KRAHL JÜRGEN (DE)
STAUFENBIEL JENS (DE)
| DE102016004051B3 | 2017-07-27 | |||
| EP2336751A1 | 2011-06-22 | |||
| US20120058052A1 | 2012-03-08 | |||
| DE102016004051B3 | 2017-07-27 |
| P a t e n t a n s p rü c h e 1. Vorrichtung (12) zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei (10), mit einer Lichtquelle (14) zur Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich (16) im Inneren des Vogeleis (10), einer spektroskopischen Einrichtung (18) zur zeit- und/oder spektralaufgelösten Analyse von aus dem Bereich (16) im Inneren des Vogeleis (10) emittierter Fluoreszenzstrahlung, einer Auswerteeinheit (20) zur Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung (18) ermittelten Daten und einem Messkopf (22) zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung in das Vogel ei (10) und Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogel ei (10)„ dadurch gekennzeichnet, dass der Messkopf (22) ein Lichtleitersystem (28) mit einem Kopfende (30) zum Aussenden der Anregungsstrahlung und Empfangen der der Fluoreszenzstrahlung aufweist. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtleiter System ein Y-förmiges Lichtleitersystem (28) mit zwei Lichtleiter strängen (32, 34) ist, die auf Seiten des Kopfendes (30) zusammengeführt sind. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterstränge (32, 34) als Lichtleiterbündel (36, 38) ausgebildet sind, deren einzelne Lichtleiter auf Seiten des Kopfendes (30) ineinandergeschlungen sind. 4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die spektroskopischen Einrichtung (18) eine Einrichtung zur zeitaufgelösten Analyse oder zur zeit- und spektralaufgelösten Analyse von Fluoreszenzstrahlung ist. 5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinheit (20) eine auf maschinellem Lernen beruhende Auswerteeinheit ist. 6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinheit (20) eine auf sogenanntem Feature-Engineering beruhende Auswerteeinheit ist. 7. Messkopf (22) für eine Vorrichtung (12) zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei (10), insbesondere für eine Vorrichtung (12) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der zum gemeinsamen Aussenden von Anregungsstrahlung in das Vogelei (10) und Empfangen von Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei (10) eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, dass der Messkopf (22) ein Lichtleitersystem (28) mit einem Kopfende (30) zum Aussenden der Anregungsstrahlung und Empfangen der der Fluoreszenzstrahlung aufweist. 8. Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei (10), mit den Schritten Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich (16) im Inneren des Vogeleis (10) mittels einer Lichtquelle (14), zeit- und/oder spektralaufgelöste Fluoreszenzanalyse von aus dem Bereich (16) im Inneren des Vogeleis (10) emittierter Fluoreszenzstrahlung mittels einer spektroskopischen Einrichtung (18), und Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung (18) ermittelten Daten, wobei mittels eines Messkopfes (22) gemeinsam die Anregungsstrahlung in das Vogelei (10) ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei (10) empfangen wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Messkopf (22) ein Lichtleitersystem (28) aufweist und das Aussenden der Anregungsstrahlung in das Vogelei (10) und das Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei (10) über ein an das Vogelei (10) herangeführtes Kopfende (30) des Lichtleitersystems (28) erfolgt. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mittels des Messkopfes (22) durch ein einziges Loch (24) in der Eischale (26) des Vogeleis (10) hindurch gemeinsam die Anregungsstrahlung in das Vogelei (10) ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei (10) empfangen wird 10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch den vorgelagerten Schritt: Erstellen des Lochs (24) in der Eischale (26), ohne eine unter der Eischale (26) liegende Eihaut zu öffnen. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich (16) im Inneren des Vogel eis ein Keimscheiben-Bereich und/oder ein Blutbahn-Bereich und/oder ein Bereich embryonaler Strukturen ist. |
Vogel ei
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, mit (i) einer Lichtquelle zur Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis, (ii) einer spektroskopischen Einrichtung zur zeit- und/oder spektralaufgelösten Analyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung, (iii) einer Auswerteeinheit zur Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten und (iv) einem Messkopf zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung in das Vogelei und Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei, vorzugsweise durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen entsprechende Messkopf für eine Vorrichtung zur in- ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, der zum gemeinsamen Aussenden von Anregungsstrahlung in das Vogelei und Empfangen von Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei, vorzugsweise durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch, eingerichtet ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, mit den Schritten (a) Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis mittels einer Lichtquelle, (b) zeit- und/oder spektralaufgelöste Fluoreszenzanalyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung mittels einer spektroskopischen Einrichtung, und (c) Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten, wobei mittels eines Messkopfes, vorzugsweise durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch, gemeinsamen die Anregungsstrahlung in das Vogelei ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei empfangen wird.
