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| Fosalvudin und Fozivudintidoxil zur Anwendung bei der Behandlung der Krankheit Covid-19 und die Verwendung von deren strukturvereinfachten Derivaten P A T E N T A N S P R Ü C H E 1 . Nucleosid-Phospholipide aufweisend die folgende Strukturformel mit Ri gleich Fluor (Fosalviudin [(2S,3S,5R)-3-Fluoro-5-(5-methyl-2,4-dioxo- pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-2-yl]methyl[(2F?S)-decoxy-3-dodecylsulfanyl- propyl]hydrogenphosphat), Chlor, Brom oder Azid (Fozivudintidoxil, [(2S,3S,5F?)-3-Azido-5-(5-methyl-2,4-dioxo-pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-2- yl]methyl[(2RS)-decoxy-3-dodecylsulfanyl-propyl]hydrogenphosphat) zur Anwendung bei der Behandlung der Krankheit Covid-19. 2. Nucleosid-Phospholipide der Struktur mit Ri Fluor, Chlor, Brom oder Azid, mit R2 C6H13, Hexyl, C7H15 (Heptyl), CsHi (Octyl), C9H19 (Nonyl), C10H21 (Decyl), C11H23 (Undecyl), C12H25 (Dodecyl), C13H27 (Tridecyl), C14H29 (Tetradecyl), C15H31 (Pentadecyl), C16H33 (Hexadecyl), C17H35 (Heptadecyl) oder C18H35 (Octadecyl) und mit R3 C6H13, Hexyl, C7H15 (Heptyl), CsH (Octyl), C9H19 (Nonyl), C10H21 (Decyl), C11H23 (Undecyl), C12H25 (Dodecyl), C13H27 (Tridecyl), C14H29 (Tetradecyl), C15H31 (Pentadecyl), C16H33 (Hexadecyl), C17H35 (Heptadecyl) oder C18H35 (Octadecyl), und dem chiralen Kohlenstoffatom * in R-Konfiguration o- der S-Konfiguration. 3. Verwendung von Nucleosid-Phospholipiden nach Anspruch 2 zur Herstel lung eines Medikaments gegen Virenerkrankungen. 4. Verwendung von Nucleosid-Phospholipiden nach Anspruch 2 zur Herstel lung eines Medikaments gegen SARS (SARS-CoV), MERS (MERS-CoV). 5. Verwendung von Nucleosid-Phospholipiden nach Anspruch 2 zur Herstel lung eines Medikaments gegen Covid-19. 6. Nucleosid-Phospholipide nach Anspruch 2 zur Anwendung bei der Behand lung von Covid-19. 7. Verfahren zur Herstellung von Fozivudintidoxil, [(2S,3S,5R)-3-Azido-5-(5- methyl-2,4-dioxo-pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-2-yl]methyl[(2RS)-decoxy-3- dodecylsulfanyl-propyl]hydrogenphosphat), aufweisend die folgenden Schritte Darstellung von 5-Decyloxy-2-phenyl-1,3-dioxan durch Umsetzen von Benzaldehyd mit Glycerin in Gegenwart von Säure, bevorzugt in Gegenwart von Merthansulfonsäure und anschließender Umsetzung des zuvor erhaltenen Produkts mit 1- Bromdecan in Gegenwart eines Katalysators, bevorzugt in Ge genwart einer Quartärammoniumsalzes in einem ersten Schritt, Darstellung von 3-Bromo-2-decyloxy-1-propyl)benzoat durch Umset zen des im ersten Schritt erhaltenen 5-Decyloxy-2-phenyl-1 ,3-dioxans mit N-Bromsuccinimid in einem zweiten Schritt, Darstellung von 3-Dodecylthio-2-deyloxy-1-propanol durch Umsetzen des im zweiten Schritt erhaltenen 3-Bromo-2-decyloxy-1-propyl)ben- zoats mit 1-Dodeycylmercaptan in basischer Umgebung in einem dritten Schritt, Darstellung von (3-Dodecylthio-2-decyloxy-1 -propyl)dihydrogen-phos- phat durch Umsetzen des im dritten Schritt erhaltenen 3-Dodecylthio- 2-deyloxy-1-propanols mit Phosphoroxychlorid in einem vierten Schritt, Darstellung von 3'-azido-3'-deoxy -5'-Thymidylsäure, mono(3-dode- cylthio-2decyloxypropyl)ester durch Umsetzen des im vierten Schritt erhaltenen (3-Dodecylthio-2-de- cyloxy-1-propyl)dihydrogen-phosphats mit 3'-Azidothymidin und anschließender Umsetzung mit Calciumacetat in einem fünften Schritt. 