DESHIDROGENASA TIPO 1 (11B-HSD1)

Memoria descriptiva

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos derivados de adamantiloxadiazoles y sus solvatos, hidratos y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, por ser útiles como inhibidores efectivos y selectivos de la actividad reductasa de la enzima 11-beta hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (11b- HSD1). En particular, se divulga el uso de compuestos derivados de adamantiloxadiazoles y sus sales farmacéuticamente aceptables por ser útiles en el tratamiento de enfermedades y condiciones vinculadas al aumento de cortisol mediado por la actividad reductasa de la enzima I Ib-HSDl, entre estas enfermedades se incluyen sin limitarse, hipertensión, obesidad, dislipidemia, diabetes de tipo 2, resistencia a la insulina, glaucoma, síndrome metabólico, desórdenes cognitivos, osteoporosis, depresión, desórdenes immmológicos, entre otras condiciones. Se dispone también de un proceso para producir los compuestos derivados de adamantiloxadiazoles.

Antecedentes del estado de la técnica

Los glucocorticoides (GC) son hormonas esteroideas vinculadas a la regulación de diversos procesos fisiológicos y metabólicos, tales como la respuesta al estrés físico y emocional. Estas hormonas producidas por la corteza adrenal pueden ser sintetizadas de forma artificial y ser utilizados como fármacos antiinflamatorios, antialérgicos e inmunosupresores derivados del colesterol o hidrocortisona. La molécula glucocorticoide más importante es el cortisol, la cual es producida y liberada tras la activación del eje hipofisosuprarrenal. Este eje es activado luego de un periodo de estrés, como, por ejemplo, al estar expuesto a una agresión física. Al activarse, el hipotálamo segrega el factor liberador de corticotropina (CRF), que va a actuar sobre la hipófisis para que ésta libere la hormona adenocorticotropa (ACTH), la cual media la activación de la glándula suprarrenal para la liberación de corticoides, dentro de ellos el cortisol. Una vez en el torrente sanguíneo, el cortisol permanece unido a proteínas del plasma sanguíneo tales como la globulina fijadora de cortisol (CBG) y la albúmina, y otro tanto circula en su forma libre (10-15%) (Kadmiel M. y Cidlowski JA., 2013). Una vez en el tejido objetivo, la acción y concentración de glucocorticoides depende del sistema enzimático 11-beta deshidrogenasa, que incluye las enzimas 11-beta hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (I Ib-HSDl) y tipo 2 ( 1 1 (i-HSD2). La isoforma 1 se expresa mayoritariamente en hígado, músculos lisos vasculares, tejido adiposo, cerebro y páncreas, y la isoforma 2 se encuentra mayormente localizada en colon y riñón.

La enzima 11 b-H SD 1 cataliza la conversión de cortisona (molécula fisiológicamente inactiva) a cortisol por medio de una reacción de óxido -reducción dependiente de la coenzima NADPH. La reacción mediada por la enzima I Ib-HSD l es una reacción bidireccional, actuando como una enzima hidroxiesteoide reductasa cuando cataliza la conversión de cortisona a cortisol, aumentando los niveles intracelulares de glucocorticoides. La enzima se encuentra asociada al receptor de glucocorticoides, permitiendo que el cortisol producido se una rápidamente al receptor de glucocorticoides y ejercer su acción.

De acuerdo a estudios previos, se ha observado que modelos murinos que tienen una sobreexpresión hepática del gen codificante de la enzima I Ib-HSDl, presentan un fenotipo de hipertensión (aumento de la presión sanguínea) y un aumento de las concentraciones de la hormona aldosterona (Masuzaki H. el al. 2003). Por otro lado, estudios en ratas con fenotipo obeso (rata Zucker) permiten concluir que en condición de obesidad existe una actividad exacerbada de la actividad hidroxiesteroide reductasa de la enzima (Livingstone DEW. et al., 2000).

In vivo se ha observado que la acción hidroxiesteroide reductasa es predominante en el tejido hepático, músculo y tejido adiposo, promoviendo la conversión de cortisona a cortisol, aumentando significativamente las concentraciones de glucocorticoides en estos tejidos (Tomlinson JW. et al., 2004).

El aumento de la concentración intracelular de cortisol puede producir el aumento de la producción de glucosa en el hígado, promover el aumento de la diferenciación de adipocitos y producir resistencia a la insulina. En este sentido, el aumento de las concentraciones de cortisol a nivel intracelular en tejidos de importancia metabólica, ha sido asociados al desarrollo de enfermedades como obesidad, diabetes, hipertensión arterial, síndrome metabólico, entre otras (Wake D. J. y Walker B.R, 2004; Walker B.R., 2006).

• Inhibidores enzima 1 Ib-HSD 1

Se han descrito previamente diversos compuestos inhibidores de la enzima I I b-HSDl, ios documentos EP 1474139, WO/2006/000371, WO/2006/024628, US2009022763 L EP1814846, US8188288, EP 1801098, WO/2007/068330, EP2044004, WO/2007/145835, WO/2007/145835, WO/2008/052638, EP 1935420, US7329683, WO 2010139827 Al, EP1918285, US20100069365, US20100022597, US201002223 16 Al son sólo ejemplos de documentos referidos a compuestos inhibidores de esta enzima.

El documento WO/2006/100502 divulga compuestos de fórmula (I): R'-Z-R ² por ser útiles como inhibidores de la enzima 1 Ib-HSDl. En una de las formas de la invención, el compuesto de fórmula (I) corresponde a un derivado de adamantiloxadiazoi, sin embargo, este compuesto incluye adicíonalmenie en su estructura un grupo tiofeno, siendo estructuralrnenre diferente de los compuestos parte del alcance de la presente invención.

A pesar de existir diversos compuestos inhibidores para la enzima I Ib-HSDl, los compuestos previamente descritos centran su mecanismo de acción y selectividad respecto de las isoformas 1 y 2 de la enzima I Ib-HSD l, apuntando a inhibir por completo la acción de la isoforma 1, sin discriminar el tipo de reacción enzimática (acción como reductasa o como deshidrogenasa). El documento WO 2006000371 A2, por ejemplo, presenta compuestos derivados de pirimidina como inhibidores de la enzima I Ib-HSDl los que tienen actividad selectiva frente a la isoforma 2 de la enzima, sin hacer referencia a la selectividad del inhibidor respecto de la acción reductasa o deshidrogenasa (oxidasa) de la enzima I Ib-HSD l.

Los inhibidores descritos en la presente solicitud, presentan actividad inhibitoria sobre la acción reductasa de la enzima I Ib-HSD l, aumentan la actividad oxidasa de la misma, y al mismo tiempo, no inhiben la acción de la enzima 1 i -HSD2.

Por otra parte, los inventores han identificado nuevos compuestos inhibidores que además de ser específicos y selectivos de las actividades de la enzima 1 Ib-HSDl, logran el efecto terapéutico deseado con concentraciones menores que las utilizadas para otros fármacos inhibidores. Por ejemplo, en el documento W02006100502 Al se presenta la información de inhibición de los compuestos ahí descritos, los que son efectivos a dosis de 10mM. Los compuestos de fórmula (I) descritos en la presente solicitud, presentan actividad inhibitoria con dosis del orden nM (100 nM).

