Le procédé de l'invention permet notamment l'allongement séquentiel et linéaire d'un oligosaccharide et/ou polysaccharide reconnu comme accepteur de glycosyle par les enzymes de type glycoside-hydrolase ou transglycosylase.

Les fluorures de glycosyle sont depuis longtemps connus pour être de bons donneurs de glycosyle et sont communément utilisés dans les réactions de transglycosylation catalysées par des glycoside-hydrolases ou des transglycosylases.

Les travaux de Hehre, publiés dans Arch. Biochem. Biophys. 135 (1969), 75 ; Arch. Biochem. Biophys. 142 (1971), 382 ; et Carbohydr. Res. 26 (1973), 240, ont montré notamment que les amylases sont capables d'utiliser des fluorures de glycosyle pour former des produits de condensation. En 1978, l'équipe de Hehre publie dans Carbohydr. Res. 61,1978, 291-299, une étude utilisant le fluorure d'a- maltosyle comme substrat de (3-amylases. Par la suite, Hehre utilise différentes souches d'a-amylase, dont l'a-amylase issue d'Aspergillus oryzae, pour la synthèse de malto-oligosaccharides à partir d'a-maltosyle et constate que ces enzymes présentent une activité non-hydrolytique préférentielle puisque très peu du produit d'hydrolyse, le maltose, est finalement isolé (cf. Carbohydr. Res. 71,1979, 287-298).

De la même façon, Okada et coll. démontre que la production de 6-O- maltosyl-cyclodextrines est possible en utilisant le transfert du fluorure d'a- maltosyle sur une cyclodextrine à l'aide d'une pullulanase (protéine appartenant à la famille des a-amylases).

L'un des principaux inconvénients de cette méthode est l'isolement de mélanges complexes de 6-O-maltosyl-cyclodextrines résultant de la pluri- substitution des cyclodextrines et de l'allongement incontrôlé des chaînes polymères.

L'utilisation de fluorure d'a-maltosyle modifié a également été décrite dans la technique. Driguez et coll. ont publié notamment la synthèse de la 6A, 6C, 6E-tri-O-méthyl-cyclomaltohexaose par condensation et cyclisation du fluorure de 6'-O-méthyl-a-maltosyle par la cyclodextrine glucosyltransférase (cGTase). Les auteurs mettent en évidence la possibilité de préparer des mélanges de cyclodextrines (a, P, y) substituées en présence de cGTase et de l'un des fluorures de maltosyle (1) (2) suivants éventuellement modifié en position 6 : J. Chem. Soc., 16, 1989, 1088-1089.

Ces fluorures de maltosyle modifiés sont reconnus à la fois comme donneurs et accepteurs de glycosyle par la cGTase.

Bornaghi et al. décrivent la synthèse des hémi-thiomaltodextrines et des hémi-C-maltooligosaccharides à partir du fluorure de 4-thio-a-maltosyle (3) et du fluorure de a-C-maltosyle (4) et en présence de cGTase : Carbohydr. Res. 305, 1997, 561-568.

Cependant, les produits de réactions sont en fait dans chaque cas des mélanges.

Le fluorure 3 en présence de cGTase permet aux auteurs, après acétylation, d'obtenir du 4-thiomaltose (42%) acétylé (produit d'hydrolyse), de l'hémithiomaltohexaose acétylé (4%), de cyclo-a- (1-4)-thiomaltotétraoside acétylé (13%), cyclo-a- (1-4)-thiomaltopentaoside acétylé (16%), cyclo-a- (1-4)-4- thiomaltohexaoside acétylé (7%). En utilisant 3 équivalents de 4-thiomaltose comme accepteur de glycosyle, les auteurs ont isolé de l'hémithiomaltotétraose (18%) et de l'hémithiomaltohexaose (14%).

Le fluorure 4 en solution tamponné et en présence de cGTase ne permit pas aux auteurs d'obtenir de produits de transglycosylation mais seulement le produit d'hydrolyse. En utilisant un milieu hydro-organique les auteurs sont parvenus à limiter la réaction d'hydrolyse du substrat. Ils ont ainsi obtenu après acétylation, de l'hémi-C-maltotétraose acétylé (18%), de l'hémi-C-maltohexaose acétylé (11%), de l'hémi-C-matooctaose acétylé (5%). Il est à noter ici que la quantité de substrat hydrolysé est élevée (respectivement 42 et 66%).

On peut signaler en outre la synthèse du fluorure de 4'-désoxymaltosyle et du fluorure de 4"-désoxymaltotriosyle par Withers et coll. (Carbohydr. Res. 268, 1995,93-106), ces deux composés n'ayant cependant jamais été utilisés à des fins synthétiques en vue de la préparation d'oligo-ou polysaccharides.

Les fluorures de maltosyle modifiés de l'invention fonctionnent comme donneurs de glycosyle pour les enzymes de type glycoside-hydrolases ou de type transglycosylases. Les modifications effectuées au niveau des positions 4II ou des positions 4II et 6Ii du fluorure de maltosyle permettent la transformation simple de ces donneurs de glycosyle en accepteurs de glycosyle de telle sorte qu'une synthèse pas à pas d'oligosaccharides et de polysaccharides est rendue possible sans risque de croissance désordonnée des chaînes polysaccharidiques.

Le procédé de l'invention permet donc un contrôle idéal de la synthèse d'oligo-ou de polysaccharides.

Plus précisément, l'invention concerne un disaccharide de formule I : dérivé du fluorure de a-maltosyle, dans lequel : R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupement fonctionnel organique, éventuellement protégé, rattaché à l'unité glycosidique par un atome d'azote, un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un atome d'halogène, ou bien RI et R2 forment ensemble un groupement fonctionnel organique, éventuellement protégé, rattaché à l'unité glycosidique par deux atomes choisis parmi les atomes d'oxygène, de soufre et d'azote, étant entendu que R1 ne représente pas un groupe hydroxyle.

La configuration des carbones asymétriques endocycliques des composés de formule I est celle des carbones correspondants de l'a-maltosyle.

La nature du groupement fonctionnel organique représentant R1 et/ou R2 est quelconque dès lors que celui-ci n'interfère pas avec la réaction de condensation ultérieure mettant en jeu le disaccharide de formule I correspondant comme réactif de départ et dès lors que R1 est transformable en groupe permettant au disaccharide résultant d'être un accepteur de glycosyle. Un accepteur de glycosyle est entendu ici comme une molécule se positionnant dans les sous-sites accepteurs de l'enzyme.

Des exemples de groupes permettant au disaccharide résultant d'être un accepteur de glycosyle sont les radicaux OH, NHa et SH. Ainsi, RI est généralement le précurseur d'un groupe OH, SH ou NH2.

Selon l'invention, R1 ne représente pas un groupe hydroxyle. Par contre, R1 peut représenter un groupe hydroxyle protégé par un groupe protecteur quelconque utilisé en chimie organique tel que l'un de ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis Greene T. W. et Wutz P. G. M., ed. John Wiley & Sons, 1991 ou dans Protecting Groups Kocienski P. J. 1994, Georg Thieme Verlag.

A l'inverse, R2 peut représenter un groupe hydroxyle libre ou bien un groupe hydroxyle protégé par un groupe protecteur tels que ceux décrits dans les deux ouvrages cités ci-dessus.

Un groupe préféré de disaccharides de formule I est constitué des disaccharides dans lesquels R2 représente-OH.

Des groupes protecteurs de fonction hydroxyle sont notamment les groupes éthers, esters, sulfonates, carbamates, acétals, hémiacétals et carbonates.

A titre d'exemple de significations de R1 et/ou R2, on peut mentionner les groupes alkoxy éventuellement substitué ; alcényloxy éventuellement substitué ; aryloxy éventuellement substitué ; diarylalcoxy éventuellement substitué ; ou triarylalcoxy éventuellement substitué ; hétéroaryloxy éventuellement substitué ; arylalkoxy éventuellement substitué ; hétéroarylalkoxy éventuellement

substitué ; alkylcarbonyloxy éventuellement substitué ; arylcarbonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylcarbonyloxy éventuellement substitué ; arylalkylcarbonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylalkylcarbonyloxy éventuellement substitué ; alkylsulfonyloxy éventuellement substitué ; arylsulfonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylsulfonyloxy éventuellement substitué ; arylalkylsulfonyloxy éventuellement substitué hétéroarylalkylsulfonyloxy éventuellement substitué ;-O-SiRfRgRh où Rf, Rg et Rh sont choisis indépendamment parmi alkyle et aryle éventuellement substitué ; - O-CO-NRaRb où Ra et Rb sont indépendamment choisis parmi alkyle éventuellement substitué, aryle éventuellement substitué, arylalkyle éventuellement substitué, hétéroarylalkyle éventuellement substitué, et un atome d'hydrogène ; et où Rc et Rd sont tels que définis ci-dessus pour Ra et Rb ou bien Rc et Rd forment ensemble une chaîne alkylène éventuellement substituée et Re est tel que défini ci-dessus pour Ra, ou bien encore Rd et Re forment ensemble une chaîne alkylène éventuellement substituée, Rc étant tel que défini ci-dessus pour Ra ; et Y représente O ou S.

Selon l'invention, R1 et/ou R2 peuvent représenter un atome d'halogène tel que pour R1 un atome de brome, de chlore ou d'iode et pour R2 un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor.

En variante, R1 et/ou R2 peuvent représenter une fonction amine ou thiol éventuellement substituée ou protégée par un ou deux des groupes protecteurs décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis Greene T. W. et Wutz P. G. M., ed. John Wiley & Sons, 1991 ou dans Protecting Groups Kocienski P. J. 1994, Georg Thieme Verlag.

De tels groupes protecteurs sont notamment les groupes carbamates, amides, azide, urée, thioacétate, disulfure, thiourée, arylthio, alkylthio, acylthio, arylcarbonylthio, acétamido ou benzamido.

A titre d'exemples de significations de R1 et R2, on peut mentionner les groupes amino ; alkylamino ; dialkylamino ;-NH-CO-Ra où Ra est tel que défini ci-dessus ; azide ;-NRa-CO-NRbRf où Ra et Rb sont tels que définis ci-dessus et Rf prend l'une quelconque des significations données ci-dessus pour Ra ;-O-CO- NH-Ra, Ra étant tel que défini ci-dessus ;-S-Ra, Ra étant tel que défini ci-dessus ; -NRa-CO-Re, Ra et Re étant tels que définis ci-dessus.

En variante, les groupes R1 et R2 peuvent former ensemble un groupe fonctionnel organique éventuellement protégé.

Un tel groupe fonctionnel est, par exemple, un groupe protecteur de fonction diol tel qu'un groupe alkylidènedioxy éventuellement substitué et, par exemple, substitué par aryle.

Ainsi, RI et R2 peuvent former ensemble un groupe O-isopropylidène ou O-benzylidène.

Un disaccharide particulièrement préféré est le disaccharide de formule 1 dans lequel R1 représente un groupe 2-tétrahydropyranyle, et de préférence R2 représente un groupe hydroxyle.

Un disaccharide également préféré est le disaccharide de formule I, dans lequel RI représente un groupe 2-tétrahydropyranyle et R2 représente un atome d'halogène, tel que le brome.

Comme autre saccharide préféré, on peut citer le disaccharide de formule I dans lequel R1 représente azido ou amino éventuellement substitué et R2 représente azido ou amino éventuellement substitué.

Un autre disaccharide préféré est celui de formule 1 dans lequel représente azido ou amino éventuellement substitué et R2 représente-OH.

Plus particulièrement on préfère les disaccharides pour lesquels dans la formule 1 - = NH2 ou azido ; R2 = OH ; ou - =NH2 Ou azido ; R2 = NH2 ou azido.