8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch Tauschen der Calcium-Kationen durch Natrium-Kati onen durch Umsetzen des im fünften Schritt erhaltenen Calcium-Salzes mit Salzsäure. 9. Verfahren zur Herstellung von Fosalviudin [(2S,3S,5R)-3-Fluoro-5-(5-me- thyl-2,4-dioxo-pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-2-yl]methyl[(2F?S)-decoxy-3- dodecylsulfanyl-propyl]hydrogenphosphat mit den Verfahrensschritten in Anspruch 7, wobei im fünften Schritt 3'-Flourothymidin anstelle von 3'- Azidothymidin eingesetzt wird. 10. Verfahren zur Herstellung von [(2S,3S,5R)-3-Chloro-5-(5-methyl-2,4-dioxo- pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-2-yl]methyl[(2F?S)-decoxy-3-dodecylsulfanyl- propyl]hydrogenphosphat mit den Verfahrensschritten in Anspruch 7, wobei im fünften Schritt 3'-Chlorothymidin anstelle von 3'-Azidothymidin eingesetzt wird. |
Die Erfindung betrifft Fosalvudin und Fozivudintidoxil zur Anwendung bei der Be handlung der Krankheit Covid-19 und die Verwendung von deren strukturverein fachten Derivaten zur Herstellung eines Medikaments gegen Covid-19.
Fosalviudin [(2S,3S,5f?)-3-Fluoro-5-(5-methyl-2,4-dioxo-pyrimidin-1-yl)t etrahydro- furan-2-yl]methyl[(2RS)-decoxy-3-dodecylsulfanyl-propyl]hydr ogenphosphat, je nach Substitution auch Fozivudintidoxil, [(2S,3S,5R)-3-Azido-5-(5-methyl-2,4-di- oxo-pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-2-yl]methyl[(2F?S)-decoxy -3-dodecylsulfanyl- propyljhydrogenphosphat mit der folgenden Struktur wurden in den 1990er Jahren als potentielle Virostatika zur Behandlung von HIV, AIDS, eingehend untersucht (im Bild das fluorsubstituierte Derivat Fosalvudin).
Im Vergleich zu anderen Virostatika (AZT) haben Fosalvudin und Fozivudintidoxil eine mehrfach höhere Wirkung in HIV-1 -infizierten CEM-SS-Zellen (eine Zellli nie). In-vitro wurden synergistische Effekte mit Proteaseinhibitoren beschrieben, wie sie auch bei anderen Inhibitoren der reversen Transkriptase Vorkommen. Eine in vivo-Studie zeigte bei Makaken eine antivirale Wirkung in vivo und in vitro. Eine vierwöchige Gabe von 7 mg/kg (äquivalent von 150 mg für Menschen) wurde von Makaken mit minimaler hämatologischer Auffälligkeit und nicht be obachteter Lebertoxizität gut vertragen. Diese Substanz wurde in einer Phase I Studie mit einer einmaligen Gabe von 5 mg bis 40 mg untersucht. (Cahn P et al, Int Conf AIDS. 2006, Abstract No. ThPE0025). Fosalvudin wurde gut vertragen, zeigte ein lineares Dosisverhältnis für AUC und für Cmax. Dabei wurde ein Halb wertszeit von 4 bis 7 Stunden beobachtet, die eine tägliche Gabe ohne Akkumu lation bei wiederholter Einnahme ermöglicht.
