EXTRAITS DE PLANTES DU GENRE TAGETES ET LEURS UTILISATIONS

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se situe dans le domaine des extraits végétaux et concerne un extrait de plantes du genre Tagetes enrichi en acide léontopodique B, un procédé de préparation d'un tel extrait ainsi qu'une composition cosmétique et une composition pharmaceutique ou nutraceutique, lesdites compositions comprenant en tant qu'agent actif au moins un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel extrait de plantes du genre Tagetes, notamment en tant que médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neurodégénérative, en particulier la maladie d'Alzheimer.

ART ANTERIEUR

La grande majorité des propriétés bénéfiques de l'Edelweiss {Leontopodium alpinum Cass., famille des Astéracées) a été attribuée aux métabolites secondaires polyphénoliques, et notamment à l'acide léontopodique identifié comme l'un des principaux composés des parties aériennes de l'Edelweiss (S. Schwaiger, et al., Leontopodic acid—a novel highly substituted glucaric acid derivative from Edelweiss (Leontopodium alpinum Cass.) and its antioxidative and DNA protecting properties, Tetrahedron, Volume 61, Issue 19, 2005, 4621-4630). L'acide léontopodique B a été retrouve en moindre quantité que l'acide léontopodique A dans les parties aériennes de l'Edelweiss (S. Schwaiger, et al. Development of an HPLC-PAD-MS assay for the identification and quantification of major phenolic edelweiss (Leontopodium alpium Cass.) constituents, Phytochemical Analysis, volume 17, no. 5, 2006, 291-298). Cette classe de métabolites secondaire dérivés de l'acide glucarique a rarement été trouvé en dehors du genre Leontopodium (S. Schwaiger et al., 2005).

La demande CN101856347 décrit une composition pharmaceutique contenant de l'acide léontopodique extrait d'une plante du genre Edelweiss, utilisée dans la préparation de médicaments destinés à traiter l'hépatite.

Costa et al. (2010) enseigne que le prétraitement de cellules avec de l'acide léontopodique isolé d'une plante du genre Edelweiss entraîne la diminution de la production d'espèces réactives de l'oxygène (Reactive Oxygen Species, ou ROS) mais n'induit aucune amélioration de la survie cellulaire (S. Costa et al.; Free radicals and antioxidants in two oxidative-stress cell models exposed to ochratoxin A and amyloid β : unexpected results, World Mycotoxin journal , August 2010, 3(3) : 257-261). L'effet anti-inflammatoire d'extraits éthanoliques d'Edelweiss comprenant de l'acide léontopodique a également été décrit (Lulli D. et al., Anti-inflammatory effects of concentrated ethanol extracts of Edelweiss (Leontopodim alpinum cass.) callus structures towards human keratinocytes and endothelial cells, Mediators of Inflammation, vol. 2012, article ID 498373).

L'effet anti-oxydant exercé par des dérivés d'acide hexarique sur des neutrophiles est également connu (Dudek et al., Caffeic acid derivatives isolated from the aerial parts of Galinsoga parviflora and their effect on inhibiting oxidative burst in human neutrophils, Phytochemistry Letters 16 (2016), 303-310). L'Edelweiss est une plante clairsemée dans les hautes montagnes de l'Europe et de l'Asie à 1 800-3 000 mètres d'altitude, dans des zones inaccessibles, et elle est protégée dans de nombreux pays. Il est donc fortement souhaitable de disposer de nouvelles sources de ce puissant antioxydant.

Tagetes est un genre de plantes herbacées de la famille des Asteraceae selon la classification classique, originaire du Mexique, d'Amérique centrale et de l'ouest de l'Amérique du Sud . Ce genre est composé d'une trentaine d'espèces dont certaines sont cultivées comme ornementales (Tagetes erecta) ou médicinales (Tagetes patula) et sont utilisées en médecine traditionnelle pour leurs propriétés antibactériennes, antifongiques et apaisantes. Les parties aériennes de plantes du genre Tagetes sont connues pour leurs vertus médicales ou cosmétiques, notamment via la présence de nombreux composés phénoliques. Cependant aucune des études publiées n'a reporté la présence d'acide léontopodique dans les plantes du genre Tagetes.

Les inventeurs ont maintenant développé un procédé permettant de préparer un extrait végétal de Tagetes enrichi en acide léontopodique B (ALB). Les inventeurs ont en effet montré que la culture de plantes du genre Tagetes, en particulier Tagetes patula et Tagetes erecta, dans des conditions particulières, permet d'obtenir un extrait desdites plantes comprenant de manière inattendue une très forte teneur en acide léontopodique B (ALB), détecté pour la première fois dans le genre Tagetes. Un tel procédé permet la réalisation d'extractions successives sans détruire ni altérer la survie des plantes. Les inventeurs ont également montré qu'un extrait végétal selon l'invention présente non seulement des bénéfices cosmétiques, notamment le traitement ou la prévention du vieillissement cutané et de l'inflammation de la peau, mais également une activité neuro-protectrice intéressante pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, et tout particulièrement la maladie d'Alzheimer.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 montre un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes erecta obtenu selon l'exemple 1.

La Figure 2 montre un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes patula obtenu selon l'exemple 2.

La Figure 3 montre la survie, en pourcentage de neurones vivants par rapport au contrôle, de neurones corticaux primaires intoxiqués pendant 24h par le peptide Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ, en présence d'un extrait racinaire de Tagetes erecta à des concentrations variant de 10 ng/mL à 10 pg/ml, conformément à l'exemple 5.

Les barres de l'histogramme représentent : témoin contrôle (1) ; + peptide Αβ1-42 (2) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 nM (3) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 100 nM (4) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 1 μΜ (5) ; peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 μΜ (6).

La Figure 4 montre la croissance du réseau de neurites intoxiqués pendant 24h par le peptide de Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ, en présence en présence d'un extrait racinaire de Tagetes erecta à des concentrations variant de 10 ng/mL à 10 pg/ml, conformément à l'exemple 5. Les barres de l'histogramme représentent : témoin contrôle (1), + peptide Αβ1-42 (2), peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 nM (3), peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 100 nM (4), peptide Αβΐ- 42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 1 μΜ (5), peptide Αβ1-42 + extrait racinaire de Tagetes erecta 10 μΜ (6).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention a pour premier objet un extrait de plantes du genre Tagetes caractérisé en ce qu'il est enrichi en acide léontopodique B et qu'il comprend au moins 2,5%, en particulier au moins 5,5%, plus particulièrement au moins 8% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.

Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un extrait de plantes du genre Tagetes enrichi en acide léontopodique B et comprenant au moins 2,5%, au moins 3%, au moins 3,5%, au moins 4%, au moins 4,5%, au moins 5%, au moins 5,5%, au moins 6%, au moins 6,5%, au moins 7%, au moins 7,5%, au moins 8%, au moins 8,5%, au moins 9%, au moins 9,5%, ou au moins 10% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.

Par « extrait de plantes du genre Tagetes » on entend le produit obtenu par l'extraction de plantes, ou d'une plante, du genre Tagetes, ou « Tagettes ».

Par « enrichi en acide léontopodique B » on entend un extrait végétal comprenant une quantité supérieure d'acide léontopodique B, par rapport à un extrait végétal correspondant pouvant être trouvé dans la nature.

Par « acide léontopodique » on entend un composé répondant à la formule générale (I) suivante :

HO

(I), dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène ou un groupe 3-hydroxybutanoyl de formule CH3-CH(OH)-CH2-CO. Par « acide léontopodique B », ou « ALB », on entend un composé répondant à la formule générale (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène. Par « acide léontopodique Bl » ou « ALB1 », on désigne un composé de formule (I) dans laquelle Q2, Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et Qi représente un atome d'hydrogène.

Par « acide léontopodique B2 » ou « ALB2 », on désigne un composé de formule (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène, ledit composé étant caractérisé en ce que la masse m/z du produit ionisé (autrement appelé ion moléculaire) en spectrométrie de masse en mode négatif est de 695 et que son temps de rétention chromatographique est supérieur à celui de l'acide léontopodique Bl dans les conditions expérimentales décrites dans l'exemple 1.1.

Par « acide léontopodique B3 » ou « ALB3 », on désigne un composé de formule (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un atome d'hydrogène, ledit composé étant caractérisé en ce que la masse m/z du produit ionisé (autrement appelé ion moléculaire) en spectrométrie de masse en mode négatif est de 695 et que son temps de rétention chromatographique est supérieur à celui de l'acide léontopodique B2 dans les conditions expérimentales décrites dans l'exemple 1.1.

Par « acide léontopodique A », ou « ALA », on entend un composé répondant à la formule générale (I) dans laquelle trois quelconques des radicaux Qi, Q2, Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et le quatrième radical représente un groupe 3-hydroxybutanoyl de formule CH ₃ -CH(OH)-CH ₂ -CO- .

Plus particulièrement, on entend par « acide léontopodique A » un composé de formule (I) dans lequel Q ₂ , Q3 et Q ₄ représentent un groupe caféoyle et Qi représente un groupe CH ₃ -CH(OH)-CH ₂ CO-.

Les différents isomères de position de l'ALB, notamment ALB1, ALB2 et ALB3, et de l'ALA sont donc des acides de formule générale (I) substitués par 3 groupements caféoyles et par un radical R, avec R choisi parmi : un groupe 3- hydroxybutanoyl et un atome d'hydrogène, tels que représentés dans le Tableau 1 ci-dessous :

Tableau 1. Structure des acides léontopodiques Par « extrait sec » on entend l'extrait obtenu par la mise en œuvre du procédé suivie d'une étape de dessication de l'extrait, la dessication étant mise en œuvre selon toute méthode bien connue de l'homme du métier, notamment de placer l'extrait en atmosphère chaude et sèche. Par « biomasse racinaire sèche » on entend la biomasse racinaire sèche déterminée avant de procéder à l'étape d'extraction racinaire. Pour l'extraction solide / liquide à partir de racine fraîche, la biomasse racinaire sèche a été mesurée à 5 ± 1,5% de la biomasse racinaire fraîche.

Selon un aspect avantageux, un extrait selon la présente invention peut être également défini en ce qu'il comprend au moins 0,75% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de biomasse sèche, plus préférentiellement au moins 1,5%, au moins 2%, au moins 2,5%, ou au moins 3% en poids d'acide léontopodique B. Selon un aspect particulier, un extrait selon l'invention est caractérisé en ce que ledit acide léontopodique B comprend les isomères de position ALB1, ALB2 et ALB3, ledit isomère ALB2 étant présent dans une proportion d'au moins 50%, préférentiellement d'au moins 80% du poids total de l'acide léontopodique B présent dans ledit extrait.

Selon un autre aspect particulier, un extrait selon l'invention est caractérisé en qu'il ne comprend pas d'acide léontopodique A en quantité détectable, ou qu'il comprend une quantité faible ou très faible d'acide léontopodique A, et de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1,5%, plus préférentiellement moins de 1% et encore plus préférentiellement moins de 0,5% d'acide léontopodique A, en pourcentage du poids total de l'acide léontopodique présent dans ledit extrait.

Selon un autre aspect avantageux, un extrait selon la présente invention comprend au moins 2,5% en poids d'acide léontopodique B, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, plus préférentiellement au moins 5,5%, au moins 6,5%, au moins 7%, au moins 7,5%, au moins 8% et au moins 8,5% en poids d'acide léontopodique B exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, et comprend moins de 1,5%, de préférence moins de 1%, plus préférentiellement moins de 0,5% d'acide léontopodique A, en pourcentage du poids total de l'acide léontopodique présent dans ledit extrait. Selon un autre aspect particulier, un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention est un extrait d'une espèce de Tagetes choisie parmi Tagetes erecta et Tagetes patula.

Selon un autre aspect particulier, un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention est un extrait d'une partie de la plante, c'est-à-dire une partie constitutive d'une plante telle que les racines, la tige, les feuilles, la fleur ou la graine. Avantageusement, l'invention a pour objet un extrait racinaire d'une plante du genre Tagetes. Pour l'obtention d'un extrait des différentes parties aériennes, quand celles-ci sont jugées suffisamment développées, elles sont mises en contact avec un liquide de lessivage ou solvant par percolation, aspersion, immersion ou macération et ensuite ledit liquide de lessivage est récupéré et traité pour en extraire les molécules d'intérêt qui ont été libérées par les parties aériennes desdites plantes. Pour l'obtention d'un extrait racinaire, quand les racines sont jugées suffisamment développées, celles-ci sont mises en contact avec un solvant par immersion ou macération, et ensuite ledit solvant est récupéré et traité pour en extraire les molécules d'intérêts qui ont été libérées par les racines desdites plantes. Ce type de procédé correspond en partie au procédé développé par la société Plant Advanced Technologies (PAT) sous le nom de « PAT Plantes à Traire ^® » et décrit dans la demande internationale WO 01/33942. Le contenu de la demande internationale WO 01/33942 est incorporé par référence à la présente description.

Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un extrait de plantes du genre Tagetes, notamment un extrait racinaire, plus particulièrement choisi parmi :

Un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un solvant,

- Un extrait obtenu par macération racinaire dans un solvant, et

Un mélange d'au moins un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un premier solvant et d'au moins un extrait obtenu par macération racinaire dans un deuxième solvant ; Dans un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention comprenant :

a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,

b) optionnellement une étape de stimulation des plantes,

c) une étape d'extraction solide / liquide des plantes optionnellement stimulées lors de l'étape b), et

d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c). Selon un mode de réalisation particulier de ce deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention comprenant :

a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,

b) optionnellement une étape de stimulation des racines des plantes, c) une étape d'extraction solide / liquide des racines optionnellement stimulées lors de l'étape b), et

d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).

Dans le cadre de l'invention, on entend par « culture des plantes en conditions hors sol », tout mode de culture dans lequel les racines de la plante ne sont pas dans de la terre. Plus précisément, la culture hors sol est une culture dans laquelle les racines des plantes reposent dans un milieu reconstitué, détaché du sol. Ce milieu de culture est irrigué de façon régulière par des solutions nutritives appropriées à la plante cultivée.

