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Title:
ENDOGLUCANASE PPCE AND CELLULASE PREPARATION CONTAINING THE SAME
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2008/111613
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed are: a novel endoglucanase PPCE which is derived from Penicillium pinophilum; a cellulase preparation containing the endoglucanase PPCE; and a method for the treatment of a cellulose-containing fiber utilizing the endoglucanase PPCE or the cellulase preparation. The endoglucanase PPCE is highly active to a fiber, and has a low optimal temperature and a strongly acidic optimal pH.

Inventors:
MORIYA TATSUKI (JP)
NAKANE AKITAKA (JP)
TSUJIUCHI GOH (JP)
FUKUSHIMA TAKAYOSHI (JP)
Application Number:
PCT/JP2008/054511
Publication Date:
September 18, 2008
Filing Date:
March 12, 2008
Export Citation:
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Assignee:
MEIJI SEIKA KAISHA (JP)
MORIYA TATSUKI (JP)
NAKANE AKITAKA (JP)
TSUJIUCHI GOH (JP)
FUKUSHIMA TAKAYOSHI (JP)
International Classes:
C12N15/09; C11D3/386; C11D7/42; C12N1/15; C12N1/19; C12N9/24; C12N9/42; C12P7/08; C12P21/02; D06L4/40; D06M16/00; D21C5/02; D21C9/00; D21H17/22
Domestic Patent References:
WO2005054475A12005-06-16
WO2001090375A12001-11-29
WO1998003640A11998-01-29
WO2001090375A12001-11-29
WO2000024879A12000-05-04
WO1998054332A11998-12-03
WO1991017243A11991-11-14
WO1998003667A11998-01-29
WO2005054475A12005-06-16
WO1998011239A11998-03-19
WO2005056787A12005-06-23
Foreign References:
JP2004313022A2004-11-11
RU2238974C22004-10-27
EP0307564A21989-03-22
RU2238974C22004-10-27
Other References:
BHAT K., MCCRAE S., WOOD T.: "The endo-(1 4)-beta-D-glucanase system of Pencillium pinophilum cellulase: Isolation, purification, and characterization of five major endoglucanase components", CARBOHYDRATE RESEARCH, vol. 190, no. 2, 1989, pages 279 - 297, XP008117784
CURRENT GENETICS, NEW YORK, NY, US, vol. 41, no. 2, 1 May 2002 (2002-05-01)
See also references of EP 2135944A4
Attorney, Agent or Firm:
MORITA, Kenichi (Itabashi-chuo Bldg. 67-8, Itabashi 2-chome, Itabashi-k, Tokyo 04, JP)
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Claims:
 以下の(a)、(b)、及び(c)の特性を有するタンパク質。
 (a)ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )由来であり、
 (b)エンドグルカナーゼ活性を有し、
 (c)N末端のアミノ酸配列が、(1)配列番号2で表わされる配列、または、(2)配列番号2で表される配列において、1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加した配列である。
 以下の(d)の特性を有する請求項1に記載のタンパク質。
 (d)ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により測定した平均分子量が25kD~27kDのタンパク質。
 以下の(e)~(i)から選択される、タンパク質。
 (e)配列番号4で表わされる16位~236位のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
 (f)配列番号4で表わされる1位~236位のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
 (g)配列番号30で表されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
 (h)配列番号4で表される16位~236位又は1位~236位のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、及び/又は修飾されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質。
 (i)配列番号4で表される16位~236位若しくは1位~236位のアミノ酸配列、又は配列番号30で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
 請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
 以下の(j)、(k)から選択される、ポリヌクレオチド。
 (j)配列番号3又は28で表わされる塩基配列、又は配列番号3又は28で表される46位~834位の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
 (k)配列番号3又は28で表わされる塩基配列又は配列番号3又は28で表される46位~834位の塩基配列において、1個又は複数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
 請求項4又は5に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
 請求項6に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
 宿主が酵母又は糸状菌である、請求項7に記載の宿主細胞。
 糸状菌が、トリコデルマ( Trichoderma )属、フミコーラ( Humicola )属、アスペルギルス( Aspergillus )属、アクレモニウム( Acremonium )属又はペニシリウム( Penicillium )属に属する微生物である、請求項8に記載の宿主細胞。
 糸状菌が、トリコデルマ( Trichoderma )属に属する微生物である、請求項9に記載の宿主細胞。
 糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )である、請求項10に記載の宿主細胞。
 請求項7~請求項11のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
 請求項12に記載の方法で生産されたタンパク質。
 請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
 請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項14に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
 セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれかの一項に記載のタンパク質、請求項14に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項15に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
 セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項14に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項15に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
 着色されたセルロース含有繊維の色を局所的に変化させる方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項14に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項15に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
 着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項14に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項15に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
 セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を遅延させる方法、又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項14に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項15に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
 セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項14に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項15に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
 洗剤組成物と接触させる工程が、その繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求項16~請求項21のいずれか一項に記載の方法。
 古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項14に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
 紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項14に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
 動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項14に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
 セルロース系の物質を分解・糖化し、バイオマスエタノールを製造する方法であって、セルロース系物質を、請求項1~請求項3及び請求項13のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項14に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
Description:
エンドグルカナーゼPPCEおよびそ れを含んでなるセルラーゼ調製物

 本発明は、エンドグルカナーゼPPCE(Endogluc anase PPCE)及びそれを含んでなるセルラーゼ調 製物、並びにそれらを利用したセルロース含 有繊維の処理方法に関する。

 従来から、セルロース含有繊維を、その 維に所望の特性を与えるためにセルラーゼ 処理することが行われている。例えば、繊 業界においては、セルロース含有繊維の肌 り及び外観を改善するために、又は着色さ たセルロース含有繊維にその色の局所的な 化を提供する「ストーンウォッシュ」の外 を与えるために、セルラーゼによる処理が われてきた〔特許文献1〕。

 この様な用途に用いられるセルラーゼとし 、ファミリー45に属するエンドグルカナー や、ファミリー5に属するエンドグルカナー 、ファミリー12に属するエンドグルカナー が挙げられる。当該分野において、これら エンドグルカナーゼは、その特徴(例えば、 適pH、至適温度、繊維に対する風合い改善 果、繊維強度に対する影響など)に合わせて 区別して使い分けられることが一般的であ 。ファミリー45に属するエンドグルカナー は主に中性領域で、ファミリー12に属するエ ンドグルカナーゼは酸性~中性領域で、ファ リー5に属するエンドグルカナーゼは酸性領 で使用される例が多い。ファミリー45に属 るエンドグルカナーゼの一例として、フミ ーラ( Humicola )属由来の精製された43kDエンドグルカナーゼ 分〔特許文献2〕や、フミコーラ属由来のエ ンドグルカナーゼNCE5〔特許文献3〕、リゾプ ( Rhizopus )属由来のエンドグルカナーゼRCEI〔特許文献4 〕などが挙げられる。

 また、ファミリー5に属するエンドグルカナ ーゼの一例として、トリコデルマ( Trichoderma )属由来のSCE3〔特許文献5〕などが挙げられる 。ファミリー12に属するエンドグルカナーゼ 一例として、トリコデルマ( Trichoderma )属由来のEGIII〔非特許文献1〕や、アスペル ルス( Aspergillus )属由来のFI-CMCase〔非特許文献2〕が挙げられ 。また、ペニシリウム( Penicillium )属菌も分子量25kDのエンドグルカナーゼを生 することが知られている〔非特許文献3〕。

 これらの酵素を使用して繊維加工を行う 合、それぞれの至適条件下で反応を行うの 一般的である。これら現在までに報告され いる酵素の至適温度は中温域(例えば、40℃~ 60℃)であり、至適pHは、酸性から中性(例えば 、pH4.0~8.0)付近である。当該分野において、 温(例えば40℃未満)や強酸性(例えば、pH4.0未 )に至適を有する酵素が工業化され、恒常的 に使用されている例はない。一方、工業的な セルロース含有繊維の処理においては、多く の場合、セルラーゼ調製物は、多量の高活性 エンドグルカナーゼを含む調製物として提供 されている。その製造方法としては、遺伝子 組換えの技術を用いて、目的の高活性エンド グルカナーゼ成分を宿主細胞において大量に 発現させる方法が知られている〔特許文献6 特許文献7〕。

 そして、これらの方法において好ましい宿 細胞としては、不完全菌類に属する糸状菌 例えば、アスペルギルス( Aspergillus )属、フミコーラ( Humicola )属、トリコデルマ( Trichoderma )属の糸状菌等が挙げられている。更に、酸 または強酸性領域での繊維加工に用いるセ ラーゼを生産させる場合、宿主由来のセル ーゼとの相乗作用が期待できることから、 性セルラーゼを生産するアスペルギルス( Aspergillus )属やフミコーラ( Humicola )属の糸状菌よりも、酸性セルラーゼを生産 るトリコデルマ( Trichoderma )属を宿主とする方が適している。特に、工 レベルでの酵素の生産を考慮した場合、生 性の高いトリコデルマ( Trichoderma )属の菌は極めて優良な宿主となる〔特許文 8〕。しかしながら、異種由来の遺伝子を、 リコデルマ( Trichoderma )属の糸状菌において発現させる際、その塩 配列上の特性が異なる(遺伝子のコドン使用 度が違う)等の理由で、発現が妨げられる場 合が多い。そのため、異種由来の遺伝子に対 して改変操作を行うことが必要となる。例え ば、接合菌類に属するリゾプス属由来のエン ドグルカナーゼRCEIをフミコーラ・インソレ スにおいて大量発現させるためには、RCEIを ードする遺伝子を宿主細胞のコドン使用頻 に合わせて最適化しなければならない〔特 文献9〕。しかし、このように最適化された としても、通常、同種遺伝子の発現量と同程 度の発現量を得ることは難しいことが予想さ れている。また、実際に異種由来遺伝子が発 現し、宿主により生産された目的の酵素が、 培養中に培養液中のプロテアーゼなどによる 分解を受け、分解物もしくは部分分解物とし て得られてくる場合も予想される。