Die Entwicklung des Fozivudintidoxil wurde aufgrund der beobachteten Vertei lung im Körper und der daraus abgeleiteten Dosis aufgrund der Toxizität für Zel len des Knochenmarks und der Leber eingestellt. (A. C. Venhoff, D. Lebrecht, F. U. Reuss, B. Heckl-Ostreicher, R. Wehr, U. A. Walker, N. Venhoff: Mitochondrial DNA depletion in rat liver induced by fosalvudine tidoxil, a novel nucleoside re- verse transcriptase inhibitor prodrug. In: Antimicrobial agents and chemotherapy. Band 53, Nummer 7, Juli 2009, S. 2748-2751). Die nicht akzeptable Toxizität ergab sich vor allem aufgrund der für HIV notwendigen sehr hohen Dosis, damit sämtliche Gewebetypen im Körper mit einer genügenden Konzentration des Wirkstoffs versorgt sind.
Fozivudintidoxil hat eine in der pharmakologisch wirksamen Gegend strukturelle Ähnlichkeit mit Remdesivir. Remdesevir mit der nachstehenden Strukturformel
wird in der aktuellen Covid-19-Pandemie als potentielles Medikament zur Be handlung eben dieser Krankheit untersucht. Nach Medienberichten lassen erste Ergebnisse die Hoffnung zu, dass Remdesevir, das wegen seiner virostatischen Eigenschaften zum Einsatz gegen Ebola- und Marburgvirusinfektionen entwickelt wurde, auch zur Eindämmung des Corona-Virus, das für Covid-19 ursächlich ist, eingesetzt werden kann.
Der prinzipähnliche Wirkmechanismus bei Fosalvudin und Fozivudintidoxil lässt die Erwartung zu, dass die nachgewiesenen virostatischen Eigenschaften auch bei Covid-19 wirken.
Eine Besonderheit, die hinzukommt, ist die Beobachtung der Tatsache aus älte ren Studien zur Wirksamkeit bei HIV, dass bei einer Gabe von 15mg/kg Körper gewicht bei Mäusen mit radioaktiven, isotopenmarkierten Substanzen der Wirk stoff mit folgenden Konzentrationen wie folgt in den Organen der untersuchten Mäuse nachgewiesen werden konnte:
Quelle: Reuss F., Kulke M., Braspenning J., Heckl-Östreicher B., Opitz H.-G. Hei delberg Pharma GmbH, Ladenburg, Deutschland
Es zeigt sich also, dass die Substanz eine starke Affinität zum Lungengewebe hat. Gerade diese in der HlV-Studie eher als nachrangig und auch nachteilig be trachtete Affinität zur Lunge hilft, dass dieses Virostatikum bei der Behandlung von Covid-19 erfolgreich eingesetzt werden kann.
In der internationalen Patentanmeldung WO 1992/003462 A1 werden erstmals neue Phospholipid-Derivate von Nucleosiden, deren Herstellung sowie die Ver wendung als antivirale Arzneimittel gelehrt. Die dort gelehrten Substanzen zeich nen sich aus durch eine Kopplung der Alkylreste im Phospholipid-Teil der Mole kularstruktur über ein Schwefel-Atom.
In der internationalen Patentanmeldung WO 95/20596 wird ein Verfahren zur Herstellung von unsymmetrischen Phosphorsäurediestern offenbart. Die dort ge lehrten Substanzen zeichnen sich aus durch eine Kopplung der Alkylreste im Phospholipid-Teil der Molekularstruktur über einer Verbindung einer Methylen gruppe mit Kohlenstoff über Alkoxyreste, Alkylthioreste, Alkylsulfinylreste oder Al- kylsulfonylreste.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die zweite medizinische Indikation der an sich bekannten Substanzen Fosalvudin und Fozivudintidoxil zur Anwendung bei der Behandlung der Krankheit Covid-19 und die Verwendung von dessen strukturvereinfachten Derivaten zur Herstellung eines Medikaments gegen Covid- 19.