En definitiva, los compuestos de fórmula (I) presentan actividad inhibitoria de la enzima I Ib-HSD l de forma selectiva y específica por su actividad reductasa, utilizando menos concentraciones para generar el efecto terapéutico deseado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos del tipo adamantiloxadiazoles de fórmula (I) y su solvatos, hidratos y sales farmacéuticamente aceptables del mismo: porque L se selecciona independientemente de un átomo de Carbono o Nitrógeno, Ri, R2 y R3 se seleccionan independientemente de un átomo de Hidrógeno, F, Br, Cl, NO2, un grupo alquilo C1-4 lineal o ramificado, o un grupo OR, donde R es H o un grupo alquilo Cw lineal o ramificado. Ejemplos de compuestos preferidos de fórmula (I) son:

BD-31 : 1 -fenil-2-(3 -adamantil- 1 ,2,4-oxadiazol-5 - BD-32: l-(4-Metoxyifenil)-2-(3-adamantil- il)etano l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

BD-34: 1 -(4-fluorofenil)-2-(3 -adamantil-

BD-33: : l-(4-clorofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

oxadiazol-5 -il)etano

BD-35: 1 -(4-bromofenil)-2-(3-adamantil- 1,2,4-

BD-36 : 1 -(4-metilfenil) -2-(3 -adamantil- oxadiazol-5 -il)etano

l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

BD-37: l-(4-hidroxifenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- BD-38: l-(3-metoxifenil)-2-(3-adamantil- oxadiazol-5-il)etano l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

BD-40 : 1 -(3 -metilfenil) -2-(3 -adamantil-

BD-39: l-(4-piridil)-2-(3-adamantil-l,2,4- l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

oxadiazol-5 -il)etano

BD-41: l-(4-tert-butilfenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- BD-42 : 1 -(3 -fluorofenil)-2-(3 -adamantil- oxadiazol-5 -il)etano l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

BD-44: l-(3-piridil)-2-(3-adamantil-l,2,4-

BD-45: l-(2-piridil)-2-(3-adamantil-l,2,4- oxadiazol-5 -il)etano

oxadiazol-5 -il)etano

BD-46: l-(4-nitrofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- oxadiazol-5 -iljetano

El objeto de la presente invención es proveer nuevos compuestos inhibidores de la enzima 11-beta deshidrogenasa tipo 1. Particularmente, los inventores han identificado, sintetizado y caracterizado compuestos del tipo adamantiloxadiazoles que presentan ventajas comparativas respecto de otros compuestos inhibidores de la enzima IIb-HSDl en cuanto a su especificidad por la actividad reductasa de la enzima y su selectividad respecto de las isoformas 1 y 2 ( 1 1 (i-HSD2). En este sentido, los compuestos descritos en la presente solicitud, presentan actividad inhibitoria sobre la acción reductasa de la enzima 1 Ib-HSDl, aumentan la actividad oxidasa de la misma, y al mismo tiempo, no afectan la acción de la enzima 11b-H802.

Los inventores han identificado nuevos compuestos inhibidores específicos y selectivos de la actividad reductasa de la enzima I Ib-HSDl de tal manera de lograr el efecto terapéutico deseado por medio de concentraciones del orden mM.

Los compuestos de fórmula (I) parte del alcance de la invención, incluyen tanto sus formas no solvatadas como formas solvatadas, incluyendo sus hidratos, por ejemplo, hemihidratos.

Es también objetivo de la presente invención, disponer de composiciones farmacéuticamente aceptables que comprendan compuestos del tipo adamantiloxadiazoles de fórmula (I).

El alcance de la presente invención incluye el uso de compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, y composiciones farmacéuticamente aceptables que los comprendan, por ser útiles como inhibidores selectivos de la enzima I Ib-HSDl. Adicionalmente, se divulga el uso de compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, y composiciones farmacéuticamente aceptables que los comprendan, por ser útiles en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de condiciones y enfermedades asociadas con la actividad de la enzima I Ib-HSDl, tales como hipertensión, obesidad, dislipidemia, diabetes de tipo 2, resistencia a la insulina, glaucoma, síndrome metabólico, desórdenes cognitivos, osteoporosis, depresión, desórdenes inmunológicos, entre otras condiciones.

La presente invención incluye además un proceso para preparar los compuestos derivados de adamantiloxadiazoles.

Descripción figuras

Figura 1.- Niveles BD40 (nM) detectado en plasma y otros tejidos a distintos periodos de tiempo, dosis IV (2 mg/Kg). Concentración detectada de BD-40 en por medio de análisis de punto único por LC-

MS/MSen diferentes tejidos: corresponde a análisis en plasma, corresponde a análisis en tejido de cerebro, corresponde a análisis en hígado, -^· corresponde a análisis en grasa epidídimo y corresponde a análisis en músculo.

Figura 2.- Niveles BD40 (nM) detectado en plasma y otros tejidos a distintos periodos de tiempo, dosis VO (10 mg/Kg). Concentración detectada de BD-40 en por medio de análisis de punto único por LC-

MS/MSen diferentes tejidos: corresponde a análisis en plasma, corresponde a análisis en tejido de cerebro, corresponde a análisis en hígado, corresponde a análisis en grasa epidídimo y corresponde a análisis en músculo.

Figura 3.- Gráfico resumen niveles de compuesto BD-44 detectado en plasma a distintos tiempos, dosis

IV (2 mg/Kg) y VO (10 mg/Kg). corresponde a detección dosis IV y corresponde a detección en dosis PO.

Definiciones

En la presente invención, cuando se refiere a sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sales no tóxicas, preparadas a partir de la adición de una base o ácido apto para su administración en mamíferos, en particular, humanos. Entre las sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sales derivadas de la adición de bases orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables, y ácidos orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables. Sales derivadas de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse, ácido acético, benzoico, benceno sulfónico, canfosulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico, xinafoico y similares. Particularmente, son sales preferidas las sales derivadas de los ácidos fumárico, bromhídrico, clrhídrico, acético, sulfúrico, metanosulfónico, xinafoico y tartárico.

Sales derivadas de la adición de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse, a sales de aluminio, amonio, calcio, sodio, zinc y similares. Se prefiere, sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio.

Sales derivadas de la adición de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitarse, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo aminas sustituidas, aminas cíclicas, aminas de origen natural y similares, tales como, arginina, betaína, cafeína, colina N,N'- dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucosamina, histidina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.

En la presente invención, cuando se refiere a solvatos, entre ellos hidratos u otro tipo de solvatos, estos son formados a partir del contacto de la forma no solvatada de compuestos de fórmula (I) y sus sales farmacéuticamente aceptables con un solvente. Solventes representativos incluyen, sin limitarse, agua, etanol, metanol, isopropanol, ácido acético y otros similares. Particularmente, cuando el solvente corresponde a agua, el solvato formado es un hidrato.

Cuanto se refiere a“enfermedad o condiciones asociada con la actividad de la enzima I Ib-HSDl” considera todos los estados de enfermedad y/o estados que son reconocidos en la actualidad o que se encuentren en un futuro vinculados con el aumento de la actividad de la enzima 1 Ib-HSD 1, y por tanto, con el aumento de los niveles tisulares de cortisol. Las enfermedades y condiciones descritas incluyen, sin limitarse, hipertensión, obesidad, dislipidemia, diabetes tipo 2, resistencia a la insulina, síndrome metabólico, glaucoma, osteoporosis, desórdenes cognitivos, depresión, ansiedad, desórdenes inmunológicos, y condiciones similares asociadas al aumento de los niveles de cortisol producidos por la enzima I Ib-HSD l.

El término“cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente en necesidad de tratamiento.

En la presente invención, cuando se hace referencia a“tratamiento” se refiere al tratamiento de una enfermedad, condición patológica o estado médico en un paciente humano que incluye: (a) Prevenir el desarrollo de la enfermedad o condición como tratamiento profiláctico del paciente;

(b) Aliviar la enfermedad o condición, provocando la regresión de ésta;

(c) Suprimir la enfermedad o condición médica, ralentizando el grado de desarrollo de ésta en un paciente; o

(d) Disminuir o aliviar los síntomas asociados a la enfermedad o condición médica en un paciente.