欧州特許第307,564号

国際公開第98/03640号

国際公開第01/090375号

国際公開第00/24879号

国際公開第98/54332号

国際公開第91/17243号

国際公開第98/03667号

国際公開第05/054475号

国際公開第00/24879号 Okada,H.et.al., “Appl.Environ.Microbiol”64, 1998 年, p.555-563 Ooi,T.et.al., “Nucleic Acids Research”18, 1990 年, p.5884 K.Mahalingeshwaraet.al., “Carbohydrate Research” 190, 1989年, p.279-297

 これまでに、繊維加工用途に使用するため 、フミコーラ( Humicola )属、トリコデルマ( Trichoderma )属、リゾプス( Rhizopus )属、ムコール( Mucor )属、ファイコマイセス( Phycomyces )属、スタフィロトリカム( Staphylotrichum )属などの様々な糸状菌からセルラーゼが単 され、それらセルラーゼをコードする遺伝 が単離されている。特にセルラーゼファミ ー5、ファミリー12、ファミリー45に属する糸 状菌由来の酵素群は繊維加工処理において優 れた効果を示すことから、当該分野において 広く使用されている。しかしながら、これら 一連の酵素群は、至適温度が中温、至適pHが 性から中性の酵素であり、低温酵素や強酸 酵素ではない。当該分野では、繊維に対し 高活性であり、至適温度が低温である酵素 、至適pHが強酸性である酵素が強く求めら ている。更に、このような特殊なプロファ ルを有する酵素が実用化されるためには、 良な宿主であるトリコデルマ属などの糸状 において遺伝子の大量発現を成し遂げ、安 で高活性なセルラーゼ調製物を提供する必 がある。このようなセルラーゼ調製物が実 化されれば、その産業的価値は計り知れな が、未だそのようなセルラーゼ調製物は実 化されておらず、また遺伝子組換えに関す 製造法の報告もない。

 本発明者らは、今般、ペニシリウム・ピノ ィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株(FERM BP-10780株)から、新規なエンドグ カナーゼ活性を有するタンパク質及びその 伝子を見出した。本発明は、エンドグルカ ーゼPPCE(Endoglucanase
PPCE)及びそれを含むセルラーゼ調製物、並び それらを利用したセルロース含有繊維の処 方法を提供するものである。本発明者は、 ニシリウム・ピノフィラム( Penicillium
pinophilum )PF1365株(FERM BP-10780株)から単離された新規な ンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質 極めて高いセルロース含有繊維の外観改善 果及び、着色されたセルロース含有繊維の ストーンウォッシュ」の外観付与効果を有 ることを見出した。特にエンドグルカナー PPCE(以下「PPCE」と略記することもある)は、 代表的な繊維加工用セルラーゼとして主に酸 性条件下で広く使用されているエンドグルカ ナーゼSCE3〔特許文献5〕やEGIII〔非特許文献1 に比べ、顕著に高い繊維処理効果を有して た。更に、そのエンドグルカナーゼPPCEは、 その至適pH、至適温度が従来より知られてい 繊維加工用セルラーゼと比較して顕著に低 、pH3、30℃付近であるという驚くべき知見 得た。またこれは、繊維加工用としての使 例はないが、ペニシリウム・ピィノフィラ IMI87160ii株由来であるエンドグルカナーゼIの 至適温度(50~55℃)、至適pH(4.0~5.0)〔非特許文献 3〕と比較しても顕著に低いものであった。

 更に本発明者らは、ペニシリウム・ピノフ ラムPF1365株(FERM BP-10780株)由来エンドグルカ ナーゼPPCEをコードする遺伝子を単離し、セ ラーゼ cbhI 遺伝子の制御配列[国際公開第98/11239号]を利 して、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )において、工業化可能な程度にPPCEを高生産 ることに成功した。従って、本発明は、ペ シリウム・ピノフィラム( Penicillium
pinophilum ) PF1365株(FERM BP-10780株)由来のエンドグルカ ーゼ活性を有する新規なタンパク質及びそ 遺伝子、並びに前記タンパク質を含有し、 好な特性を有するセルラーゼ調製物を提供 るものである。また、本発明は、前記タン ク質をコードする遺伝子によって形質転換 れた宿主細胞、及び前記宿主細胞を培養し 目的タンパク質を採取する方法を提供する のである。更に、本発明のタンパク質又は 発明のセルラーゼ調製物によりセルロース 有繊維を処理する方法を提供するものであ 。

 すなわち、本発明は以下の発明を包含する
(1)以下の(a)、(b)、及び(c)の特性を有するタン パク質。
 (a)ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )由来であり、
 (b)エンドグルカナーゼ活性を有し、
 (c)N末端のアミノ酸配列が、(1)配列番号2で わされる配列、または、(2)配列番号2で表さ る配列において、1個のアミノ酸が欠失、置 換、又は付加した配列である。
(2)以下の(d)の特性を有する(1)に記載のタンパ ク質。
 (d)ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルア ミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により測定した平 分子量が25kD~27kDのタンパク質。
(3)以下の(e)~(i)から選択される、タンパク質
 (e)配列番号4で表わされる16位~236位のアミノ 酸配列を含む、タンパク質。
 (f)配列番号4で表わされる1位~236位のアミノ 配列を含む、タンパク質。
 (g)配列番号30で表されるアミノ酸配列を含 、タンパク質。
 (h)配列番号4で表される16位~236位又は1位~236 のアミノ酸配列において、1個又は複数個の アミノ酸が欠失、置換、付加、及び/又は修 されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグ カナーゼ活性を有する改変タンパク質。
 (i)配列番号4で表される16位~236位若しくは1 ~236位のアミノ酸配列、又は配列番号30で表 れるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有す アミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナ ゼ活性を有する相同タンパク質。
(4)(1)~(3)のいずれか一項に記載のタンパク質 コードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(j)、(k)から選択される、ポリヌクレ オチド。
 (j)配列番号3又は28で表わされる塩基配列、 は配列番号3又は28で表される46位~834位の塩 配列を含むポリヌクレオチド。
 (k)配列番号3又は28で表わされる塩基配列又 配列番号3又は28で表される46位~834位の塩基 列において、1個又は複数個の塩基が欠失、 置換、及び/又は付加された塩基配列を含み かつエンドグルカナーゼ活性を有するタン ク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)(4)又は(5)に記載のポリヌクレオチドを含む 発現ベクター。
(7)(6)に記載の発現ベクターにより形質転換さ れた、宿主細胞。
(8)宿主が酵母又は糸状菌である、(7)に記載の 宿主細胞。
(9)糸状菌が、トリコデルマ( Trichoderma )属、フミコーラ( Humicola )属、アスペルギルス( Aspergillus )属、アクレモニウム( Acremonium )属又はペニシリウム( Penicillium )属に属する微生物である、(8)に記載の宿主 胞。
(10)糸状菌が、トリコデルマ( Trichoderma )属に属する微生物である、(9)に記載の宿主 胞。
(11)糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )である、(10)に記載の宿主細胞。
(12)(7)~(11)のいずれか一項に記載の宿主細胞を 培養する工程、及び前記培養によって得られ る宿主細胞又はその培養物から(1)~(3)のいず か一項に記載のタンパク質を採取する工程 含む、タンパク質の製造方法。
(13)(12)に記載の方法で生産されたタンパク質
(14)(1)~(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタン パク質を含む、セルラーゼ調製物。
(15)(1)~(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタン パク質、又は(14)に記載のセルラーゼ調製物 含む、洗剤組成物。
(16)セルロース含有繊維の処理方法であって セルロース含有繊維を、(1)~(3)及び(13)のいず れかの一項に記載のタンパク質、(14)に記載 セルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組 物と接触させる工程を含む、方法。
(17)セルロース含有繊維の肌触り及び外観の 善を目的として減量加工する方法であって セルロース含有繊維を、(1)~(3)及び(13)のいず れか一項に記載のタンパク質、(14)に記載の ルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成 と接触させる工程を含む、方法。
(18)着色されたセルロース含有繊維の色を局 的に変化させる方法であって、着色された ルロース含有繊維を、(1)~(3)及び(13)のいずれ か一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセ ラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物 接触させる工程を含む、方法。
(19)着色されたセルロース含有繊維の色を澄 化する方法であって、着色されたセルロー 含有繊維を、(1)~(3)及び(13)のいずれか一項に 記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ 製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触さ る工程を含む、方法。
(20)セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速 を遅延させる方法、又はセルロース含有繊 の毛羽立ちを低減させる方法であって、セ ロース含有繊維を、(1)~(3)及び(13)のいずれか 一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセル ーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と 触させる工程を含む、方法。
(21)セルロース含有繊維がごわつき始める速 を低減させるか又はセルロース含有繊維の わつきを低減する方法であって、セルロー 含有繊維を、(1)~(3)及び(13)のいずれか一項に 記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ 製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触さ る工程を含む、方法。
(22)洗剤組成物と接触させる工程が、その繊 の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われ (16)~(21)のいずれか一項に記載の方法。
(23)古紙を脱インキ薬品により処理して脱イ キを行う工程において、(1)~(3)及び(13)のいず れか一項に記載のタンパク質、又は(14)に記 のセルラーゼ調製物を用いることを特徴と る、古紙の脱インキ方法。
(24)紙パルプのろ水性の改善方法であって、 パルプを、(1)~(3)及び(13)のいずれか一項に記 載のタンパク質、又は(14)に記載のセルラー 調製物で処理する工程を含む、方法。
(25)動物飼料の消化能を改善する方法であっ 、動物飼料を、(1)~(3)及び(13)のいずれか一項 に記載のタンパク質、又は(14)に記載のセル ーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
(26)セルロース系の物質を分解・糖化し、バ オマスエタノールを製造する方法であって セルロース系物質を、(1)~(3)及び(13)のいずれ か一項に記載のタンパク質、又は(14)に記載 セルラーゼ調製物で処理する工程を含む、 法。

 本発明のタンパク質、エンドグルカナー PPCEは、セルロース含有繊維の肌触り及び外 観の改善、色の局所的変化、色の澄明化、毛 羽立ちの低減、ごわつきの低減等を目的とし た繊維加工、並びに洗剤用途に有用である。

エンドグルカナーゼ活性を有する タンパク質
 本明細書において「エンドグルカナーゼ」 は、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素 すなわちエンド-1,4-β-グルカナーゼ(EC3.2.1.4) を意味し、前記酵素は、β-1,4-グルカンのβ-1, 4-グルコピラノシル結合を加水分解する。