Des substituants préférés du groupe amino sont les groupes alkyle, aryle et arylalkyle dans lesquels aryle est éventuellement substitué.

Dans le cadre de l'invention, on entend par alkyle une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 14 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10, mieux encore de 1 à 6 atomes de carbone, par exemple de 1 à 4 atomes de carbone.

Des exemples de radicaux alkyle sont méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle, pentyle, isopentyle, néopentyle, 2-méthylbutyle, 1- éthylpropyle, hexyle, isohexyle, néohexyle, 1-méthylpentyle, 3-méthylpentyle, 1, 1-diméthylbutyle, 1,3-diméthylbutyle, 2-éthylbutyle, 1-méthyl-1-éthylpropyle, heptyle, 1-méthylhexyle, 1-propylbutyle, 4, 4-diméthylpentyle, octyle, 1- méthylheptyle, 2-méthylhexyle, 5,5-diméthylhexyle, nonyle, décyle, 1- méthylnonyle, 3,7-diméthyloctyle et 7,7-diméthyloctyle.

Par aryle on entend selon l'invention, un groupe hydrocarboné mono-ou polycyclique (par exemple mono-ou bicyclique) aromatique préférablement en C6-Cls, tel que phényle, naphtyle, anthryle, ou phénanthryle.

Les groupes hétéroaryle sont des groupes aromatiques hétérocycliques monocycliques ou polycycliques comprenant des hétéroatomes généralement choisis parmi O, S et N, éventuellement à l'état oxydé (cas de S et de N).

De préférence, l'hétéroaryle est mono-, bi-ou tricyclique.

De préférence, au moins l'une des monocycles constituant l'hétérocycle comprend de 1 à 4 hétéroatomes endocycliques, mieux encore de 1 à 3 hétéroatomes.

De façon préférée, l'hétérocycle est constitué d'un ou plusieurs monocycles présentant chacun de 5 à 7 sommets.

Des exemples d'hétéroaryles monocycliques de 5 à 7 sommets sont notamment la pyridine, le furane, le thiophène, le pyrrole, le pyrrazole, l'imidazole, le thiazole, l'isoxazole, le furazane, la pyridazine, la pyrimidine, la pyrazine, les thiazines, l'oxazole, le pyrazole, l'oxadiazole, le triazole et le thiadiazole.

Des exemples d'hétéroaryles bicycliques dans lesquels chaque monocycle comprend de 5 à 7 sommets sont choisis parmi indolizine, indole, isoindole, benzofuranne, benzothiophène, indazole, benzimidazole, benzothiazole,

benzofurazane, benzothiofurazane, purine, quinoléine, isoquinoléine, cinnoline, phtalazine, quinazoline, quinoxaline, naphtyridines, pyrazolotriazine (tel que pyrazolo-1, 3,4-triazine), pyrazolopyrimidine et ptéridine.

Les hétéroaryle tricycliques dans lesquels chaque monocycle comprend de 5 à 7 sommets sont, par exemple, choisis parmi l'acridine, la phénazine ou le carbazole.

Alkylène définit un groupe divalent hydrocarboné linéaire ou ramifié éventuellement substitué, de préférence en Cl-Cl4, dérivé d'un groupe alkyle par arrachement d'un atome d'hydrogène. De manière avantageuse, alkylène désigne un groupe en Ci-Cio, mieux encore en C1-C6, par exemple en C1-C4.

Alkylidènedioxy représente un groupe divalent organique de formule générale :-O-A-O- où A désigne alkylène éventuellement substitué, tel que défini ci-dessus.

Un exemple de groupe arylalkyle particulièrement préféré est benzyle.

Un exemple de groupe triarylalkyle est trityle.

Les substituants des groupes aryle et hétéroaryle sont généralement choisis parmi les atomes d'halogène ; les groupes nitro ; (Cl-Cl4) alcoxy éventuellement halogéné (et préférablement trifluorométhoxy) ; (Ci- C14) thioalcoxy éventuellement halogéné, de préférence (Cl-Clo) thioalcoxy ; (Ci- C14) alkyle éventuellement halogéné, de préférence perhalogéné (et notamment méthyle ou trifluorométhyle) ; (Cl-Cl4) alkylcarbonyle dans lequel la partie alkyle est éventuellement halogénée ; (C6-Cls) arylcarbonyle dans lequel la partie aryle est éventuellement substituée une ou plusieurs fois par halogène, (Cl-Cl4) alkyle éventuellement halogéné et/ou (Cl-Cl4) alcoxy éventuellement halogéné ; (Ci- C14) alkylcarbonylamino dans lequel la partie alkyle est éventuellement halogénée ; (C6-C18) arylcarbonylamino dans lequel aryle est éventuellement substitué une ou plusieurs fois par halogène, (Ci-Ci4) alkyle éventuellement halogéné et (Ci- C14) alcoxy éventuellement halogéné ; et (C6-Cls) aryle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par halogène, (Ci-Ci4) alkyle éventuellement halogéné tel que trifluorométhyle, et (C1-C14) alcoxy éventuellement halogéné tel que trifluorométhoxy.

Par atome d'halogène, on entend un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor.

Les groupes aryle et hétéroaryle peuvent être substitués par un ou plusieurs des substituants énumérés ci-dessus, de préférence une à trois fois, par exemple une à deux fois.

Les groupes alkyle et les parties alkyle des radicaux sus-mentionnés ainsi que les radicaux alkylène ou les parties alkylène des radicaux sus-mentionnés peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou plusieurs radicaux indépendamment choisis parmi halogène tel que brome, (Cl-Cl4) alcoxy, (Ci- C14) thioalcoxy, de préférence par un à trois radicaux de ce type.

Lorsque l'un de R1 et/ou R2 représente amino substitué, les substituants peuvent être un groupe alkyle éventuellement substitué, un groupe aryle éventuellement substitué, un groupe hétéroaryle éventuellement substitué, un groupe arylalkyle éventuellement substitué, ou un groupe hétéroarylalkyle éventuellement substitué.

Lorsque dans les disaccharides de formule I RI et/ou R2 représentent un groupe hydroxyle protégé, on préfère que celui-ci soit choisi parmi benzyloxy éventuellement substitué ; allyloxy ; trityloxy ; tétrahydropyranyloxy ; 3-bromo- tétrahydropyranyloxy ; tétrahydrothiopyranyloxy ; 1-méthoxycyclohexyloxy ; 4- méthoxytétrahydro-pyranyloxy ; 4-méthoxytétrahydrothiopyranyloxy ; acétoxy ; 2-halogénoacétoxy ; un groupe-O-SiRfRgRh où Rf, Rg et Rh sont soit tous les trois alkyle identiques ou différents, soit tous les trois aryle identiques ou différents ; tosyloxy ; et mésyloxy.

Les composés de formule I peuvent être préparés en plusieurs étapes. Le procédé de synthèse comprend tout d'abord la réaction de fluorure d'hydrogène sur un composé de formule II :

dans laquelle : P2, p3, P4, P5 et P6 sont des groupes protecteurs de fonctions hydroxyle ; R'1, R'2 désignent respectivement R1 et R2 ou bien sont des groupes précurseurs des substituants R1 et R2 ; et G représente un groupe pouvant être déplacé par un ion fluorure tel qu'un groupe alkylcarbonyle où alkyle est tel que défini ci-dessus, un groupe allylé ; un groupe epoxyde (1,2) ou un groupe-C (=NH)-CC13 ; ou bien G et P2 forment ensemble un groupe alkylidènedioxy tel que défini ci-dessus.

De préférence, G représente un groupe acétyle, les groupes P2, P3, P4, P5 et P6 pouvant être identiques.

En variante, on peut envisager la réaction de fluorure d'hydrogène sur un composé de formule II' : dans laquelle Rut1, R12, p2, P3, P4, P5 et P6 sont tels que définis ci-dessus pour la formule II et W représente-SG, SeG ou TeG, G étant tel que défini ci-dessus étant entendu que G et P2 peuvent former ensemble une chaîne alkylène où alkylène est tel que défini ci-dessus.

Cette réaction peut être mise en oeuvre en l'absence de solvant et en présence d'un large excès de fluorure d'hydrogène, celui-ci tenant lieu de solvant.

De manière avantageuse cependant, la réaction est conduite dans un solvant tel que la pyridine. Plus préférablement, on opère en outre en présence d'un large excès de fluorure d'hydrogène.

Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé de formule II ci-dessus est dissous dans un mélange 10/1 à 1/1 de fluorure d'hydrogène/pyridine. Cette réaction est habituellement conduite à température ambiante et plus généralement à une température comprise entre-10 et 50° C, par exemple comprise entre 15 et 30° C.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, P2, P3, P4, P5 et P6 représentent des groupes alkylcarbonyle tels des groupes acétyle, R'1 représente un groupe hydroxyle et R'2 est choisi parmi un atome d'halogène (tel qu'un atome de brome) ou un groupe alkylcarbonyle tel qu'un groupe acétyle.

Le composé obtenu à l'issue de cette première étape a pour formule : dans laquelle p2, p3, p4, p5, p6 et R'1, R'2 sont tels que définis ci-dessus pour la formule III.

Les étapes suivantes aboutissant à l'isolement du composé de formule 1 seront facilement mises au point par l'homme du métier en fonction de la nature des groupes R1 et R2 dans le composé de formule I visé.

Ces étapes comprennent, dans un ordre quelconque, (i) la déprotection des fonctions hydroxyle protégées respectivement par P2, P3, P4, P5 et P6, et, le cas échéant, (ii) la transformation des groupes R'1 et R'2 en groupes R1 et R2.

Lorsque dans les composés de formule II R'1 représente un groupe hydroxyle et R'2 est identique aux groupes Pz, P3, P4, P5 et P6 (identiques entre eux), la transformation du composé III en composé de formule I comprend par exemple :

- une première étape de transformation du groupe hydroxyle en position 4II en groupe R1 ; - la déprotection ultérieure simultanée des groupes hydroxyle en position zip 3I, 6I, II 3II et 6II ; - et, le cas échéant, la transformation du groupe hydroxyle en position 6 en groupe R2.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'un disaccharide tel que défini ci-dessus dans les réactions de transglycosylations catalysées par des glycoside-hydrolases ou dans les réactions de transfert catalysées par des transglycosylases. Dans ces réactions, les disaccharides de l'invention, substrats des enzymes de type glycoside-hydrolases et/ou transglycolases, fonctionnent comme donneurs de glycosyle.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, les disaccharides de l'invention sont utilisés comme substrats d'enzymes appartenant à la famille 13 des glycoside-hydrolases. Parmi ces enzymes, on compte notamment les a-amylases, les pullulanases, les cyclomaltodextrin- glucanotransférases, les cyclomaltodextrinases, les oligo-a-glucosidases, les maltogenic amylases, les néopullulanases, les a-glucosidases, les a-amylases formant maltotetraose, les isoamylases, les glucodextranases, les a-amylases formant maltohexaose, les enzymes de ramification, les 4-a-glucanotransférases, les a-amylases formant maltopentaose et les amylosucrases.

Dans le cadre de l'invention, lesdites enzymes sont utilisées pour la préparation d'oligo-ou polysaccharides par condensation séquentielle de glycosyles.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, on utilise comme substrat d'enzymes un disaccharide de formule I dans laquelle R2 représente un atome d'halogène, et plus particulièrement le brome, en vue de la préparation d'oligosaccharides ramifiés, c'est-à-dire d'oligosaccharides dans lesquels les unités monosaccharidiques forment des enchaînements avec ramifications.