Ejemplos de aplicación

Ejemplo 1: Síntesis y caracterización compuestos de fórmula (I)

En este ejemplo se presenta la síntesis química del compuesto precursor para la síntesis de compuestos de fórmula (I) que forman parte de la presente invención, y la síntesis de ejemplos de nuevos compuestos derivados de adamantiloxadiazoles de fórmula (I) que forman parte de su alcance.

- Síntesis y caracterización compuesto precursor adamantilamidoxima (1)

Se preparó una mezcla de hidrocloruro de hidra xilamina (2,59 g, 37,2 mmol) y carbonato de sodio (3,93 g, 37,1 mmol) en etanol (10 mL) y glicerol (10 mL), la cual se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Luego, se preparó una solución de cianoadamantano (2,00 g, 12,4 mmol) y clorara de aluminio (0,25 g, 1,86 mmol) en etanol (30 mL), se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, y se añadió gota a gota sobre la mezcla de hidroxilamina-carbonato. La suspensión blanca resultante se agitó vigorosamente en condiciones de reflujo durante 10 h. El progreso de la reacción se controló mediante TLC empleando vapor de yodo como agente revelador. Después de 10 h, el etanol residual se eliminó por filtración al vacío. El residuo se reparte con agua y diclorometano, y la fase acuosa se extrae adicionalmente con diclorometano. La fase orgánica resultante se lavó con salmuera y se secó con sulfato de sodio anhidro, obteniéndose un producto de color blanco. Este producto de color blanco se purificó por recristalización empleando una mezcla de acetona-hexano, generándose cristales incoloros correspondientes a adamantilamidoxima (1). El rendimiento de la síntesis fue del 85%. Punto de fusión compuesto (1): 210 - 215 °C. IR (KBr) cm ¹ : 3505 (N-H), 3405 (free O-H), 3218 (H-bonded O-H), 2908-2850 (C-H sp3); 1645 (C=N), 1582 (NH2), 1454 (CH2), 1357 (C-N). ¹ H-RMN(ppm) (400 MHz,

CDC13) d: 4,51 (s, 2H, -NH2); 1,98 (bs, 6H, H-l); 1,80 (bs, 3H, H-2); 1,67 (m, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC13) d: 159,6; 39,7; 36,6; 36,5; 28,1. Masa molecular calculada: 194,1419 g/mol; Masa molecular observada: 194,1413 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-31: l-fenil-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol-5-il)etano

Se preparó una solución de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (497 mg, 2,83 mmol) en 1,4- dioxano (10 mL) y se agitó a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota N-metilmorfolina (849 pL, 7,72 mmol) y la mezcla se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadió una solución de ácido 3-fenilpropiónico (425 mg, 2,83 mmol) en 1,4-dioxano (5 mL), y la mezcla resultante se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Después, se añadió una solución del compuesto precursor adamantilamidoxima (1) (500 mg, 2,57 mmol) en 1,4-dioxano (5 mL) y la mezcla resultante se agitó vigorosamente en condiciones de reflujo durante 3 h. El progreso de la reacción se controló por TLC. Después de 3 h, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añadió una solución al 5% de carbonato sódico. El producto se extrajo con diclorometano. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro y el disolvente se eliminó por vacío.

El producto crudo resultante se purificó por cromatografía en columna de gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n-hexano como eluyente. Como etapa de purificación adicional, el producto se purificó mediante cromatografía en capa fina empleando n-hexano como eluyente, obteniéndose un gel incoloro. Punto de fusión: producto en estado gel. IR (KBr) cm ¹ : 3086-3028 (=C- H sp ² Ar), 2917-2850 (C-H sp ³ ), 1579 (C=N), 1497 (C=C Ar), 1453 (CH ₂ ), 1349 (C-N), 1304-1026 (C- O). Ή-IIMN (ppm) (400 MHz, CDCL) d: 7,31 (dd, 2H, H-l”); 7,23 (dd, 3H, H-2”, H-3”); 3,16 (m, 4H, H-L, H-2’); 2,07 (m, 9H, H-l, H-2); 1,81 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDCL) d: 178,2; 177,0; 139,6; 128,6; 128,3; 126,6; 40,2; 36,5; 34,3; 32,8; 28,6; 28,0. Masa molecular calculada: 308,1889 g/mol; Masa molecular observada: 308,1883 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-32: l-(4-metoxifenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- oxadiazol-5 -il)etano Preparado a partir de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (248 mg, 1,42 mmol), N-metilmorfolina (424 pL, 3,87 mmol), ácido 3- (4-metoxifenil) propiónico (255 mg), 1.42 mmol) y compuesto precursor (1) (250 mg, 1.29 mmol). Se obtuvo un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n-hexano como eluyente, proporcionando un sólido blanco. El rendimiento de la reacción fue de un 42%. Punto de fusión: 48 - 53°C. IR (KBr) cnf ¹ : 3066-3003 (=C-H sp ² Ar), 2908-2850 (C-H sp ³ ), 1588 (C=N), 1612 (C=C Ar), 1451 (CH ₂ ), 1391 (CH ₃ ), 1346 (C-N), 1301 (C-O). ^-RMN/ppm) (400 MHz, CDC1 ₃ ) d: 7,24 (d, J = 8,0 Hz, 2H, H-l”); 6,96 (d, J= 8,1 Hz, 2H, H-2”); 3,90 (s, 3H, -OCH ₃ ); 3,22 (m, 4H, H-G, H-2’); 2,19 (m, 9H, H-l, H-2); 1,93 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 178,3; 176,9; 158,3; 131,6; 129,2; 114,0; 55,2; 40,2; 36,5; 34,2; 31,9; 28,8; 28,0. Masa molecular calculada: 338,5 g/mol. Masa molecular observada: 338,3 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-33: l-(4-clorofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano Se preparó una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (497 mg, 2,83 mmol), N - metilmorfolina (849 pL. 7,72 mmol), ácido 3-(4-clorofenil) propiónico (523 mg, 2,83 mmol) y el compuesto precursor adamantilamidoxima (1) (500 mg, 2,57 mmol), obteniéndose un producto que se purificó por medio de cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n - hexano como eluyente. Como etapa de purificación adicional, el producto se purificó por recristalización en etanol, proporcionando un sólido blanco. El rendimiento de la reacción fue de un 69%. Punto de fusión: 78 - 83°C. IR (KBr) cnf ¹ : 3065-3026 (=C-H sp ² Ar), 2908-2848 (C-H sp ³ ), 1582 (C=N), 1495 (C=C Ar), 1453 (CH ₂ ), 1349 (C-N), 1305-1014 (C-O), 1094 (C-Cl Ar). ^-RMN (ppm) (400 MHz, CDC1 ₃ ) d: 7,24 (d, J = 7,9 Hz, 2H, H-2”); 7, 11 (d, J= 7,8 Hz, 2H, H-l”); 3,10 (m, 4H, H-G, H-2’); 2,03 (m, 9H, H-l, H-2); 1,77 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 177,9; 177,0; 137,9; 132,5; 129,7; 128,8; 40,2; 36,5; 34,2; 32,0; 28,4; 28,0. Masa molecular calculada: 342, 1499 g/mol; Masa molecular observada: 342,1496 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-34: l-(4-fluorofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano

Este compuesto se preparó a partir de la reacción de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (248 mg, 1,42 mmol), N-metilmorfolina (424 pL, 3,86 mmol), ácido 3- (4-fluorofenil) propiónico (216 mg). , 1,29 mmol) y 1 (300 mg, 1,54 mmol) para proporcionar un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 20% en n-hexano como eluyente, proporcionando un sólido blanco. El rendimiento de la reacción fue de un 56%. Punto de fusión: 62 - 64°C. IR (KBr) cm ¹ : 3064-3005 (=C-H sp ² Ar), 2905-2848 (C-H sp ³ ), 1579 (C=N), 1604 (C=C Ar), 1453 (CH ₂ ), 1348 (C-N), 1303-1026 (C-O), 1256-1088 (C-F Ar). ¹ H-RMN(ppm) (400 MHz, CDC1 ₃ ) d: 7,41 (dd, 2H, H-l”); 7,23 (dd, 2H, H-2’); 3,38 (m, 4H, H-G, H-2’); 2,31 (m, 9H, H-l, H-2); 2,05 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 178,0; 177,0; 161,7 (d, J = 244,7 Hz, 1C); 135,2 (d, J = 3,3 Hz, 1C); 129,8 (d, J = 7,9 Hz, 2C); 115,4 (d, J = 21,3 Hz, 1C); 40,2; 36,5; 34,2;

31,9; 28,7; 28,0. Masa molecular calculada: 326,4 g/mol; Masa molecular observada: 326,4 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-35: l-(4-bromofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano

Para esta síntesis, se preparó una mezcla que contiene 2-cloro-4,6-dimetoxi- l,3,5-triazina (273 mg, 1,56 mmol), N- metilmorfolina (424 pL, 3,86 mmol), ácido 3-(4-bromofenil) propiónico (324 mg, 1,42 mmol) y el compuesto precursor adamantilamidoxima (1) (325 mg, 1,67 mmol) para dar un producto que se purificó por medio de cromatografía en columna de gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n - hexano como eluyente. A partir de la purificación, se obtuvo un sólido blanco. El rendimiento de la reacción fue de un 69%. Punto de fusión: 95 - 100°C. IR (KBr) cm ¹ : 3063-3022 (=C- H sp ² Ar), 2908-2846 (C-H sp ³ ), 1580 (C=N), 1491 (C=C Ar), 1451 (CH ₂ ), 1348 (C-N), 1304-1010 (C- O), 1072 (C-Br Ar^H-RMN (ppm) (400 MHz, CDC1 ₃ ) d: 7,41 (d, J = 8,1 Hz, 2H, H-2”); 7,22 (d, J = 8,0 Hz, 2H, H-l”); 3, 11 (sa, 4H, H-G, H-2’); 2,05 (m, 9H, H-l, H-2); 1.79 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 177,8; 177,0; 138,5; 131,7; 130,1; 120,5; 40,2; 36,5; 34,2; 32, 1; 28,3; 27,9. Masa molecular calculada: 386,0994 g/mol; Masa molecular observada: 386,0989 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-36: l-(4-metilfenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano

Se preparó una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (273 mg, 1,56 mmol), N - metilmorfolina (466 pL. 4,23 mmol), ácido 3-(p-tolil) propiónico (232 mg, 1,42 mmol) y el compuesto precursor adamantilamidoxima (1) (302 mg, 1,56 mmol) para obtener un producto que se purificó por cromatografía en columna de gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n-hexano como eluyente. Como etapa de purificación adicional, el producto se recristalizó en etanol, proporcionando un sólido blanco. El rendimiento de producción del compuesto fue del 58%. Punto de fusión: 64-68°C. IR (KBr) cm ¹ : 3064-3017 (=C-H sp ² Ar), 2905-2849 (C-H sp ³ ), 1584 (C=N), 1516 (C=C Ar), 1452 (CH ₂ ), 1387 (CH ₃ ), 1348 (C-N), 1305-1087 (C-O). ^-RMN (ppm) (400 MHz, CDC1 ₃ ) d: 7,23 (bs, 4H, H-l”, H-2”); 3,24 (m, 4H, H-G, H-2’); 2,45 (s, 3H, -CH ₃ ); 2, 19 (m, 9H, H-l, H-2); 1,92 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 178,3; 177,0; 136,5; 136,1; 129,3; 128,2; 40,2; 36,5; 34,3; 32,4; 28,8; 28,0; 21,0. Masa molecular calculada: 322,2045 g/mol; Masa molecular observada: 322,2040 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-37: 1 -(4-hidroxifenil)-2-(3-adamantil- 1,2,4- oxadiazol-5 -il)etano

Preparado a partir de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (237 mg, 1,56 mmol), N-metilmorfolina (466 pL, 4,25 mmol), ácido 3- (4-hidroxifenil) propiónico (235 mg , 1.42 mmol) y 1 (302 mg, 1.56 mmol) para dar un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 20% en n-hexano como eluyente, proporcionando un gel amarillo pálido. Rendimiento: 70%; Punto de fusión: producto en estado gel. IR (KBr) cm-1 : 3409 (OH unido a H), 3042 (= CH sp2 Ar), 2903-2848 (CH sp3), 1664-1516 (C = C Ar), 1574 (C = N), 1452 (CH2), 1350 (CN), 1305-1026 (CO heterocíclico), 1227 (CO fenólico). ¾-RMN (ppm) (400 MHz, CDC13): 7,01 (d, J = 8.3 Hz, 2H, H-l’); 6.75 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-2 "); 3,08 (m, 4H, H-l ', H-2'); 2,05 (m, 9H, H-l, H- 2); 1,78 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC13): 178,6; 176,9; 154,7; 131,2; 129.4; 115,6; 40, 1; 36,4; 34,3; 31,9; 28,9; 27,9. Masa molar calculada: 324,4 g/mol. Masa molar encontrada: 324,3 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-38: l-(3-metoxifenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- oxadiazol-5 -il)etano

Este compuesto se prepara a partir de la reacción de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (268 mg, 1,53 mmol), N-metilmorfolina (458 pL, 4,16 mmol), ácido 3- (3-metoxifenil) propiónico (250 mg). , 1,39 mmol) y 1 (296 mg, 1,53 mmol) para dar un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 20% en n-hexano como eluyente, proporcionando un gel incoloro. El rendimiento del compuesto fue del 48%. Punto de fusión: producto en estado gel. ¾-RMN (ppm) (400 MHz, CDC1 ₃ ) d: 7,23 (t, ./ = 7,7 Hz, 1H, H-2”); 6,80 (m, 3H, H-l”, H-3”, H-4”); 3,81 (s, 3H, -OCH ₃ ); 3,14 (m, 4H, H-G, H-2’); 2,08 (m, 9H, H-l, H-2); 1,81 (bs, 6H, H- 3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 178,2; 177,0; 159,8; 141,2; 129,6; 120,6; 114,0; 112,1; 55,2; 40,2; 36,5; 34,3; 32,8; 28,5; 28,0.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-39: l-(4-piridil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol-5- il)etano

Se preparó una mezcla de reacción que comprende 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (319 mg, 1,82 mmol), N-metilmorfolina (546 pL, 4,96 mmol), ácido 3-(4-piridil) propiónico (250 mg, 1,65 mmol) y el compuesto precursor (1) (354 mg, 1,82 mmol). A partir de esta reacción se obtuvo un producto que se purificó por medio de cromatografía en columna de gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 40% en n-hexano como eluyente. Como etapa de purificación adicional, el producto se purificó por cromatografía en capa fina empleando n-hexano como eluyente, obteniéndose un sólido amarillo. El rendimiento de la síntesis fue de un 52%. Punto de fusión: 75-78°C. IR (KBr) cm ¹ : 2909-2847 (C-H sp ³ ), 1574 (C=N), 1512 (C=C Ar), 1451 (CH ₂ ), 1343 (C-N), 1303-1088 (C-O), 810 ^N^H-RMN (ppm) (400 MHz, CDCb) d: 8,1 (d, J= 4,4 Hz, 2H, H-l”); 7,24 (d, J= 4,5 Hz, 2H, H-2”); 3,25 (m, 4H, H-G, H-2’); 2,13 (m, 9H, H-l, H-2); 1,87 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDC1 ₃ ) d: 177,4; 177, 1; 149,8; 148,5; 123,7; 40,2; 36,5; 34,3; 31,8; 27,9; 27,2. Masa molecular calculada: 309,1841; Masa molecular observada: 309, 1834.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-40: l-(3-metilfenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano

Este compuesto se prepara a partir de la reacción de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (276 mg, 1,57 mmol), N-metilmorfolina (472 pL, 4,29 mmol), ácido 3- (3-metilfenil) propiónico (235 mg , 1.43 mmol) y 1 (333 mg, 1.71 mmol) para proporcionar un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 30% en n-hexano como eluyente. Como una etapa de purificación adicional, el producto se purificó por cromatografía preparativa de capa fina empleando n-hexano como eluyente, proporcionando un gel incoloro. El rendimiento de ésta reacción de síntesis fue del 96%. Punto de fusión: 58-60°C. IR (KBr) cm ¹ : 3032(=C-H sp ² Ar), 2909- 2847 (C-H sp ³ ), 1582 (C=N), 1512 (C=C Ar), 1443 (CH ₂ ), 1389 (C¾), 1342 (C-N), 1296-1088 (C-O). ^-RMN (ppm) (400 MHz, CDCb) d: 7,39 (t, J= 7,2 Hz, 1H, H-2”); 7,23 (m, 3H, H-l”, H-3”, H-4”); 3,32 (m, 4H, H-L, H-2’); 2,54 (s, 3H, -CH ₃ ); 2,27 (m, 9H, H-l, H-2); 2,00 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDCb) d: 178,3; 177,0; 139,5; 138,2; 129, 1; 128,5; 127,3; 125,3; 40,2; 36,5; 34,3; 32,7; 28,7; 28,0; 21,4. Masa molecular calculada: 322,2045 g/mol; Masa molecular observada: 322,2024 g/mol.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-41 l-(4-tert-butilfenil)-2-(3-adamantil-l,2,4- oxadiazol-5 -il)etano

La síntesis se realizó por medio de la preparación de una mezcla de reacción compuesta por 2-cloro-4,6- dimetoxi-1,3,5- triazina (234 mg, 1,33 mmol), N - metilmorfolina (400 pL. 3,64 mmol), ácido 3-(4-terc- butilfenil) propiónico (250 mg, 1,21 mmol) y el compuesto precursor (1) (282 mg, 1,45 mmol). A partir de esta reacción se obtuvo un producto que se purificó por cromatografía en columna de gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n-hexano como eluyente. Como etapa de purificación adicional, el producto se recristalizó en etanol, proporcionando un sólido blanco. El rendimiento de ésta síntesis fue de 80%. Punto de fusión: 88-91°C. IR (KBr) cm ¹ : 2909-2855 (C-H sp ³ ), 1574 (C=N), 1504 (C=C Ar), 1450 (CH ₂ ), 1358 (C¾), 1343 (C-N), 1296-1088 (C-O). ¹ H-RMN (ppm) (400 MHz, CDCb) d: 7,51 (m, 1H, H-3”); 7,22 (d, = 7,7 Hz, 1H, H-4”); 7, 17 (m, 2H, H-l”, H-2”); 3,39 (m, 4H, H-L, H-2’); 2,30 (m, 9H, H-l, H-2); 2,04 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDCb) d: 177,8; 177,1; 162,9 (d, J = 246,0 Hz, 1C); 142,0 (d, J = 7,3 Hz, 1C); 130, 1 (d, J = 8,4 Hz, 1C); 123,9 (d, J= 2,8 Hz, 1C); 115,3 (d, .7= 21,3 Hz, 1C); 113,6 (d, .7 = 21,0 Hz, 1C); 40,2; 36,5; 32,4; 28,3; 28,0. Masa molecular calculada: 364,2515 g/mol; Masa molecular observada: 364,2509.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-42 l-(3-fluorofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano Preparado a partir de la reacción de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (mg, mmol), N-metilmorfolina (pL, mmol), ácido 3- (3-fluorofenil) propiónico (mg, mmol) y 1 (mg, mmol) para dar un producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 10% en n-hexano como eluyente, proporcionando un gel incoloro. El rendimiento de esta síntesis fue de 56%. Punto de fusión: producto en estado gel. ¹ H-RMN (ppm) (400 MHz, CDCb) d: 7,51 (m, 1H, H-3”). 7,22 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-4”); 7,17 (m, 2H, H-l”, H-2”); 3,39 (m, 4H, H-L, H-2’); 2,30 (m, 9H, H-l, H-2); 2,04 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDCb) d: 177,8; 177, 1; 162,9 (d, J = 246,0 Hz, 1C); 142,0 (d, J = 7,3 Hz, 1C); 130, 1 (d, J = 8,4 Hz, 1C); 123,9 (d, J = 2,8 Hz, 1C); 115,3 (d, J= 21,3 Hz, 1C); 113,6 (d, .7 = 21,0 Hz, 1C); 40,2; 36,5; 32,4; 32,4; 28,3; 28,0.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-44: l-(3-piridil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol-5- il)etano

La síntesis se realizó a partir de una mezcla de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (226 mg, 1,29 mmol), N - metilmorfolina (386 pL. 3,51 mmol), ácido 3-(3-piridil) propiónico (177 mg, 1,17 mmol) y el compuesto precursor (1) (250 mg, 1,29 mmol). A partir de la mezcla se obtuvo un producto que se purificó por cromatografía en columna de gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 40% en n- hexano como eluyente. Adicionalmente, se realizó otra etapa de purificación mediante cromatografía en capa fina empleando n-hexano como eluyente, obteniéndose como producto un gel de color amarillo. El rendimiento de esta reacción de síntesis fue del 44%. Punto de fusión: Producto en estado gel. ^-RMN (ppm) (400 MHz, CDCb) d: 8,61 (bs, 2H, H-2”, H-3”); 7,77 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-4”); 7,43 (s, 1H, H-l”); 3,18 (bs, 4H, H-G, H-2’); 1,99 (m, 9H, H-l, H-2); 1,73 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-

RMN (ppm) (101 MHz, CDCb) d: 177,4; 177,0; 149, 1; 147,5; 136,6; 135,3; 123,7; 40, 1; 39,6; 36,5; 34,2; 29,7; 27,9. - Síntesis y caracterización compuesto BD-45: l-(2-piridil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol-5- il)etano

Preparado a partir de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (226 mg, 1,17 mmol), N-metilmorfolina (386 pL, 3,51 mmol), ácido 3- (2-piridil) propiónico (177 mg). , 1.17 mmol) y 1 (250 mg, 1.287 mmol) para dar un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 60% en n-hexano como eluyente. Como una etapa de purificación adicional, el producto se purificó por cromatografía preparativa de capa fina empleando n-hexano como eluyente, proporcionando un gel amarillo. El rendimiento de ésta reacción de síntesis fue del 18%. Punto de fusión: Producto en estado gel. H-RMN (ppm) (400 MHz, CDCL) d: 8,54 (d, J= 7,2 Hz, 1H, H-l”); 7,69 (m, 1H, H-3”); 7,23 (m, 2H, H-2”, H-4”); 3,26 (m, 4H, H-L, H-2’); 1,87 (m, 9H, H-l, H-2); 1,62

(bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDCL) d: 177,6; 177,0; 159,6; 147,2; 139,5; 122,9; 40,1; 36,5; 34,2; 32,9; 27,9; 26,0.