 また、本明細書の「エンドグルカナーゼ 性」とは、CMCアーゼ活性を意味する。更に 「CMCアーゼ活性」とは、カルボキシメチル ルロース(CMC、東京化成工業株式会社製)を 水分解する活性を意味し、被験タンパク質 CMC溶液を一定時間インキュベーションした に遊離してくる還元糖量を測定して、1分間 1μmolのグルコース相当の還元糖を生成する 素量を1単位と定義する。

 エンドグルカナーゼ活性は、例えば、次 ような手順により測定することができる。 ず、被験タンパク質を含む溶液0.5mLを、2%の CMCを溶解させた50mmol/L酢酸-酢酸ナトリウム緩 衝液(pH6.0)0.5mLに添加し、50℃で30分間インキ ベーションする。次いで、得られる反応液 生成還元糖濃度を、3,5-ジニトロサリチル酸 (DNS法)で定量する。すなわち、反応30分後の 反応液1.0mL中にDNS試薬3.0mLを添加し、沸騰水 中で5分間インキュベーションした後、蒸留 8.0mLで希釈し、540nmの吸光度を測定する。段 階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量 線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量を グルコース換算で決定する。1分間に1μmolの ルコース相当の還元糖を生成する酵素量を1 位として活性を算出する。

 なお、DNS試薬は文献(例えば、「生物化学 実験法1-還元糖の定量法」、p.19~20、福井作蔵 著、学会出版センター)の記載に従って調製 ることができるが、例えば、次のような手 で調製することができる。まず、4.5%水酸化 トリウム水溶液300mLに、1%3,5-ジニトロサリ ル酸溶液880mL、及びロッセル塩255gを添加す (溶液A)。別に、1.0%水酸化ナトリウム水溶液2 2mLに結晶フェノール10gを加え、更に水を加え て溶解して100mLとする(溶液B)。溶液B69mLに炭 水素ナトリウム6.9gを加えて溶解させ、溶液A を注いでロッセル塩が十分に溶解するまで攪 拌混合し、2日間放置した後に濾過する。

 本発明によるタンパク質は、糸状菌類、具 的には、ペニシリウム( Penicillium )属に属する微生物、好ましくは、ペニシリ ム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )、より好ましくはペニシリウム・ピノフィ ム( Penicillium
pinophilum )PF1365株(FERM BP-10780株)から取得することがで る。また、これらはその変異株であっても い。更に、本発明によるタンパク質は、典 的には、そのN末端のアミノ酸配列が配列番 号2で表わされる配列を有する。N末端のアミ 酸配列は、例えば後述の実施例2で示した方 法により決定することができる。本発明によ れば、ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium
pinophilum )由来の、下記の特性を有するタンパク質が 供される:
 (A)エンドグルカナーゼ活性を有し、
 (B)N末端のアミノ酸配列が、(1)配列番号2で わされる配列、または、(2)配列番号2で表さ る配列において、1個のアミノ酸が欠失、置 換、又は付加した配列を有し、
 (C)SDS-PAGEにより測定した平均分子量が25kD~27k Dである。
ここで、SDS-PAGEによる平均分子量は、実施例1 に示した方法によって決定することができる 。また、ペニシリウム・ピノフィラム由来の 本発明によるタンパク質は、典型的には、配 列番号4で表わされる16位~236位のアミノ酸配 からなり、そのN末端グルタミン(Gln)残基が ログルタミン酸残基(pyroGlu)に修飾されてい (すなわち、配列番号30で表されるアミノ酸 列からなる)。

 本発明の別の態様では、配列番号4で表わ されるアミノ酸配列(又はその部分配列)を含 タンパク質、並びにその改変タンパク質又 その相同タンパク質が提供される。「配列 号4で表わされるアミノ酸配列又はその部分 配列を含むタンパク質」には、例えば、配列 番号4で表わされる16位~236位のアミノ酸配列 有する成熟タンパク質;1位~236位のアミノ酸 列を含むシグナルペプチド(1位~15位)が付加 れたアミノ酸配列を有する前駆体タンパク ;配列番号4で表される16位~236位のアミノ酸配 列を有する成熟タンパク質のN末端及び/又はC 末端に、適当な配列が付加されたアミノ酸配 列からなるタンパク質;並びに配列番号4で表 れる16位~236位のアミノ酸配列を有する成熟 ンパク質のN末端及び/又はC末端のアミノ酸 修飾されたタンパク質が含まれる。本発明 おける「アミノ酸配列の付加」には、配列 号4で表される16位~236位のアミノ酸配列を有 する成熟タンパク質のN末端に配列番号4で表 れる1位~15位のシグナルペプチドの一部また は全部のアミノ酸が付加されることを含む。 また、本発明における「アミノ酸配列の修飾 」には、配列番号4で表される16位~236位のア ノ酸配列を有する成熟タンパク質のN末端が 主由来の酵素により、修飾されることを含 。本修飾には、該成熟タンパク質のN末端グ ルタミン(Gln)残基がピログルタミン酸残基(pyr oGlu)に修飾されることを含む。

 シグナルペプチドは、例えば、配列番号4 で表される1位~15位のアミノ酸配列、即ち配 番号3で表わされる塩基配列において、1~3位 ATGで始まり、43~45位で終了するヌクレオチ 配列からコードされる15アミノ酸残基からな るアミノ酸配列である。本発明における「改 変タンパク質」とは、配列番号4で表わされ アミノ酸配列(又はその部分配列)において、 1個又は複数個(好ましくは、1又は数個)のア ノ酸が欠失、置換、付加、及び/又は修飾さ たアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカ ーゼ活性を有するタンパク質である。

 ここで、「欠失、置換、又は付加」など 改変に係るアミノ酸の数は、1個又は複数個 (好ましくは、1又は数個)、例えば、1~20個、 ましくは1~10個、より好ましくは1~5個、更に ましくは1~3個である。更に、改変タンパク には、配列番号4で表わされるアミノ酸配列 において、1個又は複数個のアミノ酸残基が 保存的置換されたアミノ酸配列を含み、か エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク を包含する。

 ここで、「保存的置換」とは、タンパク の活性を実質的に改変しないように1個又は 複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似 したアミノ酸で置き換えることを意味する。 例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基に よって置換する場合、ある極性残基を同じ電 荷を有する別の極性残基によって置換する場 合などが挙げられる。このような保存的置換 を行うことができる機能的に類似のアミノ酸 は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知 である。具体的には、非極性(疎水性)アミノ としては、アラニン、バリン、イソロイシ 、ロイシン、プロリン、トリプトファン、 ェニルアラニン、メチオニン等が挙げられ 。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン セリン、スレオニン、チロシン、グルタミ 、アスパラギン、システイン等が挙げられ 。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、 アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げら れる。

 また、負電荷(酸性)アミノ酸としては、 スパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられ 。本発明のタンパク質は、例えば実施例1に 載のように微生物から単離、精製すること より得ることができる。また、後述のよう 遺伝子組換え技術により本発明のタンパク をコードするポリヌクレオチドを適当な宿 において発現させ、生産されたタンパク質 単離、精製することによっても得ることが きる。

 本発明の相同タンパク質としては、配列番 4で表される16位~236位若しくは1位~236位のア ノ酸配列、又は配列番号30で表されるアミ 酸配列と90%以上(好ましくは95%以上、より好 しくは98%以上、更に好ましくは99%以上)の相 同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエン ドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質 を挙げることができる。本明細書において「 相同性」とは、市販の遺伝子情報処理ソフト ウェアGENETYX(ゼネティックス社製)により、ホ モロジーサーチ機能のデフォルト条件にて算 出した相同性を意味する。
デフォルト条件:
 Unit Size to Compare = 2
 Pick up Location = 1

エンドグルカナーゼ活性を有する タンパク質をコードするポリヌクレオチド
 本発明によれば、配列番号4で表わされるア ミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク 質、または、改変タンパク質をコードするポ リヌクレオチドが提供される。タンパク質の アミノ酸配列が与えられれば、それをコード する塩基配列は容易に定まり、よって、本発 明のタンパク質をコードする種々の塩基配列 を選択することができる。なお、本明細書に おいて、用語「ポリヌクレオチド」には、DNA 及びRNAの両方が含まれ、DNAが好ましい。

 本発明のポリヌクレオチドは、典型的には 下記からなる群より選択されるものである:
 (a)配列番号3又は28で表わされる塩基配列(又 はその部分配列)を含むポリヌクレオチド、
 (b)配列番号3又は28で表わされる塩基配列(又 はその部分配列)において、1個又は複数個の 基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基 配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオ チド。
 配列番号3で表される塩基配列又はその部分 配列を含むポリヌクレオチドには、例えば配 列番号3で表される1位~834位の塩基酸配列を有 するポリヌクレオチド、または46位~834位の塩 基酸配列を有するポリヌクレオチドが含まれ る。

 本発明によるポリヌクレオチドは、天然 来のものであっても、全合成したものであ てもよく、また、天然由来のものの一部を 用して合成を行ったものであってもよい。 発明によるポリヌクレオチドの典型的な取 方法としては、ペニシリウム・ピノフィラ のゲノムDNAを鋳型にして、PCR反応により取 することができる。また、遺伝子工学の分 で慣用されている方法、例えば、ゲノムDNA イブラリーを作製し、部分アミノ酸配列の 報を基にして作製した適当なDNAプローブを いてスクリーニングを行う方法などが挙げ れる。本発明による、エンドグルカナーゼP PCEのアミノ酸配列をコードする、典型的塩基 配列は、配列番号3で表わされる塩基配列を するものである。配列番号3で表わされる塩 配列は、1~3位のATGで始まり、832~834位のTAGで 終了するオープンリーディングフレームと411 ~469位、691~754位の2ヶ所のイントロンを含有す る。また、46~48のヌクレオチド配列は、221ア ノ酸残基からなるエンドグルカナーゼPPCEの 成熟タンパク質のN末端アミノ酸に対応する