Derzeit gibt es das Bestreben das Geschlecht eines zukünftigen Kükens bereits beim befruchteten Hühnerei bestimmen zu können.
Im Vogelei entstehen im Verlauf der Entwicklung unterschiedliche Fluorophore, insbesondere Hormone, bei männlichen und weiblichen Küken. Die entsprechenden Moleküle besitzen aufgrund ihrer komplexen Struktur ein nicht vorhersagbares Fluoreszenzvermögen. Bei der Fluoreszenz werden Elektronenübergänge vom angeregten zum Grundzustand beobachtet. Dieser Vorgang ist zeitabhängig.
Das Dokument DE 102016004 051 B3 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur optischen in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis mittels einer Lichtquelle, (b) zeit- und/oder spektralaufgelöste Fluoreszenzanalyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung mittels einer spektroskopischen Einrichtung, und (c) Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten. Mittels eines Messkopfes, der einen Strahlteiler und eine Optik umfasst, wird durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch gemeinsamen die Anregungsstrahlung in das Vogelei ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei empfangen. Für das dort beschriebene Verfahren muss das Loch jedoch relativ groß sein, was die Gefahr einer Verkeimung zur Folge hat.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, bei denen die in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einer deutlich geringeren Gefahr einer Verkeimung präzise und sicher durchgeführt werden kann.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfmdungsgemäß durch die Merkmale des unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben, die jeweils einzeln oder in Kombination einen Aspekt der Erfindung darstellen können.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, mit (i) einer Lichtquelle zur Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis, (ii) einer spektroskopischen Einrichtung zur zeit- und/oder spektralaufgelösten Analyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung, (iii) einer Auswerteeinheit zur Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten und (iv) einem Messkopf zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung in das Vogelei und Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei, vorzugsweise durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch, ist vorgesehen, dass der Messkopf ein Lichtleitersystem mit einem Kopfende zum Aussenden der Anregungsstrahlung und Empfangen der der Fluoreszenzstrahlung aufweist. Auf diese Weise kann das Aussenden und Empfangen von entsprechender Strahlung über ein sehr kleines Loch realisiert werden. Insbesondere kann mit der vorbeschriebenen Vorrichtung die Fluoreszenzstrahlung auf der Eischale empfangen werden.
Das Loch hat dann bevorzugt eine Lochgröße mit einer Dimension bzw. einem Durchmesser D im Bereich 0,5 mm < D < 3 mm. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Lichtleitersystem ein Y-förmiges Lichtleitersystem mit zwei Lichtleitersträngen ist, die auf Seiten des Kopfendes zusammengeführt sind.
Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass die Lichtleiterstränge als Lichtleiterbündel ausgebildet sind, deren einzelne Lichtleiter auf Seiten des Kopfendes ineinandergeschlungen sind. Darunter ist im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass die Lichtleiter miteinander verschlungen sind, beispielsweise verzwirbelt. Ein solches Ineinanderschlingen könnte man auch als miteinander Verflechten bezeichnen, wobei keine zwingende Regelmäßigkeit bei diesem Flechten vorgesehen ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Bereich im Inneren des Vogeleis ein Keimscheiben-Bereich und/oder ein Blutbahn-Bereich und/oder ein Bereich embryonaler Strukturen ist. Welcher dieser Bereiche gewählt wird hängt insbesondere vom Entwicklungsstadium im befruchteten Vogelei ab.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die spektroskopischen Einrichtung eine Einrichtung zur zeitaufgelösten Analyse oder zur zeit- und spektralaufgelösten Analyse von Fluoreszenzstrahlung. Sind die Frequenzen bekannt, aus denen man die Information über das Geschlecht erhalten kann, ist eine spektralaufgelösten Analyse oft nicht mehr notwendig.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Lichtquelle eine gepulste Laserlichtquelle. Bevorzugt kann vorgesehen sein, dass die Lichtquelle einen Laser zur Erzeugung von Laserpulsen aufweist. Weiter bevorzugt kann vorgesehen sein, dass dem Laser zur Erzeugung von Laserimpulsen eine Frequenzvervielfachungs-Vorrichtung nachgeschaltet ist, beispielsweise eine Frequenzverdoppler-, Frequenzverdreifacher- oder F requenzvervi erfacher- V orri chtung . Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Anregungsstrahlung eine Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich von größer oder gleich 100 nm bis kleiner oder gleich 380 nm, bevorzugt größer oder gleich 200 nm bis kleiner oder gleich 280 nm, beispielsweise eine Wellenlänge von 266 nm.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Anregungsstrahlung gepulst und weist eine Pulslänge in einem Bereich von größer oder gleich 0,1 ns bis kleiner oder gleich 1 ps auf, bevorzugt größer oder gleich 1 bis kleiner oder gleich 200 ns, besonders bevorzugt größer oder gleich 2 ns bis kleiner oder gleich 20 ns.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Anregungsstrahlung gepulst und weist eine Pulslänge im Femtosekunden- oder im Pikosekunden-Bereich auf.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist die spektroskopische Einrichtung ein Spektrometer (einen Spektrographen), wobei das Spektrometer bevorzugt dazu eingerichtet ist Fluoreszenzstrahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich von größer oder gleich 200 nm bis kleiner oder gleich 600 nm zu empfangen.
Bevorzugt kann vorgesehen sein, dass die spektroskopische Einrichtung einen Mehrkanaldetektor und einen zwischen dem Spektrometer und dem Mehrkanal detektor geschalteten Shutter aufweist. Weiter bevorzugt kann vorgesehen sein, dass einerseits der Laser und andererseits der Mehrkanal detektor und Shutter über einen Q-Switch gekoppelt sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Auswerteeinheit eine auf maschinellem Lernen beruhende Auswerteeinheit ist. Maschinelles Lernen ist (gemäß aktuellem Wikipedia-Eintrag) ein Oberbegriff für die „künstliche“ Generierung von Wissen aus Erfahrung: Ein künstliches System lernt aus Beispielen und kann diese nach Beendigung der Lernphase verallgemeinern. Dazu bauen Algorithmen beim maschinellen Lernen ein statistisches Modell auf, das auf Trainingsdaten beruht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Auswerteeinheit eine auf sogenanntem Feature-Engineering beruhende Auswerteeinheit ist. Das Feature-Engineering ist eine Form der Aufbereitung von Daten und beschreibt die Auswahl und Aufbereitung von Merkmalen, die zur Erstellung eines Machine Leaming Modells herangezogen werden.
Bevorzugt kann vorgesehen sein, dass die Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, bei einem Feature-Engineering die zentralen Momente 2. Ordnung (Standardabweichung) und 3. Ordnung (Skewness) zu berücksichtigen. Es kann vorgesehen sein, dass die Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, Merkmale aus einer Daten-Matrix zu bilden. Dabei kann die Auswerteeinheit dazu eingerichtet sein, Merkmale sowohl zeilen- als auch spaltenweise zu bilden. Bevorzugt kann vorgesehen sein, dass die Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, Merkmale mit schwachen Trenneigenschaften zu eliminieren, vorzugsweise mit Hilfe Fischer’ s Linearer Diskriminantenanalyse (LDA). Bevorzugt kann vorgesehen sein, dass die Auswerteeinheit dazu eingerichtet ist, die Treffsicherheit eines Klassifikators zu bestimmen, wobei sie bevorzugt für die Methode der 5 c 2-Kross-Validierung eingerichtet sein kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Messkopf für eine Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, welcher zum gemeinsamen Aussenden von Anregungsstrahlung in das Vogel ei und Empfangen von Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei, vorzugsweise durch ein einziges Loch in einer Eischale des Vogeleis hindurch, eingerichtet ist, ist vorgesehen, dass der Messkopf ein Lichtleitersystem mit einem Kopfende zum Aussenden der Anregungsstrahlung und Empfangen der der Fluoreszenzstrahlung aufweist. Die entsprechende Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befmchteten Vogelei ist insbesondere eine vorstehend genannte Vorrichtung.