Il doit être entendu qu'à l'inverse on entend selon l'invention par oligosaccharides linéaires des oligosaccharides dans lesquels les unités monosaccharidiques forment des enchaînements linéaires.

De manière plus particulièrement préférée, la préparation d'oligo-et polysaccharides met en jeu la cyclodextrine glycosyltransférase (cGTase), comme enzyme de type glycoside hydrolase.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé pour la préparation d'oligosaccharides ou de polysaccharides comprenant la réaction d'au moins un disaccharide de formule I de l'invention avec un accepteur de glycosyle, en présence d'une enzyme de type glycoside-hydrolase ou de type transglycosylase.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la synthèse d'oligo-ou polysaccharides à partir des disaccharides de l'invention implique une ou plusieurs réactions de condensation entre l'unité de type maltosyle d'un disaccharide de formule 1 et l'unité pyranosyle d'un accepteur de glycosyle.

De fait, de façon particulièrement avantageuse, le procédé de l'invention comprend une ou plusieurs réactions de couplage entre un disaccharide de l'invention et un accepteur de glycosyle présentant, en extrémité non réductrice, une unité pyranosyle portant au moins une fonction susceptible de réagir avec ledit disaccharide de formule I, la liaison glycosidique ayant lieu entre cette unité pyranosyle et le carbone anomère portant l'atome de fluor du disaccharide de l'invention, lequel disaccharide fonctionne comme donneur de glycosyle.

Des exemples d'unités préférées pyranosyle sont les unités allose, altrose, glucose, gulose, mannose, idose, galactose ou talose.

De manière préférée, la synthèse de l'oligosaccharide ou du polysaccharide comprend une étape de condensation entre l'unité de type maltosyle du disaccharide de l'invention et l'unité pyranosyle de l'accepteur de glycosyle, ladite condensation procédant par la réaction d'un seul groupe hydroxyle de l'unité pyranosyle de l'accepteur de glycosyle avec le carbone anomère de ladite unité de type maltosyle.

L'un des avantages de l'invention réside dans la possibilité de contrôler, étape par étape, la synthèse de l'oligosaccharide, respectivement du polysaccharide final.

Il suffit, à l'issue de chaque étape de condensation avec un dissacharide de l'invention, de procéder à une nouvelle réaction de condensation, après déprotection éventuelle d'une fonction hydroxyle de l'oligosaccharide obtenu, lequel devient pour ladite nouvelle réaction de condensation l'accepteur de glycosyle.

De préférence, le carbone anomère portant le fluor du disaccharide de l'invention réagit avec une fonction hydroxyle, thiol ou amine (et plus particulièrement une fonction hydroxyle) préférablement située en position 4 de l'unité pyranosyle de l'accepteur de glycosyle. Plus généralement, cette fonction de l'unité pyranosyle est située en position 2,3, 4 ou 6.

L'accepteur de glycosyle peut être indifféremment un monosaccharide tel que l'a-D-glucopyranoside de méthyle, un oligosaccharide ou un polysaccharide tel que le pullulane.

On préfère tout particulièrement que l'accepteur de glycosyle soit le pullulane et que le disaccharide de l'invention soit un disaccharide de formule I dans laquelle RI = NH2 ou azido et R2 = OH ou bien encore R1, R2 représentent indépendamment NH2 ou azido.

Le polymère résultant est notamment particulièrement intéressant comme nouveau vecteur en thérapie génique.

Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un vecteur utilisable en thérapie génique résultant de la condensation d'un polysaccharide constitué d'un enchaînement linéaire ou ramifié d'unités glycopyranosyle avec un ou plusieurs disaccharides de formule I tel que défini ci-dessus, ladite condensation impliquant la réaction d'une ou plusieurs fonctions hydroxyle en position 4 des unités glycopyranosyle dudit polysaccharide avec un carbone anomère portant l'atome de fluor desdit disaccharides de formule I.

De manière préférée, ledit polysaccharide est le pullulane.

De préférence, le disaccharide de formule 1 est un disaccharide de formule 1 dans laquelle R1, R2 représentent indépendamment NH2 ou azido ; ou bien encore R1 = NH2 ou azido ; R2 = OH.

Plus généralement, le procédé de l'invention est approprié pour ramifier, de façon contrôlée, les positions 4 des unités monosaccharidiques du pullulane.

D'autres exemples de polysaccharide, accepteur de glycosyle, utilisables dans le cadre de l'invention sont notamment des dextranes linéaires ou ramifiés, des alternanes, de l'amylose, du glycogène, de l'amylopectine et plus généralement tout polysaccharide suceptible d'être accepteur de glycosyle lors de l'utilisation de composé de type I tel que le défini l'invention.

Selon l'invention, le couplage du disaccharide de l'invention avec l'accepteur de glycosyle est mis en oeuvre en milieu aqueux, à un pH voisin de la neutralité, par exemple à un pH compris entre 6 et 8, de préférence à pH 7.

On opère le plus souvent en solution aqueuse tamponnée.

En variante, on peut également opérer par ajout d'une base minérale telle que la soude, l'addition étant réalisée à l'aide d'une burette automatisée contrôlée par un pH-mètre.

Des exemples de tampons utilisables à cet effet sont les tampons phosphate, sulfate, acétate, citrate, succinate et maléate, les tampons phosphate étant préférés.

Habituellement, la condensation est mise en oeuvre en mettant en présence 1 équivalent de l'accepteur de glycosyle et 1 à 5 équivalents molaires, de préférence 1,2 à 3,5 équivalents, du dérivé fluorure de maltosyle de formule I.

L'enzyme fonctionnant en tant que catalyseur est présente dans le milieu réactionnel en quantité catalytique. On utilise ainsi moins d'un équivalent d'enzyme pour un équivalent molaire d'accepteur de glycosyle (en général une quantité inférieure à 10-3M, mieux encore inférieure à 10-4M et par exemple comprise entre 10-4 et 10-6 M (telle qu'une quantité de l'ordre de 10-5M) suffit habituellement.

La réaction est généralement mise en oeuvre à une température inférieure à 100° C.

Les avantages de ce type de synthèse d'oligo-et polysaccharides utilisant les enzymes de type glycoside hydrolase au transglycosylase sont multiples : - les coûts de production sont réduits ; - les synthèses étant effectuées en milieu aqueux, les produits obtenus sont exempts de solvants organiques résiduels, ce qui garantit leur totale innocuité.

L'invention est illustrée dans la suite par les exemples de synthèse 1 à 6 suivants.

Dans les exemples, EP désigne l'éther de pétrole, PF le point de fusion expérimental et PFlitt le point de fusion rapporté dans la littérature.

EXEMPLE 1 a) Préparation du 2, 3-di-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl-(1-4)-1, 2, 3, 6-tétra-0-acétyl- D-glucopyranose A une solution de 4', 6'-O-benzylidène maltose per-acétylé (15g, 22 mmol) en solution dans l'acétonitrile (420 ml), est additionné une solution d'acide tétrafluoroborique (HBF4/H20 ; 35% v/v ; 6,1 ml). Le mélange est agité 10 minutes à température ambiante, neutralisé par de la triéthylamine (6,8 ml) puis évaporé.

Après purification par chromatographie rapide (EtOAc 3/EP 1), le composé attendu est cristallisé dans un mélange dichlorométhane/éther (12 g ; 92%) PF = 204-205 °C PFtitt. =205-206° C : K. Takeo et K. Shinmitsu, Carbohydr. Res., 133,1984, 135-145.

RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,08-168, 8 (COCH3) ; 95,82 (C1II) ; 91,29 (C1I) ; 75,21- 73,10-72, 78-72,05-71, 92-70,92-70, 28-69,42 (C2I, C3lI, C4I, C5I, C2II, C3II, C4II, C5II) ; 62,63 (C6I) ; 61, 87 (C6 u) ; 20, 78-20, 46 (COCH3) I et II se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule Al ci- dessus. <BR> <BR> <BR> b) Préparastion du 2,3,6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl-(1#4)-1,2,3,6-tétra -O-acétyl- ß-D-glucopyranose

Le composé obtenu à l'étape précédente (6,075 g, M=594 g/mol, 10,2 mmol), de l'acétate de N-hydroxy-benzotriazole (2,004 g, 1,2 éq) sont solubilisés dans du dichlorométhane (60 ml). De la triéthylamine (2,112 ml) est additionné. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 20h. Le solvant est évaporé. Le composé attendu est obtenu par cristallisation dans l'éther éthylique (5,164 g, 80 %).

RMN lH (300 MHz, CDC13) : 5,64 (Hl' ; d ; Jl, 2 = 8,4 Hz) ; 5,22 (H1II ; d ; Jl, 2 = 3,66 Hz) ; 5.17 (H3I ; t ; J2,3= J3,4 = 8, 4 Hz) ; 5,1 (H3II ; t ; J2, 3= 10,2 Hz ; J3, 4 = 9,8 Hz) ; 4,84 (H2' ; t ; J1, 2 = J2,3 = 8, 4 Hz Hz) ; 4,66 (H2I ; dd ; Jl, 2 = 3,66 Hz ; J2, 3 = 10, 23 Hz) ; 4,37 (H6aI ; dd ; Js, 6a # 2 Hz ; J6a, 6b # 12 Hz) ; 4,34 (H6aII ; dd ; Js, 6a = 4,02 Hz ; J6a, 6b = 12,06 Hz) ; 4,14 (H6bII) ; 4,10 (H6bI) ; 3,9 (H4I ; t ; J4,5 = J3, 4 = 8,4 Hz) ; 3,73 (H5) ; 3,69 (H5II) ; 3,45 (H4II ; t ; J4, s J3, 4 = 9, 8 Hz) ; 2,01-2, 0-1,98-1, 93-1,89 (CH3CO ; s ; 21 H) ; RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,06-170, 62-170,52-170, 37-169,88-169, 41- 168,65 (COCH3) ; 95,75 (Cl',) ; 91,09 (C1I) ; 74,94-72, 88-72, 31-71,46-70, 84-70,77 - 70, 03-68,47 (C2I, C3I, C4I, C51, C2n, C3II, C4II, C5II) ; 62,37 (C6I, C6) ; 20,53-20, 26 (COCH3) 1 et IN se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule Bl.

Analyse élémentaire C26H36018 : Calculée C = 49, 06 % ; H = 5,7 % ; Trouvée C = 48, 97 % ; H = 5,85 % c) Préparation du fluorure de 2,3,6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl-(1#4)-2,3,6-tri-O- acétyZ-D-glucopyranosyle

La réaction s'effectue à 0°C dans un récipient en plastique.

L'hepta-acétate obtenu à l'étape précédente (5 g, 7,86 mmol) est dissous dans une solution de fluorure d'hydrogène dans la pyridine (7 : 3 ; v/v ; 30 ml). Après une demi-heure d'agitation, le mélange réactionnel est dilué au dichlorométhane puis versé sur une solution aqueuse glacée d'ammoniaque 3M.

Après décantation la phase organique est lavée deux fois avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium glacée. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée à l'aide d'un évaporateur rotatif.

Une chromatographie rapide (EtOAc 2/EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine permet d'obtenir le fluorure attendu (4,45 g ; 95%).