発現ベクター及び形質転換された 微生物
 本発明においては、配列番号4で表わされる アミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパ ク質、または、その改変タンパク質(以下「 発明によるポリヌクレオチド」という)を、 主微生物内で複製可能で、かつ、その塩基 列がコードするタンパク質を発現可能な状 で含む発現ベクターが提供される。本発現 クターは、自己複製ベクター、すなわち、 色体外の独立体として存在し、その複製が 色体の複製に依存しない、例えば、プラス ドを基本に構築することができる。また、 発現ベクターは、宿主微生物に導入された き、その宿主微生物のゲノム中に組み込ま 、それが組み込まれた染色体と一緒に複製 れるものであってもよい。本発明によるベ ター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の 野で慣用されているものを用いることがで る。本発明による発現ベクターは、これを 際に宿主微生物に導入して所望の活性を有 るタンパク質を発現させるために、前記の 発明によるポリヌクレオチドの他に、その 現を制御する塩基配列等を含んでいるのが ましい。発現を制御する塩基配列としては プロモーター、ターミネーター及びシグナ ペプチドをコードする塩基配列等がこれに まれる。プロモーターは宿主微生物におい 転写活性を示すものであれば特に限定され 、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれ のタンパク質をコードする遺伝子の発現を 御する塩基配列として得ることができる。

 また、シグナルペプチドは、宿主微生物 おいて、タンパク質の分泌に寄与するもの あれば特に限定されず、宿主微生物と同種 しくは異種のいずれかのタンパク質をコー する遺伝子から誘導される塩基配列より得 ことができる。

 更に、本発明による発現ベクターは、こ を宿主微生物に導入して形質転換体を選択 るため、遺伝子マーカーを含んでいても良 。本発明における遺伝子マーカーは、形質 換体の選択の方法に応じて適宜選択されて いが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子 栄養要求性を相補する遺伝子を利用するこ ができる。

 これら遺伝子マーカーは、発現ベクター 別のベクターに組み込み、形質転換時に混 して同時に導入する(co-transformともいう)こ もできる。更に、本発明によれば、この発 ベクターによって形質転換された微生物が 供される。この宿主-ベクター系は特に限定 れず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸 菌などを用いた系、及び、それらを用いた のタンパク質との融合タンパク質発現系な を用いることができる。また、この発現ベ ターによる微生物の形質転換も、この分野 慣用されている方法に従い実施することが きる。更に、この形質転換体を適当な培地 培養し、その宿主細胞又は培養物から前記 本発明によるタンパク質を単離して得るこ ができる。従って、本発明の別の態様によ ば、前記の本発明による新規タンパク質の 造方法が提供される。形質転換体の培養及 その条件は、使用する微生物についてのそ と本質的に同等であってよい。

 また、形質転換体を培養した後、目的のタ パク質を回収する方法は、この分野で慣用 れているものを用いることができる。また 本発明における新規タンパク質の好適な製 方法として、不完全菌類に属する糸状菌に ける発現方法が提供される。本発明におけ 好適な宿主糸状菌として、トリコデルマ( Trichoderma )属、フミコーラ( Humicola )属、アスペルギルス( Aspergillus )属、アクレモニウム( Acremonium )属、又はペニシリウム( Penicillium )属に属するものが挙げられるが、より好ま くは、トリコデルマ( Trichoderma )属フミコーラ( Humicola )属が挙げられる。より具体的には、トリコ ルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )、トリコデルマ・リーセイ( Trichoderma
reesei )、トリコデルマ・ロンジブラシアトウム( Trichoderma   longibrachiatum )、フミコーラ・インソレンス( Humicola
insolens )、フミコーラ・サーモイデア( Humicola   thermoidea )、アスペルギルス・ニガー( Aspergillus
niger )、アスペルギルス・オリゼ( Aspergillus   oryzae )、アクレモニウム・セルロリティカス( Acremonium
cellulolyticus )又はペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium  pinophilum)が挙げられるが、更により好ましく 、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma
viride )、又はフミコーラ・インソレンス( Humicola   insolens )が挙げられる。

セルラーゼの用途/セルラーゼ調 物
 本発明は、本発明のタンパク質(例えば、配 列番号4で表わされるアミノ酸配列又はその 分配列を含むタンパク質、又はその改変タ パク質、あるいは、本発明の宿主細胞を培 することにより得られるタンパク質)を含む ルラーゼ調製物にも関する。

 一般に、セルラーゼ調製物とは、セルラ ゼ酵素の他に、例えば、賦形剤(例えば、乳 糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等)、防 剤、及び/又は、非イオン系界面活性剤等を 有させることができる。また、セルラーゼ 製物の形態は、固形状であっても液体状で ってもよく、具体的には、粉剤、粒剤、顆 剤、非粉塵化顆粒、又は液体製剤が挙げら る。本発明のセルラーゼ調製物には、本発 のタンパク質に加えて、他のセルラーゼ酵 、例えば、セロビオヒドロラーゼ、β-グル シダーゼ、及び/又は本発明のエンドグルカ ナーゼ以外のエンドグルカナーゼを含めても よい。セルラーゼ調製物の1種である非粉塵 顆粒(好ましくは、飛散性のない顆粒状)は、 通常の乾式造粒法を用いて製造することが可 能である。すなわち、粉末状態の本発明のタ ンパク質を、無機塩(例えば、硫酸ナトリウ 、塩化ナトリウム)、鉱物(例えば、ベントナ イト、モンモリナイト)、及び有機物(例えば 澱粉又は粒状セルロース等)等から選ばれる 1種又は複数種に混合した後、非イオン界面 性剤の1種又は複数種の粉末、あるいは微細 懸濁された懸濁液を加え、充分に混合又は 練する。状況に応じ、固形物を結着させる 成高分子(例えば、ポリエチレングリコール 等)又は天然高分子(例えば、スターチ等)を適 宜添加し、更に混練した後、ディスクペレッ ターなどの押し出し成形造粒を行い、成形物 をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥 させることで非粉塵化顆粒を製造することが 可能である。非イオン界面活性剤の1種又は 数の添加量は特に限定されないが、本発明 セルラーゼ調製物の全体に対して、好まし は0.1~50重量%、より好ましくは0.1~30重量%、更 に好ましくは1~10重量%とする。また、顆粒表 をポリマー等でコーティングすることによ 、酸素透過や水分透過をコントロールする とも可能である。一方、セルラーゼ調製物 1種である液状製剤(好ましくは、安定化さ た液体状)は、本発明のタンパク質を含む溶 に、エンドグルカナーゼの安定化剤(例えば 、合成高分子、天然高分子等)を配合し、必 に応じて無機塩類及び/又は合成防腐剤を添 して調製することが可能である。

 このとき、非イオン界面活性剤の1種又は 複数種を配合することも可能である。非イオ ン界面活性剤の1種又は複数種の添加量は特 限定されないが、本発明のセルラーゼ調製 の全体に対して、好ましくは0.1~50重量%、よ 好ましくは0.1~30重量%、更に好ましくは1~10 量%とする。更に、本発明は、本発明のタン ク質又は本発明のセルラーゼ調製物を含む 剤組成物を提供する。本発明の洗剤組成物 、界面活性剤(アニオン性、ノニオン性、カ チオン性、両性又は双性イオン性あるいはそ れらの混合物であり得る)をも含有し得る。 た、本発明の洗剤組成物は、当分野で既知 他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤 漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖 、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素(例え プロテアーゼ、リパーゼ、アミラ-ゼなど) 酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、 び/又は発泡促進剤等をも含有し得る。代表 なアニオン性界面活性剤は、直鎖状アルキ ベンゼンスルホン酸塩(LAS)、アルキル硫酸 (AS)、アルファーオレフィンスルホン酸塩(AOS )、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫 塩(AES)、α-スルホ脂肪酸エステル塩(α-SFMe)、 及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。 ノニオン性界面活性剤の例としては、ポリオ キシエチレンアルキルエーテル(AE)、アルキ ポリエチレングリコールエーテル、ノニル ェノールポリエチレングリコールエーテル 脂肪酸メチルエステルエトキシレート、ス ロース、及びグルコースの脂肪酸エステル 並びにアルキルグルコシド、ポリエトキシ 化アルキルグルコシドのエステル等がある

 本発明のセルロース含有繊維の処理方法は 本発明のタンパク質、本発明のセルラーゼ 製物、又は本発明の洗剤組成物を、セルロ ス含有繊維と接触させることにより行う。 発明の繊維処理方法により改善されうる、 ルロース含有繊維の性質としては、以下の のが含まれる。
(1)減量による繊維の肌触り及び外観の改善
(2)着色セルロース含有繊維の色の局所的な変 化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊 維、代表的にはジーンズへのストーンウォッ シュ様の外観及び風合いの付与
(3)着色セルロース含有繊維の色の澄明化
(4)柔軟化(ごわつき始める速度の低減、ごわ きの低減)
(5)毛羽の除去(毛羽立ち始める速度の低減、 羽立ちの低減)

 本発明の繊維処理方法は、具体的には、 維が浸漬されているか又は浸漬されうる水 、本発明のタンパク質、本発明のセルラー 調製物、又は本発明の洗剤組成物を添加す ことにより行うことができ、例えば、繊維 浸漬工程、洗濯工程、又はすすぎ工程で行 ことができる。接触温度、又は本発明のタ パク質、セルラーゼ調製物、若しくは洗剤 成物の添加量などの条件は、他の種々の条 を勘案して適宜決定されてよいが、例えば セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改 を目的とした減量加工の場合、10~60℃程度 温度で、0.1~50mg/Lのタンパク質濃度の本発明 タンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤 成物を使用することが好ましい。更に、着 されたセルロース含有繊維の色の局所的な 化を提供するために用いる場合、20~60℃程 の温度で、0.1~100mg/Lのタンパク質濃度の本発 明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗 剤組成物を使用することが好ましい。また、 着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化 することを目的とした場合、10~60℃程度の温 で、0.01~20mg/Lのタンパク質濃度の本発明の ンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組 物を使用することが好ましい。また、セル ース含有繊維がごわつき始める速度を低減 るか又はセルロース含有繊維のごわつきを 減させる場合、10~60℃程度の温度で、0.01~20mg /Lのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、 ルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用す ことが好ましい。また、セルロース含有繊 の毛羽立ち始める速度を低減するか又はセ ロース含有繊維の毛羽立ちを低減する場合 10~60℃程度の温度で、0.01~20mg/Lのタンパク質 濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製 物、又は洗剤組成物を使用することが好まし い。