Bei dem erfmdungsgemäßen Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogel ei, mit den Schritten
(a) Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich im Inneren des Vogeleis mittels einer Lichtquelle,
(b) zeit- und/oder spektralaufgelöste Fluoreszenzanalyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung mittels einer spektroskopischen Einrichtung, und
(c) Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten, wobei mittels eines Messkopfes, vorzugsweise durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch, gemeinsam die Anregungsstrahlung in das Vogelei ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei empfangen wird, ist vorgesehen, dass der Messkopf ein Lichtleiter System aufweist und das Aussenden der Anregungsstrahlung in das Vogelei und das Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei über ein an das Vogelei, vorzugsweise das Loch, herangeführtes Kopfende des Lichtleitersystems erfolgt.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des erfmdungsgemäßen Verfahrens wird also mittels des Messkopfes durch ein einziges Loch in der Eischale des Vogeleis hindurch gemeinsam die Anregungsstrahlung in das Vogelei ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei empfangen.
Der Durchführung des Verfahrens ist in der Regel ein Schritt eines Erstellens des Lochs in der Eierschale vorgelagert. Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass das Loch erstellt wird, ohne eine unter der Eischale liegende Eihaut zu öffnen. Die Fluoreszenzmessung kann durch diese Eihaut bzw. die Eihäute erfolgen.
Gemäß einer alternativen Ausgestaltung des erfmdungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass mittels des Messkopfes die Anregungsstrahlung in das Vogelei ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogelei empfangen wird, ohne dass die Eischale ein Loch aufweist. Die Anregungsstrahlung und die Fluoreszenzstrahlung durchdringen also jeweils die Eischale. Es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass mit dem vorbeschriebenen Verfahren trotzdem eine in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei möglich ist.
Gemäß einer weiteren alternativen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann vorgesehen sein, dass der Bereich im Inneren des Vogeleis aus dem Ei entnommen wird und die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) entsprechend außerhalb des Eis durchgeführt werden.
Dieses alternativen erfindungsgemäßen Verfahren zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem befruchteten Vogelei, weist die Schritte auf:
Entnehmen einer Probe aus dem Inneren des Vogeleis,
(a) Emission von Anregungsstrahlung für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich der Probe aus dem Inneren des Vogeleis mittels einer Lichtquelle,
(b) zeit- und/oder spektralaufgelöste Fluoreszenzanalyse von aus dem Bereich der Probe aus dem Inneren des Vogeleis emittierter Fluoreszenzstrahlung mittels einer spektroskopischen Einrichtung, und
(c) Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung ermittelten Daten, wobei mittels eines Messkopfes gemeinsam die Anregungsstrahlung in die Probe aus dem Inneren des Vogeleis ausgesandt und die Fluoreszenzstrahlung aus der Probe aus dem Inneren des Vogeleis empfangen wird, wobei der Messkopf ein Lichtleitersystem aufweist und das Aussenden der Anregungsstrahlung in die Probe aus dem Inneren des Vogeleis und das Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus der Probe aus dem Inneren des Vogeleis über ein an die Probe herangeführtes Kopfende des Lichtleiter Systems erfolgt.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen exemplarisch erläutert, wobei die nachfolgend dargestellten Merkmale sowohl jeweils einzeln als auch in Kombination einen Aspekt der Erfindung darstellen können. Es zeigen:
Fig. 1 einen Aufbau mit Vogelei und Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung bei diesem Vogelei gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung,
Fig. 2 eine Darstellung der entsprechende Spektren repräsentierenden Werte a jk von (a ji , . . . , a jn ) entsprechend der Wellenlänge l = 500.89 nm für ein männliches bzw. weibliches Hühnerei, und
Fig. 3 die Repräsentation eines Klassifikators (schwarze Linie) für das erste Szenario und Experiment 2 (6-tägig, durch Eihaut).