RMN Hl (300 MHz, CDC13) : 5,6 (H1 ; dd ; JHo 2 = 2,56 Hz ; JH, F = 54 Hz) ; 5, 48 (H3I ; dd#t ; J3, 4 # 9,5 Hz) ; 5,33 (H1II ; d ; JHz, 2 = 4,0 Hz) ; 5,17 (H31I ; dd#t ; J34 = 10.1 Hz) ; 4,79 (H2' ; ddd ; JI, 2 = 2,56 ; J2, 3 = 10.05 Hz ; JH, F = 22,5 Hz) ; 4,75 (H2° ; dd ; J1, 2 = 4,0 Hz ; J2, 3 = 10,6 Hz) ; 4,5 (H6aI ; dd ; Js, 6a = 2 Hz ; J6a, 6b=12, 4) ; 4,41 (H6aII ; dd ; Jazz =3,6 Hz ; J6a, 6b =12,4 Hz) ; 4,18 (H6bI ; H6bII) ; 4,11 (H5I ; m) ; 3,99 (H4I ; t ; J4,5 = 9,3 Hz) ; 3,75 (H5II ; m) ; 3,5 (H4II ; dt ; JH4, 5&num 10,1 Hz ; JH, oH=5, 6 Hz) ; 3,21 (OH non lié, JOH, H=5,6 Hz) ; 2,1-2, 08- 2,04-2, 02-1,97 (21 H COCH3).

RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,33-169, 69 (COCH3) ; 103,56 (Cl, ; d ; JC,F=229, 3 Hz) ; 95, 84 (Cl") ; 71,78-71, 66-71,58-71, 21-70,72-70, 30-69,99-68, 69 (C2I, C3, C4I, C5I, C2II, C3II, C4, C5,') ; 62,36-62, 12 (C6I, C6°) ; 20,71-20, 41 (COCH3).

S. M. (FAB) : m/z = 659 Da [M+Na] +

Analyse élémentaire C24H33FOi6 : Calculée : C 48, 32 ; H 5,58 ; F 3, 18 ; Trouvée : C 48, 34 ; H 5, 82 ; F 2. 98 ; I et II se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule C1 ci- dessus. <BR> <BR> <BR> d) Préparation du fluorure de 2,3,6-tri-O-acétyl-4-O-tétrahydropyranyl-α-D-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> glucopyranosyl-(1#4)-2,3,6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl e Du composé obtenu à l'étape précédente (3g ; 5 mmol) est dissous dans du dichlorométhane (120 ml) distillé. Du dihydropyrane (2.3 ml) est ajouté ainsi que de l'acide camphorsulfonique (86 mg). Après 3h d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est lavé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium.

La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée. Après purification par chromatographie rapide (EtOAc 1/EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine, le composé attendu est obtenu sous forme de mélange de diastéréoisomères (3,420 g ; 98 %).

RMN IH (300 MHz, CDC13) : pas d'interprétation, mélange de diastéréoisomères.

RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 170,54-169, 31 (COCH3) ; 103,56 (Cl, ; d ; Jc, F=229, 3 Hz) ; 102,05-101, 62 (C acétalique du tétrahydropyrane R et S) 95,72 (C1II) ; 75,28-73, 59- 71, 75-71, 68-71, 48-70, 77-70, 43-70, 38-70, 26-69, 99-69, 84-69, 74 (C2I, C3, C4I, C5, C2, C3II,d C4, C5II) ; 64, 03-63, 34-62, 61 - 62,14 - 62,1 - 62, 02 (C6I, C6 R et S, C tétrahydropyranyle R et S) ; 31,07-24, 99 (tétrahydropyranyle) ; 20,76-20, 41 (COCH3) ; 20,09-19, 67 (1 C tétrahydropyranyle R et S).

Analyse élémentaire : Calculée : C 51, 18 ; H 6,07 ; F 2,79 ; Trouvée : C 51,19 ; H 6,15 ; S. M. (DCI) : m/z=698 Da [M+NH4] + I et II se réferent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule D1 ci- dessus. e) Préparation du fluorure de 4-O-tétraydropyranyl-α-D-glucopyranosyl-(1#4)-α-D- glucopyranosyle Le composé per-acétylé obtenu à l'étape précédente (1,55 g ; 2, 28 mmol) est dissous dans du méthanol (50 ml). Une solution de méthylate de sodium dans le méthanol (1M ; 2,5 ml) est ajoutée. Après agitation 30 minutes à température ambiante le mélange réactionnel est refroidi à 0°C puis neutralisé avec de la résine Amberlite IRN 120 H+. Après filtration le composé est concentré, repris dans l'eau et lyophilisé (956 mg ; 2,23 mmol). Ce composé est utilisé sans autre purification.

Sous forme lyophilisé, ce fluorure est stable à-18°C.

Note : le premier composé de dégradation est l'a-fluorure de maltosyle.

S. M. (FAB) : m/z = 429 Da [M+H] + EXEMPLE 2 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Préparation du 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-α-D-glucopyranosydl-(1#4)-2,3,6-tr i-O-acétyl-α-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> D-glucopyranosyl-(1#4)-[2,3,,4,6-tétra-O-acétyl-α-D-gluco pyranosyl-(1#4)-2,3,6-tri-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> O-acétyl-α-D-glucopyranosyl-(1#o4)-2,3,6-t4ri-O-acétyl-α -D-glucopyranosyl-(1#6)]- 2, 3-di-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl- (1--4)-1, 2,3, 6-tétra-0-acétyl-D-glucopyranose

Du panose [ (a-D-glucopyranosyl- (1-6) J-a D-glucopyrahosyl- (1 -4)-D-glucopyranose) (80 mg ; 0, 158 mmol) et du fluorure de maltosyle modifié obtenu à l'exemple le) (171 mg ; 0,4 mmol ; 2,5 éq) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (8 ml ; 0,1 M ; pH=7). De la cGTase (en quantité catalytique) est additionnée. Le mélange est agité pendant deux heures à température ambiante. Une chromatograhie sur couche mince (éluant H20 1/CH3CN 2) montre la complète conversion du fluorure. Le mélange réactionnel est porté à 100°C pendant 5 minutes. La protéine est filtrée sur coton. Le filtrat est lyophilisé puis acétylé dans un mélange pyridine/anhydride acétique (1,5 : 1, v/v, 25 ml) pendant une nuit à 70°C. Du méthanol (10 ml) est additionné à 0°C pour neutraliser l'excès d'anhydride acétique. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au CH2Ck, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au CH2CI2 (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2S04 puis évaporées à sec. Le résidu est repris au CH2Cl2 (10 ml) et de l'acide trifluoroacétique (10 ml) est additionné. Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à température ambiante, évaporé à sec puis acétylé 14 heures dans un mélange pyridine/anhydride acétique (1,5 : 1, v/v, 3,5 ml) à température ambiante. Le mélange est alors refroidi à 0°C et du méthanol (lml) est additionné. Après évaporation sur évaporateur rotatif, le résidu est purifié par chromatographie rapide (CH2C12 100/ MeOH 1), m = 230 mg (0,125 mmol, 80 %).

S. M. (électrospray) m/z = 2141 (M+Na) + EXEMPLE 3 Préparation du α-D-glucopyranosyl-(1#4)-α-D-glucopyranosyl-(1#4)-[α-D-&l t;BR> <BR> <BR> glucopyranosyl-(1#4)- α-D-glucopyranosyl-(1#4)-α-D-glucopyranosyl-(1#6)]-α-D-&l t;BR> <BR> glucopyranosyl-(1#4)-D-glucopyranose

Le composé de l'exemple 2 (100 mg ; 0,546 mmol) est dissous dans du MeOH (30 ml) et une solution de méthylate de sodium dans le méthanol est ajouté (1M, 300 µl). Le mélange réactionnel est agité une nuit à température ambiante. Une chromatographie sur couche mince (H2O 1/CH3CN 1,5) révèle la totalité de la réaction. La solution est ensuite neutralisée avec de la résine Amberlite IRN 120 (H+), évaporée, co-évaporée à l'eau puis lyophilisée pour donner le composé attendu 61 mg (96 %).

S. M. Haute résolution : m/z = 1191.3441 Da [M+K] + Correspondant à C42H72036K m/z = 1175.3701 Da [M+Na] + Correspondant à C42H72036Na Abréviation DP utilisée pour : degrés de polymérisation (nombre d'unité glucosyle) Couplage spectrométrie de masse/spectrométrie de masse : Ions fils de (M+Na) + :-1012, 8 Da (DP6+Na) + 850, 6 Da (DP5+Na) + 688, 9 Da (DP4+Na) + 526, 9 Da (DP3+Na) + - 347,1 Da (DP2+Na) + -203, 2 Da (DP1+Na) + RNM 1H : (400 MHz, Dz0 (4,65 ppm), 298 K)

-Hl oc14 (trois massifs) : 5, 23 ppm, 5,19 ppm, 5,149 ppm ; d ; J12= 4 Hz ; - Hla : 5,073 ppm ; J12 = 3, 6 Hz et 5,028 ppm ; J12 = 4 Hz ; -H1 α16 : 4, 808 ppm ; d ; J12= 3,2 Hz ; - Hip : 4,491 ppm, d ; J12 = 8 Hz ; 3,9-3, 4 ppm ; massif ; tout proton non cité - H4 des unités non-réductrices : 3,249 ppm ; t ; J32 = 9,6 Hz -H2p : 3, 114 ppm ; t ; J32 # J12 RMN 13C: (400 MHz, D20, 298 K) - 100, 38 ; 100,09 ppm : Cl de liaisons al4 ; - 98, 92 ppm : C1 de liaison al 6 ; - 96, 09 ppm : Cl (3 ; - 92, 21 ppm : Cla ; - 79, 139 ; 78, 25 ; 78,06 ; 77,85 ; 77,73 ; 77,14 ; 77,00 ; 76,42 ; 74,98 ; 74,25 ; 73,70 ; 73,48 ; 73,30 ; 73,19 ; 73,05 ; 72,07 ; 71, 98 ; 71,76 ; 71,62 ; 71,52 ; 70,65 ; 70,51 ; 70, 38 ; 69,64 ppm : tout carbone non cité (soit 28 carbones).

- 67, 83-67,67 : C6 appartenant à la liaison glycosidique al 6.

Dédoublement dû : -à la forme a et à la forme ß - ou à l'équilibre conformationnel.

- 61, 14 ; 60,90 ; 60,80 ; 60,67 ppm : C6 ne participant pas à une liaison glycosidique (6 carbones).

EXEMPLE 4 <BR> <BR> <BR> <BR> a) Préparatioin du 2,3-di-O-acétyl-6-bromo-6-désoxy-α-D-glucopyranosyl-(1#4) - 1, 2, 3,6-tétra-O-acétyl-ß-D-glucopyranose

A une solution du composé de l'exemple la) (5g ; 7,86 mmol) dans la pyridine (54 ml) de la triphénylphosphine (PPh3 ; 4 g ; 2 éq) et du tétrabromure de carbone (CBr4 ; 2,57 g, 1,02 éq) sont additionnés à 0°C. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes à 0°C puis 3 heures à 50°C. Une chromatographie sur couche mince (EtOAc 1/EP 1) montre la disparition du produit de départ. Du méthanol (5 ml) est alors ajouté. Le milieu réactionnel est évaporé puis co-évaporé avec du toluène. Le composé attendu est obtenu par purification par chromatographie rapide (4 : 2 g, 84 %).

