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Patent Searching and Data


Title:
GENETIC INFORMATIVITY STUDY
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2009/034199
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to the use of unique individual gametes, specifically sperm, for carrying out genetic informativity studies, such as haplotype construction analysis, for use in pre-implantation genetic diagnosis, particularly in cases in which genetic alteration occurs de novo in a family or in the absence of biological samples from affected or carrier members of the same family.

Inventors:
LLEDO BOSCH BELEN (ES)
Application Number:
PCT/ES2008/000247
Publication Date:
March 19, 2009
Filing Date:
April 15, 2008
Export Citation:
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Assignee:
INST BERNABEU S L (ES)
LLEDO BOSCH BELEN (ES)
International Classes:
C12Q1/68
Foreign References:
EP1330541A12003-07-30
US6977148B22005-12-20
Other References:
ALTARESCU G. ET AL.: "Single-sperm analysis for haplotype construction of de-novo paternal mutations:application to PGD for neurofibromatosis type 1", HUMAN REPRODUCTION, vol. 21, no. 8, August 2006 (2006-08-01), pages 2047 - 2051
PENG AT EL.: "Whole genome amplification from single cells in preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis", EUROPEAN JOURNAL OF OBSTETRICS&GYNECOLOGY AND REPRODUCTIVE BIOLOGY, vol. 131, no. 1, 24 February 2007 (2007-02-24), pages 13 - 20
TUR-KASPA I. ET AL.: "Sperm DNA genotyping for preimplantation genetic diagnosis(PGD)", FERTILITY AND STERILITY, vol. 82, 1 September 2004 (2004-09-01), pages S254
DATABASE WPI Week 200239, Derwent World Patents Index; AN 2002-353134
LLEDO B. ET AL.: "Preimplantation genetic diagnosis of Marfan syndrome using multiple displacement amplification", FERTILITY AND STERILITY, vol. 86, no. 4, 1 October 2006 (2006-10-01), pages 949 - 955
ALTARESCU G. ET AL.: "Sinqle-sperm analvsis for haplotvpe construction of de novo paternal mutations: application to PGD for neurofibromatosis tvpe 1", HUMAN REPRODUCTION, vol. 21, no. 8, August 2006 (2006-08-01), pages 2047 - 2051
PENQ ET AL.: "Whole qenome amplification from sinqle cells in preimplantation qenetic diaqnosis and prenatal diaqnosis", EUROPEAN JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOQY AND REPRODUCTIVE BIOLOQY, vol. 131, no. 1, pages 13 - 20
TUR-KASPA ET AL.: "Sperm DNA qenotypinq for preimplantation genetic diagnosis (PGD)", FERTILITY AND STERILITY, vol. 82, 2004, pages S254
SALAS, THE BACTERIOPHAGES, vol. 169, 1988
DIB, C.: "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites", NATURE, vol. 380, no. 6570, 1996, pages 152 - 154
Attorney, Agent or Firm:
TEMIÑO CENICEROS, Ignacio (1 _ 1°, MADRID, ES)
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Claims:

REIVINDICACIONES

1. Uso de gametos únicos individualizados para llevar a cabo estudios de informatividad genética.

5

2. Uso de acuerdo con Ia reivindicación anterior 1 , caracterizado porque el estudio de ¡nformatividad genética se emplea para Ia identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica. 0 3. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque el estudio de informatividad genética se emplea para el estudio de polimorfismos, segregación o mutacionales.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3,5 caracterizado porque el estudio de informatividad genética se emplea para el propósito de selección de gametos en el contexto de fertilización in-vitro.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque el estudio de informatividad genética se emplea para el 0 propósito de diagnóstico genético preimplantacional.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque se emplea en aquellos casos en los que Ia mutación responsable de Ia enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o 5 bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.

7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque el material biológico de partida para Ia obtención de los gametos únicos individualizados se selecciona entre una muestra seminal, o ovocitos y corpúsculo polar de ovocitos maduros.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque el gameto único individualizado es un espermatozoide.

5 9. Método de estudio de informatividad genética caracterizado porque comprende Ia amplificación del ADN de gametos únicos individualizados mediante amplificación genómica por desplazamiento múltiple.

10. El método de acuerdo con Ia reivindicación anterior 9, caracterizado porque Ia amplificación genómica por desplazamiento múltiple se lleva a cabo usando Ia ADN polimerasa del bacteriófago ph¡29.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 10, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) aislar un único gameto de una muestra; b) poner en contacto el gameto único individualizado con un tampón de lisis alcalino; c) neutralizar Ia lisis alcalina; y d) realizar Ia amplificación con Ia ADN polimerasa del bacteriófago ph¡29.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 11 , caracterizado porque el gameto único individualizado es un espermatozoide.