Die Fig. 1 zeigt in einer schematischen Darstellung einem Messaufbau mit mehreren Vogeleiern 10 und einer Vorrichtung 12 zur optischen in-ovo Geschlechtsbestimmung bei einem dieser Vogeleier 10. Die Vorrichtung 12 umfasst eine Lichtquelle 14 zur Emission von Anregungsstrahlung in Form von Lichtpulsen für eine Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich 16 im Inneren des Vogel eis 10, eine spektroskopischen Einrichtung 18 zur zeit- und/oder spektralaufgelösten Analyse von aus dem Bereich im Inneren des Vogel eis 10 emittierter Fluoreszenzstrahlung, einer computerbasierten Auswerteeinheit 20 zur Geschlechtsbestimmung aus den mittels der spektroskopischen Einrichtung 18 ermittelten Daten und einem Messkopf 22 zum gemeinsamen Aussenden der Anregungsstrahlung in das Vogel ei 10 und Empfangen der Fluoreszenzstrahlung aus dem Vogel ei 10 durch ein einziges Loch 24 in der Eischale 26 des Vogel eis 10 hindurch. Der Messkopf 22 weist ein Lichtleitersystem 28 mit einem Kopfende 30 zum Aussenden der Anregungsstrahlung und Empfangen der der Fluoreszenzstrahlung auf. Dieses Kopfende 30 ist auch das Kopfende des Messkopfes 22 und wird zum Messen an das Loch 24 in der Eischale 26 gehalten. Das Lichtleitersystem 28 des Messkopfes 22 ist Y-förmig ausgestaltet und umfasst zwei Lichtleiterstränge 32, 34, einen Lichtleiter sträng 32 für die Anregungsstrahlung und einen Lichtleiterstrang 34 für die Fluoreszenzstrahlung. Die beiden Lichtleiterstränge 32, 34 sind auf der Seite des Kopfendes 30 zusammengeführt. Die Lichtleiterstränge32, 34 sind jeweils als Lichtleiterbündel 36, 38 ausgebildet, deren einzelne Lichtleiter (im Detail nicht gezeigt) auf Seiten des Kopfendes 30 ineinandergeschlungen sind.
Die Lichtquelle 14 weist im gezeigten Beispiel einen Laser 40 zur Erzeugung von Laserpulsen und einer dem Laser 40 nachgeschalteten Frequenzverdoppler- Vorrichtung 42 auf. Die Lichtquelle 14 ist also eine gepulste Laserlichtquelle.
Die spektroskopische Einrichtung 18 weist im gezeigten Beispiel ein Spektrometer (einen Spektrographen) 44, einen als ICCD-Kamera ausgebildeten Mehrkanal detektor 46 und einen zwischen Spektrometer 44 und Mehrkanal detektor 46 zwischengeschalteten Shutter 48 auf. Eine Kopplung zwischen Laser 40 einerseits und Mehrkanaldetektor 46 und Shutter 48 andererseits erfolgt über einen sogenannten Q-Switch 50 und einen detektorseitigen Impulsgenerator 52. Als Auswerteeinheit 20 dient ein Computer.
Der Laser ist im Beispiel ein ND: YAG Laser mit einer Wellenlänge von 1064nm. Durch Frequenzverdoppelung wird eine Wellenlänge der Anregungsstrahlung von 266nm erreicht. Die laserinduzierten Fluoreszenzsignale werden von der Multi-Channel Detektor-ICCD- Kamera 46 aufgenommen. Das Faserbündel des Lichtleitersystems 28 leitet nicht nur den Laserstrahl auf die Probe, also das Innere des Vogel eis 10, sondern leitet auch das erzeugte Fluoreszenzlicht zum Detektor 46. Bei der Messung wird zu jedem Zeitpunkt das komplette Spektrum aufgenommen. So können ZLIF -Messungen direkt auf Oberflächen durchgeführt werden. Der Emissionsbereich liegt zwischen 300 und 600nm. Der entscheidende Bereich im Inneren des Vogel eis 10, in dem die Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, ist ein Keimscheiben-Bereich, ein Blutbahn-Bereich und/oder ein Bereich embryonaler Strukturen.