Il existe différentes techniques de culture hors sol tels que les systèmes sans substrat qui nécessitent une solution nutritive enrichie en oxygène, et les systèmes avec substrat. Parmi les systèmes sans substrat, on peut citer l'aquiculture pour laquelle la solution nutritive est non circulante et est contenue dans un bac de culture, la Nutrient Film Technique (N. F.T.) pour laquelle la solution nutritive s'enrichit en oxygène dissous au cours de son déplacement par échange avec l'air, et l'aéroponie pour laquelle les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide : elles sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation (via un brumisateur) de la solution nutritive dans un milieu fermé. Parmi les systèmes avec substrat, on retrouve la subirrigation dans laquelle la solution nutritive pénètre dans le substrat au niveau de sa partie inférieure et la percolation dans laquelle la solution nutritive est distribuée par irrigation discontinue à la surface supérieure du système puis percole vers le bas du substrat. Le substrat, minéral ou organique, est neutre et inerte comme du sable, de l'argile ou de la laine de roche par exemple. Ce substrat peut être également d'origine industrielle. On entend par « culture des plantes en aéroponie » un mode de culture hors sol pour lequel les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide. Selon un mode de réalisation particulier, les plantes sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation, via un brumisateur, de la solution nutritive dans un milieu fermé.

Typiquement, dans un procédé selon l'invention, on peut disposer des plantes sur des plateaux avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire en-dessous, on dispose les plateaux sur des tables formant zone de rétention pour collecter l'excédent d'un liquide diffusé vers les plantes, et on transfère les plateaux sur les tables à différents postes.

Lors de l'étape a), les plantes cultivées en aéroponie sont alimentées par pulvérisation racinaire d'une solution nutritive de sels minéraux essentiels (Azote - N, Phosphore - P, Potassium - K), afin d'obtenir un développement racinaire maximum et une concentration maximum en molécules d'intérêt, sans altérer la survie de la plante. L'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales, sait comment adapter les proportions et concentrations des différents sels minéraux pour optimiser le développement racinaire et la concentration des molécules d'intérêt. Les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont dans ce cas comprises dans une gamme d'électroconductivité faible s'étendant avantageusement entre 0,4 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 0,6 à 0,8 mS, afin de favoriser une plus grande diversité de molécules dans les extraits.

Dans l'étape c) d'un procédé selon l'invention, on entend par « extraction solide/liquide » toute technique d'extraction par solvant qui consiste à extraire une espèce chimique se trouvant dans un solide et étant soluble dans ledit solvant. Parmi ces techniques d'extraction, on peut citer la macération, l'exsudation, l'infusion, la décoction, l'extraction par extracteurs de Soxhlet et de Kumagawa, l'extraction assistée par micro-onde, l'extraction assistée par ultrason, l'extraction par voie enzymatique, l'extraction par fluide supercritique (C02 +DPG). L'extraction conduit à la récupération des métabolites contenus dans l'une ou l'autre partie des plantes, et notamment les racines, au moyen d'un liquide de lessivage, ou solvant, mis en contact avec les racines coupées et/ou encore accrochées à la plante, dans un solvant particulier et pendant une durée appropriée.

Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des plantes ou d'une partie des plantes, est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation et une macération. Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des plantes ou d'une partie des plantes, avantageusement les racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation racinaire et une macération racinaire. Cette étape consiste notamment en une étape de « trempage », pendant laquelle on met les racines des plantes dans un bac de trempage contenant un liquide pendant une durée prédéterminée. Typiquement, les plantes sont disposées sur un plateau avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire au-dessous, le plateau est remonté après le trempage, puis le liquide contenu dans le bac de trempage est collecté. Selon un aspect particulier, l'étape de trempage est suivie d'une étape de coupe dans laquelle la partie aérienne ou la partie racinaire des plantes est partiellement coupée pour récolter la partie coupée. Il est possible d'extraire les substances des parties coupées, outre l'extraction des substances lors du trempage.

De préférence, dans un procédé selon l'invention, l'exsudation racinaire est réalisée sur des racines encore attachées à la plante. Selon un autre aspect préféré, la macération racinaire est réalisée sur des racines fraîchement coupées, c'est-à-dire coupées depuis moins de 24 heures, et de préférence le plus tôt possible après coupage, idéalement juste après coupage, lesdites racines étant éventuellement séchées après leur section et avant macération. Le séchage des racines peut être réalisé par la mise en œuvre de tout procédé de séchage adapté, connu de l'homme du métier, et notamment en plaçant les racines à une température comprise entre 40°C et 60°C pendant 4 heures, de préférence dans un environnement sec. Le séchage des racines peut notamment être réalisé dans une étuve ventilée.

Plus particulièrement, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant choisi parmi : les alcools, les glycols et les solvants eutectiques. Ledit alcool est choisi de préférence parmi l'éthanol et le méthanol, utilisés purs ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% d'alcool, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit glycol est un diol dans lequel les deux groupes hydroxyl sont portés par des carbones différents, et est choisi parmi : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1,2 diol et le butylène glycol, et est utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse de glycol, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% de glycol, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit solvant eutectique est constitué de deux composants ou plus, qui peuvent être solides ou liquides et qui, dans une composition particulière, présentent une forte diminution de leur température de fusion, rendant ainsi le mélange liquide. Les solvants eutectiques naturels sont principalement constitués d'acides aminés, d'acides organiques, de sucres et de dérivés de la choline. L'eau peut faire partie du solvant, mais est dans ce cas fortement retenu dans le liquide et ne peut être évaporée. Les combinaisons particulières des composants constituant ledit solvant eutectique sont choisies parmi notamment, et de manière non exhaustive, le chlorure de choline - glucose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 4: 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide tartrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - xylose (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - xylose (ratio 3 : 1), l'acide citrique - saccharose (ratio 1 : 1), l'acide citrique - glucose (ratio 1 : 1), le glucose - acide tartrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - urée (ratio 1 : 2), le chlorure de choline - xylitol - eau (2 : 1 : 3) et l'acide lactique - glucose - eau (5 : 1 : 3). Ces solvants permettent de favoriser l'extraction d'une forte teneur en acide léontopodique B (ALB) et ses isomères. Dans le cas d'un mélange d'extraits racinaires, lesdits premier et deuxième solvants peuvent être identiques ou différents.

Selon un aspect particulier de l'invention, le solvant est caractérisé par un pH acide, notamment lorsqu'il est utilisé lors de l'étape d'extraction solide/liquide. Selon un aspect particulier, ledit alcool ou ledit glycol utilisé lors d'une étape d'extraction solide/liquide est caractérisé par un pH compris entre 2 et 5, de préférence entre 2 et 4, plus préférentiellement entre 2,5 et 3,5. Selon un autre aspect particulier, un extrait végétal selon l'invention est caractérisé par un pH compris entre 2,5 et 5, de préférence entre 2,5 et 4 et plus avantageusement entre 3 et 4. L'utilisation d'un solvant à pH acide favorise la solubilisation des composés d'intérêt dans ledit solvant et limite la dégradation chimique ou enzymatique des métabolites secondaires dont ALB lors de l'extraction. Les acides utilisés pour l'ajustement du pH du solvant ou de l'extrait sont de préférence l'acide phosphorique, l'acide citrique ou l'acide chlorhydrique. Plus particulièrement, ledit glycol est choisi dans le groupe suivant : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1, 2 diol et le butylène glycol.

Le propane 1,3 diol, ou triméthylène glycol, peut être préparé par synthèse chimique selon des techniques connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature, il est aussi disponible commercialement. Ledit propane 1,3 diol peut également être produit par la mise en œuvre d'un procédé de fermentation en conditions adaptées d'un organisme vivant, notamment une souche génétiquement modifiée d'Escherichia coli. Le propane 1,3 diol ainsi obtenu est désigné par le terme de « propane 1,3 diol biosourcé », un tel produit est produit puis purifié comme décrit notamment dans la demande internationale WO 2004/101479 et commercialisé sous la marque Zéméa®. Par « butylène glycol » on entend le butane 1,2 diol, le butane 1,3 diol, le butane 2,3 diol et le butane 1,4 diol. De façon encore plus particulière, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide comprend la mise en présence des racines avec du propane 1,2 diol ou avec du propane 1,3 diol, et notamment du propane 1,3 diol biosourcé.

Selon un aspect particulier, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant pendant une durée comprise entre 15 minutes et 30 minutes pour l'exsudation racinaire et pendant une durée comprise entre 1 heure et 96 heures, notamment entre 24 heures et 72 heures, plus particulièrement entre 36 heures et 48 heures pour la macération racinaire.

Selon un autre aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend une étape de section des racines puis de séchage des racines sectionnées, préalablement à l'étape de macération desdites racines, la macération étant réalisée par la mise en présence des racines avec un solvant.

Le procédé selon l'invention peut donc comprendre une première étape d'exsudation racinaire effectuée par immersion dans un solvant des racines encore accrochées à la plante pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, suivie d'une étape de macération racinaire des racines coupées de la plante, puis éventuellement séchées.

Les durées d'exsudation racinaire et/ou de macération racinaire sont choisies de manière à favoriser l'extraction d'une forte quantité en composés d'intérêt tout en n'altérant pas la survie de la plante et sans mener à l'épuisement des ressources. Ainsi les plantes, après l'étape d'exsudation racinaire, sont remises en culture en aéroponie selon les étapes a) et optionnellement b) afin de recommencer leur développement racinaire et favoriser la production par les racines de métabolites secondaires.

Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un extrait racinaire de plantes du genre Tagetes. Selon un aspect préféré, un procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un extrait racinaire de plantes du genre Tagetes erecta ou Tagetes Patula. Selon un mode de réalisation préféré, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait de plantes du genre Tagetes selon l'invention comprenant :

a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,

b) une étape de stimulation des racines des plantes,

c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), et

d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).

Selon un autre aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape b) de stimulation des racines des plantes comprend :

• une étape d'élicitation dans laquelle les racines sont mises en présence d'une solution comprenant au moins un agent choisi parmi : un sel, un tensioactif, un solvant, un éliciteur d'origine fongique ou bactérienne, un dérivé de l'acide jasmonique, en particulier le méthyl jasmonate, l'acide salicylique, un générateur d'éthylène, une chitine, des chitosans et/ou leur mélange, et/ou

• une étape de mise en présence des racines avec une solution carencée en azote, c'est-à-dire une solution comprenant une proportion d'azote inférieure à la proportion d'azote habituellement considérée comme optimale pour le développement de la plante et en particulier des racines, avantageusement moins de 15% d'azote, et avantageusement ne comprenant pas d'azote, lesdites étapes étant séquentielles ou simultanées. Les racines peuvent également être stimulées par la mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote. La mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote provoque un « stress azoté » responsable de la stimulation. Selon un aspect particulier, une solution carencée en azote selon la présente invention est une solution comprenant moins de 15% d'azote, de préférence moins de 10% d'azote, avantageusement moins de 8%, plus avantageusement moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% d'azote et encore plus avantageusement 0% d'azote.

L'étape b) de stimulation permet d'augmenter de manière significative la teneur en métabolites secondaires dans les racines et favoriser ainsi le flux des métabolites sortant des racines vers le solvant choisi pour l'extraction et ce, sans perte totale de la viabilité de la plante afin qu'elle puisse être remise en culture puis réutilisée. En d'autres termes, l'étape de stimulation de la plante permet de favoriser la production et la sécrétion des molécules d'intérêt.

Avantageusement, l'étape b) de stimulation des racines est réalisée par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution d'éliciteurs choisie parmi les dérivés d'acide jasmonique comme par exemple le méthyl jasmonate, l'acide salicylique et les chitosans ou par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape b) est mise en œuvre par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution choisie parmi :

• une solution de méthyl jasmonate à une concentration comprise entre 0,01 et 200 μΜ, avantageusement entre 0,1 et 20 μΜ,

· une solution d'acide salicylique à une concentration comprise entre 1 et 500 μΜ, avantageusement entre 10 et 50 μΜ,

• une solution de chitosans à une concentration de 0,002 à 1 g/L, avantageusement de 0,05 à 0,1 g/L, et

• une solution nutritive N/P/K comprenant moins de 6% d'azote, ladite solution étant de préférence vaporisée sur les racines.

En outre, l'étape b) de stimulation des racines avec une solution d'éliciteurs est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 1 jour et 21 jours, de préférence entre 1 et 7 jours. Selon un aspect particulier, l'étape b) de stimulation des racines par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 10 jours et 8 semaines, de préférence 3 semaines.

Lors de l'étape b), les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont comprises dans une gamme d'électroconductivité faible s'étendant avantageusement entre 0,4 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 0,6 à 0,8mS, afin de favoriser une plus grande diversité de molécules dans les extraits.

Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) est réalisée après l'étape a). Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) et l'étape a) sont effectuées de manière simultanée, la solution de stimulation est alors incorporée à la solution nutritive ou administrée par tout autre mode d'administration connu de l'homme du métier.

Selon un perfectionnement, l'étape de « trempage » est précédée d'une étape de lavage dans laquelle le liquide diffusé vers les plantes est de l'eau claire. On limite ainsi l'apport des éléments contenus dans la solution nutritive ou dans l'éventuelle solution de stimulation lors de l'étape de trempage.

Avantageusement, l'invention a pour objet un procédé comprenant les étapes suivantes :

a) une étape de culture de Tagetes en conditions hors-sol, et particulièrement en aéroponie,

b) une étape de stimulation des racines des plantes,

c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), comprenant :

- une première phase de mise en présence des racines encore liées à la plante avec un solvant, en particulier pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, - suivie d'une seconde phase comprenant la section desdites racines et la macération des racines sectionnées dans un solvant,

ledit solvant, identique ou différent dans la première et la deuxième phase, est choisi parmi les alcools, les glycols et les solvants eutectiques, et étant utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, de glycol ou de solvant eutectique, et

d) la récupération des extraits obtenus lors de l'étape c). Un procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape supplémentaire de réajustement de la teneur en solvant de l'extrait, pour obtenir une teneur avantageuse d'au moins 50%, et/ou un ajustement du pH de l'extrait, pour obtenir un pH avantageusement compris entre 3 et 5, de préférence d'approximativement 3,5, en vue de la conservation de l'extrait.