Fosalvudin und Fozivudintidoxil zeichnen sich aus durch eine Verbindung von Zidovudin (auch Azidothymidin, kurz AZT), nämlich ein chemisches Derivat des Nukleosids Thymidin mit einem Phospholipid. Fosalvudin und Fozivudintidoxil weisen demnach drei unterschiedliche Bereiche auf:
Im Strukturbild ist Fluor-substituiertes Fosalvudin abgebildet. Im linken Teil befin det sich links der Lipidrest, in der Mitte eine Phosphatgruppe als Bindeglied und rechts der Fluor-substitutierte Zidovudinrest.
Pharmakologisch gehört Zidovudin zu den nukleosidischen Reverse-Transkrip- tase-lnhibitoren (NRTI), einer Gruppe antiretroviraler Substanzen. Zidovudin dient zur Behandlung HIV-1 -infizierter Patienten im Rahmen einer antiretroviralen Kombinationstherapie.
Fosalvudin und Fozivudintidoxil verbessern die Wirkung des Zidovudinrestes durch die Phospholipid-Gruppe. Die gängige Vorstellung ist, dass sich das Phos pholipid auf der Oberfläche lebender Zellen anreichert. Die Beschaffenheit des Phospholipidrestes bestimmt damit die Affinität zu bestimmten Zelltypen. Die einst beobachtete Affinität zum Lungengewebe macht diese Substanz zu einem Kandidaten für die Behandlung von Covid-19. Auf der Oberfläche der Zelle angereichert, liefert der Phoshpolipidrest dem zu bekämpfenden Virus das Zidovudin, in dem es am Ort des auf der Zelloberfläche anhaftenden Virus das Zidovudin in räumliche Nähe zum Virus bringt.
Die Menge der als Medikament zu verabreichenden Substanz beträgt beim Men schen zwischen 50 mg und 800 mg in ein bis zwei Dosen pro Tag. Bei einer Pan demie sind besonders große Mengen des Wirkstoffs notwendig, um die erkrankte Bevölkerung mit genügend Wirkstoff versorgen zu können. Bei der vielstufigen Synthese von Fosalvudin und Fozivudintidoxil treten im Bereich des schwefelhal tigen Lipidrests nicht unerhebliche Probleme auf, da der Sulfanyl-Schwefel stark zur Oxidation neigt und dabei bilden sich Sulfoxide. Die Aufreinigung des synthe tisierten Fosalvudins ist zwar möglich, erschwert aber die Synthese unter nicht unerheblichem Zeitaufwand. Reste der Sulfoxide müssen wegen der vermuteten starken Toxizität als Verunreinigung bei der Synthese quantitativ aus der pharma kologisch wirksamen Substanz entfernt werden.
In der bekannten Struktur von Fosalvudin und Fozivudintidoxil befindet sich au ßerdem ein chirales Kohlenstoff-Atom im Phospholipid. Der Unterschied der Wir kung der beiden in Bezug auf dieses Kohlenstoffatom enatiomeren Formen wurde bei den bereits durchgeführten Phase Il-Studien nicht näher untersucht.
Die Synthese von Fosalvudin und Fozivudintidoxil verläuft über eine Vielzahl von chemischen Zwischenstufen. Dabei sind manche Zwischenstufen stark oxida tionsempfindlich.
Es wird daher vorgeschlagen, die Struktur des bekannten Fosalvudin und Fozivu dintidoxil abzuändern und als Derivat als Medikament zur Verwendung bei der Behandlung von Covid-19 zur Verfügung zu stellen.
Vorgeschlagen wird eine Strukturänderung im Bereich des Phospholipidrestes, in dem die Decoxy-Gruppe und die Dodecylsulfanylgruppe ersetzt werden durch eine Estergruppe, wobei die Ester basieren können auf lineyren Alkansäuren, nämlich der Capronsäure (n-Hexansäure), Önanthsäure (n-Heptansäure), Caprylsäure (n-Octansäure), Pelargonsäure (n-Nonansäure), Caprinsäure (n-De- cansäure), Undecansäure, Laurinsäure (n-Dodeacnsäure), Tridecansäure, Myris tinsäure (n-Tetradecansäure), Pentadecansäure, Palmitinsäure (n-Hexadecan- säure), Heptadecansäure, Stearinsäure (n-Octadecansäure)
Anstelle der Fluorsubstitution im Zidovudinrest kann auch eine Substitution mit Azid, Brom oder mit Chlor vorliegen. Die Kohlenstoffreste an den Lipidketten kön nen von C6H 13 , Hexyl, über C 7 H 15 (Heptyl), CsH (Octyl), C9H 19 (Nonyl), C 10 H 21 (Decyl), C11H23 (Undecyl), C12H25 (Dodecyl), C13H27 (Tridecyl), C14H29 (Tetrade- cyl), C15H31 (Pentadecyl), C16H33 (Hexadecyl), C17H35 (Heptadecyl) bis hin zu C 18 H3 5 (Octadecyl) reichen.