Im Folgenden wird ein Beispiel der in ovo Geschlechtsbestimmung bei 3- bis 6-tägigen gebrüteten Hühnereiern durch zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie (ZLIF) mittels der Vorrichtung 12 diskutiert.
Bei allen Untersuchungen ist die Ausrichtung des Bereichs 16 der embryonalen Strukturen (kurz: des Embryos) zum Messkopf 22 entscheidend. Die Position des Embryos kann durch das Schieren bestimmt werden. Dieses Beispiel betrifft die Untersuchungen von 3- bzw. 6- tägigen angebrüteten Eiern. Mit Hilfe des Messsystems können Hühnereier in drei Arten untersucht werden:
1. Messung durch die Eischale 26;
2. Messung ohne Eischale 26 durch die intakte Eihaut;
3. Messung direkt auf dem Embryo.
Für die Untersuchungen von 3- bzw. 6-tägigen angebrüteten Eiern 10 wurden die Hühnereier ausgerichtet und dann von oben durch die Eischale 26 gemessen. Bei Alternative zwei wurde die Eischale 26 vorsichtig entfernt, sodass eine Messung durch die intakte Eihaut durchgeführt werden konnte. Bei diesen beiden Versuchsarten kann die Ausrichtung des Embryos nicht fehlerfrei sichergestellt werden. Aus diesem Grund wurde bei der dritten Alternative die Eihaut entfernt und eine Messung direkt auf dem Embryo und auf den Blutadern wiederholt.
Die ZLIF -Messungen können in der Abhängigkeit von den äquidistant steigenden Zeiten ti, . . . , t h für einen festen n als Wertereihen oder gleichbedeutend als Signalreihen oder Vektoren a = («i , . . . , a n ) € i' 1 erfasst werden. Da zu jedem Zeitpunkt i j , j = 1, . . . , n das komplette Spektmm aufgenommen wird, ist es möglich die Weitereihen als (mathematische) Matrizen € K" 1X " zu definieren: wobei die Spalten i“ 1 / 5 · · · 5 a "ö) e von A die oben genannten Spektren zum Zeitpunkt X j sind. Somit entspricht das Ergebnis der ZLIF-Messung bei jedem einzelnen Vogelei einer Matrix aus zugehörigen Messwerten. Je nach der Art der ZLIF-Messung sowie Geschlecht von 3- bzw. 6-tägigen angebrüteten Eiern werden solche Matrizen einer der folgenden Klassen zugeordnet:
(Geschl. (m/w), Tag. (3/6), Art (ohne Eisch. durch int. Eih., Embr.)} .
Dabei wurden zur fehlerfreien Zuordnung der Geschlechter die Proben vom Embryo im Genlabor mittels quantitativ Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und entsprechenden Primer Sets analysiert.
Mit Methoden des Maschinellen Lernens (ML) kann ein System angelernt werden, welches eine direkte Geschlechtsbestimmung aus ZLIF -Messungen ermöglicht.
Dabei handelt es sich sowohl um die klassischen ML Methoden als auch um die eigenen ML relevanten wissenschaftlichen Publikationen der an dieser Patentanmeldung beteiligten Erfinder.
Für das Anlernen des Systems sind die Klassen unterschiedlicher Geschlechter dennoch gleicher Brutzeiten und gleicher Arten vom Interesse. Dies ist keine Einschränkung, da normalerweise sowohl die Brutzeiten als auch die Art der Messung bekannt sind. Die Überlegungen führen zum binären Klassifikationsproblem für die zwei Klassen:
Cx (für weiblich) und CY (für männlich).