RMN IH (300 MHz, CDC13) : 5,68 (H1I ; d ; J1, 2 = 8,22 Hz) ; 5,31 (H1II ; d ; J1, 2 = 3, 83 Hz) ; 5,24 (H3I ; t ; J3, 4 = 8,7 Hz) ; 5,15 (H3" ; t ; J2, 3 # J3,4 #10, 2 Hz) ; 4,84 (H2I ; t ; J2, 3 = 9,14 Hz) ; 4,66 (H2II ; dd ; J2,3 = 10,3 Hz) ; 4,46 (H6a' ; dd ; J5,6as = 2,4 Hz ; J6a, 6b = 12, 2 Hz) ; 4,17 (H6bI ; dd ; J5, 6a = 4,7 Hz ; J6a,6b = 12,2 Hz) ; 3,96 (H4I ; t ; J4, 5= 9.6 Hz) ; 3,79-3, 75 (H5I ; H5II) ; 3,68- 3,53 (H4 ; H6aII ; H6bII ; m) ; 2,06-2, 03-2,02-1, 99-1,96-1. 95 (CH3CO ; s ; 18 H) ; RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 171, 13-168, 78 (COCH3) ; 95,67 (C1I) ; 91,18 (Cln) ; 74,96- 73,12-72, 44-71, 73-71, 28-70, 82-70,72-70, 14 (C2I, C3', C4I, C5', C2II, C3n, C4°, C5") ; 62,61 (C6) ; 32,66 (C6u) ; 20,75-20, 38 (COCH3).

S. M. (DCI) : m/z = 674 Da (M+NH4) + I et IN se réfèrent aux unités glycosidiques représentées ci-dessus à la formule A4. b) Préparation du fluorure de 2, 3-di-O-acétyl-6-bromo-6-désoxy-α-D-glucopyranosyl- (1#4)-2, 3, 6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyle

La réaction s'effectue à 0°C dans un récipient en plastique.

L'hexa-acétate obtenu à l'étape précédente (2,041 g ; 3,11 mmol) est dissous dans une solution de fluorure d'hydrogène dans la pyridine (7 : 3 ; v/v ; 20 ml). Après une demi-heure d'agitation, le mélange réactionnel est dilué au dichlorométhane puis versé sur une solution glacée d'ammoniaque 3M.

Après décantation la phase organique est lavée deux fois avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium glacée. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée à l'aide d'un évaporateur rotatif.

Une chromatographie rapide (EtOAc 2/EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine permet d'obtenir le fluorure attendu (1,71 g ; 90 %).

RMN Hl (300 MHz, CDC13) : 5,59 (H1 ; dd ; JHz, 2 = 2,93 Hz ; JH, F= 53,3 Hz) ; 5, 47 (H3I ; dd ; J3, 4 = 8, 8 Hz) ; 5,34 (Hl ; d ; JH,, 2 = 3,6 Hz) ; 5,15 (H3° ; dd ; J3,4 = 9,14 Hz) ; 4, 76 (H2I ; ddd ; J2, 3 = 10,23 Hz ; JH,F # 23 Hz) ; 4,73 (H2II ; dd ; J2,3 = 10,6 Hz) ; 4,51 (H6aI ; dd ; J5, 6a = 2,2 Hz ; J6a, 6b=12,4) ; 4,17 (H6bI ; dd ; J5, 6b =4,02 Hz) ; 4,10 (H5I ; m) ; 3,99 (H4I ; t ; J4,5 # 9, 8 Hz) ; 3,75 (H51l ; m) ; 3,6-3, 48 (H4' ; H6all ; H6bII ; m) ; 2,07-2, 02-2,01-2, 0-1,97-1, 96 (18 H COCH3).

RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 171,33-169, 76 (COCH3) ; 103,54 (Cl' ; d ; JC, F=227, 8 Hz) ; 95,70 (Cln) ; 71,80-71, 31-70,7-70, 35-70,06 (C21, C31, C4', C5I, C2II, C3II, C4II, C5II) ; 62,17 (C6) ; 32,71 (C6°) 20,9-20, 36 (COCH3).

I et II se réfèrent aux unités glycosidiques représentées ci-dessus à la formule B4. c) Préparation du fluorure de 2, 3-di-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy-4-0- <BR> <BR> tétrahydropyranyl-α-D-glucopyranosyl-(1#4)-2,3,6-tri-O-ac� �tyl-α-D-glucopyranosyle

Le composé obtenu à l'étape précédente (1,725 g ; 2,79 mmol) est dissous dans du dichlorométhane distillé (95 ml). Du dihydropyrane (1,4 ml) est ajouté ainsi que de l'acide camphorsulfonique (50 mg). Le mélange réactionnel est agité 2 heures à température ambiante puis lavé avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée. Après purification par chromatographie rapide (EtOAc 1/EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine. Le composé attendu est obtenu sous forme de mélange de diastéréoisoméres (1,8 g ; 95 %).

RMN : pas d'interprétation, mélange de diastéréoisomères.

S. M. (DCI) : m/z = 718 Da (M+NH4) + <BR> <BR> <BR> d) Préparation du fL'uorure de 6-bromo-6-désoxy-4-0-tétralzydropyranyl-a-D-<BR> <BR> <BR> <BR> glucopyranosyl-(l -4)-a-D-glucopyranosyle Le composé per-acétylé obtenu à l'étape précédente (1 g ; 1,42 mmol) est dissous dans du méthanol (20 ml). Une solution de méthylate de sodium dans le méthanol (1M ; 200 u. l) est ajoutée. Après agitation 30 minutes à température ambiante le mélange réactionnel est refroidi à 0°C puis neutralisé avec de la résine Amberlite IRN 120 H+. Après filtration le composé est concentré, repris dans l'eau et lyophilisé (683 mg ; 98%).

Ce composé est utilisé sans autre purification.

Sous forme lyophilisé, ce fluorure est stable à-18°C.

S. M. (FAB) : m/z = 513 Da (M+Na) + EXEMPLE 5 Préparation du 2,3, 4-tri-O-acétyl-6-bromo-6-désoxy-α-D-glucopyranosyl-(1#4)- 2, 3,6- <BR> <BR> tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl-(1#4) 2,3,6-tri-O-acétyl--α-D-glucopyranoside de méthyle

Du fluorure obtenu à l'exemple 4d) (80 mg ; 0,163 mmol) et de l'a-D-glucopyranoside de méthyle (94, 8 mg ; 3 éq) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (7 ml ; 0,1 M ; pH=7, 0). De la cGTase en quantité catalytique est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé à 40 °C pendant 14 heures puis chauffé à 100°C pendant 5 minutes. La protéine est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide acétique à 50% jusqu'à pH # 4 et agité pendant 1 heure. Le mélange est ensuite neutralisé par ajout d'une solution ammoniaque à 10 % puis évaporé. Le résidu est co-évaporé 3 fois à l'eau, lyophilisé puis acétylé une nuit à 70°C dans un mélange pyridine/anhydride acétique (1,5 : 1, v/v, 16 ml).

Du méthanol (7 ml) est additionné à 0°C pour neutraliser l'excès d'anhydride acétique. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au CHaClz, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au CH2C12 (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2S04.

Le composé attendu est obtenu par chromatographie rapide (éluant : éther éthylique) (118 mg, 75 %).

RMN Hl (300 MHz, CDC13) : 5, 48 (H3I ; dd ; J2, 3= 10.1 Hz ; J3, 4= 8,17 Hz) ; 5, 38 (H1III ; d ; Jl, 2 = 3, 9 Hz) ; 5, 37 (H3" ; dd#t * ; J3, 4 = 8.32 Hz) ; 5,32 (H3III ; dd ; J3, 4 = 9,61 Hz) ; 5,25 (H1II ; d, Jl, 2 = 4,08 Hz) ; 4,98 (H4III ; dd#t *, J3, 4 = 9, 04) ; 4,79 (H1I ; d, Jl, 2 = 3, 5 Hz) ; 4, 79 (H21II ; dd ; J2, 3 = 10,4 Hz ; ) ; 4,72 (H2I ; dd ; J2, 3 = 10, 1 Hz) ; 4,70 (H2n ; dd ; J2, 3 = 10,5 Hz) ; 4, 45 ; 4.41 (H6al ; H6aII ; dd ; Js, 6a= 2,5 Hz ; J6a, 6b=12,24) ; 4, 28 ; 4,19 (H6bI ; H6blI ; dd ; J5, 6b =3,5 et 3.2 Hz) ; 3,9 massif (H4I ; H4' ; H51 ; H5II ; HSIII ; 5H) ; 3,38 (CH3 ; s) ; 3,38 +/-0,05 ppm massif (H6a ; H6bIII) ; 2,13-1, 94 (27 H, COCH3).

(* dd # t : doublet de doublet pratiquement triplé).

RNM 13C (300 MHz, CDC13) : 171,2-168, 7 (COCH3) ; 96,58 (Cl) ; 95,57-95, 42 (C1II, Clm) ; 73,72-72, 86 (C4I, C41I) ; 72,56 (C3) ; 71, 58 (C3II) ; 71,23 (C2) ; 70,53 (C4) ; 70,34-70, 12 (C2II, C2m) ; 69,09-69, 04-68,98-67, 52 (C5I, C5'I, C#III, C5) ; 62,96- 62,53 ("C6I, C6) ; 55,27 (CH3) ; 31,15 (C6) ; 21-20,38 (COCH3).

I, II et ni se réfèrent aux unités glycosidiques représentées ci-dessus à la formule A5.

M. S. (FAB) : m/z = 983 (M+Na) + EXEMPLE 6 Préparation d'un pullulane modifié par condensation d'unités maltosyle au niveau des positions 4 des unités glycosidiques Etape a) Du pullulane (50 mg) et du fluorure obtenu à l'exemple le) (63,4 mg : 1,5 éq. ) sont mis en solution dans du tampon phosphate (5 ml ; 0,1 M ; pH = 7,0). De la cGTase (en quantité catalytique) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 2 heures à température ambiante. Une chromatographie sur couche mince (CH3CN 4 / H2O 1) révèle la conversion totale du fluorure. Le mélange réactionnel est précipité dans 200 ml d'éthanol (95%). Le précipité est récupéré par centrifugation et séché une nuit sous vide. On obtient ainsi 65 mg soit un taux de substitution d'environ 37 %.

Etape b) Le polymère obtenu à l'étape précédente (21 mg) est dissous dans une solution d'acide chlorhydrique 10-2 M (2 ml). Le mélange réactionnel est agité 2 heures à température ambiante. Le mélange est ensuite neutralisé par ajout d'ammoniaque puis précipité dans l'éthanol. Après centrifugation le polymère est séché sous vide. On isole ainsi 15 mg.

Le degré de substitution est déterminé par méthylation suivant la méthode Hakomori.

Le polymère méthylé ainsi obtenu est hydrolysé en milieu acide. Les monosaccharides obtenus sont réduits puis acétylés. Le mélange obtenu est analysé en couplage chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse.

Unités glycosylées : Aire de 1-O-acétyl-2, 3,4, 6-tetra-O-méthylhexytol : 17190 Unités non-glycosylées : Aire de : 1, 6-di-O-acétyl-2, 3, 6-tri-O-méthylhexytol : 29163 Degré de substitution : 37%

Les spectres RNM 1H des polymères des exemples 6a) et 6b) sont comparés avec celui du pullulan.

