세포 배양 접시에 4X10 ⁵ 의 밀도로 접종한후 37°C , 5%

C0 ₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. UVB를 15mJ 조사한 후 추출물 혹은 ΙΙβ-HSDl 저해제인 PF915275 이하 PF)를 대조군으로 첨가하여 24 시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, DAKARA, 일본) 1 을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260ran에서 RNA를 정량한 후， cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국) . RT— PCR은 PCR기계 (Step One Plus , Appl ied Biosys terns , 미국)를 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Appl ied

Biosystems , 미국)을 ΙΙβ-HSDl 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 에세이하였다. 프라이머와 반웅 조건은 하기의 표 3과 같았으며， ΙΙβ-HSDl과 MMP-1 유전자의 발현양은 β-act in유전자에 대해 보정을 하여 나타내었다.

【표 3】

ΙΙβ-HSDl F 5 ' -AAGCAGAGCAATGGAAGCAT-3 ' 94 ⁰ C에서 5분 동안 중합효소 활성화， 95 ⁰ C 30초 , 50°C 1분 , 72°C

1분간 40사이클로 중합반웅

Πβ-HSDl R 5 ' -GAAGAACCCATCCAAAGCAA-3 ' 94 ⁰ C에서 5분 동안 중합효소 활성화， 95°C 30초， 50°C 1분， 72°C

1분간 40사이클로 증합반웅

MMP-1 F 5 ' -AAGCGTGTGACAGTAAGCTA-3 ' 94 ⁰ C에서 5분 동안 중합효소 활성화， 95°C 30초， 50°C 1분， 72°C

1분간 40사이클로 중합반웅

MMP-1 R 5 ' -AACCGGACTTCATCTCTG-3 ' 94°C에서 5분 동안 중합효소 활성화, 95 ⁰ C 30초， 50 ^o C 1분， 72°C

1분간 40사이클로 중합반웅 또한， 상기 제조한 실시예 1을 사용하여 사람 섬유아세포에서 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl의 UVB로 유도된 cor t is 과 type 1 procol lagen 발현저해 효과를 확인하기 위해 사람 섬유아세포를 6 wel l 세포 배양 접시에 4X10 ⁵ 의 밀도로 접종한 후 37 ⁰ C , 5 C0 ₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. UVB를 15mJ 조사한 후 추출물과

ΙΙβ-HSDl 저해제인 PF를 대조군으로 첨가하여 24 시간 동안 추가 배양하고 배지를 회수하였다. 회수한 배지는 12 ,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 불순물을 제거하고 Cort i sol ELI SA( Enzyme一 1 inked immunosorbent assay) ki t (R&D system, 미국)와 type 1 procol lagen EIA(Enzyme i睡 uno assay) ki t (DAKARA, 일본)를 이용하여 에세이 하였다.

그 결과， 도면 1 내지 4에 나타낸 바와같이 진세노사이드 Rg3 , Rg5, Rkl에서 농도 의존적으로 UVB에 의해 증가한 ΙΙβ-HSDl , Cort i sol , MMP-1의 저해와 type 1 procol lagen의 회복 효능을 확인하였다. 도면에서， (-)는 UVB를 조사하지 않은 것이고, (+)는 UVB를 조사한 것이고， PF는 UVB를 조사한 후 PF를 첨가한 것이고， Ginsenoside는 UVB를조사한후 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl를 첨가한 것이다. 실험예 2: 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl의 IRA에 의한 광노화 스트레스 억제 효과

상기 제조한 실시예 1을 사용하여 사람 섬유아세포에서 진세노사이드 Rg3 ,

Rg5, Rkl의 IRA로 유도된 ΙΙβ-HSDl와 MMP-1의 mRNA 발현저해 효과를 확인하기 위해 상기의 실험예 1에 기술한 방법과 동일한 방법으로 사람 섬유아세포를 배양하여 IRA를 조사하고 실험용 시료 (실시예 1) 혹은 PF를 첨가한 후 24 시간 추가 배양하여 ΙΙβ-HSDl와 MMP-1의 메신저 RNA 발현양을 확인하였다. 프라이머와 반웅 조건은 상기의 표 3과 같으며， ΙΙβ-HSDl와 MMP-1 유전자의 발현양은 β-act in 유전자에 대해 보정을하여 나타내었다.

또한， 진세노사이드 Rg3 , Rg5, Rkl의 IRA로 유도된 cort i s 과 type 1 procol lagen 발현저해 효과를 확인하기 위해 상기의 실험예 1에 기술한 방법과 동일한 방법으로 사람 섬유아세포를 배양하여 IRA를 조사하고 실험용 시료 (실시예 1) 흑은 PF를 첨가한 후 24 시간 추가 배양하여 cort is 과 type 1 procol lagen 단백질 발현양을 확인하였다.

그 결과， 도 5 및 7에 나타낸 바와 같이 진세노사이드 Rg3 , Rg5, Rkl에서

ΙΙβ-HSDl과 MMP-1 의 메신저 RNA 저해 효능을 나타냄과 동시에 도 6 및 8에 나타낸 바와 같이 Cort i sol 저해와 type 1 procol lagen 회복 효능을 보였다. 도면에서 (―)는 IRA를조사하지 않은 것이고， (+)는 IRA를조사한 것이고， PF는 IRA를 조사한 후 PF를 첨가한 것이고, Ginsenoside는 UVB를 조사한 후 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rkl를 첨가한것이다. 제형예 1: 토너제의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 소재를 함유하는 토너제를 하기의 표 4에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라통상적인 방법으로 제조하였다. 【표 4】

제형예 2: 로션제의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 소재를 함유하는 로션제를 하기의 성분 및 조성비에 따라통상적인 방법으로 제조하였다.

【표 5】

카르복실비닐폴리머 0.2 아르기닌 0.2 방부제 미량 향료 미량 정제수 잔량 제형예 3: 크림제의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 소재를 함유하는 크림제를 하기의 성분 및 조성비에 따라통상적인 방법으로 제조하였다.

【표 6]

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