Für eine Menge von Hühnereiern gleicher Brutzeiten werden ZLIF-Messungen gleicher Art durchgeführt. Des Weiteren werden die Hühnereier mittels qPCR einer der Klassen Cx oder CY zugeordnet . Somit erhalten wir Objekte mit G Cx oder Ay G C y m y den Strukturen entsprechend oben beschriebenen Matrizen A.
Zum Anlernen des Systems für direkte Geschlechtsbestimmung wird folgende Merkmalsextraktion vom Objekt A durchgeführt. Es wird dabei angenommen, dass die Werte einzelner Zeilen von A, also (ay, . . . , a_ jn ), j = 1, . . . ,m durch statistische Verteilungen beschrieben sind. Physikalisch bedeuten die Zeilen die zeitaufgelöste Messungen für bestimmte feste Wellenlängen. Fig. 2 repräsentiert das Beispiele einer Zeile (ay, . . . , ay) für ein festes j entsprechend der Wellenlänge l = 500.89nm für die Messung bei einem männlichen (m) bzw. weiblichen (w) Hühnerei. Aus der Darstellung ist ersichtlich, dass durch unterschiedliche Formen der Messungsreihen die Klassifikation prinzipiell möglich ist.
Zentrale Momente von a j := (ay, . . . , ay), j = 1, . . . ,m beschreiben statistische Eigenschaften von a j . Die ersten drei Momente sind Mittelwert m, Standardabweichung s und Schiefe S:
Für jedes Objekt sind jeweils m Merkmale (a j ) und m Merkmale S(a j ),j = 1, . . . ,m extrahiert. Der Merkmalsvektor f £ M 2 " jedes Objekts ist somit: f = (s(bi), . . . , s(& ih ), S(ai), . . . , S(a m )) -
Elm die Treffsicherheit der Klassifikation von Cx und CY zufrieden zu stellen, wird Merkmalsselektion durchgeführt. Mit Hilfe von „Fisher’ s Linear Diskriminant Analysis“ (LDA) werden dabei die Merkmale mit schwachen Trenneigenschaften eliminiert, da diese zur Klassifikation zu geringen Beitrag liefern und Ergebnisse verschlechtern können. Die Merkmale mit starken Trenneigenschaften werden zur Konstruktion einer Klassifikations hyperebene mittels LDA verwendet. Zum Anlernen und Validieren des Systems für die direkte Geschlechtsbestimmung sind mehrere Datensätze generiert worden. Dafür wurde eine Mengen Mi von 12 + 13 Hühnereiern genommen und Messungen durchgeführt. Insgesamt waren es ca. 30 Hühnereier, dennoch das Geschlecht mittels qPCR konnte nicht für alle bestimmt werden. Zu einem späteren Zeitpunkt fand die nächste ZLIF -Messung an einer anderen Menge M2 von 15+10 Hühnereiern statt. Hier waren es anfangs 40 Hühnereier, aber wie in dem ersten Versuch konnte das Geschlecht nicht für alle bestimmt werden. Diese beiden Versuche sollen zeigen, dass die beschriebene Methode zur direkten Geschlechtsbestimmung geeignet ist. Mindestens zwei Messungen sind für die Validierung der Ergebnisse notwendig.
Im ersten Versuch mit der Menge Mi sind 12 Hühnereier (6m+6w, 3-tägige Embryos) sowie 13 Hühnereier (6m+7w, 6-tägig erst ohne Eischale durch die intakte Eihaut, danach an Embryos) mit ZLIF gemessen worden. Im zweiten Versuch mit der Menge M2 sind 15 Hühnereier (3m+12w, 3-tägige Embryos) sowie 18 Hühnereier (14m+4w, 6-tägig erst ohne Eischale durch die intakte Eihaut, danach an Embryos) gemessen worden. An jedem Hühnerei sind die ZLIF -Messungen 15 mal wiederholt worden. Somit liefert jedes Hühnerei 15 Objekte für eine der Klassen. Zusammengefasst in Tabelle 1 sind die zwei Versuche mit je drei Experimenten.
Tabelle 1: Zwei Versuche je drei Experimente zum Aiilcrnen und Validieren des System. Die Bezeichnung Obj. stellt für die Anzahl von Objekten.