Darstellung von Fozivudintidoxil
1. Darstellung von 5-Decyloxy-2-phenyl-1,3-dioxan
Eine Lösung von 19,1 kg Benzaldehyd, 16,6 kg Glycerin und 534 g Methansul fonsäure in 60 I Toluol wurde unter Rückfluss ca. 4 h lang erhitzt bis 3,2 I Wasser abgetrennt werden konnten.
Die Lösung wurde auf 0 bis 5°C gekühlt und 180 I Isohexan wurden in einem Zeit raum von 30 bis 45 min hinzugefügt. Zur Kristallisierung wurde die Suspension bei 0° bis 5°C 3h lang gerührt. Nach Hinzufügen von 60 I 50%iger NaOH-Lösung und 120 I Toluol wurde das Isohexan-Toluol-Wasser-Gemisch unter vemindertem Druck abdestilliert bis die Dampftemperatur 80°C betrug. Dabei entstanden 200 I Destillat.
60 I 1-Bromdecan und 2,1 kg Aliquat 336 (Starks' Katalysator, ein Quartärammo niumsalz) wurden hinzugefügt und die Mischung wurde 3 h lang auf 85° bis 90°C erwärmt.
Nach Abkühlung auf Raumtemperatur und Verdünnung mit 220 I demineralisier- tem Wasser wurde die organische Phase abgetrennt und 3 mal mit 180 I demine- ralisiertem Wasser extrahiert. Die Toluolphase wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in einem Dünnschicht-Verdampfer bei 1 mbar und 150°C Betriebstemperatur behandelt, um Decanol und Bromdecan zu entfernen.
58 kg des rohes Produkts wurden in 370 I Isohexan gelöst und aufgereinigt mit 2 kg Aktivkohle. Nach Filtrierung wurde die Lösung übernacht auf -20°C gekühlt.
Die abgetrennten Kristalle wurden mit 5I kaltem Isohexan gewaschen und bei 15° bis 20°C getrocknet.
Ausbeute: 44 kg (76% basierend auf eingesetztem Benzaldehyd)
Reinheit (GC): 98%
2. Darstellung von 3-Bromo-2-decyloxy-1-propyl)benzoat
Eine Mischung von 7kg 5-decyloxy-2-phenyl-1,3-dioxan und 3,06 kg 1,3-Dibrom- 5,5-dimethylhydantoin in 87 I Isohexan wurde auf 50°C erwärmt. Nach 4 Stunden io wurde die Suspension auf Raumtemperatur gekühlt, durch einen Aktivkohlefilter gefiltert und im Vakuum bei max. 30°C aufkonzentriert.
Das rohe, erhaltene Öl wurde für die nächste Stufe verwendet und bei 0°bis 5°C gelagert. Lagerung sollte 2 Tage nicht überschreiten.
Ausbeute: 8,9 kg
Reinheit (GC): ca. 90%
3. Darstellung von 3-Dodecylthio-2-deyloxy-1-propanol
5,4 I 1-Dodecylmercaptan in 6,3 I Methanol wurden behandelt mit 4,19 I einer Natriummethylat-Lösung (30%) in 32 I Methanol wobei die Temperatur unter 30°C gehalten wurde. Danach wurde das rohe Öl von (3-Bromo-2-decyloxy-1- propyl)benzoat (8,7 kg, 90%iger Reinheit) in 15 I Methanol hinzugefügt bei Raum temperatur und die Lösung wurde 15 h lang gerührt.