 更に、本発明は、古紙を脱インキ薬品に り処理して脱インキを行う工程において、 発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ 製物を用いることを特徴とする古紙の脱イ キ方法に関する。本発明のタンパク質又は ルラーゼ調製物は、古紙に作用させると脱 ンキの効率を向上させるため、古紙から再 紙を製造する過程において有用である。上 脱インキ方法によれば、残インキ繊維が大 に減少するため、古紙の白色度を向上させ ことができる。上記脱インキ薬品は、一般 古紙の脱インキに用いられる薬品であれば く、特に限定されないが、例えば、水酸化 トリウム、炭酸ナトリウム等のアルカリ、 酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン の界面活性剤、ノニオン系の界面活性剤、 はオレイン酸等の補集材などが挙げられ、 剤として、pH安定剤、キレート剤、又は分 剤等が挙げられる。上記脱インキ方法を適 し得る古紙は、一般に古紙と呼ばれるもの あればよく、特に限定されないが、例えば 機械パルプ及び化学パルプを配合した新聞 紙、雑誌古紙、下級~中級印刷古紙、化学パ プよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の 刷古紙が挙げられる。更に、一般に古紙と ばれるもの以外であっても、インクの付着 ている紙であれば、上記脱インキ方法を適 することができる。

 更に、本発明は、紙パルプのろ水性の改 方法に関し、前記方法は、紙パルプを、本 明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調 物で処理する工程を含む。前記方法によれ 、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下 伴うことなく、有意に改善されるものと考 られる。前記方法を適用し得るパルプは特 限定されないが、例えば、古紙パルプ、再 環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パ プ、加工熱処理その他の高収率パルプ等が げられる。

 更に、本発明は、動物飼料の消化能を改 する方法に関し、動物飼料を、本発明のタ パク質又は本発明のセルラーゼ調製物で処 する工程を含む。前記方法によれば、動物 料中のグルカンが適度に低分子化されるた 、動物飼料の消化能を改善することができ 。更に、本発明によるタンパク質を動物飼 中で用いることにより、飼料中のグルカン 消化能を改善することができる。従って、 発明によれば、動物飼料の消化能を改善す 方法であって、本発明のタンパク質又はセ ラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を む方法が提供される。

 更に、本発明はバイオマスエタノールの 造方法に関し、セルロース系の物質(セルロ ース繊維を含む)を本発明のタンパク質又は 発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を む。前記方法によれば、本発明によるタン ク質をセルロース系の物質に作用させ、こ を分解・糖化し、グルコースを製造するこ ができる。得られたグルコースは他の微生 (例えば酵母など)を用いた発酵技術によりバ イオマスエタノールに変換することが可能で ある。

微生物の寄託
 本発明によるエンドグルカナーゼPPCEの由来 であるペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株は、2007年(平成19年)2月7日に独立行政 人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ (あて名:〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1 丁目1番地1 中央第6)に国際寄託され、国際受 託番号はFERM BP-10780である。

 プラスミドPCR2.1-TOPOにPPCE遺伝子を挿入した ラスミドp28FULL18で形質転換された本発明の 腸菌( Escherichia   coli )JM109/p28FULL18株は、2007年(平成19年)2月7日に独 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 ンター(あて名:〒305-8566 日本国茨城県つく 市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託され、 国際受託番号は、FERM BP-10781である。本発明 発現ベクターの宿主となりうるトリコデル ・ビリデ( Trichoderma
viride )MC300-1株は、1996年(平成8年)9月9日に独立行政 人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ (あて名:〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1 丁目1番地1 中央第6)に国内寄託(原寄託)され ものであり、1997年(平成9年)8月11日から国際 寄託に移管されている。国際受託番号(国際 託番号に続く[
]内は国内受託番号)は、FERM BP-6047[FERM P-15842] である。

 以下、実施例をもって本発明を更に具体 に説明するが、本発明はこれら実施例に限 されるものではない。

《実施例1:ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株からの着色綿毛羽除去活性を有する 分の単離精製》
 ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株を、TS培地(2.0%可溶性でんぷん、1.0%グ ルコース、0.5%ポリペプトン、0.6%小麦胚芽、0 .3%酵母エキス、0.2%大豆粕、0.2%炭酸カルシウ 、pH7.0)中、25℃で振とう培養した。24時間培 養の後、(N)培地(5.0%アビセル、2.0%酵母エキス 、0.1%ポリペプトン、0.03%硫酸マグネシウム、 pH6.8)に植菌し、更に25℃5日間培養した。菌体 を除去した培養上清液を粗精製セルラーゼ調 製液とした。この粗精製セルラーゼ調製液を 最終濃度1.2mol/Lの硫酸アンモニウムの溶液に るように調製した後、1.2mol/L硫酸アンモニ ムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)で平 化させたHiTrap TM PhenylHPカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス 製)にアプライし、50mmol/L酢酸ナトリウム緩 液(pH5)中、硫酸アンモニウム濃度が1.2mol/L、 0.96mol/L、0.72mol/L、0.48mol/L、0.24mol/L、0mol/Lのス テップワイズ溶離法により溶出して、分画し た。このうち硫酸アンモニウム濃度が0.24mol/L のときに溶出した画分に着色綿布に対する毛 羽除去活性が認められた。着色綿布に対する 毛羽除去活性は、以下のように行った。予め 染色された青色綿ニットの生地を大型ワッシ ャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立 たせた青色綿ニット生地を下記の条件で毛羽 除去処理を行い、処理後の布の毛羽の取れ具 合を目視にて判定し、毛羽除去活性の有無を 調べた。

  試験機械:洗濯堅牢度試験機L-12(大栄科学 器製作所社製)
  温度  :40℃
  時間  :120分
  反応pH:pH2(5mmol/Lクエン酸緩衝液)
 処理液には、分画液とともにステンレスビ ズを適当量加えた。

 次に、硫酸アンモニウム0.24mol/L溶出画分 PD-10脱塩カラム(GEヘルスケバイオサイエン 社製)を用い、添付のマニュアルの条件に従 て脱塩した後、50mmol/L酢酸緩衝液(pH4.0)とな よう調整し、50mmol/L酢酸緩衝液(pH4.0)で平衡 させたResourceMonoSカラム(GEヘルスケバイオサ イエンス社製)にアプライした。そして、50mmo l/L酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)から50mmol/L酢酸 ナトリウム緩衝液(pH5.0)中1mol/L塩化ナトリウ に対して、NaCl0.1molずつのステップワイズ溶 法で溶出し、分画した。その結果、カラム 吸着せず通過した画分に着色綿布に対する 羽除去活性が認められた。更に、通過画分 、50mmol/L酢酸緩衝液(pH4.0)で平衡化させたReso urceMonoQカラム(GEヘルスケバイオサイエンス社 製)にアプライした。そして、50mmol/L酢酸緩衝 液(pH4.0)から50mmol/L酢酸緩衝液(pH5.0)中1mol/L塩 ナトリウムに対して、NaCl0.1molずつのステッ ワイズ溶離法で溶出し、分画した。その結 、カラムに吸着せず通過した画分に着色綿 に対する毛羽除去活性が認められた。得ら た通過画分を10Kカット限外濾過膜(ミリポア 社製)にて濃縮し、PPCE画分とした。PPCE画はCMC アーゼ活性を有していた。次に、粗精製セル ラーゼ調製液及び各カラム精製工程における 活性画分のSDS-PAGEを実施した。SDS-PAGEは、セ フティーセルミニSTC-808電気泳動槽(テフコ社 製)及びプリキャストミニゲル 12%-SDS-PAGEmini 1.0mmゲル厚(テフコ社製)を使用し、泳動方法 製品取扱い説明書に従った。分子量マーカ はLMW Calibration For SDS Electrophoresis(GEヘルス ケバイオサイエンス社製)を使用した。泳動 、クマシーブリリアントブルーR250(ナカライ テスク社製)で染色し、脱色した。その結果 平均分子量(MW)約26kDのタンパク質が精製に伴 い、濃縮されていることが明らかとなった。 特に、粗精製セルラーゼ調製液とPPCE画分を 較すると、約26kDのタンパク質比率は著しく 加していた。以上のことから、着色綿毛羽 去活性を有する成分は、平均分子量(MW)約26k Dのタンパク質であると推定し、以降の実験 行った。

《実施例2:ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株由来PPCEのN末端アミノ酸配列の同定》
 実施例1において得られたPPCE画分をSDS-PAGEに 供した後、マルチフォーII(GEヘルスケバイオ イエンス社製)を用いてPVDF膜(ミリポア社製) へ電気的にブロットした。これをブリリアン トブルーG(東京化成工業社製)で染色した後、 脱色した。この膜から分子量約26kDのタンパ 質(PPCE)がブロットされた部分を切り出し、 ロテインシークエンサーModel492(アプライド イオシステムズ社製)に供し、N末端アミノ酸 配列の解析を試みたがエドマン分解によるシ グナルは得られなかった。よってN末端アミ 酸が修飾保護されていることが判明した。

 そこで、先の切り出したメンブレンを0.5%ポ リビニルピロリドン-40(シグマ社製)/100mmol/L酢 酸溶液に37℃、30分間浸漬し、膜上のタンパ 質未結合部分をブロックした後、Pfuピログ タミン酸アミノペプチダーゼ(Pyroglutamate Amin opeptidase)(タカラバイオ社製)で50℃、5時間処 することにより修飾N末端残基を除去し、再 シークエンシングを行った。得られた配列 以下の通りであった(Xaaは不明アミノ酸残基 を示す)。
 
シーケンス結果:Gln-Ser-Leu-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Ser-Ser-Ty r-Thr-Ser(12残基)(配列番号1)

 保護されたN末端アミノ酸をPfuピログルタミ ン酸アミノペプチダーゼで脱保護したところ 、シグナルが得られたことから、PPCEのN末端 ミノ酸は、ピログルタミン酸(pyroGlu)である 考えられる。また、本プロテインシークエ サーでは、システィン(Cys)のシグナルは得 れないことから、Xaaはシステインであると 定できる。よってPPCEのN末端アミノ酸配列は 以下の配列と考えられる。
 
