Настоящее изобретение относится к коллагеновым мембранам, используемым в качестве ксеноимплантатов, матрицы в тканевой инженерии, при выращивании культуры клеток, а также основы масок для косметических манипуляций.

Традиционно коллагеновые мембраны получают из кожи и других соединительнотканных структур (например, перикарда) наземных животных, чаще всего крупного рогатого скота и свиней.

Несмотря на достаточно широкое применение этих мембран, оказалось, что они могут содержать патогенные вирусы, и в том числе смертельный для человека, вирус губчатой энцефалопатии. Кроме того, для значительных групп населения использование ксеноимплантатов от определенного вида животных не представляется возможным из-за религиозных и этических соображений.

В связи с этим все больший интерес и значимость приобретают коллагеновые мембраны, получаемые на основе соединительно -тканных структур морских гидробионтов. Более чистая в экологическом отношении среда обитания морских организмов в значительной степени гарантирует отсутствие в них патологических факторов, представляющих опасность для человека.

В качестве источника для получения коллагеновых мембран обычно используется кожа рыб.

Для получения коллагеновой мембраны из кожи рыб исходный объект подвергается специальной обработке для разрушения и удаления посторонних клеточных структур, а также липидов, глобулярных белков, нуклеиновых кислот и других неколлагеновых компонентов.

Получаемая в результате мембрана обычно представляет собой коллагеновую пленку, толщиной порядка 0,2-0, 4 миллиметра, обладающую биосовместимостью и резорбируемостью в физиологических условиях - факторов, определяющих успешность их применения.

Однако, не менее важными характеристиками коллагеновой мембраны, помимо биосовместимости и резорбируемости, является ее механическая прочность и пластичность.

Механическая прочность, характеризуемая как величина предельного напряжения разрушения в условиях линейной деформации, для большинства известных коллагеновых мембран находится в интервале от 5 до 15 МРа, а пластичность, оцениваемая как относительное удлинение при разрыве, на уровне 7-9%.

Несмотря на то, что коллагеновые мембраны с такими характеристиками могут использоваться в практике, достаточно актуальной задачей является получение более прочных и одновременно пластичных коллагеновых мембран, поскольку высокие значения этих показателей позволяют расширить сферу применения и снижают риск механического разрушения мембран, особенно при хирургических вмешательствах и косметических манипуляциях.

К сожалению решить эту задачу при использовании кожи рыб до последнего времени не удавалось.

В связи с этим было предложено в качестве исходного сырья для получения коллагеновой мембраны использовать не кожу, а чешую рыб.

Известен способ получения высокопрочной коллагеновой мембраны, предложенный Tanaka, et. al. "High-strength collagen fiber membrane and manufacturing method thereof ' (US Patent N 9,315,562, Apr. 19, 2016.).

Способ предполагает использование в качестве коллагенсодержащего сырья чешуи рыб в основном вида Tilapia семейства Cichlidae.

В основе способа лежит экстракция коллагена, с последующим его выделением в виде гидратированного фибриллярного геля, высушиваемого между двумя слоями влагонепроницаемого материала, при котором испарение растворителя происходит только с открытых боковых поверхностей.

Несмотря на то, что получаемая в результате коллагеновая мембрана обладает прочностью на разрыв порядка 30 МРа, сама мембрана, как и способ ее получения, имеют ряд существенных недостатков.

Прежде всего, прочность, получаемой согласно изложенному способу мембраны, не принципиально превышает прочность известных аналогов, а ее пластичность, определяемая как величина максимального удлинения при разрыве, составляет не более 8%.

Кроме того, мембрана неоднородна по толщине. При этом разница в толщине одного и того же образца может достигать 30%, считая от среднего значения этого показателя. Это приводит к непредсказуемости топологии ее разрыва, особенно при фиксации мембраны с помощью хирургических нитей. Кроме того, разнотолщинность обуславливает существенные различия в скорости рассасывания отдельных участков мембраны, что представляет определенную проблему в случае ее использования в качестве резорбируемого ксеноимплантата.

К недостатками способа можно отнести:

- необходимость деминерализации для удаления из чешуи содержащихся в ней минеральных веществ использование экстракционной схемы выделения коллагена из деминерализованного сырья, что значительно увеличивает длительность процесса, требует больших количеств высокоочищенных реагентов и воды, а также применения многократного центрифугирования или фильтрации;

- формирование мембраны путем сушки коллагенового геля между двумя слоями стекла или полимерного материала, что представляет собой длительную и практически не масштабируемую процедуру, и делает крайне сложным использование способа.

Целью настоящего изобретения является коллагеновая мембрана из морских гидробионтов, представляющая собой пленку практически одинаковой толщины, большей прочности и пластичности, а также способ ее получения, лишенные вышеприведенных недостатков.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья используется покровная биоткань мантии головоногих моллюсков, точнее кальмаров, конкретно - кальмара вида Dosidicus Gigas семейства Ommastrephinae.

Кальмар Dosidicus Gigas - это многочисленный вид десятируких кальмаров, биомасса которого, по существующим оценкам, составляет примерно 10 млн. тонн, а объем вылова только в районах Тихого океана колеблется от 300 до 700 тыс. тонн в год.

Основная масса дозидикуса перерабатывается с целью отделения мантии - наиболее ценного в пищевом отношении компонента кальмара. При этом, уже на начальных стадиях биоткани покрывающие мантию, отделяются и практически не используются.