Un procédé selon l'invention comprend avantageusement au moins une étape supplémentaire de purification et/ou de traitement de l'extrait végétal, une telle étape est notamment choisie parmi :

au moins une filtration, en particulier une nanofiltration et/ou une filtration stérilisante et/ou une filtration clarifiante,

une extraction liquide/solide,

une purification,

une concentration et

une décoloration de l'extrait racinaire,

de telles méthodes de purification et/ou de traitement sont bien connues de l'homme du métier. Cette étape permet d'obtenir l'extrait final de Tagetes, de préférence de Tagetes patula et Tagetes erecta et en particulier de Tagetes erecta riche en polyphénols, notamment en léontopodique B (ALB) et ses isomères de position.

Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un extrait de plantes du genre Tagetes de préférence Tagetes patula et Tagetes erecta, particulièrement riche en polyphénols, notamment en acide léontopodique B et ses isomères. En particulier, l'extrait de plantes obtenu par le procédé décrit ci-dessus, est riche en un mélange des différents isomères de l'ALB, comme par exemple ALB1, ALB2 et ALB3. Un chromatogramme (Figure 1) de l'analyse d'un extrait racinaire de Tagetes erecta obtenu selon l'invention, montre que l'acide léontopodique B est présent dans cet extrait sous la forme d'au moins trois isomères : ALB1, ALB2 et ALB3. ALB2 est l'isomère majoritairement présent. De préférence, au moins 50%, encore plus préférentiellement au moins 80% en poids desdits ALB sont sous la forme de l'isomère ALB2, par rapport au poids total d'acide léontopodique B. La présente invention a également pour objet un extrait susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention.

La présente invention a pour troisième objet une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient. Avantageusement, ledit extrait est un extrait de plantes du genre Tagetes, de préférence Tagetes patula et Tagetes erecta et notamment un extrait racinaire de plantes du genre Tagetes, en particulier un extrait racinaire de Tagetes patula ou de Tagetes erecta selon l'invention.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition cosmétique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement cosmétique adapté à un sujet comme par exemple le type de peau.

La composition cosmétique selon l'invention est avantageusement destinée à une application topique. Elle peut notamment se présenter sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une lotion, d'un gel, d'un sérum, d'un spray, d'une mousse, d'une solution, d'une pommade, d'une émulsion, d'un patch ou d'un masque. Une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un excipient cosmétiquement acceptable choisi en fonction du type d'administration souhaitée. Une composition cosmétique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc.

Un excipient cosmétiquement acceptable peut être choisi parmi les polymères, les composés siliconés, les agents tensioactifs, les agents de rhéologie, les agents humectants, les agents de pénétration, les composants huileux, les cires, les émulsifiants, les agents filmogènes, les parfums, les électrolytes, les ajusteurs de pH, les agents antioxydants, les conservateurs, les colorants, les nacres, les pigments et leurs mélanges.

Une composition cosmétique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre agent cosmétiquement actif, tels qu'un autre agent anti-âge, un agent hydratant, un agent ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante, un agent stimulant la microcirculation cutanée, un agent sébo- régulateur pour le soin des peaux grasses, un agent nettoyant ou purifiant, un agent anti-radicalaire, un agent anti-inflammatoire, un filtre solaire chimique ou minéral, etc.

Avantageusement, une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un extrait de Tagetes selon l'invention, et en particulier un extrait racinaire de Tagetes patula ou de Tagetes erecta selon l'invention, en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, en poids par rapport au poids total de la composition.

La présente invention a pour quatrième objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition cosmétique selon l'invention, pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme ainsi que la fonction barrière de l'épiderme et l'hydratation de la peau, et/ou pour protéger l'épiderme des stress environnementaux. Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à prévenir ou ralentir le vieillissement cutané. Une composition cosmétique selon l'invention peut aussi notamment être destinée à avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation qui peut se développer après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes. Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à favoriser l'intégrité et l'efficacité de la fonction barrière de l'épiderme. Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à stimuler l'hydratation de la peau.

La présente invention a pour cinquième objet une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, et une composition nutraceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient nutraceutiquement acceptable.

Dans la présente invention, on désigne par « pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable » tout ingrédient qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou nutraceutique, qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire ou chez l'Homme.

On désigne par « sels pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables » d'un composé, des sels qui sont pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables, comme défini ci-dessus, et qui possèdent l'activité pharmacologique souhaitée du composé parent. De tels sels comprennent :

(1) les hydrates et les solvates,

(2) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés avec des acides inorganiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2-naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, ou

(3) les sels d'addition de base pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique ou inorganique pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable. Les bases organiques acceptables comprennent la diéthanolamine, l'éthanolamine, N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques acceptables comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique adapté à un sujet comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. En fonction du type d'administration souhaitée, la composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant pharmaceutiquement connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc.

Avantageusement, ladite composition pharmaceutique comprend au moins un extrait selon l'invention en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, en poids par rapport au poids total de la composition.

Une composition pharmaceutique est particulièrement adaptée pour une administration par voie orale, nasale, transdermique, parentérale, topique, rectale et mucosale. Elle peut se présenter sous forme sèche, telle que par exemple : capsule molle, gélule, comprimé, lyophilisât, poudre, granule, ou patch, ou sous forme liquide, telle que : solution, suspension, spray, crème ou gel.

L'excipient pharmaceutiquement acceptable est connu de l'Homme du Métier et est choisi selon le mode d'administration de la composition pharmaceutique. A titre d'exemple, l'excipient pharmaceutiquement acceptable peut être choisi dans le groupe constitué par les agents diluants, liants, désintégrants, les colorants, les lubrifiants, les agents solubilisants, les agents promoteurs d'absorption, les filmogènes, les agents gélifiants, et leurs mélanges.

La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un composé choisi dans le groupe constitué par les émollients, les actifs hydratants, les activateurs de la synthèse de kératine, les kératorégulateurs, les kératolytiques, les agents restructurant de la barrière cutanée (activateurs de la synthèse des lipides cutanés, agonistes PPARs ou Peroxysome Proliferator Activated Receptor), les activateurs de la différenciation des kératinocytes (rétinoïdes, calcidone®, le calcium), les antibiotiques, les agents anti-bactériens, les composés antifongiques, les agents anti-viraux, les sébo- régulateurs, les immunomodulateurs, tels que le tacrolimus, le pimécrolimus, les oxazolines, les conservateurs, les agents anti-irritants, les agents apaisants, des filtres et écrans solaires, les agents anti-oxydants, les facteurs de croissance, les agents cicatrisants ou les molécules eutrophiques, les médicaments et les agents anti-inflammatoires, les médicaments et les agents anti-Alzheimer.

La présente invention a pour sixième objet un extrait selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament.

Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention ou une composition nutraceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne et/ou pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.

Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, pour avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, pour stimuler la fonction barrière de l'épiderme ainsi que l'hydratation de la peau. Dans ce cas, ledit extrait sera avantageusement associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée, et ladite composition pharmaceutique contiendra avantageusement un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée.

Selon un autre aspect particulier, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention ou une composition nutraceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou traiter une maladie neuro-dégénérative.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par « maladie neurodégénérative » une maladie impliquant principalement une détérioration du fonctionnement, et éventuellement la mort, des cellules nerveuses, et en particulier des neurones. Ces maladies induisent des troubles d'ordre cognitivo-comportemental, sensoriel et moteur. Selon un aspect particulier, ladite maladie neurodégénérative est choisie parmi : la maladie d'Alzheimer, l'ataxie spinocérébelleuse, l'atrophie multisystématisée, la maladie d'Alexander, la maladie d'Alpers, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson, la maladie de Pick, la myofasciite à macrophages, la paralysie supranucléaire progressive, la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique.

Dans le cadre de la présente invention, une maladie neurodégénérative peut être une maladie neurodégénérative due au stress oxydatif. C'est le cas notamment de la maladie d'Alzheimer. On entend par « maladie d'Alzheimer » (MA) une maladie affectant principalement les personnes de plus de 65 ans, souffrant de différents symptômes cliniques tels que le déclin progressif de la mémoire, de la pensée, du langage et de la capacité d'apprentissage. Le rôle toxique du peptide β-amyloïde (Αβ) est maintenant passé de fibrilles Αβ insolubles à des plus petits agrégats solubles d'oligomères de Αβ. Il a été prouvé que des oligomères solubles de Αβ isolés de cortex de patients présentant la maladie d'Alzheimer induisent directement l'hyper- phosphorylation de la protéine Tau (T) et la dégénérescence des neurites (Jin M, et al ., Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5; 108(14) : 5819-24). Ainsi, toutes les substances ayant une propriété réductrice de la neurotoxicité du peptide Αβ peuvent être utiles en tant que nouvel agent thérapeutique pour le traitement ou la prévention de la maladie d'Alzheimer.

Selon un aspect particulier, la présente invention a donc pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou traiter la maladie d'Alzheimer. La présente invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique de la peau visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme ainsi que la fonction barrière de l'épiderme et l'hydratation de la peau, et/ou pour protéger l'épiderme des stress environnementaux, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend l'application, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'une composition cosmétique selon l'invention.

Avantageusement, dans la méthode selon l'invention, la composition cosmétique est appliquée chez un sujet en ayant besoin, notamment en prévision de ou consécutivement à une exposition unique ou répétée de la peau à un stress oxydant. En effet, ce dernier peut générer un excès de radicaux libres pouvant accélérer les signes de vieillissement cutané.

L'invention a enfin pour objet une méthode de prévention et/ou de traitement d'une maladie neurodégénérative, notamment d'une des maladies citées ci- dessus, et particulièrement la maladie d'Alzheimer, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un composé d'un extrait selon l'invention, d'un extrait préparé par un procédé selon l'invention, d'une composition nutraceutique selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention à un patient en ayant besoin. En outre, l'invention concerne une méthode pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, pour atténuer l'inflammation de la peau, pour avoir un effet apaisant ou calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, pour stimuler la fonction barrière de l'épiderme ainsi que l'hydratation de la peau, et pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie, chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition nutraceutique selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention. La présente invention concerne également une composition nutraceutique comprenant un extrait selon l'invention, ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et un excipient nutraceutiquement acceptable, pour améliorer les fonctions cognitives chez un patient atteint d'une maladie neurodégénérative, et particulièrement la maladie d'Alzheimer. L'excipient nutraceutiquement acceptable est connu de l'Homme du Métier et est choisi parmi les excipients conformes aux réglementations internationales applicables aux additifs alimentaires. Selon un aspect particulier, d'autres extraits botaniques connus de l'Homme du Métier peuvent également être ajoutés à une composition nutraceutique selon l'invention pour améliorer les fonctions cognitives chez un patient atteint d'une maladie neurodégénérative, et particulièrement la maladie d'Alzheimer. Ces extraits botaniques peuvent être choisies parmi des extraits de plantes ou d'une partie de plantes (par exemple racine, tige, feuille, fleur, graine, bourgeon, fruits) comme les citrus (orange, citron, pamplemousse), le genre Rosa (églantier, rosier), Panax ginseng, Bacopa monnieri, cassis, Ginkgo biloba, la vigne, la sarriette, le romarin, l'aulne, le noyer, l'olivier. Les exemples 1 à 4 qui suivent et les Figures 1 à 4 visent à illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.

EXEMPLES Exemple 1 : Préparation et caractérisation d'extraits racinaires de Tagetes erecta selon l'invention

Les extraits Tagetes erecta sont préparés à partir de plantes originaires de l'Ile de la Réunion. Le fournisseur est la Société Horticole de Bassin Plat, EARL Bassin Plat 31, Chemin de la Croix de Jubile 97410 Saint Pierre, Ile de la Réunion.

1.1 Extrait préparé à partir d'un solvant glycolé

Un extrait racinaire polyphénolique de Tagetes erecta, riche en ALB, est obtenu selon le procédé suivant : • Culture de Tagetes erecta en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 0,4 et 1,6 mS/cm,

• Stimulation de la plante pendant une durée de 2 à 4 semaines par un stress azoté par l'utilisation d'une solution nutritive N/P/K comprenant : moins de 6% d'azote, 15% de phosphore et 40% de potassium, et d'une électroconductivité de 0,6 à 0,8 mS/cm,

• Extraction des molécules d'intérêt par immersion des racines encore accrochées à la plante pendant une durée de 15 à 30 minutes dans un mélange propane 1,2 diol/eau, selon un ratio compris entre 85/15 et

70/30, à température ambiante et à un pH de 3,

• Extraction des molécules d'intérêt par macération des racines coupées de la plante pendant une durée de 48 à 72 heures dans un mélange propane 1,2 diol/eau selon un ratio compris entre 85/15 et 70/30, à température ambiante et à un pH de 3,

• Mélange des extraits obtenus aux deux étapes d'extraction précédentes,

• L'extrait est purifié (élimination des sels par nanofiltration), concentré par nanofiltration et clarifié par filtration clarifiante, et

• Réajustement de la teneur en propane 1,2 diol de l'extrait (au moins 50%) ainsi que du pH (approximativement 3,5) de l'extrait en vue de sa conservation.

L'extrait racinaire de Tagetes erecta ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :

• Teneur en extrait sec : 13,3 g/L

· Teneur estimée en ALB1 : 154 mg/L (soit 1,15% de l'extrait sec ou 0,6% de la biomasse racinaire sèche)

• Teneur déduite en ALB2 et ALB3 : 813 mg/L (soit 6,1% de l'extrait sec ou 3% de la biomasse racinaire sèche)

• Teneur déduite en ALB totaux (ensemble des isomères) : 967 mg/L (soit 7,3% de l'extrait sec ou 3,6% de la biomasse racinaire sèche)

• Solvant : 62%

pH : 3,66

La quantification des ALB se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir d'un standard d'ALBl commercial fourni par Extrasynthèse (Genay, France) solubilisé dans le solvant d'extraction et acidifié au pH 3,5 avec de l'acide phosphorique. Les concentrations de tous les isomères d'ALB sont ainsi exprimées en équivalents d'ALBl dans chaque extrait.