- Síntesis y caracterización compuesto BD-46: l-(4-nitrofenil)-2-(3-adamantil-l,2,4-oxadiazol- 5-il)etano

Preparado a partir de la reacción de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina (226 mg, 1,29 mmol), N- metilmorfolina (386 pL. 3,51 mmol), ácido 3- (4-nitrofenil) propiónico (228 mg, 1,17 mmol) y 1 (250 mg, 1,29 mmol) para dar un producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna por gravedad empleando una mezcla de acetato de etilo al 20% en n-hexano como eluyente, proporcionando un sólido blanco. El rendimiento de esta reacción de síntesis fue del 66%. H-RMN (ppm) (400 MHz, CDCL) d: 8,00 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-l”); 7,22 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2”); 3,08 (m, 4H, H-G, H-2’); 1,89 (m, 9H, H-l, H-2); 1,63 (bs, 6H, H-3). ¹³ C-RMN (ppm) (101 MHz, CDCL) d: 177,3; 177,1; 147,0; 146,9; 129,3; 123,9; 40,2; 36,5; 34,3; 32,3; 27,9; 27,8.

Ejemplo 2: Efecto inhibitorio y selectivo de compuestos de fórmula (I) sobre la actividad de la enzima IIb-HSDl

En este ejemplo, se presentan ensayos de actividad biológica para determinar el efecto inhibitorio de compuestos de fórmula (I) contra la enzima I Ib-HSDl deshidrogenasa y cómo estos compuestos inhiben específicamente la actividad oxidasa (deshidrogenasa) de la enzima y su selectividad respecto de las isoformas 1 y 2 (1 i -HSD2).

Los ensayos de actividad biológica se realizan por medio de la determinación de la concentración inhibitoria del 50% (IC50) de la producción de cortisol respecto al control cuando una enzima recombinante I Ib-HSD l (Cayman Chemical, MI, USA; N° Item 10007815) es expuesta a los diferentes compuestos.

- Determinación de la actividad 1 Ib-HSD 1 reductasa

Primero, se prepararon soluciones stock de los compuestos en DMSO a una concentración de 10 mM, de la cual se hicieron diluciones seriadas para la curva de eficacia.

En cuanto a la enzima 1 1 b-HSD 1 recombinante (Cayman Chemical, MI, USA; Ne Item 10007815), ésta se preparó en el Buffer Tris 20 mM EDTA 5 mM pH 6.0 (buffer tris) a distintas diluciones.

Inicialmente, se determinó la concentración de enzima a utilizar en los ensayos para evaluar la actividad biológica de los compuestos. Para esto, se utilizó el producto Kit Cortisol (Cisbio, MA, USA; Cat no. 62CRTPEG).

El protocolo consistió en preparar el buffer de reacción, adicionando cortisona 266 nM y NADPH 333 mM en buffer Tris. Luego, este buffer de reacción se agrega en los pocilios de la placa para la reacción HTRF (Homogeneous Time Resolved Fluorescence) junto a la enzima en proporción 4: 1 respectivamente, y se incuba durante 2 horas a 37°C. En el caso de los pocilios control, se agregaron dos pocilios con buffer tris, sin compuestos.

Tras el tiempo de incubación, se agregaron los reactivos del kit Cortisol, Cortisol d2 y Cortisol criptato en relación muestra, Cortisol d2 y cortisol criptato 2: 1 : 1, en cantidad según el tamaño del pocilio como indica el proveedor (para el control negativo del kit, se reemplaza el cortisol d2 por el buffer de reconstitución del kit). Esta reacción, se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente para posteriormente leer la fluorescencia a 665 y 620 nm.

Una vez determinada la concentración de enzima a utilizar, se prosigue con el protocolo de kit cortisol para la determinación de la curva de eficacia para los compuestos. Tal como se realizó previamente, se preparó una placa para HTRF adicionando a cada pocilio del buffer der reacción, la enzima 1 Ib-HSDl recombinante y los compuestos a ensayar en relación 3 : 1 : 1, respectivamente. Luego, la placa se incubó a 37°C durante 2 horas.

Tras el tiempo de incubación, se agregan los reactivos del kit cortisol, cortisol d2 y cortisol criptato, y se incubó nuevamente durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se determinó la fluorescencia de cada pocilio a 665 y 620 nm. - Determinación de la actividad 1 Ib-HSD 1 oxidasa La determinación de la actividad I Ib-HSDl oxidasa se realiza a través de la medición de la concentración de cortisona producida en la reacción con y sin los compuestos. Para esto, se utilizó el producto Kit Cortisol (Cisbio).

Para el análisis, los compuestos se reconstituyen en DMSO en un stock de concentración 10 mM, a partir del cual se prepararon diluciones seriadas para la curva de eficacia.

Las diluciones de la enzima I Ib-HSDl recombinante se prepararon en Buffer Tris 20 mM EDTA 5 mM pH 6.0 (buffer tris).

Inicialmente, se determinó la concentración de enzima a utilizar. Para esto se preparó una placa para HRTF con buffer Tris con cortisol 100 nM y NADP+ 200 mM, incluyéndose en los pocilios de la placa para HTRF junto a la enzima en proporción 4:1 respectivamente, y se incubó durante 2 horas a 37°C. Luego de este tiempo, se adicionaron los reactivos del Cortisol kit, Cortisol d2 y Cortisol criptato en relación muestra, Cortisol d2 y cortisol criptato 2: 1:1, incubando esta nueva reacción durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se determinó la fluorescencia a 665 y 620 nm.

Una vez determinada la concentración de enzima a utilizar, se prosigue con el protocolo de Cortisol Kit para la determinación de la curva de eficacia de los compuestos. Se preparó nuevamente una placa HRTF, en donde en cada pocilio se adicionó el buffer de reacción, la enzima I Ib-HSDl recombinante y el compuesto en relación 3: 1: 1, respectivamente. La placa se incubó a 37°C durante 2 horas. Pasado el tiempo de incubación se agregaron los reactivos del kit cortisol cortisol d2 y cortisol criptato como se indicó anteriormente. Luego se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora para, por último, leer la fluorescencia a 665 y 620 nm.

- Determinación de la actividad 1 4i-HSD2 oxidasa

Para evaluar la actividad 11b-H802 oxidasa se determinó la concentración de cortisona producido en la reacción con y sin los compuestos por medio del producto Cortisol Kit (Cisbio).

Tal como en los ensayos previos, los compuestos se reconstituyen en DMSO a stock 10 mM, para luego hacer diluciones seriadas para la curva de eficacia.

Para determinar el IC50 de los compuestos, se utilizó un modelo de microsomas hepáticos humanos de donantes (BioReclamationlVT Inc.), los que se prepararon en Buffer Tris 20 mM EDTA 5 mM pH 6.0 (buffer Tris).

Para realizar el ensayo se preparó la placa para HTRF la que contiene buffer Tris, cortisol 100 nM y NAD ⁺ 200 mM. A los pocilios correspondiente se adiciona la enzima en una proporción 4:1, respectivamente, y se incuba durante 2 horas a 37°C. Para el control del kit se agregan dos pocilios solo con buffer tris. Luego del tiempo de incubación, se le agregan los reactivos del Cortisol kit, Cortisol d2 y Cortisol criptato en relación muestra, Cortisol d2 y cortisol criptato 2: 1: 1. Para el control negativo, en algunos pocilios se reemplazó el cortisol d2 por el buffer de reconstitución del kit. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para posteriormente leer a 665 y 620 nm.

Una vez determinada la concentración de enzima a utilizar, se prosigue con el protocolo de Cortisol Kit para la determinación de la curva de eficacia para los compuestos. Para esto se preparó el buffer de reacción y posteriormente en una placa para HTRF se agregó a cada pocilio el buffer de reacción, microsomas en concentración de 5mg/mL y el compuesto en relación 3: 1: 1, respectivamente. En el caso de los controles de reacción, para el control negativo se incluye el buffer de reacción sin cortisol y sin compuesto. Para el caso del control positivo, no se adiciona compuesto, y para los controles del kit se agrega solo el buffer de reacción en los pocilios del control negativo y positivo.