Description:

ESTUDIO DE INFORMATIVIDAD GENéTICA

La presente invención se engloba dentro del área de ciencias de Ia salud, dentro del sector de aplicación de Medicina Reproductiva, Genética y Biología Molecular, principalmente.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

El Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) es una novedosa técnica al servicio de Ia Medicina Reproductiva que permite Ia selección de embriones provenientes de ciclos de reproducción asistida libres de una determinada anomalía genética o cromosómica, antes de ser transferidos al útero materno. Actualmente, es una de las principales vías de innovación e investigación.

El DGP se ofrece a parejas portadoras o afectas de una determinada enfermedad genética o cromosomopatía, ya que se enfrentan a un importante riesgo reproductivo pudiendo elegir entre diferentes opciones: (a) diagnóstico prenatal, (b) donación de gametos, (c) adopción o (d) no tener descendencia. El DGP es una alternativa al diagnóstico prenatal evitando que Ia pareja tenga que someterse a una interrupción del embarazo en caso de que el feto se encuentre afecto.

La primera aplicación fue realizada por A. Handyside en 1990 consiguiendo Ia selección de embriones libres de una enfermedad genética ligada a los cromosomas sexuales. En Ia actualidad, el DGP permite el diagnóstico de cromosomopatías incluyendo el cribado de aneuploidías cromosómicas, el sexado en parejas portadoras de enfermedades ligadas a los cromosomas sexuales y anomalías cromosómicas estructurales, empleando Ia hibridación in situ fluorescente (FISH). En combinación con Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) se puede realizar el diagnóstico de enfermedades monogénicas. De modo que se diferencian en el DGP dos grandes bloques, desde el punto de vista de Ia metodología diagnóstica y del nivel de estudio: anomalías cromosómicas y enfermedades monogénicas.

La limitación principal del DGP de enfermedades monogénicas es Ia cantidad de DNA disponible para realizar el diagnóstico, ya que disponemos

de una única célula para realizar el estudio. Los métodos empleados deben ser altamente sensibles y eficaces, a Ia vez que rápidos, extremando al máximo las medidas encaminadas a prevenir Ia contaminación. Entre los métodos empleados para el DGP de las enfermedades monogénicas, los fragmentos amplificados mediante PCR se pueden analizar por: digestión con enzimas de restricción, secuenciación y análisis de polimorfismos.

Los diagnósticos que dependen de Ia amplificación del ADN mediante PCR están sujetos a una serie de problemas, tales como:

- "alíele dropout" (ADO) fenómeno que ocurre cuando solamente uno de los dos alelos presentes es amplificado, provocando errores de diagnóstico en embriones heterocigotos.

- Contaminación con ADN exógeno debido al gran número de ciclos de PCR necesarios para Ia amplificación de un único genoma y a Ia posibilidad de contaminación con células del cúmulo materno o de espermatozoides. De ahí Ia necesidad de testar rigurosamente los reactivos utilizados para Ia PCR, así como liberar completamente el embrión de células del cúmulo y utilizar Ia inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) como técnica de fertilización.

- Reducida o limitada eficacia de amplificación.

La utilización de polimorfismos ligados a los genes objeto del diagnóstico es Ia estrategia más eficaz y segura al evitar los posibles errores debido al ADO 1 al tiempo que permite detectar los posibles casos de contaminación con ADN exógeno, que también podrían producir errores de interpretación y por tanto diagnósticos erróneos. Para incrementar Ia sensibilidad del diagnóstico se incluye más de un polimorfismo. Generalmente, se emplean dos polimorfismos que flanquean el gen o Ia mutación responsable de Ia enfermedad, Ia combinación de los mismos conforman el haplotipo asociado o ligado a Ia enfermedad.

El primer paso previo a cualquier DGP de enfermedades monogénicas es el estudio genético del caso índice. A partir del cual se debe realizar un estudio de informatividad familiar con el que poder conocer cuales son los polimorfismos asociados a Ia enfermedad. Para ello, debe existir algún otro miembro de Ia familia vivo, afecto o portador, y así comparando

miembros sanos y afectos poder establecer cual es el haplotipo de riesgo en esa familia.

En casos en los que Ia mutación responsable de Ia enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia, es decir, sólo hay un miembro afecto vivo o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores, el estudio de polimorfismos o segregación, a pesar de ser Ia mejor estrategia para el DGP no puede ser utilizada.