En Figure 1 est présenté un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes erecta obtenu selon l'exemple 1. L'appareil utilisé pour analyser l'extrait est une UPLC Shimadzu Nexera X2 (les pompes LC-30AD, passeur d'échantillon SIL-30AC, four CTO-20A, détecteurs à barrette de diodes SPD-M20A ; Kyoto, Japon) fonctionnant en phase inverse avec une colonne Kinetex biphenyl (00F- 4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) de dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm. La phase mobile est constituée d'un solvant A (Eau ultrapure Mili-Q, Merck Millipore +0.1% d'acide formique, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et d'un solvant B (Acetonitrile, Sigma-AIdrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) dont le gradient a été programmé de la façon suivante : 5-20% B (0-3.5 min), 20-27.5% B (3.5-8 min), 27.5-90% B (8-8.1 min), 90% B (8.1- 10 min), 90-5% B (10-10.1 min), 5% B (10.1-12 min) . Le débit d'analyse est de 0,5 mL/min avec une température de four de 40°C. En sortie de colonne, un détecteur à barrettes de diodes enregistre les spectres UV entre 220 et 370 nm. L'appareil est couplé à un spectromètre de masse (Shimadzu LCMS-2020) fonctionnant avec une ionisation par électrospray (4,5 kV) en mode positif et négatif dans une gamme de m/z entre 100 et 1000. Le logiciel LabSolutions (version 5.60 SP2) est utilisé pour exploiter le système. L'extrait à analyser est filtré sur un filtre 0,2pm avant injection.

1.2 Extrait préparé à partir de solvant hydroéthanolique

Des Tagetes erecta sont cultivées en aéroponie avec un milieu de culture 15/10/30 (azote/phosphore/potassium) ayant une électroconductivité de 0,4 à 1,6 mS/cm, puis les racines sont stimulées pendant une durée de 2 à 4 semaines par un stress azoté par l'utilisation d'une solution nutritive N/P/K comprenant : moins de 6% d'azote, 15% de phosphore et 40% de potassium, et d'une électroconductivité de 0,6 à 0,8 mS/cm. Les racines sont coupées puis sont séchées 48h dans une étuve ventilée à une température comprise entre 40 et 50°C. 450 mg de racines séchée sont broyés à sec puis macérées pendant 3 heures sous agitation à température ambiante dans 45 mL d'une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v). Ensuite l'extrait à analyser est filtré sur un filtre 0,2pm avant injection en UPLC selon le matériel et les méthodes décrits ci-dessus dans l'exemple 1.1.

La quantification des ALB est réalisée selon le matériel et les méthodes décrits ci-dessus dans l'exemple 1.1.

L'extrait racinaire de Tagetes erecta ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :

• Pas d'ALA identifié

• Teneur estimée en ALB1 : 0,5% de la biomasse racinaire sèche ou 2,5% de l'extrait sec

· Teneur déduite en ALB2 et ALB3 : 2,2% de la biomasse racinaire sèche ou 11% de l'extrait sec

• Teneur déduite en ALB totaux (ensemble des isomères) : 2,7% de la biomasse sèche ou 13,5% de l'extrait sec. Exemple 2 : Préparation d'un extrait racinaire et d'un extrait de feuilles de Tagetes patula cultivées en aéroponie sans étape de stimulation et caractérisation de la teneur en ALB de ces extraits

Les extraits de racines ou de feuilles sont préparés à partir de racines et de feuilles séchées de Tagetes patula, originaire de l'Ile de la Réunion. Le fournisseur est la Société Horticole de Bassin Plat, EARL Bassin Plat 31, Chemin de la Croix de Jubile 97410 Saint Pierre, Ile de la Réunion. Les plantes au stade 2 feuilles sont mises en culture en aéroponie avec un milieu de culture 6/10/36 (azote/phosphore/potassium) ayant une électroconductivité de 0,7 mS/cm. Après 2,5 semaines de culture en milieu aéroponique, des racines et des feuilles fraîches sont coupées, puis séchées 48h dans une étuve ventilée à une température comprise entre 40 et 50°C. 20 mg de tissus séchés (feuilles ou racines) sont broyés à sec puis macérées pendant 3 heures sous agitation à température ambiante dans 2 mL d'une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v). Ensuite l'extrait est filtré sur un filtre 0,2 pm avant injection en UPLC selon le matériel et les méthodes utilisés pour l'exemple 1. L'extrait racinaire de Tagetes patula selon le chromatogramme présenté en Figure 2 présente les caractéristiques suivantes :

• Pas d'ALA identifié • Teneur estimée en ALB1 : 0,07% de la biomasse sèche ou 0,35% de l'extrait sec

• Teneur déduite en ALB2 : 0,27% de la biomasse sèche ou 1,35% de l'extrait sec

· Teneur déduite en ALB totaux (ensemble des isomères) : 0,34% de la biomasse sèche ou 1,7% de l'extrait sec.

La présence d'ALA ou d'ALB n'a pas été identifiée dans les extraits de feuilles de Tagetes patula.

La quantification des ALB se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir d'un standard d'ALBl commercial fourni par Extrasynthèse (Genay, France) solubilisé dans le solvant d'extraction et acidifié au pH = 3,5 avec de l'acide phosphorique. Les concentrations de tous les isomères d'ALB sont ainsi exprimées en équivalents d'ALBl dans chaque extrait.

En Figure 2 est présenté un chromatogramme de l'extrait racinaire de Tagetes patula obtenu selon l'exemple 2, le matériel et les méthodes utilisés pour réaliser la chromatographie sont identiques aux matériels et les méthodes de la chromatographie de l'exemple 1.1.

Exemple 3 : Caractérisation d'un extrait racinaire de Tagetes erecta vis-à-vis d'un bénéfice cosmétique - Identification de cibles par analyse des modifications d'expression de gènes par qRT-PCR sur cartes TaqMan

L'étude consiste à mesurer les effets de l'extrait de Tagetes erecta par qRT- PCR sur cartes TaqMan microfluidiques, d'une part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans la biologie du derme, le remodelage des tissus conjonctifs et le vieillissement (carte « Dermal Benefits » définie par StratiCELL) et, d'autre part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans les fonctions clés de l'épiderme, telles que la fonction barrière en lien direct avec l'hydratation, la réponse antioxydante, ou encore la pigmentation par les mélanocytes (carte « Epidermal Benefits » définie par StratiCELL).

Le protocole a consisté à ajouter de l'extrait de Tagetes erecta dans le milieu de culture de fibroblastes humains NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) en monocouche et d'épidermes humains mélanisés reconstitués (RHE/MEL/001), et, après 24 h, à analyser les différentes populations d'ARN pour identifier les gènes différentiellement exprimés par qRT-PCR.

Une étude préalable de cytotoxicité a permis de définir la concentration de travail de l'extrait de Tagetes erecta pour l'étude d'expression génique.

Le TGF-βΙ (Transforming Growth Factor-beta-1) et la vitamine D3 (la, 25- dihydroxyvitamin D3), dont les effets sont documentés dans la littérature, ont été utilisés comme molécules de référence afin de valider les systèmes d'essai et la méthode d'analyse. 3.1. Matériels et méthodes

Extrait

Les plantes Tagetes erecta sont cultivées en aéroponie selon l'exemple 1. Les racines fraîches sont coupées puis macérées à température ambiante pendant 24 heures dans une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v). Ensuite l'extrait est filtré. Le solvant est éliminé en utilisant un évaporateur rotatif et la poudre séchée au dessiccateur. Une analyse par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrographie de masse (Agilent 1200 séries) a permis de vérifier la présence d'acide léontopodique B dans l'extrait.

Culture Cellulaire

La première partie de l'étude a été réalisée sur des fibroblastes de derme humains NHDFs (ATCC, CRL-2522, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu DMEM (Invitrogen, 31885-049) contenant des antibiotiques (Pénicilline/Streptomycine, Invitrogen, 15140-122) mais ne contenant pas de sérum. Ces cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.

La seconde partie de l'étude a été réalisée sur des épidermes reconstitués (StratiCELL®, RHE/MEL/001) contenant ou non des mélanocytes humains primaires NHEMs (Normal Human Epidermal Mélanocytes) provenant d'un donneur de phototype foncé (phototype IV à V) (Invitrogen, C2025C, lot n°439684). Les tissus ont été cultivés à l'interface air-liquide durant 14 jours dans un milieu de culture approprié, et une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02. Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait de Tagetes erecta par une étude préliminaire de cytotoxicité

Afin de déterminer la concentration d'analyse optimale pour l'extrait de Tagetes erecta, une expérience préliminaire a été réalisée sur fibroblastes NHDFs, sur mélanocytes humains NHEMs et sur épidermes reconstitués.

Les fibroblastes NHDFs ont effectué 30,1 et 30,7 doublements de population et les mélanocytes NHEMs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 h avant l'application des actifs.

Les épidermes reconstitués (RHE/001 ; lot CB0314/2) ont été transférés dans une plaque 12 puits avant d'être traités avec l'extrait.

L'extrait a été dilué dans le milieu de culture, puis ajouté, sans filtration préalable, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs ne contenant pas de sérum, dans le milieu des mélanocytes humains primaires NHEMs, ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés.

Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules et des épidermes au MTS (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-( 4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout d'extrait de Tagetes erecta et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3) pour les fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs, et à 2 concentrations et 3 répétitions (n = 3) pour les épidermes reconstitués. Les 2 concentrations testées pour les épidermes reconstitués ont été choisies sur la base des résultats de cytotoxicité obtenus pour les mélanocytes NHEMs.

Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.

Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à la mesure des modifications d'expression des gènes cibles. Les concentrations suivantes, en pg d'extrait sec/ml, ont été testées :

Fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs: 0,16 pg/ml, 0,8 pg/ml, 4 pg/ml, 20 pg/ml, lOOpg/ml ;

Epidermes reconstitués : 4 pg/ml et 20 pg/ml.

Analyse des modifications d'expression génique L'extrait a été ajouté, à une concentration choisie, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs (ayant effectué 30,5 et 30,8 doublements de population) en absence de sérum ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés mélanisés (RHE/MEL/001, lots CB0314/3 et CB0314/4), sans filtration préalable à la mise en contact des cellules/épidermes.

Des molécules de référence ont été étudiées en parallèle, à savoir, le TGF-βΙ pour les fibroblastes NHDFs et la vitamine D3 (VD3) pour les épidermes reconstitués. Extraction de l'ARIM total

L'extraction des ARNs totaux a été réalisée à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, 74106). 24 h après l'ajout de l'extrait, les cellules ont été rincées au PBS et lysées dans le tampon de lyse ad hoc, alors que les épidermes ont été directement plongés dans ce tampon (des triples de culture ont été réalisés pour chaque condition). L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à -80°C.

Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire

La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).

- Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNase-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham).

Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics d'électrophorèse correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S-ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN. L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S-ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARN de poids moléculaire plus élevé.

Synthèse des ADNs complémentaires ou ADNc

Les transcriptions inverses (RT) ont été réalisées à l'aide du kit « High Capacity RNA-to-cDNA Kit » (Applied Biosystems, 4387406). Pour la synthèse des ADNc, un mix a été préparé selon les instructions du fournisseur, avec 2 pg d'ARN total, le tampon ad hoc fourni dans le kit et l'enzyme transcriptase inverse. Cette réaction a été réalisée à 37°C pendant 1 heure, puis 5 minutes à 95°C et finalement les échantillons d'ADNc ont mis sur glace et stockés à - 20°C. Validation des systèmes d'essai - qPCR en temps réel à l'aide de sondes fluorescentes de type TaqMan

La méthode de qPCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l'expression de différentes cibles spécifiques dans les populations d'ARNs issues des fibroblastes NHDF traités par le TGF-βΙ (20ng/ml) ainsi que des épidermes mélanisés traités par la vitamine D3 (ΙΟΟηΜ) et par le solvant éthanol (EtOH 0,1%), utilisé pour solubiliser la VD3.

Les séquences cibles des gènes d'intérêt ont été amplifiées par PCR en utilisant les « TaqMan Gene Expression Assays » (Applied Biosystems). Ces kits comprennent une sonde TaqMan et 2 amorces spécifiques, qui ont été pré-mélangées à une concentration de 18 μΜ pour chaque amorce et de 5 pM pour la sonde. Ce mélange est concentré 20 fois. Les sondes TaqMan ont été greffées avec un fluorophore (FAM) à l'extrémité 5' de la séquence et avec un «quencher» de fluorescence en 3'.

Les PCRs ont été réalisées à l'aide du système 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Les réactions ont été réalisées dans un volume de 20 pL. Le mélange réactionnel contient 10 pL de TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 pL de TaqMan Gene Expression Assay et 5 pL d'eau RNase-free. Dans chaque puits d'une microplaque 96 puits, 16 μΙ_ du mélange et 4 μΙ_ d'ADNc (4 ng) ont été ajoutés. A des fins de normalisation, des mélanges réactionnels avec des sondes et amorces correspondant à la glycéraldehyde-3- phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour les fibroblastes et à la β2- microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés ont également été préparés avec les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a servi de contrôle négatif d'amplification. Les cycles thermiques ont été programmés avec une étape d'incubation à 50°C pendant 2 min, suivie d'une première étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min. Le protocole d'amplification PCR s'est poursuivi avec 40 cycles de 15 sec à 95°C suivi d'une min à 60°C. Les niveaux d'expression ont été quantifiés selon la méthode de calcul de l'expression relative par rapport à un gène de ménage (2 ^"Δα ), dérivée du calcul des ΔΔΟ: (Pfaffl, A new mathematical model for relative quantification in real- time RT-PCR, Nucleic Acids Res, 29 (9), 2001, 2002-2007; Livak and Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the ^&a method, Methods, 25 (4), 2001, 402-408) décrite ci-après :

La quantification relative des transcrits a été réalisée par l'utilisation d'une méthode de calcul qui consiste à comparer la moyenne des valeurs de contrôle (Ct) obtenues pour les conditions TGF-βΙ (20ng/ml) et VD3 (ΙΟΟηΜ) avec les conditions témoins respectives (CTL non traité et CTL Ethanol 0,1%). Ces Ct représentent le seuil de détection à partir duquel la quantité d'ADN est telle que le signal se distingue significativement du bruit de fond. Cette valeur moyenne de Ct a été normalisée par rapport à un gène de ménage, à savoir la Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour les fibroblastes NHDF et la β2-microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés reconstitués. Ainsi, la différence de niveau d'expression (RQ) a été obtenue par utilisation de la formule :

2 ^_ (ACt condition traitée - ACt condition de référence)

où ACt = Ct (gène cible) - Ct (gène de ménage) au sein d'un même échantillon d'ADNc.