Danach wurden 3,4 I NaOH-Lösung (50%) hinzugefügt, wobei die Temperatur unter 45°C gehalten wurde. Danach wurde die Lösung auf 40° bis 45°C zwei Stunden lang erwärmt.
50 I Methanol/Wasser wurden in Vakuum abgezogen und 60 I demineralisiertes Wasser wurde hinzugefügt. Erneut wurden 30 I Methanol/Wasser abdestilliert.
Der Rückstand wurde 30 min lang gerührt mit 47 I Methyl-tert-butylether. Die or ganische Phase wurde abgetrennt und einmal mit 14 I gesättigter Natriumchlorid lösung gewaschen und aufkonzentriert im Vakuum. Der Rückstandwurde einer Dünnschichtverdampfer-Destillation ausgesetzt bei weniger als 1mbar Druck und 200°C. Das nicht verflüchtigbare Öl wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
Ausbeute: 8,8 kg
Reinheit (GC): > 85%
Didodecyldisulfid: 1 ,5-2 %
4. Darstellung von (3-Dodecylthio-2-decyloxy-1-propyl)dihydrogen-phos- phat
Eine Lösung von 18,8 kg 3-Dodecylthion-2-decyloxy-1-propanol und 6,9 kg 2,6- Lutidin in 92 I Toluol wurden bei 0° bis 3°C über einen Zeitraum von 2 Stunden zu 10 kg Phophoroxychlorid in 92 I Toluol gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 3 Stunden bei 0° bis 3°C gerührt, um die Reaktion ausreagieren zu las sen. Das ausgefallene Hydrochlorid wurde durch Filtration entfernt, mit 96 I Toluol gewaschen und das Filtrat wurde unter Kühlung langsam in 109 1 demineralisier- tes Wasser gegeben, wobei die Temperatur zwischen 25° und 30°C gehalten wurde. Nach etwa 6 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Emulsion mit 12 I Methyl-tert-butylether behandelt und auf 50° bis 60° erwärmt. Die organi sche Phase wurde abgetrennt und das Lösemittel wurde im Vakuum abgezogen. Das verbleibende Öl wurde in 450 I Ethylmethylketon gelöst. Zur heftig gerührten Lösung wurden über einen Zeitraum von 1 ,5 Stunden 5,4 kg Calciumacetat in 33 I demineralisiertem Wasser hinzugefügt. Die Suspension wurde mindestens 8 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Das erhaltene Calciumsalz wurde mit 50 I Ethylmethylketon und 100 I demineralisierte Wasser gewaschen.
Das feuchte Calciumsalz wird für den nächsten Schritt ohne Trocknung verwen det. Ausbeute: 22,5 kg Calciumsalz (basierend auf der Trockensubstanz)
5. Darstellung von 3'-azido-3'-deoxy -5'-Thymidylsäure, mono(3-dode- cylthio-2decyloxypropyl)ester Calciumsalz
8,3 kg feuchtes (3-dodecylthio-2-decyloxy-1-propyl)dihydrogenphosphat als Cal ciumsalz aus dem vorherigen Schritt 4 (basierend auf der Trockensubstanz) wur den in 30 I Methyl-tert-butylether und 6 I 6M Salzsäure gelöst und gerührt. Da nach wurde die organische Phase abgetrennt, in Vakuum aufkonzentriert und mit 10 I trockenem Pyridin mitverdampft, um Spuren von Wasser zu entfernen. Der Rückstand wurde gelöst in 42 I trockenem Pyridin und 6,92 kg 2,4,6- triisobutylbenolsulfonylchlorid und 4,06 kg 3'-Azidothymidin (Zidovudin, auch Azidothymidin, kurz AZT) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde gerührt für 4 Stunden bei 20° bis 25°C unter einer Stickstoffatmosphäre. Das Pyridin wurde entfernt im Vakuum bei einer Höchsttemperatur von 60°C (Vakuum < 5 mbar über eine Stunde)
Der Rückstand wurde bei 50° bis 55°C in 33 I Methyl-tert-butylether suspendiert und auf 20° bis 25°C abgekühlt. Das ausgefallene Salz wurde abgefiltert und ge waschen mit 20 I Methyl-tert-butylether. (10 kg Triisobutylbenzolsulfonyl-pyridin- salz).