Tras incubar placa durante 2 horas, se adiciona a los pocilios correspondientes, los reactivos del kit cortisol, cortisol d2 y cortisol criptato como se indicó anteriormente. Luego se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora para, finalmente, leer la fluorescencia 665 y 620 nm.

A partir de los ensayos previamente descritos, se obtuvieron los resultados descritos en la tabla 1.

Tabla 1.- Actividad inhibitoria de los compuestos de fórmula (I) contra la actividad oxidasa de la enzima IIb-HSDl y su selectividad respecto de las isoformas 1 y 2 (11P-HSD2).

Ejemplo 3: Determinación de características de biofarmacia de compuestos de fórmula (I), BD-40 y BD-44.

En este ejemplo de aplicación se presentan los resultados de la determinación de permeabilidad sobre monocapas de BD-40 y BD-44, solubilidad del compuesto de formula (I) BD-40 y capacidad de unión a proteínas plasmáticas del compuesto BD-40.

Previo a estos análisis, se estandarizaron las metodologías analíticas para detectar y cuantificar los compuestos BD-40 y BD-44. Para esto, se desarrollaron metodologías analíticas por uHPLC-MS/MS en tándem (Triple Quad 4500, AB Sciex Instruments) para los compuestos BD-40 y BD-44.

Los parámetros de ionización fueron optimizados por medio de infusión directa (1 mL/min) de soluciones a 1 pg/mL en mezcla acetonitrilo (ACN)/agua 50:50. Estos parámetros para la ionización son presentados en la siguiente tabla (Tabla 2):

Tabla 2 Parámetros de fuente de ionización para la detección de los compuestos BD-40 y BD-44.

*GS1: Gas nebulizador. GS2: Gas de secado. TEM: Temperatura del capilar. IS: Voltaje ion-spray.

CUR: Gas Cortina (Curtain gas). CAD: Gas de colisión.

Luego de obtener los parámetros de ionización óptimos, fue necesario realizar la optimización de los parámetros de fragmentación de cada compuesto, para ello se operó el espectrómetro de masas en modalidad múltiple reaction monotoring (MRM), modo positivo. Para realizar la cuantificación se utilizaron las transiciones 322.976/135.100 (BD 40), 310.080/135.100 (BD 44), 210.061/193.200 (minoxidilo) y 267.072/145.100 (atenolol). Los parámetros MRM y fragmento cuantificador para cada compuesto son descritos en la tabla 3, donde además se incluyen como marcadores minoxidilo y atenolol.

Tabla 3.- Parámetros espectrométricos MRM para cada compuestos BD-40 y BD-44.

*DP: Potencial de desagrupación (Declustering Potential). CE: Energía de colisión. CXP: Energía de salida. El potencial de entrada (EP) fue 10.00 en todos los casos.

Posterior a la determinación de los parámetros mencionados, se realizó el análisis cromatográfico. Para ello se utilizó el equipo Ekspert ultraLC 100-XL (AB Sciex Instruments) con autosampler termostato y homo para columna. Se utilizó una columna C18 (Inertsil OSD-4, 3 um, 2,1 x 100 mm), el volumen de inyección fue de 10 pL, el flujo de 0.5 mL/min y la temperatura de la columna de 40 °C. La fase móvil fue agua 10 mM formiato de amonio pH 5 al 5% en ACN (A) y ACN 10 mM formiato de amonio al 5% en agua (B). La tabla 4 presenta los gradientes de elusión para cada compuesto.

Tabla 4 Gradientes de elusión para los compuesto BD-40 y BD-44.

Los métodos presentados fueron validados de forma parcial, para ello, se evaluó especificidad, rango, linealidad, precisión y exactitud. Para realizar esta evaluación se prepararon soluciones estándar de cada compuesto (BD-40 y BD-44) en un rango de concentraciones que va desde 0,1 hasta 1000 ppb, en dos modalidades. En la primera modalidad se preparó una curva de calibración para cada compuesto y la segunda modalidad comprendía soluciones estándares de los compuestos (BD-40 y BD-44) más los marcadores minoxidilo y atenolol. Las soluciones fueron evaluadas por triplicado.

Estos métodos mostraron ser específicos para cada compuesto, y presentaron rangos lineales de al menos 3 órdenes de magnitud, coeficientes de determinación (R2) de al menos 0,984, coeficientes de variación para cada concentración y cada fármaco de no más de 1,6% con exactitudes superiores a 93%.

- Análisis de permeabilidad sobre monocapas de los compuestos de formula (I), BD-40 y BD- 44).

En este ensayo se utilizaron células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), las cuales se encuentran establemente transfectadas con el gen que codifica para glicoproteína P humana (hMDRl). Estas células fueron cultivadas en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) alto en glucosa y suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% piruvato 5 mM, 1% Non-essential amino acids solution X5, 20.000 UI/mL de penicilina G y 20.000 UI/mL de estreptomicina, una temperatura de 37°C, 90% de humedad relativa y un 5% de CO2. Estas células fueron sembradas en placas estériles al cuarto día de crecimiento o hasta alcanzar un 90% de confluencia.

Diez días antes de la realización del análisis de transporte, se sembraron células en insertos Transwells® (1,12 cm2) a una densidad de 60.000 células/cm ² . Las monocapas fueron suplementadas cada dos días con medio de cultivo fresco. El día de análisis, las células fueron lavadas 3 veces (ambos compartimentos) con el buffer de transporte Hanks Balanced Salt Solution, HBSS pH 6,8 a 37°C, para luego ser incubadas con 500 pL de solución de compuesto 10 pM en presencia de los marcadores minoxidilo (10 pM) y atenolol (10 pM) en el compartimento apical y 1,5 mL de buffer en el compartimento basolateral (experimento A-B, n=3). De manera paralela se realizaron experimentos B- A (1,5 mL de solución donante en compartimento basolateral y 0.5 mL buffer en apical). Las monocapas se incubaron en agitación (50 rpm) a una temperatura de 37°C) por un periodo de 2 horas. Adicionalmente se realizó este ensayo en presencia del inhibidor de Pgp elacridar (5 mM). Luego del tiempo de agitación, se removieron los insertos, se realizó muestreo de los compartimentos y se traspasaron las células a viales de HPLC diluyendo estas muestras con la fase móvil cromatografía. Estas muestras se mantuvieron a -20 °C hasta su tiempo de análisis. El balance de masas de cada compuesto siempre se mantuvo sobre el 80%.

El transporte bi-direccional de cada compuesto fue parametrizado como permeabilidad aparente (Papp) a partir de los valores de flujo transcelular a partir de la primera ley de Fick, según la ecuación (1),

Papp = (dM_R)/(A-dT-C_D ) (1)

Donde dMR corresponde a la cantidad de compuesto en el compartimento receptor al tiempo t (nmol); A es el área de la monocapa (cm ² ); dT es la duración del experimento (s); y CD es la concentración donante al tiempo cero (mM). Para cada compuesto se obtuvo la razón de eflujo (RE) según la ecuación (2),

RE = (Papp) ^L (B-A)/ (Papp) ^L (A-B) (2)

En esta ecuación, PappB-A es la permeabilidad aparente del compuesto en la dirección de secreción y PappA-B es la permeabilidad aparente del compuesto en la dirección de absorción. Una RE > 2 en ausencia de elacridar, y similar a 1 en presencia de elacridar, confirma secreción activa mediada por pgP. La Tabla 5 muestra los valores de PappA-B y RE para BD-40 y BD-44.

Tabla 5.- Permeabilidad aparente y razón de flujo de los compuestos de formula (I) BD-40 y BD-44.

Los valores de Papp BD-40 y BD-44 fueron superiores a los del marcador de alta permeabilidad minoxidilo (pO.Ol). La Papp del marcador de integridad atenolol fue inferior a 0.5x10-6 cm/s. Los valores de RE no fueron superiores a 2 y no se vieron afectados por la presencia del inhibidor pgP elacridar por lo que se descarta que BD-40 y BD-44 sean sustratos de glicoproteína P.