Préparation des cartes microfluidiques Taqman, réalisation de la PCR quantitative et analyse des Ct Les mélanges réactionnels pour PCR sur cartes microfluidiques TaqMan, produites à façon par Applied Biosystems, ont été préparés en suivant les instructions détaillées du guide Applied Biosystems Micro Fluidic Card Getting Started Guide. En résumé, 100 ng d'ADNc ont été ajoutés à un mélange spécifique pour PCR (Taqman Universal PCR Master Mix, 4364338, Applied Biosystems) avant d'être injectés dans la carte et dispersés par capillarité. Après avoir centrifugé la carte, celle-ci a été scellée avant la réalisation de la PCR quantitative et l'analyse avec le système 7900HT d'Applied Biosystems, à l'aide du software ABI PRISM® 7900 Séquence Détection System, SDS2.4. Les cycles seuil (Ct) ont été obtenus pour tous les gènes représentés sur les cartes et exprimés par les fibroblastes NHDF et par épidermes reconstruits mélanisés.

Les résultats ont été exportés à partir du dispositif de qPCR en temps réel en utilisant le logiciel SDS RQ Manager (vl .2.1, Applied Biosystems) et l'analyse des modifications d'expression a été réalisée à l'aide du logiciel Data Assist (V3.0., Applied Biosystems) conçu pour réaliser la quantification relative de l'expression génique en utilisant la méthode de comparaison des Ct (ΔΔΟ:) (Pfaffl, 2001 et Livak and Shmittgen, 2001) décrite dans le paragraphe ci- dessus et une combinaison d'analyses statistiques. Comme précisé plus haut, la méthode de calcul des ΔΔΟ: consiste en la comparaison des valeurs de Ct obtenues pour les conditions traitées par l'extrait avec la condition de référence (contrôle DMSO). Ces valeurs de Ct ont elles-mêmes été normalisées par rapport au gène de ménage GAPDH (glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase) pour les fibroblastes NHDF et B2M (β-2 microglobulin) pour les épidermes reconstruits mélanisés. La valeur de Ct maximale admissible utilisée comme seuil de détection a été fixée à 36 cycles.

3.2. Résultats 3.2.1. Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait par une étude de cytotoxicité

L'étude préalable de cytotoxicité sur les fibroblastes NHDF, sur les mélanocytes humains NHEM et sur les épidermes reconstitués a permis de définir une concentration de travail (préparé dans du DMSO) pour l'étude d'expression génique. Le solvant présent dans l'extrait a été testé en parallèle. Le SDS à 0,08% (pour NHDF) et à 0,05% (pour NHEM) a été utilisé comme contrôle positif de cytotoxicité afin de valider l'expérience. Sur la base de ces résultats (données non montrées), les concentrations suivantes ont été choisies pour la suite de l'étude : 100 pg d'extrait sec /ml (pour les fibroblastes NHDF) et 20 pg d'extrait sec/ml (pour les épidermes mélanisés reconstitués).

3.2.2. Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire

Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARNs ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées). La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrée, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions de synthèse des ADNs complémentaires.

3.2.3. Effets de l'extrait sur 94 gènes cibles au sein des fibroblastes NHDF

L'extrait a été ajouté dans le milieu de culture des fibroblastes NHDF (n = 3). Des contrôles traités seulement par le solvant DMSO à 1% (véhicule de l'extrait) ont également été analysés. En parallèle, le TGF-βΙ (20 ng/ml) a été étudié en tant que contrôle de validation. Après 24 heures de culture des fibroblastes NHDF, les populations d'ARNs totaux ont été extraites, leur intégrité a été analysée par électrophorèse capillaire, et les différences d'expression géniques ont été analysées par qRT-PCR à l'aide de cartes TaqMan 96-puits, ciblant les fonctions clés du derme.

Les résultats sont présentés de manière récapitulative sous la forme d'un tableau (Tableau 2) indiquant des gènes représentatifs d'un effet cosmétique bénéfique, variant significativement, 24 heures après l'application de l'extrait sur des fibroblastes de derme humains NHDF. Extrait

Symbole- n° essai Nom du gène

RQ p-value

SOD2-Hs00167309_m l Superoxide dismutase 2, mitochondrial 13,58 0

CCL5-Hs00982282_m l Chemokine (C-C motif) ligand 5 2,24 0,0368

HMOX1-Hs01110250_m l Hème oxygènase (decycling) 1 2,05 0,0197

DCN-Hs00754870_sl Décorine (PGS2) 1,77 0,0396

SOX2-Hs01053049_sl Transcription facteur SOX-2 1,71 0,0361

HPSE-Hs00935036_m l Héparanase 1,66 0,0017

TXNRD1-Hs00917067_m l Thiorédoxine réductase 1 1,56 0,0199

NQOl-Hs02512143_sl NAD(H)déshydrogénase, quinone 1 1,51 0,0025

MT2A-Hs02379661_g l Métallothionéine 2A 1,51 0,0208

COL3A1-Hs00943809_m 1 Collagène 3 alpha 1 subunit (COL3A1) 1,43 0,002

CYR61-Hs00998500_g l Protéine CYR61 1,43 0,0293

Collagène sous-unité 16 alpha 1

COL16A1-Hs00156876_m l

(COL16A1) 1,42 0,034

NGF-Hs00171458_m l « Beta-nerve growth factor » 1,32 0,0036

FBLN5-Hs00197064_m l Fibuline-5 1,29 0,0062

MYC-Hs00153408_m l Myc proto-oncogène protéine 1,26 0,039

G6PD-Hs00166169_m l Glucose-6-phosphate déshydrogénase 1,18 0,0411

BDNF/NT-3 Facteurs de croissance

NTRK2-Hs00178811_m l

récepteur 0,56 0,0078

MKI67-Hs01032443_m l Antigène Ki-67 0,48 0,0111

Membre 16 de la superfamille des

NGFR-Hs00609977_m l récepteurs au facteur de nécrose

tumorale (p75NTR) 0,06 0,0006

Tableau 2 : Liste des gènes qui varient de manière significative 24 heures après l'application de l'extrait racinaire de Tagetes erecta (à 100 pg ES/ml) sur des fibroblastes de derme humains NHDFs. Le symbole des gènes et le numéro d'essai, le nom des gènes, l'expression relative (RQ) par rapport au véhicule DMSO à 1% (RQ > 1 : augmentation - RQ < 1 : diminution) et la valeur p (p-value) sont présentés.

• Défense anti-oxydante (6 gènes surexprimés)

L'extrait de Tagetes erecta induit remarquablement l'expression du gène de la superoxyde dismutase 2 (SOD2) (X 13,6). Cette régulation est couplée à la surexpression d'autres gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant, tels que HMOXl (hème oxygénase 1 (X2,l)), TXRNDl (thioredoxine réductase 1 (XI, 6)), NQOl (NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (XI, 6)), MT2A (métallothionéine 2A (XI, 5)) et G6PD (Glucose-6-phosphate déshydrogénase (X 1,2)).

La superoxyde dismutase 2 codée par le gène SOD2 est une protéine mitochondriale impliquée en première ligne dans la défense contre les espèces réactives de l'oxygène. En effet, elle convertit l'anion superoxyde en hydroperoxyde qui, lui-même, est convertit en oxygène et en eau par la catalase et les peroxyrédoxines.

La NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (NQOl ) est une autre enzyme détoxifiante qui favorise, par réduction, la formation des hydroquinones à partir des quinones, empêchant la production d'espèces radicalaires. Le gène NQOl est surexprimé en réponse à des agents pro-oxydants, à des métaux lourds, aux UV ou encore à des radiations ionisantes afin de protéger la cellule de leurs effets néfastes.

La glucose-6-phosphate déshydrogénase codée par le gène G6PD est la première enzyme de la voie des pentoses phosphates. Elle catalyse l'oxydation du glucose-6-phosphate en 6-phosphoglucono-5-lactone. Cette réaction est couplée à la réduction d'une molécule de NADP+ en NADPH, nécessaire à la réduction du glutathion GSSG (forme oxydée) en glutathion GSH (forme réduite), un puissant antioxydant.

Les métallothionéines, dont fait partie la métallothionéine 2A (MT2A), sont des protéines de faibles poids moléculaires capables de lier les métaux. Elles sont impliquées dans diverses fonctions biologiques telles que la neutralisation des radicaux libres, le stockage de zinc ou encore dans la protection contre la toxicité du cadmium.

Le gène HMOXl codant pour la protéine HO-1 ou hème oxygénase est souvent surexprimé en réponse à un stress, et joue un rôle crucial dans la protection et le maintien de l'homéostasie cellulaire. La protéine HO-1 est impliquée dans la dégradation de Thème (ayant des propriétés pro-oxydantes) en monoxyde de carbone, fer ferreux et biliverdine. Ces 2 derniers composants sont les précurseurs des antioxydants bilirubine et ferritine. HMOXl est donc connu pour son rôle protecteur contre le stress oxydant. Le système thiorédoxine est un des systèmes majeurs de défense antioxydante. Dans ce système, la thiorédoxine réductase catalyse le transfert d'électrons provenant du NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) vers la thiorédoxine, qui elle-même exerce une action réductrice sur diverses protéines cibles. Parmi les 3 isoformes de la thiorédoxine réductase, l'isoforme 1 codée par le gène TXRND1 est la plus étudiée. Elle est connue pour être notamment sous le contrôle transcriptionnel du facteur de transcription Nrf-2 jouant un rôle majeur dans la défense anti-oxydante.

La surexpression de 6 gènes impliqués dans la défense anti-oxydante témoigne de la capacité de l'extrait à réduire les effets de stress pro-oxydants générant un excès de radicaux libres, comme les UV accélérant les signes de l'âge au niveau de la peau, ou encore de lutter contre diverses pathologies ou conditions pro-inflammatoires, également génératrices d'espèces réactives de l'oxygène.

L'extrait se positionne clairement par rapport à une revendication cosmétique liée au contrôle de la production de radicaux libres, dans une optique anti-âge ou anti-inflammatoire.

• Résistance et élasticité de la peau

Plusieurs gènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire (MEC) sont également induits : DCN, HPSE, COL3A1, COL16A1, FBLN5.

La décorine (DCN) intervient, au niveau du derme, dans l'assemblage des fibrilles de collagène. Les collagènes III (COL3A1 ) et XVI (COL16A1 ) jouent un rôle dans le maintien de l'homéostasie de la MEC et sont donc importants pour la résistance et l'élasticité du derme. L'héparanase encodée par le gène HPSE joue un rôle dans la dégradation des héparans sulfate (HS), des composants de la membrane basale présents au niveau des membranes cellulaires où ils sont associés avec d'autres protéines pour former des protéoglycans (entre autres le perlécan, les syndécans et les glypicans). La fibuline-5 (FBLN5) joue quant à elle un rôle majeur dans l'assemblage des fibres élastiques au niveau du derme.

Ces régulations positionnent donc l'extrait comme potentiellement intéressant afin de favoriser la restructuration du derme dans le contexte du vieillissement cutané. • Neurotrophines et perception de la douleur

Plusieurs gènes sont également réprimés par l'extrait : c'est le cas de NTRK2 (X0,6) et de NGFR (X0,06) . Ces derniers codent pour des récepteurs aux neurotrophines, responsables de la sensation de la douleur. La sous- expression de ces gènes pourrait favoriser un effet apaisant ou calmant sur la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.

Les neurotrophines font partie d'une famille de facteurs de croissance contrôlant le développement, la maintenance et l'apoptose des cellules neuronales. Les neurotrophines exercent également de multiples fonctions non-neuronales : elles régulent la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose et le remodelage des tissus notamment au niveau de la peau .

Les fibroblastes de derme ainsi que les myofibroblastes synthétisent et sécrètent des neurotrophines telles que le Nerve Growth Factor (NGF), le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ou encore la neurotrophine-3 (NT- 3) . Les effets des neurotrophines sont médiés par leurs récepteurs exprimés également par les fibroblastes. On distingue deux classes de récepteurs : les récepteurs de la famille des tyrosine kinase receptors (Trk) et le récepteur aux neurotrophines p75 (p75 NTR ou NGFR) . Chaque récepteur a une affinité et spécificité propre vis-à-vis de son ou de ses ligands. TrkB (codé par le gène NTRK2) lie spécifiquement BDN F ainsi que NT-3 et NT-4. P75 NTR est q uant à lui capable de lier toutes les neurotrophines.

Les neurotrophines, via leurs récepteurs, stimulent la prolifération et la migration des fibroblastes ainsi que la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. Elles pourraient donc être impliquées dans la régulation du remodelage des tissus lors du processus de cicatrisation des plaies cutanées. Le NGF est un facteur neurotrophique, initialement décrit comme un facteur de survie des neurones dans le système nerveux central, mais également au niveau des neurones sensoriels ou des nocicepteurs de la peau . NGF joue également un rôle dans l'inflammation . En effet, la neutralisation du NGF inhibe la sensibilisation des neurones sensoriels (nocicepteurs), avec pour effet de réduire la perception de la douleur associée à un état inflammatoire. L'extrait induit une diminution de l'expression des gènes codant pour des récepteurs aux neurotrophines, incluant notamment les récepteurs TrkB (NTRK2) (X 0,06) et p75 NTR (NGFR) (X 0,06) et du NGF. Celui-ci pourrait donc favoriser un effet apaisant ou calmant pour la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.