PPCEのN末端アミノ酸配列:Gln-Gln-Ser-Leu-Cys-Ser-Gln -Tyr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser(13残基;但し、N末端グルタ ンはピログルタミン酸に修飾されている)( 列番号2)

 このN末端アミノ酸配列を用いて相同性検索 (GENETYX;ゼネティックス社製)を行ったところ ペニシリウム・ベルクロッサム( Penicillium   verruculosum )由来のエンドグルカナーゼIII[ロシア公開第2 238974号]のアミノ酸配列と相同性を有してい 。よってPPCEはファミリー12に属するエンド ルカナーゼであることが示唆された。

《実施例3:エンドグルカナーゼPPCE遺伝子のPCR 増幅》
 PPCEのN末端アミノ酸配列が、ファミリー12に 属するペニシリウム・ベルクロッサム由来の エンドグルカナーゼIIIと相同性を有していた ことから、ロシア公開第2238974号に記載のEGIII の塩基配列に基づき、PCRによるペニシリウム ・ピノフィラム( Penicillium
pinophilum )PF1365株由来エンドグルカナーゼPPCE遺伝子の 幅を試みた。

(1)ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株由来のクロモソ-ムDNAの単離
 ペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株をTS培地で28℃、24時間培養し、遠心 離によって菌体を回収した。得られた菌体 りISOPLANT(ニッポンジーン社製)を用いてクロ ソームDNAの抽出を行った。条件はキットに 付のマニュアルに記載の条件に従った。

(2)PCRによるペニシリウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株由来ファミリー12エンドグルカナーゼ 遺伝子断片の増幅
 ペニシリウム・ベルクロッサム( Penicillium   verruculosum )由来のエンドグルカナーゼIIIのN末端、C末端 のアミノ酸配列に対応するDNA配列に基づき、 以下の配列の合成プライマーを作製した。
 
MSW-N:CAACAGAGTCTATGCGCTCAATACTCGAGCTACACCAGT(配列番号5)
MSW-C:CTAATTGACAGCTGCAGACCAA(配列番号6)

 上記のプライマー(MSW-N、MSW-C)を用い、実施 3(1)で取得したクロモソームDNAを鋳型にし、 LA PCR TM  Kit Ver2.1(タカラバイオ社製)によりPCR反応を 行った。条件は、94℃1分の後、(94℃、30秒間) ・(60℃、30秒間)・(72℃、1分間)の反応を20サ クル行い、最後に72℃ 10分間処理し、反応 終了した。得られた反応液はアガロースゲ 電気泳動に供した。その結果、約0.8kbpの遺 子断片の増幅が認められたため、クローン して塩基配列の決定を行うこととした。ア ロースゲル電気泳動で分離した約0.8kbpの遺 子断片を切り出し、Wizard SVGel and PCR Clean-U p System(プロメガ社製)を用いて、DNAの精製を った。条件についてはキットに添付の条件 従った。得られた約0.8kbpの精製DNAをTOPO TA  Cloning Kit(インビトロジェン社製)を用い、TOPO ベクター(PCR2.1-TOPO)にクローン化した。得ら たプラスミドを定法により増幅・抽出し、DN A配列の決定を行った。プラスミドの抽出はQI Afilter Plasmid Kit(キアゲン社製)を用い、条件 ついてはキットに添付の条件に従った。ま 、DNA塩基配列の決定は、dRhodamine Terminator K it(アプライドバイオシステムズ社製)および ライマーとしてM13ユニバーサルプライマー たは下記の配列を有するRevプライマーを用 て反応を行った。
 
Rev:CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号7)

 条件についてはキットに添付の条件に従っ 。得られた反応液をキットに添付のマニュ ルに記載の条件に従って精製し、ABI PRISM 3 10 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステム 社製)を用いて解析を行った。その結果、PCR よって増幅された遺伝子断片は、ペニシリ ム・ベルクロッサム( Penicillium   verruculosum )由来のエンドグルカナーゼIIIと相同性を示 遺伝子であることが明らかとなった。

《実施例4:ゲノムウォーキングによるペニシ ウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株由来ファミリー12エンドグルカナーゼ 遺伝子断片の取得》
 ゲノムウォーカーキット(ベクトン・デッキ ンソン社製)を用い、PCRにより増幅されたペ シリウム・ピノフィラムPF1365株由来ファミ ー12エンドグルカナーゼ遺伝子断片の上・下 流域の増幅を試みた。条件についてはキット に添付の条件に従った。ペニシリウム・ピノ フィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株より抽出したクロモソームDNAを制限 素 Pvu II、 Stu Iを用いて完全分解し、分解したクロモソー DNAとキットに添付のアダプターを連結し、 イブラリーを作製した。また、実施例3で得 れた配列をもとに、次に、下記の配列を有 る合成プライマーを作製し、PCR反応に用い 。
 
 24-GSP-R1:CGCCAGAGCTGGAAATGGAGTTGACATAAG(配列番号8)
 24-GSP-R2:GTGCACTGGGAGCCAGAGCCACTGCTCTCA(配列番号9)
 24-GSP-F1:TTTCGTATGATCTCTTCACGGCAGCGGATA(配列番号10)
 24-GSP-F2:ATCAACCATGTTACCTACAGTGGTGACTAT(配列番号11)

  Pvu IIまたは Stu Iライブラリーを鋳型にし、プライマーとし 24-GSP-R1またはF1と、キットに添付のAP-1を用 、ExTaqPremix(タカラバイオ社製)を用いてPCR反 を行った。条件は、94℃2分の後、94℃2秒・7 2℃3分の反応を7サイクル行い、94℃2秒・67℃3 分の反応を32サイクル行い、最後に67℃4分処 し、反応を終了した。1回目のPCR反応液を脱 イオン水で希釈したものを鋳型として、2回 のPCR反応を行った。プライマーとして24-GSP-R 2またはF2と、キットに添付のAP-2を用い、ExTaq Premix(タカラバイオ社製)を用いてPCR反応を行 た。条件は、94℃2分の後、94℃2秒・72℃3分 反応を5サイクル行い、94℃2秒・67℃3分の反 応を20サイクル行い、最後に67℃4分処理し、 応を終了した。得られた反応液はアガロー ゲル電気泳動に供した。結果、 Pvu IIライブラリーを鋳型にし、24-GSP-R1とAP-1で1 目のPCR反応を、24-GSP-R2とAP-2で2回目のPCR反応 を実施したサンプルにおいて、約2Kbpの遺伝 断片の増幅が認められた。また、 Stu Iライブラリーを鋳型にし、24-GSP-F1とAP-1で1回 目のPCR反応を、24-GSP-F2とAP-2で2回目のPCR反応 実施したサンプルにおいても、約2Kbpの遺伝 子断片の増幅が認められた。次に、これらの 約2Kbpの遺伝子断片を切り出し、QIAQUICK GEL EX TRACTION KIT(キアゲン社製)を用いて、DNAの精製 を行った。条件についてはキットに添付の条 件に従った。得られたそれぞれ約2Kbpの精製DN AをTOPO PCR CLONING KIT(インビトロジェン社製) 用い、TOPOベクター(PCR2.1-TOPO)にクローン化 た。

 得られたプラスミドを定法により増幅・ 製し、DNA配列の決定を行った。プラスミド 抽出はQIAPREP MINIPREP KIT(キアゲン社製)を用 、条件についてはキットに添付の条件に従 た。また、DNA塩基配列の決定は、dRhodamine T erminator Kit(アプライドバイオシステムズ社製 )およびプライマーとしてM13ユニバーサルプ イマーまたはRevプライマーを用いて反応を った。条件についてはキットに添付の条件 従った。得られた反応液をキットに添付の ニュアルに記載の条件に従って精製し、ABI  PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシス テムズ社製)を用いて分析を行った。

 その結果、 Pvu IIライブラリー由来の約2KbpのPCR産物は、実施 例3(2)で得られた遺伝子の上流域を、 Stu Iライブラリー由来の約2KbpのPCR産物は、実施 3(2)で得られた遺伝子の下流域を、それぞれ 含んでいた。よって、これらのPCR産物の塩基 配列を連結することにより、ペニシリウム・ ピノフィラム( Penicillium
pinophilum )PF1365株由来のPPCE遺伝子の全長が明らかとな た。得られたPPCE遺伝子の塩基配列(配列番 3)は、ペニシリウム・ベルクロッサム( Penicillium
verruculosum )由来のエンドグルカナーゼIII遺伝子の翻訳 域と相同な領域を含んでいた。そしてその 伝子の相同性を、市販の遺伝子情報処理ソ トウェアGENETYX(ゼネティックス社製)を用い 算出したところ、82%であった。更にDNA断片 配列より推定されるアミノ酸配列(配列番号4 )をもとに、GENETYX(ゼネティックス社製)を用 て相同性を算出したところ、ペニシリウム ベルクロッサム( Penicillium
verruculosum )由来のエンドグルカナーゼIIIと86%の相同性 あった。また、DNA断片の配列より推定され アミノ酸配列(配列番号4)をもとに、公知の ータベース(NCBI)でblastp検索を行ったところ アスペルギルス・アキュレータス( Aspergollus
aculeatus )由来のFI-CMCaseと72%、トリコデルマ・リーセ ( Trichoderma   reesei )由来のEGIIIと53%の相同性を有していた。これ らは全てファミリー12に属するエンドグルカ ーゼであることから、得られたDNA断片はペ シリウム・ピノフィラム PF1365株由来由来 ファミリー12エンドグルカナーゼ遺伝子の翻 訳領域及びその上・下流を含む遺伝子断片で あるものと考えられた。

《実施例5:PPCE遺伝子のトリコデルマ・ビリデ ( Trichoderma   viride )での発現》
(1)PPCE発現用遺伝子断片の取得
 PPCE遺伝子は、開始コドンの上流の配列に Stu I、終止コドンの下流に Pst Iを予め含む形で以下のような変異導入用プ イマーを設計し、PCR法にて増幅した。
 
32228-NSTU:CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTAACTTTTCTCCTG (配列番 12)
32228-CPST:CCCTGCAGCTAATTGACAGAAGCAGACC (配列番号13)