- Solubilidad del compuesto de formula (I) BD-40. Para estudiar la solubilidad de BD-40 en el rango de pH del tracto gastrointestinal, se utilizaron matraces con buffers regulatorios a pH 1,2; 4,5; y 6,8. Se preparó una solución stock de 100 mM en DMSO que fue agregada en volúmenes establecidos sobre los buffers hasta observar la aparición de turbidez. Estas soluciones se prepararon en triplicado en concentraciones finales de DMSO de 0,5 a 5,0% V/V de cada buffer, luego fueron incubadas a 37°C con agitación vigorosa por 48 horas y luego otras 48 horas pero sin agitación. Las muestras fueron centrifugadas y el sobrenadante fue diluido con la fase móvil cromatografía para luego ser analizado mediante pHPLC-Ms/Ms. El valor de solubilidad a cada pH se obtuvo a partir del intercepto de la línea recta solubilidad versus %DMSO. La Tabla 6 presenta los valores de solubilidad acuosa de BD-40 en el rango de pH de 1,2-6, 8.

Tabla 6.- Solubilidad acuosa de BD-40 en el rango de pH gastrointestinal

Análisis de la capacidad de unión a proteínas plasmáticas del compuesto de formula (I), BD-40.

Para realizar este estudio, se empleó el kit comercial Transil XL PPB Binding Kit, v2, Sovicell, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

De acuerdo con los resultados, la unión a proteínas plasmáticas de BD-40 fue 98,3 ± 1,9%.

La determinación de la unión del fármaco a proteínas plasmáticas permite definir la eficacia del fármaco. Cuando se encuentra unida a proteína plasmática, el fármaco puede atravesar las membranas celulares llegando a su blanco terapéutico. Además, se pierde menos fármaco por excreción, permitiendo tener la dosis efectivamente terapéutica del compuesto en su blanco de acción. En este caso, el compuesto de fórmula (I) BD-40 presenta porcentajes de alta eficacia, con una pérdida menor del fármaco.

Ejemplo 4: Ensayo in vivo con compuestos de formula (I) BD-40 y BD-44.

Para la evaluación de los compuestos BD-40 y BD-44 de manera in vivo , se utilizaron ratones machos C57BL/6J, de aproximadamente 9-12 semanas de edad, los cuales fueron facilitados por el bioterio de la Fundación Ciencia & Vida.

Los animales fueron clasificados según peso y divididos en los siguientes grupos (Tabla 7): Tabla 7.- Clasificación de los individuos para pruebas in vivo de los compuestos de formula (I) BD-40 y BD-44.

I.V.: administración intravenosa, V.O: administración vía oral.

La solución que contiene la dosis de BD-40 y BD-44 fue formulada en un vehículo que contiene 30 % dimetil sulfóxido (DMSO), 20 % Kolliphor y 50 % PBS a una concentración de 1 mg/mL. De esta solución, se realizó una dilución 0.4 mg/mL para administración IV.

En la administración intravenosa (I.V), por cada compuesto luego de ser administrado a los ratones, fueron separados en grupos de 3 y fueron eutanasiados en los tiempos 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 260, 480 y 1440 minutos. Para la administración oral (V.O), los ratones fueron separados en grupos de 3 y fueron eutanasiados a los tiempos 15, 30, 60, 120, 240, 260, 480 y 1440 minutos. Para obtener ensayos a tiempo cero, se utilizaron ratones a los cuales no se les administro compuesto.

De cada animal se obtuvo sangre completa (en microtubos con EDTA), estas muestras fueron centrifugadas a 9000 g a una temperatura de 4°C por un periodo de 5 minutos, obteniéndose el plasma y almacenado a -80°C.

Además, de los animales se obtuvieron los órganos como cerebro, hígado, músculo, grasa de epidídimo, corazón y riñón, los que fueron congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80°C.

Se analizaron muestras de plasma y muestras de cerebro, hígado, grasa de epidídimo y músculo (tejido). A las muestras de tejido se les agrego 2X en volumen de agua (peso/volumen), en tanto la mezcla de músculos se le agrega 4X en volumen de agua (peso/volumen), tras lo cual fueron homogenizadas usando un equipo Bullet Blender (Next Advance, USA).

Todas las muestras fueron analizadas como un punto único por LC-MS/MS, considerando la metodología analítica ya estandarizada y presentada en el ejemplo de aplicación 3. Para comenzar, se realizó una curva de calibración. Para ello los controles, las muestras de plasma y órganos se prepararon agregando a estas 180 pL de acetonitrilo frió, se sometieron a vortex por 15 segundos y se centrifugaron a 6100 g por 30 segundos a 4°C. De este procedimiento se obtuvo el sobrenadante el cual se diluyó en 2 volúmenes de ácido fórmico 0,2% en agua y transferido a un vial que permitirá ser inyectado en LC-MS/MS.

Las condiciones para el análisis LC-MS/MS fueron:

HPLC: Eksigent UltraLC 100

Autosampler: Eksigent UltraLC 100-XL at RT

Fase móvil: A-0, 1% ácido fórmico en agua; B-0, 1% ácido fórmico en acetonitrilo.

Columna: YMC Triart l,9pm; 2,0 ^c 50mm

Volumen de inyección: 2 pL

Gradiente: 5% B por 0,25 min - 5-95% B por 0,75 min - 95% B por 2 min - 95-5% B por 0,25 min - 5% B por 0,25 min

Flujo: 0,6 mL/min

Espectrómetro de masas: Applied Biosystems/SCIEX QTRAP 4500

Interfaz: TurbolonSpray (ESI) a 600°C

Software: Analyst.

Para ambos compuestos se realizó un análisis en el modo positivo, detectando para BD-40 el ión parental 323.4 [M+l] y el ión producto 135.2 [M+l]; y paraBD-44 el ión parental 310.4 [M+l] y el ión producto 135.2 [M+l]

a) Resultados análisis farmacocinético BD-40 - Análisis muestras de plasma compuesto BD-40 Los resultados obtenidos para los parámetros farmacocinéticos de BD-40 en plasma se resumen en la tabla 8. El tiempo medio (hr) del fármaco fue de 3,30 cuando se administró intravenosamente y de 0,864 hrs. cuando se administró oralmente. Tabla 8.- Resultados análisis farmacocinético para BD-40 en plasma

IV: administración intravenosa, PO: Administración oral, NC: No determinado o calculado

Se realizó también la detección y análisis de parámetros farmacocinéticos para el compuesto BD-40 en cerebro, hígado, tejido graso y músculo. Se observa que el compuesto BD-40 tiene buena biodisponibilidad pudiendo ser detectado en los diferentes tejidos de órganos evaluados (cerebro, hígado, grasa y músculo) tanto cuando se administró oral como intravenosamente (figuras 1 y 2). b) Resultados análisis farmacocinético BD-44 Los resultados obtenidos para los parámetros farmacocinéticos de BD-44 se resumen en la tabla 9. El tiempo medio (hrs) de eliminación del fármaco fue de 1,02 cuando fue administrado vía intravenosa y de 1,05 cuando se administró oralmente. El compuesto BD-44 fue detectado hasta 6 horas post administración tanto cuando se administró intravenosamente, como oralmente (figura 3). Si bien se observó una baja disponibilidad aparente de BD-44 en plasma y no se detectó en los tejidos ensayados, éste corresponde a un análisis inicial sin considerarse el régimen de administración del fármaco.

Tabla 10.- Resultados análisis farmacocinético para BD-44 en plasma

IV: administración intravenosa, PO: Administración oral, NC: No determinado o calculado

Referencias

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