L'extrait favorise un effet apaisant ou calmant pour la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.

3.2.4. Effets de l'extrait racinaire de Tagetes erecta sur 94 gènes cibles au sein des épidermes reconstruits mélanisés

L'extrait a été ajouté dans le milieu de culture des épidermes mélanisés reconstruits (n = 3) . Des contrôles traités par le solvant DMSO (0,2% pour les épidermes reconstruits) dans lequel a été préparé l'extrait ont également été analysés. En parallèle, la vitamine D3 ( 100 nM) a été étudiée en tant que contrôle de validation . La vitamine D3 ayant été solubilisée dans l'éthanol, une condition « solvant éthanol » a été utilisée en tant que condition témoin . Après 24 h de culture, les populations d'ARNs totaux ont été extraites, leur intégrité a été analysée par électrophorèse capillaire, et les différences d'expression géniques ont été analysées par q RT-PCR à l'aide de cartes Taq Man 96-puits, ciblant les fonctions clés de l'épiderme.

Les résultats sont présentés de manière récapitulative sous forme d'un tableau (Tableau 3) indiquant des gènes représentatifs d'un effet cosmétique bénéfique, variant significativement, 24 heures après l'application de l'extrait sur des épidermes. Extrait

Symbole- n° essai Nom du gène

RQ p-value

HRNR-Hs02340614_m l Hornérine 3,6 0,0003

MMP1-Hs00899658_m l Matrice métalloprotéinase-1 2,1 0,0076

AQP5-Hs00387048_m l Aquaporine-5 1,9 0,0366

LAMA3-Hs00165042_m l Laminine sous-unité alpha-3 0,9 0,0312

HMOX1-Hs00157965_m l Hème oxygénase (Decycling) 1 0,8 0,0384

LCE2B-Hs00863535_g l « Late cornified envelope » protéine 2B 0,8 0,0373

LOR-Hs01894962_sl Loricrine 0,8 0,0258

RNASE7-Hs00922963_sl Ribonucléase 7 0,8 0,0061

PLG-Hs00264877_m l Plasminogène 0,7 0,0026

LTF-Hs00914334_m l Lactotransferrine 0,7 0,0025

Tableau 3 : Liste des gènes qui varient de manière significative 24 heures après l'application de l'extrait racinaire de Tagetes erecta (à 20 pg ES/ml) sur des épidermes reconstruits. Le symbole des gènes et le numéro d'essai, le nom des gènes, l'expression relative (RQ) par rapport au véhicule DMSO à 0,2% (RQ > 1 : augmentation - RQ < 1 : diminution) et la valeur p (p-value) sont présentés.

• Fonction barrière de l'épiderme

L'extrait augmente l'expression des gènes HRNR et AQP5. L'hornérine (HRNR) et l'aquaporine-5 (AQP5) participent toutes deux au maintien de la fonction barrière de l'épiderme et à son hydratation .

L'extrait agit en tant qu'inducteur de l'expression du gène codant pour l'hornérine (HRNR), avec une amplitude de 3,6. L'hornérine est une protéine présente au niveau de la couche cornée et de la couche granuleuse de l'épiderme. De travaux récents démontrent que cette protéine est structurellement assez proche de la pro-filaggrine (précurseur de la filaggrine) .

L'hornérine est une protéine essentielle à la résistance mécanique de la couche cornée. Il s'agit en effet d'un constituant majeur de l'enveloppe cornée, substrat de la transglutaminase-3 et localisée en périphérie des cornéocytes. Un rôle de défense antimicrobienne a également été mis en évidence pour certains peptides dérivés de l'hornérine. Il a aussi été démontré que HRNR est sous-exprimé in vivo dans de nombreux cas de dermatite atopique. Le fait que l'hornérine soit induite par un traitement de la peau aux UV ou après « tape stripping » suggère un rôle de cette protéine au niveau de l'intégrité de la fonction barrière de la peau après restauration de celle-ci suite à des stress occasionnés par l'exposition au soleil ou par le frottement mécanique lié par exemple au rasage. L'extrait induit également la surexpression de AQP5 (X 1,9) codant pour l'aquaporine-5, une protéine membranaire agissant comme transporteur de l'eau au travers la membrane plasmique et jouant donc un rôle important dans l'hydratation de l'épiderme.

Du fait de son effet positif sur l'expression d'une protéine (hornérine) essentielle de la couche cornée et de la couche granuleuse de l'épiderme, l'extrait démontre un rôle positif dans l'intégrité et l'efficacité de la fonction barrière de l'épiderme.

De plus, en induisant la surexpression d'une protéine (aquaporine-5) impliquée dans le transport de l'eau au travers de la membrane plasmique, l'extrait joue un rôle positif dans l'hydratation de la peau.

• Cicatrisation cutanée

L'extrait racinaire de Tagetes erecta induit l'expression du gène de la métalloprotéinase-1 MMP-1 d'un facteur de 2,1. Les MMPs sont des métalloprotéinases capables de cliver la plupart des composants de la MEC et de modifier, par protéolyse, bon nombre de molécules importantes pour la cicatrisation cutanée. En particulier, MMPl joue un rôle majeur dans la ré- épithélialisation des kératinocytes, essentielle dans le processus de cicatrisation des plaies cutanées. MMPl facilite l'assemblage de la MEC, l'élongation et la migration des cellules, la réorganisation du cytosquelette d'actines, et induit l'activation de la kinase ERK (extracellular signal-regulated kinase) nécessaire à la motilité et la capacité d'invasion des cellules épithéliales. En outre, il a été montré que la protéine MMPl est surexprimée au niveau de l'épiderme en réponse aux plaies cutanées.

La surexpression du gène MMP-1 au niveau de l'épiderme par l'extrait permet de le positionner comme un actif favorisant potentiellement la cicatrisation cutanée, en particulier au niveau de la fermeture de la plaie. L'extrait se montre sur ce point très intéressant car il induit une amplitude d'expression de ce gène d'un facteur de 2,1. Exemple 4 : Effet d'extraits racinaires de Tagetes erecta dans du propane 1,2 diol, sur des fibroblastes et des kératinocytes humains - Etude en puces à ADN "GeneChip Human Gene"

Afin d'analyser la possibilité qu'un extrait selon l'invention possède une action bénéfique sur la peau, une étude transcriptomique sur puce à ADN a été réalisée à partir de fibroblastes humains (NHDFs) et de kératinocytes humains (NHEKs) traités durant 24 heures par un extrait racinaire de Tagetes erecta. Les variations d'expression des gènes ont été contextualisées et interprétées biologiquement au travers de la base de données propriétaire « StratiCELL Skin Knowledge database ».

Une étude de cytotoxicité préalable réalisée dans les modèles cellulaires ad hoc, à savoir fibroblastes humains (NHDFs) et kératinocytes humains (NHEKs), a permis de déterminer la concentration optimale de l'extrait utilisé pour l'étude.

4.1. Matériels et méthodes

Extrait racinaire

Un extrait racinaire de Tagetes erecta a été préparé selon l'exemple 1.1.

Culture Cellulaire

L'étude a été réalisée sur des fibroblastes de derme humains NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) (ATCC/LGC promoChem, CRL-2522, origine : prépuce) à environ 40% de leur potentiel prolifératif in vitro. Ces cellules ont été cultivées en monocouche en milieu DMEM (Invitrogen, 31885-049) sans sérum et contenant des antibiotiques (pénicilline/streptomycine, Invitrogen, 15140-122).

D'autre part, l'étude a également été réalisée sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs (Normal Human Epidermal Kératinocytes ; Lonza, 0019206, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu Epilife contenant de l'HKGS (Human Keratinocyte Growth Supplément) et de la gentamycine.

Les cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.

Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Tagetes erecta par une étude préliminaire de cytotoxicité Afin de déterminer la concentration d'analyse optimale de l'extrait, une expérience préliminaire a été réalisée sur fibroblastes NHDFs et kératinocytes NHEKs.

Les fibroblastes NHDFs et les kératinocytes NHEKs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 heures avant l'application de l'extrait, en milieu DMEM (INVITROGEN, 31885) contenant des antibiotiques (pénicilline/streptomycine, INVITROGEN, 15140) en présence de 10% de sérum pour les NHDFs ou en milieu Epilife (INVITROGEN, M-EPI-500 A) contenant le supplément HKGS (INVITROGEN, S-001-K) et de la gentamycine (INVITROGEN, 15710-049) pour les NHEKs.

L'extrait a été solubilisé dans le milieu de culture approprié, puis placé en contact des fibroblastes NHDFs ou des kératinocytes NHEKs durant 24 heures. Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules au MTS (3-(4,5- dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfop henyl)-2H- tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout de l'extrait et de son solvant (propane 1,2 diol 60% pH = 3,5) et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3).

Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.

Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à l'analyse transcriptomique.

Les concentrations suivantes, en pourcentage v/v, ont été testées pour l'extrait et le solvant :

Fibroblastes NHDFs et kératinocytes NHEKs: 3%, 1%, 0,33% 0,11%, 0,037% Traitement des cellules

L'extrait ou le solvant ont été appliqués à une concentration choisie, pendant 24h, dans le milieu de culture des fibroblastes NHDFs et des kératinocytes NHEKs. Des quadruples de culture ont été réalisés pour chaque condition (n=4).

Extraction de l'ARIM total

Au terme des traitements, les populations d'ARNs totaux ont été extraites. L'extraction a été réalisée à l'aide du kit RNeasy (Qiagen). Après 24h de traitement, les cellules ont été rincées avec du PBS et lysées dans du tampon ad hoc. L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à -80°C en vue de l'analyse transcriptomique.

Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire

La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).

Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNAse-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham). Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics d'électrophorèse correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S-ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN. L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S-ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARNs de poids moléculaire plus élevé.

Phase d'hybridation sur puces GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix)

Les ARNs ont ensuite été dilués à 50 ng/μΙ et 50 μΙ de chaque échantillon (n = 3) ont été utilisés. La quatrième réplique sert de back-up.

Les échantillons d'ARN (50ng) ont été amplifiés par l'utilisation de la technologie Ribo-SPIA, selon 3 étapes (Ovation Pico WTA System V2, NuGEN, 3302-12) et purifiés avec le kit Agencourt RNA Clean up XP Beads (Agencourt - Beckam Coulter Genomics, A29168). Pour chaque échantillon, 5 pg ont été fragmentés et marqués à la biotine, grâce au NuGEN Encore Biotin Module (NuGEN, 4200-12). L'hybridation a été effectuée sur des puces à ADN du modèle GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix, 902112). Les étapes d'hybridation sur puce, lavage et fixation, ont été réalisées suivant le protocole défini par Affymetrix. La solution d'hybridation a été préparée par utilisation des kits Affymetrix Genechip Expression 3' Amplification Reagent Hybridization Controls (Affymetrix, 900454) et Hybridization Module for GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, 900720), et mélangée avec l'ADN complémentaire (ADNc) amplifié dans les étapes précédentes. L'hybridation a été réalisée durant 18h dans le four GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, 800139). Le lavage et la révélation ont été réalisés à l'aide de la station fluidique GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix, 00- 0079) et les mesures d'intensité ont été scannées avec le GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

Prétraitement des données d'hybridation

Le traitement des données brutes a été réalisé avec les logiciels R (v3.2.3) et le package 'oligo' (vl .34.2) du projet BioConductor (v3.2 ; Gentleman R. et al., Génome Biology 2004, 5, R80). La dernière version des librairies fournies par Affymetrix, construites sur la version 19 du génome humain (UCSC Human génome 19), et la méthode RMA, décrite par Irizarri et al. (Irizarry Ra. et al., Speed Tp. Biostatistics. 2003b, 4 (2), 249-64 ; Irizarry Ra. et al., Boeke Jd . Stat Appl Genêt Mol Biol. 2003a, 2, Epub. 2003 Mar 18) ont été utilisées afin de guider et effectuer le prétraitement et l'annotation des séquences.

Analyse des données, annotation et analyse thématique

L'analyse statistique individuelle des gènes/transcrits a été réalisée avec les méthodes "Moderated t" et "Moderated F" implémentées dans le package R Limma 3.26.8.

L'annotation des gènes et la définition de groupes de gènes pour l'analyse de sur-représentation ont été réalisés au départ de la base de données interne « StratiCELL Skin Knowledge Database » (Salmon M & Berger F. Expression Cosmétique 2014, 30, 91-94).

L'analyse de sur-représentation a été réalisée avec la méthode du test hypergéométrique dans but de caractériser les facteurs thèmes/groupes d'intérêt dermo-cosmétique au départ de la proportion de leurs cibles détectées et différentiellement exprimées. L'analyse a été menée au départ de la liste des gènes détectés avec une p-value de 0,05 et une différence du niveau d'expression (Taux de variation ou fold-change ou FC) supérieur à 1,5 (bi-latéral). 4.2. Résultats

4.2.1. Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait racinaire de Tagetes erecta par une étude préliminaire de cytotoxicité Une étude de la cytotoxicité a été réalisée sur des fibroblastes NHDFs et sur des kératinocytes NHEKs. L'extrait et son solvant ont été appliqués dans les milieux de culture, durant 24h (n = 3). Le contrôle non traité a été arbitrairement fixé à 100% de viabilité et le seuil de cytotoxicité a été fixé par convention à 80% de viabilité. La condition SDS constitue le contrôle positif qui valide l'expérience.

Sur la base des résultats de l'étude préliminaire de cytotoxicité (données non montrées), les concentrations optimales (en pourcentage v/v) sélectionnées pour l'extrait et son solvant sont les suivantes : Extrait et solvant (propane 1,2 diol) : pour les fibroblastes NHDFs 3% et pour les kératinocytes NHEKs 1%.