Otro grupo de candidatos en los que se contempla Ia posibilidad de llevar a cabo un DGP son aquellas parejas en Ia que uno de sus miembros es portador de una anomalía cromosómica. Usualmente, suelen ser portadores de anomalías cromosómicas estructurales (translocaciones, grandes inversiones) aunque también serían candidatos potenciales aquellos individuos que presentan mosaicismo para anomalías cromosómicas numéricas (mosaicos para el Síndrome de Klinefelter, mosaicos 47,XYY, etc.). Una reorganización cromosómica conlleva Ia producción de una cierta proporción de gametos desequilibrados y por Io tanto a Ia obtención de embriones cromosomicamente anormales. La probabilidad de obtener embriones cromosomicamente equilibrados, desequilibrados pero viables (y por Io tanto de posibles descendientes afectos de síndromes debidos a anomalías cromosómicas) o cromosomicamente desequilibrados no viables (que suelen cursar en abortos de primer trimestre) dependerá de cada reorganización concreta.

Los portadores de anomalías cromosómicas también suelen ser pacientes fenotipicamente normales. No obstante, en su mayoría, conocen su riesgo reproductivo ya que es frecuente que Ia reorganización cromosómica de que son portadores tenga un origen familiar. Por otra parte, no es de extrañar que sean parejas que consultan por infertilidad debido a su dificultad para conseguir un embarazo o para obtener gestaciones evolutivas. La posibilidad de llevar a cabo un DGP en estos pacientes dependerá de cada reorganización cromosómica en concreto.

A Io largo de los últimos años el DGP ha aumentado ampliamente su espectro de aplicación. Otros candidatos y posibilidades diagnósticas que algunos grupos incluyen en sus programas de DGP son: pacientes con edad

reproductiva avanzada, en las cuales de sugiere una selección embrionaria a través de un estudio cromosómico con el objetivo de mejorar las tasas de implantación en este grupo y reducir su riesgo de transmisión de cromosomopatías a Ia descendencia; pacientes provenientes de ICSI (Inyección Citoplasmática de Espermatozoides) por factor masculino severo en los cuales se ha detectado un incremento significativo de anomalías cromosómicas en los espermatozoides; pacientes con fallos repetidos de FIV implantación en los que se sospecha de posibles anomalías cromosómicas como las causantes de los resultados negativos obtenidos; pacientes en los que se sospecha de Ia existencia de un mosaicismo gonadal e individuos de riesgo para Ia transmisión de carcinomas hereditarios.

La primera limitación técnica que impone el diagnóstico preimplantacional es Ia fuente de embriones ya que las parejas candidatas a un DGP deben someterse a una FIV con los consiguientes tratamientos, desventajas y limitaciones que el procedimiento implica. Así pues, Ia tasa de éxito de Ia FIV, estimada en un 50% de forma global, representa también una importante limitación para el DGP.

Por otra parte, no debemos olvidar que el número y Ia calidad de los embriones obtenidos condicionarán el éxito de un diagnóstico preimplantacional.

Una limitación importante de Ia aplicación de DGP a partir de embriones se debe al estadio embrionario en el cual se practica Ia biopsia, ya que ha de permitir Ia retirada de uno o dos blastómeros sin que afecte a Ia viabilidad del embrión. Por otra parte, hemos de disponer de tiempo suficiente para llevar a cabo del estudio genético y Ia transferencia en el mismo ciclo evitando, dentro de Io posible, Ia congelación de los embriones biopsiados.

La identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica se puede establecer empleando el ADN obtenido a partir de linfocitos de sangre periférica. Como resultado de Ia amplificación por PCR se obtienen dos alelos por cada polimorfismo en caso de que se trate de un individuo heterocigoto y un único alelo en caso de ser homocigoto. Los polimorfismos que se encuentren en estado homocigoto no pueden ser

empleados para realizar estudios de segregación ya que no aportan información de cromosomas independientes. En el caso de los heterocigotos claramente se diferencian dos alelos. Cada alelo proviene de un progenitor, uno materno y otro paterno, sin poder distinguirlos sin disponer de Ia historia familiar.

Por Io tanto, de Io que se conoce en Ia técnica se deriva que es muy deseable disponer de métodos alternativos que permitan llevar a cabo estudios de informatividad genética, particularmente en aquellos casos en los que Ia mutación responsable de Ia enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

Los inventores han encontrado que es posible utilizar Ia amplificación de ADN de gametos únicos individualizados para llevar a cabo un estudio de informatividad genética, e.g. polimorfismos, segregación o mutacional, en aquellos casos en los que Ia mutación responsable de Ia enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.

Así pues, de acuerdo con un primer aspecto de Ia presente invención, ésta proporciona el uso de gametos únicos individualizados para llevar a cabo un estudio de informatividad genética.

De acuerdo con una realización de Ia presente invención, el estudio de informatividad genética se emplea para Ia identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica. Preferentemente, el estudio de informatividad genética se emplea para el estudio de polimorfismos, segregación o mutacionales.