Das Filtrat wurde im Vakuum abgedampft. Das verbleibende viskose Öl wurde in 75 I Aceton gelöst und unter heftigem Rühren in eine Lösung von 2 kg Calciu macetat-Hydrat in 15 I demineralisiertem Wasser gegeben. Es wurde für eine weitere Stunde gerührt und das Salz wurde abfiltriert und gewaschen mit 20 L Aceton und 100 I demineralisiertem Wasser. Das rohe Calciumsalz wurde gela gert ohne vorherige Trocknung.
Ausbeute: 9,5 kg rohes Calciumsalz, basierend auf der Trockensubstanz
6. Vorbereitung der HPLC-Lösung
Das rohe Calciumsalz wurde in 30 I Methyl-tert-butylether und 3,5I 6M Salzsäure unter Rühren gelöst. Danach wurde die organische Phase abgetrennt, im Va kuum aufkonzentriert und erneut in 136 1 Methanol gelöst. 12 I Waser und 40 g Natriumacetat wurden hinzugegeben. Der pH-Wert wurde auf 5,0 bis 5,5 durch Hinzufügen von konzentrierter NaOH-Lösung eingestellt. Die Mischung wurde ge filtert, um eine verbliebene Trübung zu entfernen und für die weitere HPLC- Reinigung aufbewahrt.
7. HPLC-Chromatografie
Die zuvor erstellte Lösung wurde in Portionen von 4 I auf eine HPLC-Säule (200 - 350 mm, Merck, LiChroprep RP 18, 15 - 25 pm) und eluiert mit ungefähr 50 I Me thanol/ 0,02M Na-Acetat-Lösung 87,5/12,5 als mobile Phase. Zwischen zwei Durchläufen wurde die Säule mit 20 I Methanol gespült. Das Eluat von ca 40 Durchläufen (700 bis 800 I) wurde gesammelt, verdünnt mit 130 I demineralisiertem Wasser und behandelt mit einer Lösung von 1,15 kg Cal cium Acetat in 22 I Wasser. Die erhaltene Suspension wurde 5 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt und das Calciumsalz wurde filtriert und gewa schen mit 50 I demineralisiertem Wasser. Das reine Calciumsalz wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Trocknung verwendet.
Ausbeute: 6,0 bis 7,0 kg Calciumsalz, basierend auf der Trockensubstanz
8. Darstellung von S'-Azido-S'-deoxy-S'-thymidylsäure, mono(3-dodecylthio- 2-decyloxypropyl)ester-Natriumsalz 10,0 kg gereinigtes Calciumsalz wurden in 65 I Methyl-tert-butylether suspendiert und gerührt 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. 14,4 I 2M Salzsäure wurde hinzugefügt und das Rühren wurde fortgeführt bis sämtlicher Niederschlag aufgelöst war.
Der Rührer wurde gestoppt, die organische Phase wurde abgetrennt und extra hiert mit 20 I demineralisiertem Wasser. Die organische Phase wurde gefiltert und das Lösemittel wurde im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde gelöst in 60 I Toluol und 30 I Toluol wurden abdestilliert, um Spuren von Wasser zu entfernen. Die verbleibende Lösung wurde unter Rühren bei 20° bis 25°C auf einen pH- Wert von 6,9 bis 7,1 mit Natriummethylat-Lösung eingestellt.
Der Toluol Lösung wurde langsam und unter Rühren 240 I kochendes Aceton hinzugefügt. Rückfluss wurde aufrechterhalten für 15 Minuten. Danach wurde die Suspension auf 0° bis 5°C innerhalb von 3 Stunden gekühlt und bei dieser Tem peratur für weitere 2 Stunden gerührt. Das Natriumsalz wurde abfiltriert, gewa schen mit 40 I Aceton, getrocknet, gemahlen und erneut getrocknet.
Ausbeute: 9,5 kg
B E Z U G S Z E I C H E N L I S T E keine