Spectre du pullulan :-Hl al4 (2 pics) : 5, 27 ; 5,23 ppm ; int* = 2 ; - DH1α16 : 4,83 ppm ; int* = 1 ; - 3, 9-3,4 ppm ; massif ; tout proton non cité : intégrale théorique : 18 intégrale mesurée : 18,5 Polymère de l'exemple 5a) : al a14 (2 pics) : 5,26 ; 5,24 ppm ; int* = 2, 56 ; Hi al 6 (massif) : 4, 83 ppm ; int* = 1 ; - 3, 9-3,4 ppm ; massif ; tout proton non cité ; - 1, 71-1,42 ppm ; 2 pics, int *=1, 66, groupe tétrahydropyranyle Polymère de l'exemple 5b) :-Hi cd4 (2 pics) : 5, 26 ; 5,24 ppm ; int* = 2, 56 ; - H1α16 (massif) : 4,83 ppm ; vint* = l ; - 3, 9-3,4 ppm ; massif ; tout proton non cité : - 1,71-1,42 ppm ; 2 pics, int * = 1.66 résultat de l'intégration EXEMPLE 7 a) Préparation du (2, 3, 6-tri-O-acétylo-4-O-tétrashydropyranyl-α-D-glucopyranosyl )- (1-4)-S- (2, 3, 6-tri-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)- (I- 4)-2, 3, 6-tri-O-acétyl-thio-α-D- glucopyranoside de triphénylméthyle A une solution du fluorure E1 préparé à l'exemple le) (50 mg ; 0,12 mmol) et du thio-a- D-glucopyranoside de triphénylméthyle (62 mg ; 1,2 éq. ) dans du tampon phosphate (3

ml ; 0,1 M ; pH=7, 0), de la CGTase (207 Ill) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé à 40'C pendant 2 heures, lyophilisé, repris dans un mélange pyridine/anhydride acétique (10 ml ; 1/1 ; v/v) et une quantité catalytique de DMAP est ajouté. Le mélange est agité à 70°C pendant 12 heures, neutralisé à froid par ajout de méthanol à 0°C (5 ml) et évaporé. Le résidu est repris dans le dichlorométhane lavé à l'eau puis avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est récupérée, séchée sur sulfate de sodium anhydre, évaporée et co-évaporée au toluène. Le mélange de diastéréoisomères est purifié par chromatographie rapide (EP 1/EtOAc 1) (127 mg ; 86%).

S. M. haute résolution (ES+):C60H72O25NaS [M+Na]+ Calculé : m/z = 1247, 3981 Trouvé : m/z = 1247, 3989 RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 170,69-170, 59-170,32-169, 78-169, 49-169, 39- 169,32-169, 20 (COCH3) ; 144,35 (CIv aromatiques) ; 129,79-127, 80-126,94 (CH aromatiques) 101,14-100, 67 (C acétalique du tétrahydropyrane R et S) ; 95,77-95, 65 (Cl',, Clm) ; 81,66 (Cl) ; 76,58-75, 28-73,93-73, 57-72,59-72, 42-71, 78-71, 56- 70,36-70, 26-69,79-69, 60-69,25-68, 76 (C2', C31, C4I, C51, C2II, C3II, C4, C5 n, C2III, C3III, C4III, C5III, CPh3) ; 63,91-63, 20-63,00-62, 54-62,24-62, 00 (C6', C6n, C6, R et S, C tétrahydropyranyle R et S) ; 31,05-30, 92-25,04-24, 92 (2 C tétrahydropyranyle R et S) ; 20,85-20, 75-20,66-20, 51-20,46 (COCH3) ; 20,16- 19,53 (1 C tétrahydropyranyle R et S). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> b) Préparation du (2,3,4,-Tétra-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl)-(1#4)-(2,3,6-t ri-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> O-acétyl-α-D-glucopyranosyl)-(1# 4) -2,3, 6-tri-O-acétyl-12-S-acétyl-1-thio-α-D- glucopyranose

A du composé A7 préparé à l'étape précédente (81 mg ; 66, 2 jumol) dissous dans du dichlorométhane (1,9 ml), sont additionnés du triéthylsilane (Et3SiH ; 35, 8 µl ; 225, mol) et de l'acide trifluoroacétique (1,2 ml). Le mélange est agité 45 minutes à température ambiante puis évaporé. Le résidu est repris dans de la pyridine anhydre (2 ml) et de l'anhydride acétique (1,5 ml) ainsi qu'une quantité catalytique de DMAP sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité 12 heures à température ambiante puis neutralisé par ajout de méthanol (1,2 ml) à 0°C et évaporé. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (EP/EtOAc : 1-1,5) (45 mg ; 69 %).

[α]D : +183 (c = 0,27 ; Chloroforme) S. M. haute résolution (ES+) : C4oH54026SNa [M+Na] + Calculé : m/z = 1005, 2522 Trouvé : m/z = 1005, 2519 RMN 1H (400 MHz, CDCl3) : Déplacements chimiques Constantes de couplage B7 7 1 5'I i rc",, <. i i s t. 6, 09 5, 07 5, 13 3, 87 3, 95 4, 35 4, 23 5, 1 10, 3 7 9, 7 2, 6 12, 4 4, 1 9pst 5, 22 4, 72 5, 35 3, 9 3, 94 4, 42 4, 13 4, 1 10, 3 9, 6 9, 6 2, 2 12, 3 3 5, 34 4, 82 5, 32 5, 03 3, 9 4, 21 4, 01 3, 4 10, 4 9, 7 9, 7 3, 6 12, 2 2, 3 SCOCH3 : 2, 40 COCH3 : 2,14-2, 12-2, 11-2, 06-2,02-2, 00-1,99-1, 97-1,96 RMND 13C (100 MHz, CDC13) : Déplacements chimiques B7 < l 9W Jt 79, 69, 41 72, 71 71, 76 68, 94 62, 88 79, 75 69, 41 72, 71 71, 76 68, 94 62, 88 96, 02 70, 34 71, 76 68, 47 72, 47 62, 23 5, 65 70, 04 69, 34 67, 86 73, 84 61, 32

SCOCH3 : 191,51 SCOCH3 : 31,24 COCH3 : 170,3-169, 2 COCH3 : 20,41 EXEMPLE 8 a) Préparation du (2, 3, 4, 6-Tétra-O-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(1e 4)-(2, 3, 6-tri-<BR> <BR> <BR> O-acétyl-α-D-glucopyranosyl)-(1# 4)-(2,3-di-O-acétyl-6-bromo-6-désoxy-α-D-<BR> <BR> <BR> glucopyranosyl)- (1- )-1, 2, 3, 6-tétra-O-acétyl-D-glucopyranose

Du fluorure E1 préparé à l'exemple le) (250 mg ; 0,58 mmol) et du 6-bromo-6-déoxy-a- D-glucopyranosyl-D-glucopyranose (235 mg ; 1 éq. ) sont dissous dans du tampon phosphate (25 ml ; 0,1 M ; pH=7, 0). De la CGTase (750 u. l) est ajoutée et mélange réactionnel est incubé 1 heure à 40 °C puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH # 2 et agité pendant 20 minutes à température de la pièce. La solution est alors neutralisée par ajout d'ammoniaque puis lyophilisée. Le lyophilisât est dissous dans la pyridine anhydre (30 ml), de l'anhydride acétique (20 ml) et du DMAP (< lmg) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à 70°C pendant 12 heures puis l'anhydride en excès est neutralisée par ajout à de méthanol (20 ml) à 0°C. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au dichlorométhane, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au dichlorométhane (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de potassium anhydre et évaporées.

Le mélange anomère attendu est purifié par chromatographie rapide (EP/EtOAc : 3-4) (521 mg, 70%).

S. M. (Fab+) : m/z 1299 [M+Na] + Analyses élémentaires pour C24H33BrO : Calculée : C 47, 07 ; H 5,29 ; Br 6,26 Trouvée : C 47,25 ; H 5,52 ; Br 6,34 RMN IH (300 MHz, CDC13, 303°K) : 6,62 (Hll ; d, JI, 2 = 3,7 Hz) ; 5,69 (Hlip ; d, J1, 2= 8,0 Hz) ; 6,01-3, 70 (H sucre) ; 2,15-1, 93 (39 H COCH3).

RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K) : 170,56-170, 45-170,34-169, 88 (COCH3) ; 96,01 - 95, 64 (Cl', Clm, C1y) ; 91,21 (C1Iß) ; 88, 81 (Cll) ; 75,1-74, 56-73,63-73, 51- 72,89-72, 40-72,15-71, 73-70,99-70, 40-70,15-69, 97-69, 71-69, 39-69,18- 68,96 - 68,47 - 68,01 (C2I, C3I, C4I, C5I, C2II, C#II, C4II, C5II, C2III, C3III, C4III, C5III, C2IV, C3IV, C4IV, C5IV); 62,72 - 61,38 (C6I,C6III,C6IV); 33,38 (C6II); 20,77 - 20,48 (COCH3).

EXEMPLE 9 a) Préparation du α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-[α-D- glucopyranosyl-(1#4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-S-α-D-glucopyranosyl-(1# 6)]-6-<BR> <BR> thio-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-D-glucopyranose

Du S-oc-D-glucopyranosyl- (l- 6)-6-thio-a-D-glucopyranosyl- (l- 4) -D-glucopyranose (34,2 mg ; 65,7 jjmol) et du fluorure E1 préparé à l'exemple le) (94 mg ; 4 éq. ) sont dissous dans du tampon phosphate (4,6 ml ; 0,1 M ; pH=7, 0). De la CGTase (141 µl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 2 heures à température ambiante puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH 2 et agité pendant 20 minutes à température de la pièce. La solution est alors neutralisée par ajout d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium saturée puis lyophilisée. Le mélange est purifié sur colonne C. L. H. P. (colonne NHa ; éluant : CH3CN 55 H20 45) deux fractions sont récupérées FI et F2. La fraction Fl est dissoute dans l'eau (10 ml) et de la résine acide (DOWEX 50 W x 8) est ajouté. Le mélange est agité 8 heures à température ambiante puis filtré. La phase aqueuse est lavée avec de l'acétate d'éthyle (3x) et réunie avec la fraction F2. Une lyophilisation permet d'obtenir le composé attendu (51 mg ; 66%).

S. M. haute résolution (ES+) : C42H7203sNaS [M+Na] + : Calculé : m/z = 1191, 3473 Trouvé : m/z = 1191, 3473 RMN 13C (100 MHz, D20) : 100-99,65 (C1II, C1III, C1IV, ClVI, C1VII) ; 96,21 (C1Iß) ; 92,27 (Cl'a) ; 85,69 (CVα,ß) ; 80, 44-77, 72-77, 53-77, 40-77, 19-77, 04-76, 59-74, 99- 74,41-74, 26-73,67-73, 40-73,24-73, 08-72,12-71, 89-71,74-71, 58-71,26- 71,17-70, 47-69,68 (C2I, C3I, C41, C51, C21l, C3n, C4II, C5I, C2III, C3III, C4III, C%III, C2IV, C3IV, C4IV, C5IV C2v C3V C4V C5V C2VId, C3, C4, C5VI, C2, C3, C4, C5VII); 612,42-61 (C6I, C6III, C6IV, C6V, C6VI, C6VII); 31,05 (C6II).

EXEMPLE 10 a) (2,3, 4, 6-Tétra-(O-acétyl-α-D-glu7copyranosyl)-(1# 4)-(2, 3, 6-tri-0-acétyl-a-D- <BR> <BR> glucopyranosyl)-(1# 4)-(2,3-di-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl-6-bromo-6-désoxy-) -<BR> <BR> <BR> (1# 4)-(2,3,6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl)-(1# 4)-2,3,6-tri-O-acétyl-α-D- glucopyranoside de méthyle

Du composé D4 préparé à l'exemple 4d) (100 mg ; 0,20 mmol) et de a-D- glucopyrannoside de méthyle (43,5 mg ; 1,1 éq. ) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (3,7 ml ; 0,1 M ; pH=7, 0). De la CGTase (130 ul) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 15 heures à 40 °C puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH # 2 et agité pendant 20 minutes à température de la pièce. La solution est alors neutralisée par ajout d'ammoniaque et du fluorure E1, préparé à l'exemple le) (112 mg ; 1,3 éq) en solution dans le tampon (1 ml) ainsi que de la CGTase (129 p. l) sont ajoutés. Le mélange

est incubé 2 heures à température ambiante puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH # 2 et agité pendant 20 minutes. La solution est alors neutralisée par ajout d'ammoniaque. Le lyophilisât est dissous dans la pyridine anhydre (20 ml), de l'anhydride acétique (10 ml) et du DMAP (< lmg) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à 70°C pendant 12 heures puis l'anhydride en excès est neutralisée par ajout à de méthanol (10 ml) à 0°C. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au CH2C12, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au CH2C12 (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2S04 et évaporées. Une purification par chromatographie rapide (Et20 puis Et20 10 Acétone 1) permet d'obtenir le composé A10 (161 mg ; 52%).