 PCRの反応は、実施例3(1)で取得したペニシリ ウム・ピノフィラム( Penicillium   pinophilum )PF1365株のクロモソームDNAを鋳型に、32228-NSTU 32228-CPSTの合成DNAをプライマーにして、ExTaqP remix(タカラバイオ社製)を用いて実施した。 件は、94℃2分の後、94℃1分・50℃2分・72℃1.5 分の反応を25サイクル行い、最後に72℃3分処 し、反応を終了した。アガロースゲル電気 動により反応後のサンプルを分離し、約800b pの遺伝子断片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTI ON KIT(キアゲン社製)を用いて、DNAの精製を行 った。条件についてはキットに添付の条件に 従った。得られた精製DNAをTOPO PCR CLONING KIT( インビトロジェン社製)を用い、TOPOベクター( PCR2.1-TOPO)にクローン化した。得られたプラス ミドをp28FULL18とした。プラスミドp28FULL18を定 法により増幅・精製し、上述の方法に従い、 DNA配列を解析した。その結果、プラスミドp28 FULL18は開始コドンの上流の配列に Stu I、終止コドンの下流に Pst Iを有するPPCE遺伝子を含むことを確認できた プラスミドp28FULL18に含まれるPPCE遺伝子の塩 基配列が実施例4で決定したPPCE翻訳領域の配 と一致したことから、本遺伝子断片を以降 発現検討に用いた。

(2)PPCE発現プラスミドの構築
 プラスミドp28FULL18を制限酵素 Stu Iおよび Pst Iで切断し、アガロースゲル電気泳動により 応後のサンプルを分離し、約800bpの遺伝子断 片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キア ン社製)を用いて、DNAの精製を行った。次に プラスミドpCBI-M2[国際公開第2005/056787号の実 施例B1]を制限酵素 Stu Iおよび Pst Iで切断し、アガロースゲル電気泳動により 応後のサンプルを分離し、約5.6kbpの遺伝子 片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キア ン社製)を用いて、DNAの精製を行った。これ に先に得られた約800bpの遺伝子断片をTaKaRa DN A Ligation Kit Ver.1(タカラバイオ社製)を用い 連結し、プラスミドpPPCE-F2を作製した。

(3)プラスミドpPPCE-F2によるトリコデルマ・ビ デ( Trichoderma   viride )の形質転換体の作製
 実施例5(2)で得られたプラスミドpPPCE-F2によ トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )の形質転換は、国際公開第2005/056787号に記載 の方法に従い、実施した。即ち、ウラシル生 合成遺伝子( pyr4 )欠損株であるトリコデルマ・ビリデ( Trichoderma
viride )strain2株を宿主とし、選択マーカーとしてニ ーロスポラ・クラッサ( Neurospora   crassa )のpyr4遺伝子を用いたコートランスフォーメ ション(co-transformation)法により形質転換を実 施した。まず、国際公開第2005/056787号に記載 方法に従い、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma
viride )strain2のプロトプラストを調製し、得られた ロトプラスト懸濁液100μLと7μgのプラスミド pPPCE-F2及び3μgのプラスミドpPYR4(ニューロスポ ラ・クラッサ( Neurospora
crassa )由来のpyr4遺伝子をLITMUS28にサブクローンし プラスミド)を混合した。混合液を氷冷下で5 分間静置し、400μLのPEG溶液(60%ポリエチレン リコール4000、10mmol/L塩化カルシウム、10mmol/L トリス塩酸緩衝液、pH7.5)を加え、更に氷冷下 で20分間静置した。以上の処理をしたプロト ラスト懸濁液をSUTC緩衝液(0.5mol/Lシュークロ ース、10mmol/L塩化カルシウム、10mmol/Lトリス 酸緩衝液、pH7.5)で洗浄した後、0.5mol/Lシュー クロースを含む最少培地に軟寒天とともに重 層し、28℃で5日間培養した。培養後、生育し たコロニーを再度、最少培地に移植し、ここ で生育したコロニーを形質転換体とした。

(4)プラスミドpPPCE-F2によるトリコデルマ・ビ デ( Trichoderma   viride )形質転換体の培養
 実施例5(3)で得られた形質転換体50株をPSW培 (1.0%グルコース、4.0%ラクトース、2.0%大豆粕 、1.0%小麦胚芽、0.2%リン酸二水素カリウム、0 .2%硫酸アンモニウム、0.2%リン酸アンモニウ 、0.2%炭酸カルシウム)に植菌し、28℃にて5日 間培養した。培養後、遠心分離により菌体を 除去し、得られた培養上清を粗酵素液とした 。粗酵素液をSDS-PAGEに供したところ、形質転 体において特異的に約26kDのタンパク質が発 現していた。特に発現量の多かった322F-205株 培養上清を用いて、以降の洗浄試験を実施 た。

《実施例6:PPCE遺伝子発現株の毛羽除去活性評 価》
(1)発現タンパク質濃度の測定
 PPCE遺伝子発現株の毛羽除去活性を評価する ため、対照としてトリコデルマ・リーセイ( Trichoderma   reesei )由来のEGIII〔非特許文献1〕及び、トリコデ マ・ビリデ( Trichoderma
viride )由来のエンドグルカナーゼSCE3〔特許文献5〕 及びアスペルギルス・アキュレータス( Aspergollus   aculeatus )由来のFI-CMCase〔非特許文献2〕の遺伝子を実 例5に従い、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma
viride )において発現させ、同様に培養上清を調製 た。得られた培養上清及びPPCE遺伝子発現株 培養上清を実施例1の方法に従い、12%ゲルを 用いてSDS-PAGEに供した。泳動後、SYPRO Ruby pro tein gel stain(インビトロジェン社製)で染色、 水洗し、モレキュラーイメージャーFX(バイオ ラッドラボラトリーズ社製)及びQuantity One(バ イオ・ラッドラボラトリーズ社製)を用いて ンド解析を行い、全タンパク質に占める発 タンパク質比率を測定した。次に培養上清 の全タンパク質濃度をプロティンアッセイ ット(バイオラッドラボラトリーズ社製)によ り、ウシγグロブリンをスタンダードとして 量した。得られた全タンパク質濃度と発現 ンパク質比率を乗じることにより、発現タ パク質濃度を求めた。

(2)着色綿毛羽除去活性の測定
 PPCE遺伝子発現株及び実施例6(1)で得られた 照株の培養上清を用いて、毛羽除去活性を 定した。まず、予め染色された茶色綿ニッ の生地を大型ワッシャー中で毛羽立たせた その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生 を下記の条件で毛羽除去処理を行い、処理 の布の毛羽の取れ具合を目視にて判定し、 羽除去活性を調べた。

  試験機械:洗濯堅牢度試験機L-12(大栄科学 器製作所社製)
  温度  :40℃
  時間  :60分
  反応液 :5mmol/L酢酸緩衝液(pH4) 40mL
 処理液には、培養上清とともにステンレス ーズを適当量加えた。

 表2に形成された毛羽が目視評価でほぼ50% 除去されるのに要する培養上清液量を示した 。また、実施例6(1)で求めた発現タンパク質 度から、この時使用した発現タンパク質量 算出した。結果、PPCEが最も少量のタンパク で毛羽を除去できることが明らかとなった

《実施例7:PPCEの毛羽除去活性による温度、pH ロファイル》
(1)PPCEの毛羽除去活性による温度プロファイ
 実施例6で用いたPPCEとEGIII発現株の培養上清 を使用して温度プロファイルを以下の洗浄条 件にて調べた。洗浄後、目視により毛羽の除 去度を評価し、毛羽が目視評価でほぼ50%除去 されるのに要する培養上清液量を算出した。 この液量より、各サンプル中で最も毛羽を除 去した温度を100%として相対活性を求めた。 3に示す通り、PPCEの至適温度は30℃、EGIIIの 適温度は40℃であった。

  試験機械:洗濯堅牢度試験機L-12(大栄科学 器製作所社製)
  温度  :20℃~60℃
  時間  :60分
  反応液 :5mmol/L酢酸緩衝液(pH4) 40mL
 処理液には、培養上清とともにステンレス ーズを適当量加えた。

(2)PPCEの毛羽除去活性によるpHプロファイル
 実施例6で用いたPPCEとEGIII発現株の培養上清 を使用してpHプロファイルを以下の洗浄条件 て調べた。洗浄後、目視により毛羽の除去 を評価し、毛羽が目視評価でほぼ50%除去さ るのに要する培養上清液量を算出した。こ 液量より、各サンプル中で最も毛羽を除去 たpHを100%として相対活性を求めた。表4に示 す通り、PPCEの至適はpHは3、EGIIIの至適pHは4で あった。

  試験機械:洗濯堅牢度試験機L-12(大栄科学 器製作所社製)
  温度  :40℃
  時間  :60分
  反応液 :5mmol/Lクエン酸または酢酸緩衝液( pH2~6) 40mL
 処理液には、培養上清とともにステンレス ーズを適当量加えた。

《実施例8:コドン最適化PPCE遺伝子のトリコデ ルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )での発現》
(1)コドン最適化PPCE遺伝子の取得
 トリコデルマ属において使用頻度の高いコ ンのみで構成するPPCE遺伝子をPCR反応により 合成した。

a)PCEM1-2断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-1:
CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTGACCTTCCTGCTGAACCTGGCCGTCGCCGCCAGCGCC CAGCAGAGCCTGTGCAGCCAGTACAGCAGCTACAC(配列番号14)
PCEM-2:
TGGCTGCCGCTGCCGCTGCTCTCGCCCCACAGGTTGTTGTTGACGCTGTACTGGCCGCTG GTGTAGCTGCTGTACTGGCT(配列番号15)

 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-1、 PCEM-2)を20pmol使用し、Primestar MAX DNA POLYMERASE( タカラ社製)を用いてPCR反応を行った。条件 、98℃10秒・55℃5秒・72℃30秒の反応を30サイ ル行った。反応液はQIAQUICK PCR PURIFICATION KI T(キアゲン社製)を用いてDNAの精製を行い50μL TEバッファーに溶出した。条件については ットに添付の条件に従った。得られた約150bp のDNA断片をPCEM1-2とした。

b)PCEM3-4断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-3:
AGCAGCGGCAGCGGCAGCCAGTGCACCTACGTCAACAGCATCAGCAGCAGCGGCGTCAGC TGGAGCACCACCTGGAACTG(配列番号16)
PCEM-4:
TTGGTCAGGCCGCTCAGCTGGCTGTTGGCGTAGCTCTTGACGCTGGTGCTGCCGCCGCTC CAGTTCCAGGTGGTGCTCCA(配列番号17)
 