Für die gewählte Zeitauflösung gilt n = 20, das Spektrum ist äquidistant aufgenommen beginnend mit l~ 200, 08nm bis l ~ 596, 75nm und es gilt m = 1024. Die Merkmalsvektoren jedes Objekts entsprechen somit: und haben die Längen 2 · m = 2048. Für das Anlernen und Validieren des Systems sind zwei Szenarien getestet worden. Im ersten Fall bestehen die Klassen Cx und C Y aus den Objekten von beiden VersuchenMi undiVh und zum Anlemen und Testen des Systems wird zwischen Versuchen nicht unterschieden. In C Y im Experiment 1. sind es also 135 Objekte, im Experiment 2. sind es 300 und im 3. sind es auch 300 Objekte. In Cx im Experiment 1. sind es 270 Objekte, im Experiment 2 sind es 165 und im Experiment 3 sind es 165 Objekte.
Anschließend sind die Klassen Cx und C Y je in Trainingsobjekte und Testobjekte zufällig unterteil worden. Der Klassifikator wird für die Trainingsobjekte designet und an den Testobjekten wird die Treffsicherheit des Klassifikators überprüft. Zum Bestimmen der Treffsicherheit des Klassifikators verwenden wir die Methode der 5 c 2-Cross-Validierung. Dies ist eine etablierte Methode für die Bestimmung der Treffsicherheit eines Klassifikators. Die Idee der 5 x 2-Kross-Validierung ist die Anzahl von Trainingsobjekten und die Anzahl von Testobjekten gleich zu nehmen, sodass man wechseln kann die Trainingsmenge zur Testmenge und umgekehrt. Die Ergebnisse der 5 x 2-Kross-Validierung liefern einen zuverlässigen Mittelwert für die Treffsicherheit. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse gelistet.
Tabelle 2: Ergebnisse der 5 X 2-Kross- Validierung für Objekte aus beiden Versuchen.
Fig. 3zeigt die Repräsentation eines entsprechenden Klassifikators (schwarze Linie) für das erste Szenario und Experiment 2 (6-tägig, durch Eihaut).
Im zweiten Szenario wird beim Anlernen und Testen zwischen Versuchen unterschieden. Beim zweiten Versuch sind es mehr Objekte als beim ersten. Es wird hier erwartet, dass das System stabiler ist je mehr Objekte zum Trainieren verwendet werden. Aus diesem Grund wird der Klassifikator an den Objekten aus dem Versuch 2. trainiert und an den Objekten aus dem Versuch 1. getestet. Die Ergebnisse findet man in nachstehend aufgeführter Tabelle 3.
Tabelle 3: Ergebnisse für Treffsicherheit beim Trainieren an Objekten aus M2 und Testen an M \ .
Fazit: Die durchgeführten Experimente zeigen, dass eine direkte Geschlechtsbestimmung bei gebrüteten Hühnereiern mittels ZLIF möglich ist. Die Brutzeiten liegen dabei zwischen 3 und 6 Tagen. Es können eine zuverlässige Treffsicherheit zwischen 76.67% und 92.27% erreicht werden. Diese Methode hat ein großes Potenzial zur Verbesserung der Treffsicherheit. Die Potenziale basieren sowohl auf der Optimierung des ZLIF -Experiments als auch auf der Optimierung der Merkmalsextraktion, Merkmalsselektion und des Designs des Klassifikators.
Bezugszeichen 10 Vogel ei
12 Vorrichtung zur in-ovo Geschlechtsbestimmung
14 Lichtquelle
16 Bereich (im Vogelei)
18 spektroskopische Einrichtung
20 Auswerteeinheit
22 Messkopf
24 Loch (in Eischale)
26 Eischale
28 Lichtleitersystem
30 Kopfende
32 Lichtleiter sträng
34 Lichtleiterstrang
36 Lichtleiterbündel
38 Lichtleiterbündel
40 Laser
42 Frequenzverdoppler- Vorrichtung
44 Spektrometer
46 Mehrkanal detektor
48 Shutter
50 Q-Switch
52 Impulsgenerator