[α]D : +105 (c = 0,25, Chloroforme) S. M. haute résolution (ES+) : C6lH83BrO4oNa [M+Na] + Calculé : m/z =1557, 3542 Trouvé : m/z = 1557, 3542 RMN'H (400 MHz, CDC13) : Déplacements chimiques Constantes de couplage A10 . k a '., a. a I rY- 1 , H1 , H2,, : I3 H4. H''5, Ta b J12 , 23 a <-J3-J45, Ta..-ab., J5b 4, 82 4, 75 5, 51 3, 95a 3, 97a 4, 45 4, 30 3, 6 10, 1 9, 0 7, 0 3, 3 12, 3 2, 8 5, 29 4, 70 5, 39 3, 89 4, 00 4, 49 4, 25 4, 1 10, 3 9, 2 9, 4 3, 3 12, 6 4, 0 5, 30 4, 72 5, 40 3, 96a 3, 98a 3, 74a 3, 70a 4, 2 10, 3 8, 6 7, 5 2, 1 11, 5 <1 + 5, 33 4, 73 5, 35 3, 97 3, 90 4, 22 4, 01 4, 2 10, 3 8, 7 9, 6 3, 8 12, 4 3, 1 +e ;, 540 4, 84 5, 36 5, 05 3, 90 4, 56 4, 23 4, 0 10, 6 9, 5 10, 3 2, 7 12, 3 3, 5 a : Protons dégénérés ; * : Indétermination entre les deux unités sucre OCH3 : 3,41 COCH3 : 2,17-2, 16-2,14-2, 07-2,07-2, 04-2,02-2, 01-2, 00-1,98-1, 97-1,96 RMNi3C (100 MHz, CDC13) : 170,45-169, 56 (COCH3) ; 96,58-95, 87-95,65-95, 53 (Cl, Cl, Cl, Cl'v, Cl) ; 74,18-76, 79-73,67-72, 64-72,34-71, 73-71,26-

70, 36-69, 97-69, 40-69, 11-68, 94-68, 77-68, 45-67, 98-67, 54 (C2, C3, C4I, C5I, C2) C3I, C4II, C5II, C2III, C3III, C4III, C5III, C2IV, C3IV, C4IV, C5IV, C2V, C3V, C4V, C5V); 63,00-62, 71-62, 56-61,36 (C61, C611, C6IV, C6V) ; 55,33 (OCH3) ; 33,45 (C6) ; 20,83- 20,51 (COCH3).

EXEMPLE 11 a) Préparation du 2, 3, 6-Tri-O-acétyl-a-D-galactopyranosyl-(1 4)-1, 2, 3, 6-tétera-* D-glucopyranose Du composé B1, préparé à l'exemple lb) (202 g ; 0,32 mmol) est dissous dans du dichlorométhane anhydre (8, 6 ml) et de la pyridine (860 J. l) est ajoutée. La réaction est refroidis à 0°C et de l'anhydride triflique (143 µl) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes et lavé à froid avec : de l'eau, une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et avec une solution acide d'hydrogénosulfate de potassium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le résidu est repris dans du diméthylformamide distillé (12 ml) et du nitrite de tétrabutylammonium est jouté (922 mg). Le mélange réactionnel est agité pendant 12 heures à température ambiante, dilué avec de l'acétate d'éthyle puis lavé successivement avec une solution de chlorure de sodium saturée et à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (1. EtOAc 1 EP1 ; 2. EtOAc 1,5 EP 1) (192 mg ; 95%).

[α] D : +73,3 (c = 1 ; Chloroforme) S. M. haute résolution (ES+) : C26H360i8Na [M+Na] + Calculé : m/z = 659,1799 Trouvé : m/z = 659, 1813 S. M. haute résolution (ES+) : C26H360igK [M+K] + Calculé : m/z = 675,1539 Trouvé : m/z = 675, 1542

RMN IH (300 MHz, CDC13, 303°K) : 5,70 (H1I ; d ; Jl, 2 = 8,2 Hz) ; 5,38 (H1I ; d ; Jl, 2 = 3,6 Hz) ; 5, 38 (plu ; Jl, 2 = 3,7 Hz) ; 5,24 (H3I ; dd t ; J2, 3 # J3, 4 # 9,3 Hz) ; 5, 18 (H3a ; H2II ; dq) ; 4, 94 (H2I ; dd t ; J2, 3 9,3 Hz) ; 4,45 (H6aI ; dd ; Js, 6a = 2,4 Hz ; J6a, 6b = 12,2 Hz) ; 4, 31 (H6an ; dd ; Js, 6a = 6, 76 Hz ; J6a, 6b = 11,3 Hz) ; 4,15 (H6bI ; dd ; Js, 6b = 5,11 Hz) ; 4,11 (H6bII ; dd ; J5, 6b = 3,66 Hz) ; 4,07 (H4II ; m) ; 3,99 (H4I ; dd ; J4, 5 = 8,59 Hz) ; 3,96 (H5II ; m) ; 3,78 (H5I ; m) ; 2, 08-2, 07-2,06-2, 02-1,98-1, 97 (CH3CO ; s ; Intg = 21 H).

RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K):128 170, 84-170, 69-170, 39-170,03-169, 78- 169, 54-168, 75 (COCH3) ; 96,26 (C1II) ; 91,26 (Cl) ; 75, 26-73, 25-72, 20-70, 97- 69, 13-68, 64-67, 34-67, 17 (C2, C3I, C4I, C5I, C2, C3, C4, C5II) ; 62, 71-62, 29 (C6I, C6II) ; 20,75-20, 71-20, 65-20, 61-20, 44 (COCH3). b) Préparation du 4-Azido-4-désoxy-2,3,6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl-(1 # 4)- 1, 2,3, 6-tétra-O-acétyl-ß-D-glucopyranose Le composé All, préparé à l'exemple lla) (110 mg ; 0,17 mmol) est dissous dans du dichlorométhane anhydre (4 ml) et de la pyridine (400 µl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est refroidi à-15°C est de l'anhydride triflique (70 µl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à-15°C puis 2 heures à température ambiante. Le mélange est alors lavé à froid avec : de l'eau, une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et avec une solution acide d'hydrogénosulfate de potassium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le résidus est repris dans du diméthylformamide distillé (0,9 ml) et de l'azoture de sodium (64 mg) est ajouté.

Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures puis dilué avec de l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau, séché sur sulfate de sodium anhydre et évaporé. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (EtOAc/EP : 4-1) (102 mg ; 91%).

[UID : +181 (c = 1 ; Chloroforme)

S. M. haute résolution (ES+) : C26H3sN30mNa [M+Na] + Calculé : m/z = 684, 1864 Trouvé : m/z = 684, 1863 S. M. haute résolution (ES+) : C26H35N3O17K [M+K]+: Calculé : m/z = 700,1604 Trouvé : m/z = 700, 1591 RMN 1H (300 MHz, CDC13, 303°K) : 5,70 (pli ; d ; Jl, 2 = 7,8 Hz) ; 5,32 (H3,, ; dd 3 t ; J3, 4 = 9,7 Hz) ; 5,31 (H1II ; d) ; 5,25 (H3I ; dd t ; J2,3 = 8, 2 Hz) ; 4,93 (H2I ; dd # t ; J2, 3 = 9,5 Hz) ; 4,77 (H21l ; dd ; Jl, 2 = 3,8 Hz ; J2,3 = 10,4 Hz) ; 4,40 (H6a* ; dd ; Js, 6a = 3 Hz ; J6a, 6b = 12, 2 Hz) ; 4,30 (H6a* ; dd ; Js, sa = 2,1 Hz ; J6a, 6b = 12,2 Hz) ; 4,19 (H6b* ; dd ; Js, 6b = 3, 66 Hz) ; 4,15 (H6b* ; dd ; Js, 6b = 4, 38 Hz) ; 3,95 (H4I ; dd ; J4, 5 = 10,1 Hz) ; 3,79 (H5I ; m) ; 3, 70 (H5I, m) ; 3,56 (H4II ; dd # t ; J4,5 = 10, 4 Hz) ; 2,08-2, 07-2,06-2, 02-1, 98-1, 97 (CH3CO ; s ; intg 18 H).

* : indétermination entre l'unité I et IL RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K) : 170,67-170, 32-169, 91-169,56-169, 41- 168,70 (COCH3) ; 95,97 (Cl',) ; 91,26 (C1I) ; 75,16-73, 05-72,71-70, 92-70,16- 69, 94-68, 98 (C2I, C3I, C4I, C5, C2, C3, C5) ; 62, 46-62, 32 (C6I, C6II) ; 60,04 (C4II) ; 20,73-20, 58-20,48 (COCH3). <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> c) Préparation du Fluorure de 4-Azido-4-désoxy-2, 3, 6-tri-O-acétyl-a-D- glucopyranosyl-(1# 4)-2, 3, 6-tri-o-acétyl-α-D-glucopyranosyle La réaction s'effectue à 0°C dans un récipient en plastique.

Du composé Bll préparé à l'exemple llb) (100 mg, 0,15 mmol) est dissous dans une solution de fluorure d'hydrogène dans la pyridine (7 : 3 ; v/v ; 3 ml). Après une demi-heure d'agitation, le mélange réactionnel est dilué au dichlorométhane puis versé sur une solution glacée d'ammoniaque 3M.

Après décantation la phase organique est lavée deux fois avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium glacée. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée à l'aide d'un évaporateur rotatif.

Une chromatographie rapide (EtOAc/EP : 1-1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine permet d'obtenir le fluorure attendu (71 mg ; 75%).

[α] D : +112 (c = 0,3 ; Chloroforme) S. M. haute résolution (ES+) : C24H32FN3O15Na [M+Na] + Calculé : m/z = 644, 1715 Trouvé : m/z = 644, 1720 S. M. haute résolution (ES+) : C24H32FN3O15K [M+K]+: Calculé : m/z = 660, 1455 Trouvé : m/z = 660, 1470 RMN 1H (300 MHz, CDC13, 303°K) : 5,61 (Hll ; dd ; Jl, 2 = 2,7 Hz ; JI, F = 53,2 Hz) ; 5,50 (H3I ; dd ; J2,3 = 10, 1 Hz ; J3,4 = 9,0 Hz) ; 5,35 (H1II ; d) ; 5,33 (H3° ; dd t ; J3,4 = 9,9 Hz) ; 4,80 (H2' ; ddd ; J2, F = 26,7 Hz) ; 4,78 (h2II ; dd ; Jl, 2 = 4,0 Hz ; J2, 3 = 10,4 Hz) ; 4,40 (H6aI ; dd ; Js, 6a = 2, 2 Hz ; J6a, 6b = 12,4 Hz) ; 4,31 (H6aII ; dd ; Js, 6a = 2,2 Hz ; J6,, 6b = 12, 4 Hz) ; 4,21 (H6bII, J5, 6b = 3,5 Hz) ; 4,16 (H6bI ; J5,6b = 3,8 Hz) ; 4,13 (H5I ; m) ; 3,95 (H41 ; dd # t ; J4, 5= 9,7 Hz) ; 3,70 (H5II ; m) ; 3,58 (H41l ; dd # t ; J4, 5 = 10, 4 Hz) ; 2,12-2, 10-2,07-2, 04-1,99 (CH3CO ; S ; intg = 18 H).

RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K) : 170,23-170, 03-169,59-169, 42 (COCH3) ; 103,56 (Cl' ; d, JC, F = 229,3 Hz) ; 95,89 (C1II) ; 71, 88-71, 71-70, 70-70, 38-70, 28- 70, 23-70, 16-69, 89-69, 01 (C2I, C3, C4I, C5, C2II, C3, C5) ; 62, 22-61, 98 (C6, C6II) ; 60,0 (C4I) ; 20, 80-20, 70-20,53-20, 43 (COCH3). d) Préparation du Fluorure de 4-Azido-4-désoxy-α-D-gloucopyranosyl-(1# 4)-α-D- glucopyranosyle

Du composé Cl l, préparé à l'étape précédente (34 mg ; 51,5 jjmol) est dissous dans du méthanol (10 ml). Une solution de méthanolate de sodium dans le méthanol (1M ; 100 al) est ajoutée. Après 4 heures d'agitation à température ambiante le mélange réactionnel est refroidi à 0°C puis neutralisé avec de la résine Amberlite IRN 120 H+. Après filtration le composé est concentré, repris dans l'eau et lyophilisé (19 mg ; 100 %). Ce composé est utilisé sans autre purification.

[α]D: +154 (c = 0,87 ; eau) S. M. haute résolution (ES+) : C12H2-0FN3O9Na [M+Na] + : Calculé : m/z 3 92, 1081 Trouvé : m/z 392, 1081 RMN 1H (400 MHz, D20) : Déplacements chimiques Constantes de couplage Cil i s il I2.. H3 ; t I. H5 ET36a Hbb v ; l J 3 4S d5av Jab : :. JSb,. Jl'. : :, Z, C11 5, 54 3, 50 3, 85 3, 61 3, 79 3, 71 3, 64 2, 8 9, 9 9, 4 9, 9 2, 1 12, 6 1 4, 2 53, 3 9 ,. s : ;. 5, 30 3, 50 3, 68 3, 30 3, 54 3, 59 3, 55 3, 9 9, 9 102 10. 1 ff. r

RMN 13C (100 MHz, CDC13) : 107,46 (C1I ; d, JC, F = 229,4 Hz) ; 100,14 (C1II) ; 76, 02- 73,19-72, 94-72,30-71, 97-71,55-71, 33-71,09 (C2I, C3, C4I, C5, C2, C3II, C5II) ; 61,90-60, 97 (C61, C6u) ; 60,34 (C4").

EXEMPLE 12 <BR> <BR> a) Préparation du (2,3,6-Tri-O-acétyl-4-azido-4-désoxy-α-D-glucopyranosyl)- <BR> <BR> (1# 4)-(2,3,6-tri-O-acétyl-α-D-glucopyranosyl)-(1# 4)-(di-O-acétyl-6-bromo-6-désoxy- α-D-glucopyranosyl)-(1# 4)-1, 2, 3,6-tétra-O-acétyl-D-glucopyranose

Du fluorure Dll, préparé à l'exemple lld) (90,9 mg ; 0,25 mmol) et du 6-bromo-6- désoxy-a-D-glucopyranosyl- (l- 4) -D-glucopyranose (90,9 mg ; 0,22 mmol) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (0,1 M ; pH = 7 ; 9 ml) et de la CGTase (270 u. l) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 3 heures à température ambiante puis lyophilisé. Le solide est repris dans de la pyridine distillée (10 ml) et de l'anhydride acétique est ajouté (10 ml) ainsi qu'une quantité catalytique de 4, 4-diméthylaminopyridine (DMAP ; 1 mg). La réaction est agitée 12 heures à 70 °C puis le milieu réactionnel est refroidi et l'anhydride en excès est détruit par addition lente de méthanol à 0°C (5 ml). Le mélange est agité 20 minutes à température ambiante puis concentré. Le résidu est repris au dichlorométhane, lavé avec une solution d'hydrogénosulfate de potassium, une solution d'hydrogéno-carbonate de sodium et de l'eau. La phase organique est récupérée, séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (Et2O) (200 mg ; 71 %).

S. M. haute résolution (ES+) : C4gH64BrN3031Na [M+Na] + Calculé : m/z 1089, 3234 Trouvé : m/z= 1089, 3233 RMN 1H (400 MHz, CDC13) : Déplacements chimiques Constantes de couplage .. ° E :, _ 4,.,. A12 : Hl'.. FI2. : H3, Ïi4...- ; 5., fi6a.. T36b : . J12 vT23, v=J34''lJ45 JSa.. Jab'i, JSbe'. A12 , a.< 6, 22 4, 93 5, 48 4, 00 4, 11 4, 48 4, 26 3, 7 10, 0 8, 9 9, 8 2, 7 12, 4 3, 9 5, 74 4, 94 5, 26 3, 99 3, 85 4, 45 4, 28 8, 0 9, 2 8, 4 9, 9 3, 2 12, 4 4, 5 Hiß. t. 5, 31 4, 74 5, 42 3, 99 3, 98 3, 76 3, 68 3, 8 10, 1 ;, ßS-5, 33 4, 72 5, 39 3, 97 3, 98 3, 76 3, 68 4, 1 10, 1 8, 9-5, 0 11, 5 i 11 tX 5, 30 4, 72 5, 33 3, 91 3, 90 4, 53 4, 15 4, 2 10, 0 9, 2--12, 5 3, 4 5, 35 4, 78 5, 35 3, 59 3, 68 4, 30 4, 20 4, 1 10, 2 10, 0 10, 4 3, 2 12, 4 4, 0

CH3CO : 2,20-2, 14-2,13-2, 11-2, 08-2,04-2, 01-2, 00-1,99-1, 98-1, 96.

RMN 13C (100 MHz, CDC13) : 170,82-170, 56-170,36-169, 99-169,53 (COCH3) ; 96,01-95, 84-95,56 (C1, C1, C1) ; 91,21 (C1Iß) ; 88, 82 (C1Iα) ; 75, 17-74, 42- 73.54-73. 34-72,93-72, 40-72,17-71, 69-71,10-70, 97-70,33-70, 14-70,00- 69,73-69, 17-68, 87 (C2I, C3', C4, C5, C2II, C3, C4II, C5II, C2, C3, C4, C5, C2N, C3N, C5W) ; 62, 57 - 62. 21 (C6I, C6E, C6y) ; 59,99 (C4IV), 33,44 (C6u) ; 20, 84- 20,53 (COCH3).

EXEMPLE 13 a) Préparation du 4-Azido-4-désoxy-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-d glucopyranosyl- (1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-D- glucopyranose

Du fluorure Dll, préparé à l'exemple lld) (10 mg ; 27,1 pmol) est dissous dans du tampon phosphate (50 mM ; pH = 7 ; 95 ul) et du méthanol (156 Ill) ainsi que de l'α- amylase d'Aspergillus oryzae en solution dans le tampon (54 U ; 51 µl) sont ajoutés. Le mélange est incubé à température de la pièce pendant 2 heures puis chauffé à 100 °C pendant 5 minutes et filtré. Le mélange est concentré et co-évaporé à l'eau. Le composé attendu est purifié sur Sep-pack Cl 80 (15 mg ; 65%).

S. M. haute résolution (ES+) : C30H51N3O25Na [M+Na]+ Calculé : m/z 876, 2709 Trouvé : m/z = 876, 2713

RA4NiH (300 MHz, D20, 303°K) : 5,30-5, 25 (H1II, H1III, H1IV, H1V ; m) ; 510 (H1I ; d ; 3,7 Hz);d 4,35 (H1Iß; d; 8,0 Hz); 3,87-3,42 (H2Iα H2I, H2III, H2IV, H2V, H3IH3II, H3III, H3IV, H3V, H4IH4II, H4III, H4IV, H5IH5II, H5III, H5IV, H5V, H6aIH6aII, H6aIII, H6aIV, H6aV, H6bIH6bII, H6bIII, H6bN, H6bV ; m) ; 3,15 (H2Iß. ; dd ; J2, 3 = 9,12 Hz ; 3, 32 (H4 ; dà t ; J = 9,7 Hz). b) Préparation du 4-Amino-4-désoxy-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D- glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-D- glucopyranose

Du sulfure d'hydrogène est mis à buller pendant 30 minutes dans un mélange pyridine/ eau (1 : 1 ; 3 ml) contenant le composé A13 (15 mg ; 17,6 umol). Le ballon est ensuite fermé hermétiquement et le milieu réactionnel est agité pendant 12 heures à température ambiante puis filtré, concentré et co-évaporé à l'eau. Le composé attendu est purifié sur Sep-pak Cl 80 et lyophilisé (14 mg ; 96 %).

S. M. haute résolution (ES+) : C3oHs4N02s [M+H] + Calculé : m/z = 828, 2983 Trouvé : m/z = 828, 2985 RMN'H (300 MHz, D2O, 303°K) : 5,32-5, 26 (H1II, Hln, H1IV, Hlv ; m) ; 5,10 (Hl" ; d ; 3, 56 Hz) ; 4,52 (H1Iß ; d ; 8,0 Hz) ; 3,86-3, 41 (H2Iα H2II, H2III, H2IV, H2V, H3IH3II, H3III, H3IV, H3V, H4IH4II, H4III, H4IV, H5IH5II, H5III, H5IV, H5V, H6aIH6aII, H6aIII, H6aIV, V H6bIH6bII, H6bIII, H6bIV, H6bV ; m) ; 3,14 (H2Iß; dd ; J2,3 = 9,4 Hz ; 2,89 (H4V; dd # t ; J = 9,7 Hz).

RMN 13C (100 MHz, CDCl3) : 100,20-99,95 (C1II, C1III, C1IV, C1V) ; 96,14 (C1Iß) ; 92, 27 (C1Ia) ; 77,32-77, 18-77, 05-76,55 (CrI,Cr4II, CrIII, CrIV) ; 74,91-74, 38-73,67- 73,57-72, 29-71,91-71, 83-71,66-71, 52-70, 30 (C2I, C3I, C5I, C2II, C3II, C5II, C2, C3, C5, C2, C3, C5, C2, C3, C4, C5) ; 61,01-60, 80 (C6I, C6, C6, C6, C6) ; 52,59 (C4I). c) Préparation du 4-Désoxy-4-(6-nitrovératrylaxycarbonylamino)-a-D- <BR> <BR> glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-glucopyranosyl-(1# 4)-α-D-<BR> <BR> <BR> glucopyranosyl-(1# 4)-D-glucopyranose A du composé B13, préparé à l'exemple 13b) (10 mg ; 12.1 (Jmol) dissous dans du DMF anhydre (300 pilz est ajouté de la pyridine (5 µl). Le mélange est refroidis à 0 °C et du chloroformate de 6-nitroveratryle (3,2 mg ; 1 éq. ) ainsi qu'une quantité catalytique de DMAP sont ajoutés. Le mélange est agité 4 heures à température ambiante et du chloroformate (3,2 mg) est ajouté. Le mélange réactionnel est chauffé à 70 °C pendant 12 heures et du chloroformate (3,2 mg) est ajouté. Le mélange est alors chauffé 4 heures à 100 °C et refroidis à 0 °C. De l'acétone (3 ml) est ajouté et le précipité formé est filtré, dissous dans l'eau, purifié sur Sep-pack Cl 80 et lyophilisé (9 mg ; 70 %).

S. M. haute résolution (ES+) : C4oH62N2031Na [M+Na] + Calculé : m/z= 1089, 3234 Trouvé : m/z= 1089, 3233