4.2.2. Quantification des ARNs par spectrophotométrie

Le rapport de l'absorbance à 260nm et 280nm est utilisé pour évaluer la pureté de l'ARN . Un rapport proche de 2 permet de considérer l'échantillon comme étant pur et dépourvu de contamination par des protéines. Le rapport 260/230 est utilisé en tant que mesure secondaire de la pureté de l'échantillon. La valeur 260/230 est généralement plus élevée que le ratio 260/280 et est attendue aux environs de 2,2. Les ratios obtenus pour l'ensemble des échantillons de la présente étude sont donc satisfaisants (données non montrées) et ont été qualifiés ensuite par électrophorèse capillaire.

4.2.3. Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire

Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARN ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées).

La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrées, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions d'amplification, de purification, marquage à la biotine puis hybridation sur puces à ADN.

4.2.4. Analyse des modifications d'expression de gènes induites par l'extrait racinaire de Tagetes erecta

Au terme de l'étude transcriptomique sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs, l'extrait racinaire de Tagetes erecta pourrait jouer un rôle potentiel dans le renforcement de la cohésion et de la différenciation épidermique, la protection contre les stress environnementaux et la défense anti-microbienne. Cependant, l'étude sur fibroblastes NDHFs a révélé quelques observations en lien avec une activité détoxifiante. Ci-après, les régulations observées en lien avec ces hypothèses sont renseignées entre parenthèses, comme suit : (nom du gène - Taux de variation ou Fold change - p-value) et remises dans le contexte des fonctions de la biologie cutanée modulées par les protéines correspondantes.

4.2.4.1 Stimulation de la différenciation épidermique

(kératinocytes)

L'épiderme humain est un épithélium stratifié constituant une barrière dont les couches sont définies par le stade de différenciation des cellules qui les composent. Au fur et à mesure de leur différenciation, les kératinocytes se chargent en filaments de kératine et contiennent une matrice retenant l'eau, le tout étant entouré par l'enveloppe cornée. Les kératinocytes en phase terminale de différenciation sont isolés par les lipides intercornéocytaires et sont attachés les uns aux autres par les cornéodesmosomes.

Les kératinocytes basaux progressent à travers les quatre couches de l'épiderme : basale, épineuse, granuleuse et cornée.

La couche basale est formée par une seule assise de kératinocytes cubiques ou prismatiques liés les uns aux autres par les desmosomes. Dans cette couche les cellules se divisent, l'une des deux cellules reste dans la couche basale tandis que l'autre migre vers les couches supérieures. Les kératinocytes basaux sont attachés par les hémi-desmosomes à une membrane basale qui sépare l'épiderme du derme et forme la jonction dermo-épidermique. La couche épineuse est formée par 5 à 15 assises de kératinocytes polygonaux liés les uns aux autres par les desmosomes. Ces cellules contiennent des tonofilaments, les filaments précurseurs de la kératine.

La couche granuleuse est formée par 3 couches de kératinocytes qui contiennent des grains de kératohyaline et des granules lamellaires.

La couche cornée est formée de 5 à 15 couches de cornéocytes, c'est-à-dire des kératinocytes différenciés qui ne présentent plus de noyaux et d'organites, mais ils sont entourés par une enveloppe cornée. Ils sont chargés en filaments de kératine.

• Formation des filaments de kératine

Au cours de la différenciation épidermique, les filaments de kératine (appelés tonofilaments) se font de plus en plus nombreux et commencent à s'agréger dans les cellules de la couche épineuse pour former les tonofibrilles. Au niveau de la couche granuleuse, ils s'associent aux granules de kératohyaline. Les granules de kératohyaline sont composés de loricrine, d'involucrine (IVL - 5,11 - p=0, 00000049), de trichohyaline et de profilaggrine qui sera transformée en filaggrine par différentes protéases, dont la caspase 14 (CASP14 - 10,63 - p=0, 0000014). La réticulation de la filaggrine avec la kératine accélère le processus d'agrégation et d'alignement des tonofilaments permettant de former les câbles de kératine qui composent 85% du volume des cornéocytes. Ceux-ci sont ensuite associés aux desmosomes lors de la formation de l'enveloppe cornée par les transglutaminases (TGM1 - 7,21 - p=0, 00000024). La kératine joue le rôle de structure mécanique rigide en association avec l'enveloppe cornée pour assurer le maintien de l'intégrité épidermique.

Au niveau de la couche basale, les kératinocytes expriment principalement les kératines 5, 14 et 15 (KRT15 - 1,9 - p=0, 00016) alors que les couches supérieures comportent plutôt les kératines 1 (KRT1 - 1,62 - p = 0,015), 2, 10 (KRT10 - 7,38 - p=0, 00000026) et 13 (KRT13 - 13,83 - p=0, 0000075).

• Formation de l'enveloppe cornée

Au cours de la différenciation des kératinocytes stimulée par divers facteurs de transcription tel que la protéine zinc finger 750 (ZNF750 - 9,42 - p=0.00000065), la membrane plasmique est progressivement remplacée par une coque rigide appelée enveloppe cornée. L'initiation de ce changement se traduit par un assemblage protéique intracellulaire coordonné par les transglutaminases (TGMl - 7,21- p=0, 00000024). La périplakine {PPL - 2,08 - p=0,0002), l'envoplakine et l'involucrine (IVL - 5,11 - p=0, 00000049) forment une armature qui recouvre progressivement la face interne de la membrane plasmique. Simultanément, la structure protéique est renforcée par d'autres protéines comme la loricrine, l'hornerine, les protéines « small proline rich » (SPRR1A - 6,75 p=0, 00000011; SPRR1B - 5,71 - p=0, 0000007; SPRR2A - 1,9 - p=0,002; SPRR3 - 2,26 - p=0,0007 et SPRR4 - 1,92 p = 0,0039), les protéines S100 (S100A7 - 2,46 - p=0,0068 ; S100A8 - 6,55 - p=0, 00000016 ; S100A9 - 8,54 - p=0, 0000043 ; S100A12- 2,43 - p=0,0013), et les protéines « late-cornified envelope » (LCE3D - 1,99 - p=0,0012; LCE1C - 1,5 - p=0,031).

• La barrière épidermique

Pour assurer pleinement ses fonctions, l'épiderme nécessite le maintien d'un gradient en eau entre les couches profondes (teneur en eau ~70%) et les couches superficielles (teneur en eau ~20%). Ce gradient est maintenu grâce à plusieurs systèmes, dont principalement les lipides intercornéocytaires, le facteur d'hydratation naturel (NMF) et les jonctions intercellulaires.

Les lipides intercornéocytaires forment une barrière hydrophobe majoritairement composée de céramides à longues chaînes. La synthèse des céramides sont assurés, entre autres, par l'acyl-CoA à longue chaîne synthétase membre 1 de la famille ou «acyl-CoA synthetase long chain family member 1» (ACSL1 - 2,08 - p=0,0002) et la « serine palmitoyltransferase long chain base subunit 3 » (SPTLC3 - 1,79 - p=0, 00025). Le transport des céramides est quant à lui réalisé par, entre autres, la protéine de liaison 5 aux acides gras ou « fatty acid binding protein 5 » (FABP5 - 2,2 p=0, 000036) et l'ATP-binding cassette sous-famille A membre 12 (ABCA12 - 1,99 - p=0,0017).

Le facteur naturel d'hydratation (Natural Moisturizing Factor ou NMF) est spécifique de la couche cornée. Il est composé à 50% d'acides aminés et de leurs dérivés obtenus suite à la protéolyse de la filaggrine 16 par la caspase 14 (CASP14 - 10,63 - p=0, 000014). Les aquaporines, protéines intégrales de la membrane plasmique, constituent un autre groupe d'intervenants dans le transport aqueux et jouent aussi un rôle crucial dans l'hydratation de la peau (AQP3 - 2,57 -p=0, 000019 ; AQP8 - 1,62 - p=0,01).

Parmi les différents types de jonctions intercellulaires, les jonctions serrées sont des structures d'adhésion qui contrôlent le passage paracellulaire de molécules, dont l'eau . Elles sont constituées de plusieurs familles de protéines : les claudines (CLDN1 - 3,01 - p=0, 000035 ; CLDN7 - 1,6 - p=0,0022) et l'occludine qui permettent le rapprochement des membranes plasmiques de deux cellules adjacentes. Les desmosomes représentent un autre type de jonctions situées entre les kératinocytes. Parmi les composants de ce type de structures, les desmocollines (DSC1 - 8,24 - p=0, 00000059 ; DSC2 - 2,78 - p=0, 0000035 ; DSC3 - 1,61 - p=0, 00057) et desmogléines (DSG1 - 10,06 - p=0, 0000013 ; DSG3 - 1,98 p=0, 000048) sont des glycoprotéines transmembranaires appartenant à la famille des cadhérines. Leurs parties extracellulaires assurent l'adhésion intercellulaire tandis que leurs parties cytoplasmiques s'associent avec des protéines intracellulaires telles que la plakoglobine {JUP - 1,93 - p=0, 00082), la plakophiline (PKP1 - 1,99 - p=0, 00019) ou encore la desmoplakine (DSP - 1,78 - p=0, 00017). La desmoplakine interagit elle-même avec les filaments de kératine permettant ainsi l'attachement du cytosquelette au complexe d'adhésion. Au cours de la cornification, les desmosomes sont modifiés, la plaque desmosomale est incorporée à l'enveloppe cornée et la cornéodesmosine y est intégrée. Ils portent alors le nom de cornéodesmosomes.

Les facteurs de transcription « Grainyhead-like » (GRHL1 - 3,24 - p=0, 000031; GRHL3 - 6,28 - p=0,0000037) jouent aussi un rôle essentiel dans la formation de la barrière épidermique et dans sa régénération après une blessure. GRHL3 est impliqué dans la voie contrôlant la polarité des kératinocytes au sein de l'épiderme, une voie essentielle pour assurer une morphologie organisée du tissu et sa réparation.

4.2.4.2 Protection contre le stress environnementaux

(kératinocytes et fibroblastes) La peau constitue une barrière contre les stress environnementaux. Pour faire face à ces stress que sont les polluants et les xénobiotiques, les kératinocytes et les fibroblastes surexpriment un ensemble de gènes capables de les neutraliser et de maintenir l'équilibre cellulaire.

· Les protéines cytochrome P450 des kératinocytes (CYP1A1 - 7,36 - p=0, 000047; CYP1B1 - 5,87 - p=0, 0000039; CYP4B1 - 1.52 p=0,013) et des fibroblastes (CYP1B1 - 2,99 - p=0, 000012) sont des hémoprotéines qui interviennent dans des réactions d'oxydo-réduction de métabolites ou xénobiotiques (monooxygénases). Les CYP sont très impliquées dans la biodégradation de nombreuses molécules exogènes et participent à la détoxification de l'organisme.

L'aldéhyde déshydrogénase 3A1 catalyse la transformation d'aldéhydes en acides. Pour les kératinocytes, l'expression du gène est augmentée (ALDH3A1

- 1,53 p = 0,025). Cette déshydrogénase est impliquée dans la détoxification de l'acétaldéhyde dérivé d'alcool, dans le métabolisme des corticoïdes et dans la peroxydation des lipides.

• L'expression de gènes codant pour des protéines de choc thermique ou « Heat Shock Proteins » ou HSP est augmentée pour les kératinocytes (HSPA4L - 1,57 - p=0,0021 ; HSPB1 - 2,77 - p=0, 000011; HSPB3 - 2,88 - p=0,0011). Les HSP sont des protéines chaperonnes ayant pour fonction principale de gérer la réponse aux stress (infection, inflammation, exercice, exposition aux toxines, famine, hypoxie, manque d'eau, etc.). La crystalline alpha B dont l'expression est aussi augmentée pour les kératinocytes (CRYAB

- 1,96 - p=0, 00012) joue également le rôle de chaperonne en cas de stress pour prévenir l'agrégation des protéines. Ces protéines chaperonnes peuvent être aidées par des protéines co-chaperonnes, comme par exemple « BCL2- associated athanogene » dont l'expression du gène est augmentée pour les kératinocytes {BAG1 - 1,66 p = 0,00053).

• La cellule dispose de régulateurs de toxicité tels que les métallothionéines dont l'expression de deux gènes est augmentée pour les fibroblastes (MT1G - 11,19 - p=0, 00000079 et MT1H - 3,91 - p=0, 00023), de petites protéines qui se caractérisent par leur haute affinité pour les ions métalliques (arsenic, cadmium, etc.). Elles sont directement associées à la régulation de l'homéostasie des cations essentiels et du potentiel d'oxydo- réduction de la cellule.

La ferritine dont le gène FTL est augmentée pour les kératinocytes (FTL light chain - 1,58 - p = 0,0023) est quant à elle, responsable de la détoxification du fer.

• Pour faire face aux effets délétères des rayonnements UVs, et plus particulièrement les espèces réactives de l'oxygène (ROS), les organismes ont développé un système de défense élaboré qui peut dans certains cas être en déséquilibre ou « débordé », on parle alors de stress oxydant. Parmi la batterie de protéines mobilisées pour faire face au stress oxydant, on note la NADPH déshydrogénase quinone 1 dont l'expression du gène est augmentée pour les kératinocytes (NQOl - 1,65 - p=0, 00063) et Thème oxygénase 1 dont l'expression du gène est augmentée pour les fibroblastes (HMOX1 - 3,01

- p=0, 000013). Le potentiel rédox du cytoplasme des cellules est maintenu grâce au glutathion, un tripeptide synthétisé en partie par la glutamate cystéine ligase dont l'expression du gène GCLC est augmentée pour les kératinocytes (GCLC - 2,07 - p=0, 000065), à partir de L-cystéine et de L- glutamate. Le glutathion permet de détoxifier l'organisme des métaux lourds mais aussi d'éliminer les ROS puisque la glutathion peroxydase dont l'expression du gène GPX2 est augmentée pour les kératinocytes (GPX2 - 1,8

- p=0, 00038) utilise le glutathion pour réduire les peroxydes via une réaction d'oxydo-réduction.