 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-3、PCE M-4)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い PCR反応、断片の精製を行った。得られた約14 0bpのDNA断片をPCEM3-4とした。

c)PCEM5-6断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-5:
CAGCTGAGCGGCCTGACCAAGAAGCTGGTCAGCAACCTGCAGAGCATCCCCACCAGCGTC CAGTGGAGCTACAGCAACAC(配列番号18)
PCEM-6:
GTGACGTGGTTGATGTCGGCGGCGGTGAACAGGTCGTAGCTGACGTCGGCGACGATGTTG GTGTTGCTGTAGCTCCACTG(配列番号19)
 
 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-5、PCE M-6)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い PCR反応、断片の精製を行った。得られた約14 0bpのDNA断片をPCEM5-6とした。

d)PCEM7-8断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-7:
GCCGACATCAACCACGTCACCTACAGCGGCGACTACGAGCTGATGATCTGGTAAATATGC CCCCGTCGTATTTCAAGTAT(配列番号20)
PCEM-8:
CAGGGGCTGGGCGCCGCCGTACTTGCCCAGCCTGATATCTTGATTAGCGGGAGATGTCTC ATACTTGAAATACGACGGGG(配列番号21)
 
 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-7、PCE M-8)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い PCR反応、断片の精製を行った。得られた約14 0bpのDNA断片をPCEM7-8とした。

e)PCEM9-10断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-9:
ACGGCGGCGCCCAGCCCCTGGGCAGCCAGATCGGCACCGCCAACGTCGGCGGCGCCACCT GGCAGCTGTGGTACGGCGTC(配列番号22)
PCEM-10:
GCCGTTCCAGCTGGTGGTCTGGCTGCTGGCGACGAAGCTGTAGGTCTTCTGGCTGCCGTT GACGCCGTACCACAGCTGCC(配列番号23)
 
 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-9、PCE M-10)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い PCR反応、断片の精製を行った。得られた約1 40bpのDNA断片をPCEM9-10とした。

f)PCEM11-12断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-11:
AGACCACCAGCTGGAACGGCGACATCCTGCAGTTCTTCAAGTACCTGCAGAGCAACCAGG GCTTCCCCGCCAGCAGCCAG(配列番号24)
PCEM-12:
ATCATGTCAGATACAAGGAGTCTATAGGAACAGAAAGGGTCATGGCTTACCGATCAGGTA CTGGCTGCTGGCGGGGAAGC(配列番号25)
 
 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-11、PC EM-12)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い 、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約 140bpのDNA断片をPCEM11-12とした。

g)PCEM13-14断片の作製
 まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴ ヌクレオチドを作製した。
 
PCEM-13:
CTCCTTGTATCTGACATGATTGCTTCGGTATCAGACCTGCAGTTCGGCACCGAGCCCTTC ACCGGCAGCCAGACCACCCT(配列番号26)
PCEM-14:CCCTCGAGCTAGTTGACGCTGGCGCTCCAGTGGTTGACGGTCAGGGTGGTCT GGCTGCCGGT(配列番号27)
 
 鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM-13、PC EM-14)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い 、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約 120bpのDNA断片をPCEM13-14とした。

h)PCEM1-4断片の作製
 実施例8(1)a)で得られたPCEM1-2及び実施例8(1)b) で得られたPCEM3-4各1μLを鋳型とし、上記のプ イマー(PCEM-1、PCEM-4)を20pmol使用し、Primestar  MAX DNA POLYMERASE(タカラ社製)を用いて2回目のP CR反応を行った。条件は、98℃10秒・55℃5秒・ 72℃30秒の反応を30サイクル行った。反応液は QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT(キアゲン社製)を用 てDNAの精製を行い50μLのTEバッファーに溶出 た。得られた約270bpのDNA断片をPCEM1-4とした

i)PCEM5-8断片の作製
 実施例8(1)c)で得られたPCEM5-6及び実施例8(1)d) で得られたPCEM7-8各1μLを鋳型とし、上記のプ イマー(PCEM-5、PCEM-8)を20pmol使用し、2回目の 応を行った。上記の実施例8(1)h)の方法に従 、PCR反応、断片の精製を行い、得られた約2 60bpのDNA断片をPCEM5-8とした。

j)PCEM9-12断片の作製
 実施例8(1)e)で得られたPCEM9-10及び実施例8(1)f )で得られたPCEM11-12各1μLを鋳型とし、上記の ライマー(PCEM-9、PCEM-12)を20pmol使用し、2回目 の反応を行った。上記の実施例8(1)h)の方法に 従い、PCR反応、断片の精製を行い、得られた 約260bpのDNA断片をPCEM9-12とした。

k)PCEM1-8断片の作製
 実施例8(1)h)で得られたPCEM1-4及び実施例8(1)i) で得られたPCEM5-8各1μLを鋳型とし、上記のプ イマー(PCEM-1、PCEM-8)を20pmol使用し、Primestar  MAX DNA POLYMERASE(タカラ社製)を用いて3回目のP CR反応を行った。条件は、98℃10秒・55℃5秒・ 72℃30秒の反応を30サイクル行った。反応液は QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT(キアゲン社製)を用 てDNAの精製を行い50μLのTEバッファーに溶出 た。得られた約510bpのDNA断片をPCEM1-8とした

l)PCEM9-14断片の作製
 実施例8(1)j)で得られたPCEM9-12及び実施例8(1)g )で得られたPCEM13-14各1μLを鋳型とし、上記の ライマー(PCEM-9、PCEM-14)を20pmol使用し、3回目 の反応を行った。上記の実施例8(1)k)の方法に 従い、PCR反応、断片の精製を行い、得られた 約360bpのDNA断片をPCEM9-14とした。

m)プラスミドpCR-PCEmの作製
 実施例8(1)k)で得られたPCEM1-8及び実施例8(1)l) で得られたPCEM9-14各1μLを鋳型とし、上記のプ ライマー(PCEM-1、PCEM-14)を20pmol使用し、4回目 PCR反応を行った。条件は、98℃10秒・55℃5秒 72℃30秒の反応を30サイクル行った。アガロ スゲル電気泳動により反応後のサンプルを 離し、約800bpの遺伝子断片を切り出し、QIAQU ICK GEL EXTRACTION KIT(キアゲン社製)を用いてDNA の精製を行い50μLのTEバッファーに溶出した 得られた精製DNAにdNTP、バッファー及びEXTaq( カラ社製)を加え、72℃で10分インキュベー しA塩基を付加した後に、TOPO PCR CLONING KIT( ンビトロジェン社製)を用い、TOPOベクター(P CR2.1-TOPO)にクローン化した。得られたプラス ドをpCR-PCEmとした。プラスミドpCR-PCEmを定法 により増幅・精製し、上述の方法に従いDNA配 列を解析した。その結果、プラスミドpCR-PCEm 、コドン最適化PPCE遺伝子の翻訳領域(配列 号28)に加え、開始コドンの上流に制限酵素 Stu Iの認識配列、終止コドンの下流に Xho Iの認識配列を有することが確認できた。

(2)コドン最適化PPCE発現プラスミドの構築
 プラスミドpCR-PCEmを制限酵素 Stu Iおよび Xho Iで切断し、アガロースゲル電気泳動により 応後のサンプルを分離し、約800bpの遺伝子断 片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キア ン社製)を用いて、DNAの精製を行った。
 次に、実施例5(2)と同様に、プラスミドpCBI-M 2を制限酵素 Stu Iおよび Xho Iで切断し、約5.6kbpの遺伝子断片を回収、精 した。これに先に得られた約800bpの遺伝子断 片をLigation High(東洋紡社製)を用いて連結し プラスミドpPPCE-Mを作製した。

(3)プラスミドpPPCE-Mによるトリコデルマ・ビ デ( Trichoderma   viride )の形質転換体の作製
 実施例8(2)で得られたプラスミドpPPCE-Mによ 、トリコデルマ・ビリデ( Trichoderma   viride )を形質転換した。形質転換の方法は、実施 5(3)の方法に従い、ウラシル生合成遺伝子( pyr4 )欠損株であるトリコデルマ・ビリデ( Trichoderma
viride )strain2株を宿主とし、選択マーカーとしてニ ーロスポラ・クラッサ( Neurospora   crassa )のpyr4遺伝子を用いたコートランスフォーメ ション(co-transformation)法により形質転換を実 施した。7μgのプラスミドpPPCE-M及び3μgのプラ スミドpPYR4を使用してトリコデルマ・ビリデ strain2を形質転換し、40株の形質転換体を得 。

(4)プラスミドpPPCE-Mによるトリコデルマ・ビ デ形質転換体の培養
 実施例8(3)で得られた形質転換体40株を実施 5(4)記載のPSW培地に植菌し、28℃にて5日間培 養した。培養後、遠心分離により菌体を除去 し、得られた培養上清を粗酵素液とした。粗 酵素液をSDS-PAGEに供したところ、形質転換体 おいて特異的に約26kDのタンパク質が発現し ていた。また、これらの粗酵素液の毛羽除去 活性を実施例7に従い測定したところ(測定条 ・・・温度;30℃、時間;60分、反応液;5mmol/L エン酸緩衝液pH3.0)、非形質転換の宿主と比 して、形質転換体において特異的に活性が 上していた。

 本発明は、セルロースの各種処理、例えば セルロース含有繊維の処理、古紙の脱イン 処理、紙パルプのろ水性の改善、動物飼料 消化能改善、バイオエタノールの製造など 用途に利用することができる。
 以上、本発明を特定の態様に沿って説明し が、当業者に自明の変形や改良は本発明の 囲に含まれる。

 配列表における配列番号5~27の各配列は、 PCR用プライマーである。配列番号28の配列は コドン最適化(改変)遺伝子である。配列番 29の配列は、コドン最適化(改変)遺伝子より 定されるアミノ酸配列である。