К последним относится слой соединительной ткани, непосредственно примыкающий к мантии и представляющий собой особую биоткань, состоящую из коллагеновых волокон. Эта коллагеновая биоткань (в определенной степени функционально аналогичная фасции) достаточно легко механически отделяется, и может быть получена в виде гидратированной прочной пленки миллиметровой толщины, и площадью порядка нескольких тысяч квадратных сантиметров, в зависимости от размера особи кальмара. Основным компонентом биоткани является коллаген, при незначительном содержании липидов, углеводов и минеральных веществ.

После очистки биоткани от неколлагеновых компонентов может быть получена тонкая прочная мембрана, геометрические размеры которой близки исходному фрагменту.

Для этого отделенная механическим способом биоткань обрабатывается в течение 3-10 часов водным раствором нейтральной соли с ионной силой 0,2-0, 5 М, например, хлористого натрия.

При такой обработке биоткань практически не увеличивается в объеме, существенного изменения ее структуры не происходит, в то же время часть глобулярных белков, пептидов, нуклеиновых кислот и нуклеотидов, а также низко- и высокомолекулярных углеводов переходит в солевой раствор.

При использовании солевых растворов с концентрацией ниже 0,2 М наблюдается заметное набуханию биоткани с определенным изменением ее нативной структуры, а при концентрациях выше 0,5 М - промотируется агрегация коллагеновых фибрилл, с существенным ростом жесткости биоткани, негативно сказывающимся на полноте экстракции неколлагеновых компонентов.

Уменьшении времени обработки ниже указанного предела снижает степень извлечения неколлагеновых компонентов, а его увеличение - не сопровождается ее существенным ростом.

После обработки биоткань извлекается из солевого раствора и помещается в 5-10 кратный избыток слабощелочного водного раствора с pH 8-10, содержащий липазу и протеазу, в котором выдерживается в течение 3-4 часов при температуре 10-25 град. Цельсия, при постоянном контроле и поддержании pH на исходном уровне. В процессе обработки происходит гидролиз липидов и неколлагеновых белков, и переход продуктов гидролиза в раствор.

В качестве липазы предпочтительно использовать щелочную липазу, например LIPOPAN F, липазин, флюозим ГЗХ, а также нейтральную или щелочную протеазу, например ENZYM, ПРОК, суперлотан А.

Выбранный интервал pH близок к оптимальному с точки зрения активности ферментов. При этом снижение температуры обработки ниже 10 град. С увеличивает время гидролиза, а ее увеличение выше 25 град. С может приводить к изменению нативной структуры коллагена и частичной инактивации ферментов. После завершения ферментативной обработки, биоткань промывается водой и обрабатывается в течение 30 мин 1 М раствором уксусной кислоты, содержащем 10% хлористого натрия, для инактивации ферментов, а затем 0,1 М раствором бикарбоната натрия для нейтрализации кислоты, и дистиллированной водой для очистки от солей и других низкомолекулярных соединений.

Полученная влажная очищенная биоткань извлекается из раствора, высушивается на воздухе или сублимацией.

По существу, она представляет собой воздушно -сухую коллагеновую пленку (мембрану), содержащую в пересчете на абсолютно -сухое вещество как минимум 98% коллагена, при практическом отсутствии липидов, а также низко- и высокомолекулярных углеводов.

Комплекс физико-механических свойств коллагеновой мембраны значительно превосходит свойства известных аналогов. Так предельное напряжение при разрыве достигает 250 МРа, при величине относительного удлинения более 20%.

Воздушно-сухая коллагеновая мембрана, имеет толщину от 20 до 100 мкм, при отклонении от среднего значения не более 5%.

Процесс получения коллагеновой мембраны, согласно предложенному способу, исключает стадии экстракции и осаждения коллагена, и характеризуется, в целом, простотой, небольшой продолжительностью, не требует использования дорогостоящих реагентов и сложного оборудования, и может быть легко масштабирован.

Ниже приведен конкретный пример, применения изобретения.

Кальмар Dosidicus Gigas разделывается на анатомические части, с отделением слоя соединительной биоткани, непосредственно примыкающего к мантии, который промывается водой.

100 г биоткани, размером около 950 кв. см, помещается в пятикратный избыток 0,5 М раствора хлористого натрия, в котором выдерживается в течение 8 часов, после чего извлекается из солевого раствора и промывается 2 литрами воды.

Промытая биоткань переносится в водный раствор бикарбоната натрия с pH 8, содержащем липазу Lipopan F и протеазу Enzym, в количествах, обеспечивающих липазную и протеазную активность в растворе на уровне 50 и 10 ME соответственно, выдерживается в нем в течение 4 часов при температуре 20°С, в режиме периодического перемешивания и рН-статирования, а затем извлекается из раствора и промывается 1 литром воды. Промытая биоткань помещается в 1 М раствор уксусной кислот, содержащий 10% хлористого натрия, в котором выдерживается в течение 10 мин, и затем в 0,2 М раствор бикарбоната натрия для нейтрализации кислоты, и промывается дистиллированной водой до нейтрального pH среды. Промытая биоткань высушивается на воздухе при температуре 40°С.

В результате получают коллагеновую мембрану, представляющая собой тонкий плоский полупрозрачный лист площадью 820 кв. см, толщиной 50 мкм, с разнотолщинностью в 1,5 мкм, с пределом прочности на разрыв 220 МРа, и относительном удлинении при разрыве 23%, содержащая 98% коллагена в пересчете на абсолютно сухое вещество.

Коллагеновая мембрана обладает биосовместимостью, резорбируемостью в физиологических условиях, характеризуется повышенными физико -механическими характеристиками, может использоваться как ксеноимплантат, в инженерии тканей, выращивании культуры клеток и косметических манипуляциях, практически без ограничений.