4.2.4.3 Stimulation de la défense anti-bactérienne

(kératinocytes)

Pour lutter contre les agressions pathogènes, les kératinocytes peuvent produire des peptides anti-microbiens, responsables de l'attraction et de l'activation des cellules immunitaires.

Les peptides anti-microbiens ont une activité à large spectre et détruisent les organismes en perturbant leur intégrité membranaire. Certains d'entre eux sont exprimés de manière constitutive mais la plupart sont inductibles. Les principaux peptides sont les défensines (DEFB1 - 2,29 - p=0,0027) et la cathélicidine Les kératinocytes expriment d'autres peptides de ce type notamment la calgranuline A (S100A8 - 6,55 - p=0, 00000016) et la calgranuline B (S100A9 - 8,54- p=0, 0000043) qui forment un complexe hétérodimérique antimicrobien appelé calprotectine. Il a été démontré que la calprotectine exerce son activité antibactérienne contre Escherichia coli, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus Epidermidis, Capnocytophaga sputigena et Borrelia burgdorferi (Maladie de Lyme). La calgranuline C (S100A12 - 2,43 - p = 0,0013) quant à elle, séquestre le zinc et le cuivre nécessaire à la croissance de certaines bactéries (Helicobacter pylori) et les prive de leurs nutriments.

D'autre part, l'étude transcriptomique a permis de mettre en évidence une augmentation très importante de l'expression du gène codant pour la chémokine (C-X-C motif) ligand 14 (CXCL14 - 6,4 - p=0, 00000035). Cette chémokine est constamment produite dans l'épiderme et le derme en conditions saines. Cependant, en plus de ses effets chémo-attractants, elle possède une activité bactéricide reconnue contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Streptococcus pyogenes.

Différents mécanismes sont mis en place pour moduler la prolifération des bactéries, parmi ceux-ci, on distingue le processus de desquamation qui permet d'éliminer les micro-organismes indésirables installés sur les cornéocytes. La desquamation repose sur l'équilibre entre la synthèse de protéines structurales des cornéodesmosomes et leur dégradation par des protéases spécifiques comme les kallikréines (KLK5 - 2,82 - p=0, 0000066; KLK7 - 6,47 - p=0, 00000012) et la cathépsine L2 (CTSV - 2,73 - p=0, 0000062). Cet équilibre est également contrôlé par les inhibiteurs de protéases, notamment l'inhibiteur de peptidase de leucocyte sécréteur ou « secretory leukocyte peptidase inhibitor » (SLPI - 5,95 - p=0, 0000012). En plus de cette fonction, SLPI est reconnu comme étant un anti-microbien depuis les années 80.

4.3. Conclusion

En modulant positivement les gènes codant pour les protéines impliquées dans la différenciation épidermique, le renfort de l'enveloppe cornée, les jonctions cellulaires, l'hydratation, la synthèse et le transport des céramides, l'extrait racinaire de Tagetes erecta pourrait potentiellement stimuler le renouvellement de l'épiderme. L'extrait pourrait également renforcer la cohésion de l'épiderme et ses propriétés de barrière, limiter la perte en eau et favoriser de la sorte l'hydratation du tissu.

L'application de l'extrait de Tagetes erecta sur les cultures cellulaires de kératinocytes et fibroblastes suggère par ailleurs une activité potentiellement protectrice face aux stress environnementaux suite à l'induction de l'expression des gènes codant pour les métallothionéines, pour les enzymes impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques et pour les protéines et enzymes responsables de la défense antioxydante.

De plus, il pourrait jouer un rôle dans la défense antimicrobienne de l'épiderme en augmentant l'expression des gènes codant pour certains peptides antimicrobiens ou pour des chémokines impliquées dans la défense antibactérienne et antifongique.

Exemple 5 : Effet d'un extrait racinaire de Tagetes erecta sur la survie de neurones corticaux primaires blessés par le peptide Αβ (20 pg, 24 heures) et sur un réseau de neurites de neurones corticaux primaires blessés par le peptide Αβ (20 pg, 24 heures).

Le but de cette étude est d'évaluer les effets de l'extrait racinaire sur des neurones corticaux primaires de rat, intoxiqués par le peptide Αβ selon le modèle in vitro de la maladie d'Alzheimer décrit dans Callizot et al., 2013 (Callizot N. et al., Operational dissection of β-amyloid cytopathic effects on cultured neurons, J Neurosci Res. 2013, 91 : 706-16). La survie des neurones ainsi que l'intégrité du réseau de neurites sont évalués. 5.1. Matériels et méthodes

Extrait racinaire

L'extrait racinaire est préparé à partir de racines séchées de Tagetes erecta. Les plantes sont cultivées en aéroponie selon l'exemple 1. Les racines fraîches sont coupées et séchées. 70 g de racines séchées sont broyées à sec puis macérées pendant 65 heures dans 1 litre de méthanol. Ensuite l'extrait est filtré. Le solvant est éliminé en utilisant un évaporateur rotatif et la poudre séchée au dessiccateur pour au final obtenir 4,15 g de poudre. L'analyse chromatographique réalisée selon l'exemple 1.1 a permis de montrer la présence d'acide léontopodique B dans l'extrait. Quatre concentrations sont testées : 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1 pg/mL et 10 pg/mL d'extrait sec dilué dans de l'eau avec 0,1% de DMSO.

Le véhicule utilisé est le milieu de culture (voir la section ci-dessous) contenant 0,1% de DMSO (Pan Biotech, Batch : H 130813).

Culture cellulaire de neurones corticaux

Des neurones corticaux de rat sont cultivés comme décrit dans Singer et al., 1999 (Singer C, et al., Mitogen-activated protein kinase pathway médiates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J Neurosci. 1999, 19 : 2455-2463) et Callizot et al., (2013). En résumé, des rats femelles gravides sont tuées par dislocation cervicale après 15 jours de gestation. Les fœtus sont collectés et immédiatement placés dans un milieu glacé L15 Leibovitz (Pan Biotech, Batch : 8810315) additionné de 2% pénicilline (10,000 U/ml) et d'une solution de streptomycine (10 mg/ml) (PS; Pan Biotech, batch : 1451013) et 1% de albumine de sérum de bovin (BSA; Pan Biotech, batch : K180713). Le cortex est traité pendant 20 min à 37°C avec une solution de trypsine- EDTA (Pan Biotech, Batch : 3330914) à une concentration finale de 0,05% trypsine et 0,02% EDTA. La dissociation est stoppée par l'ajout du milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) avec 4,5 g/L de glucose (Pan Biotech, Batch : 8530315), contenant de la DNase I grade II (concentration finale 0,5 mg/ml; Pan Biotech, Batch : H140508) et 10% sérum de veau fœtal (FCS; Invitrogen, Batch : 41Q1613K). Les cellules sont mécaniquement dissociées par trois passages forcés à travers des cônes de pipette de 10 mL. Les cellules sont ensuite centrifugées à 515g pendant 10 min à 4°C. Le surnageant est jeté, et le culot est suspendu dans un milieu de culture défini consistant en un milieu Neurobasal (Invitrogen, batch : 1715722) avec une solution à 2% de supplément B27 (Invitrogen, lot: 1709534), 2 mmol/L de L-glutamine (Pan Biotech, lot: 6620314), 2% de solution de PS, et 10 ng/ml de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF; Pan Biotech, Batch : H140108). Les cellules viables sont comptées avec un cytomètre Neubauer, en utilisant le test d'exclusion du bleu trypan. Les cellules sont ensemencées à une densité de 30,000 par puits d'une plaque de 96 puits préenduits de poly-L-lysine (Biocoat, Batch : 21614030) et sont cultivées à 37°C dans un incubateur contenant 95% d'air et 5% de C02. Le milieu est changé tous les jours. Après 11 jours de culture, les neurones corticaux sont intoxiqués par une solution de peptides Αβ1-42 (voir ci- dessous). Préparation du peptide Αβ1-42 et exposition de l'extrait racinaire audit peptide

La préparation du peptide Αβ1-42 est réalisée selon la procédure décrite dans Callizot et al., (2013). En résumé, le peptide Αβ1-42 (Bachem, Batch : 1014012) est dissous dans le milieu de culture défini mentionné ci-dessus, dépourvu de sérum, à une concentration initiale de 40 pmoles/L. Cette solution est doucement agitée pendant 3 jours à 37°C dans le noir et immédiatement utilisée après avoir été diluée dans le milieu de culture à la concentration testée (20 μΜ).

Au onzième jour de culture, l'extrait racinaire testé aux 4 différentes concentrations est dissous dans le milieu de culture et est ensuite préincubé avec les neurones corticaux primaires pendant 1 heure avant l'application du peptide Αβ1-42. La solution de peptide Αβ1-42 est ajoutée à une concentration finale de 20 μΜ diluée dans le milieu de culture en présence de l'extrait à tester et le tout est laissé pendant 24 heures.

Evaluation de la survie des neurones et de l'intégrité du réseau de neurites

24 heures après intoxication par le peptide Αβ1-42, le surnageant de la culture cellulaire a été enlevé et les cultures de neurones corticaux ont été fixées par une solution froide d'éthanol (95%, Sigma, Batch : SZBD3080V) et d'acide acétique (5%, Sigma, Batch : SZBD1760V) pendant 5 min à -20°C. Après perméabilisation avec 0,1% de saponine (Sigma, Batch : BCBJ8417V), les cellules sont incubées pendant 2 heures à température ambiante, avec un anticorps de souris monoclonal anti-microtubule-associated-protein 2 (MAP-2, Callizot et al. , A new long term in vitro model of myelination. Expérimental Cell Research, October 2011. Volume 317, Issue 16, Pages 2374-2383), Sigma, batch : 063M4802) dilué à 1/400 dans du PBS (PAN, Batch : 1870415) contenant 1% de sérum de veau fœtal (FCS) et 0,1% de saponine. Cet anticorps spécifique des corps cellulaires et des neurites, permet l'étude de la mort des cellules neuronales ainsi que l'effet de l'extrait sur la croissance des neurites. Cet anticorps est révélé par un IgG de chèvre anti-souris marqué par un Alexa Fluor 488 (Molecular Probe, Batch : 1664729) à une dilution de 1/400 dans du PBS contenant 1% FCS, 0,1% saponine, pendant 1 heure à température ambiante.

L'extrait est testé pour une culture. Pour chaque concentration d'extrait et les contrôles, 6 puits sont évalués, 30 photos par plaque sont prises en utilisant ImageXpress (Molecular Devices) avec un grossissement x20, pour évaluer le réseau de neurites et le nombre de neurones. L'analyse des photos est réalisée en utilisant Custom Module Editor (Molecular Devices). Les résultats sont présentés en termes de nombre de cellules positives ou de réseau de neurite marqué par le marqueur MAP-2.

Chaque ligne de la plaque est organisée de la façon suivante :

- Pas de traitement (contrôle négatif) / 0,1% DMSO

- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / 0,1% DMSO

- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (10 ng/mL) / 0,1% DMSO

- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (100 ng/mL) / 0,1% DMSO

- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (1 pg/mL)/ 0,1% DMSO

- Peptide Αβ1-42 20 μΜ / Extrait racinaire (10 pg/mL) / 0,1% DMSO Chaque ligne est répétée 6 fois.

Analyse statistique

Toutes les données sont exprimées en pourcentage du contrôle des conditions (contrôle = 100%). Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne +/- l'erreur standard de la moyenne (Standard Error of the Mean SEM) (s.e.mean) de n =6 puits par condition. Les analyses statistiques réalisées pour les différentes conditions sont des analyses de variances ou ANOVA suivie par le test PLSD de Fischer ou le test de Dunnett en utilisant le logiciel GraphPad Prism.

5.2. Résultats

La Figure 3 représente l'effet de l'extrait racinaire de Tagetes erecta sur la survie des neurones corticaux primaires intoxiqués pendant 24 heures par le peptide Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ . La Figure 4 représente l'effet de l'extrait racinaire de Tagetes erecta sur la croissance du réseau de neurites intoxiqués pendant 24 heures par le peptide Αβ1-42 ajouté à une concentration finale de 20 μΜ . Ces données permettent de vérifier l'état de santé des neurones corticaux, car le stress engendré par la pathologie Alzheimer par le biais du peptide Αβ1-42 affecte le nombre de connexions neuronales (neurites).

Le témoin contrôle n'a pas été traité avec le peptide Αβ1-42. Seul le véhicule utilisé pour l'extrait racinaire (le milieu de culture contenant 0,1% de DMSO) a été ajouté à la culture cellulaire de neurones corticaux. On observe 100% de survie des neurones dans cette condition.

L'ajout du peptide Αβ1-42 à une concentration finale de 20 μΜ, induit au bout de 24 heures une mort significative des neurones (Figure 3) ainsi qu'une perte significative du réseau de neurites (Figure 4) comme précédemment indiqué dans la littérature (Callizot et al., 2013).

L'extrait racinaire pre-incubé avec les cellules neuronales en culture 1 heure avant l'ajout du peptide Αβ1-42 apporte un effet sur la survie des neurones de plus en plus important avec des concentrations croissantes d'extrait. L'extrait racinaire à la concentration la plus forte (10 pg/mL) montre un effet significatif sur la survie des neurones (par 30%). L'effet protecteur semble donc dépendre de la dose appliquée : l'effet augmente avec la dose appliquée (Figure 3).

L'extrait racinaire pre-incubé 1 heure avec les cellules neuronales en culture avant l'ajout du peptide Αβ1-42 montre un effet significatif sur le réseau de neurites dès sa plus faible concentration de 10 ng/mL (Figure 4).

Ces résultats montrent que l'extrait racinaire de Tagetes erecta permet de réduire la neurotoxicité causée par le peptide Αβ. Cet extrait selon l'invention est un bon candidat pour la protection des neurones corticaux et le maintien de leurs connections, c'est-à-dire le maintien de l'intégrité du réseau de neurites. Ainsi, l'extrait selon l'invention présente un intérêt en tant que nouvel agent thérapeutique pour la prévention et/ou le traitement de la maladie d'Alzheimer.