De acuerdo con otra realización particular de Ia presente invención, el estudio de informatividad genética se emplea para el propósito de selección de gametos en el contexto de fertilización in-vitro.

Según una realización preferida de Ia presente invención, el estudio

de ¡nformatividad genética se emplea para el propósito de diagnóstico genético preimplantacional.

Según otra realización preferida, el estudio de informatividad genética se lleva a cabo en aquellos casos en los que Ia mutación responsable de Ia enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.

Un segundo aspecto de Ia presente invención hace referencia a un método de estudio de informatividad genética que comprende Ia amplificación del ADN de gametos únicos individualizados mediante amplificación genómica por desplazamiento múltiple (MDA).

En una realización del método de Ia presente invención, dicha amplificación se lleva a cabo empleando Ia ADN polimerasa del bacteriófago ph¡29. El resultado de Ia reacción se utilizará para realizar los estudios de informatividad genética, p.e. mediante Ia amplificación de los polimorfismos y de Ia mutación pudiendo establecer el haplotipo de riesgo en casos en los que no se puedan realizar estudios de informatividad familiar (casos de novo).

La confluencia de dos alelos en una célula somática se debe a que Ia dotación genética de los humanos es diploide. En el caso de los organismos con reproducción sexual, antes o después de Ia formación del zigoto se debe reconstituir Ia dotación del individuo para mantener Ia genética de Ia especie. En los humanos ocurre durante Ia gametogenésis en Ia que tras Ia meiosis, los gametos o células germinales poseen Ia mitad de Ia dotación genética, haploide, que permitirá tras Ia fecundación completar Ia dotación genética diploide de Ia especie. De modo, que en cada gameto encontramos independizados todos y cada uno de los alelos del genotipo del individuo.

De acuerdo con Io descrito en Ia presente invención, es posible llevar a cabo un estudio de forma independiente de cada gameto, Io que supone una importante ventaja respecto a las técnicas empleadas hasta Ia fecha, ya que en Ia misma célula germinal es posible identificar Ia presencia o ausencia de Ia mutación, así como los polimorfismos asociados. No siendo necesario comparar los resultados obtenidos con ningún miembro de Ia familia para

establecer el haplotipo de riesgo ya que al tratarse de una célula haploide por si mismos son concluyentes.

De modo que Ia estrategia propuesta por Ia presente invención, podrá ser aplicada de forma universal a cualquier caso para evitar requerir a miembros de Ia familia en el estudio. Así mismo, cualquier estudio genético en que se necesite realizar un análisis de polimorfismos, segregación o mutacional puede ser efectuado siguiendo este procedimiento.

De este modo, de acuerdo con una realización preferida de Ia presente invención, el estudio de informatividad genética se selecciona entre estudios de polimorfismos, segregación o mutacionales.

De acuerdo con una realización de Ia presente invención, el material biológico de partida para Ia obtención de los gametos únicos individualizados se selecciona entre una muestra seminal, ovocitos y corpúsculo polar de ovocitos maduros. Preferiblemente, como material biológico de partida se emplea una muestra seminal.

Por Io tanto, de acuerdo con una realización particularmente preferida, Ia invención se refiere al uso de un espermatozoide como gameto único individualizado para Ia realización de estudios de informatividad genética.

Según una realización particular de Ia presente invención, el método comprende las siguientes etapas:

a) aislar un único gameto de una muestra; b) poner en contacto el gameto único individualizado con un tampón de lisis alcalino; c) neutralizar Ia lisis alcalina; y d) realizar Ia amplificación con Ia ADN polimerasa del bacteriófago ph¡29.

En el contexto de Ia presente invención, por ADN polimerasa del bacteriófago ph¡29 se entiende cualquier ADN polimerasa aislada de células infectadas con fagos del tipo ph¡29, que empleen una proteína terminal para

Ia iniciación de Ia replicación del ADN. Estos fagos están descritos de forma general en Salas.y col., The Bacteriophages 169, 1988.

La amplificación genómica por desplazamiento múltiple (Múltiple Displacement Amplificaron, MDA) es una técnica conocida para Ia amplificaión del genoma completo (Whole Genome Amplification, WGA) de células. ésta técnica, MDA, se describe en US 6977148. En Ia actualidad se comercializan kits para llevar a cabo dicha técnica, p.e. Genomiphi de Amersham Biosciences, UK. Es conocida Ia limitación de esta técnica para Ia amplificación del genoma de células únicas y/o de muestras de ADN menores de 1 ng. Sin embargo, de manera sorprendente, los inventores de Ia presente invención, han encontrado que es posible Ia amplificación del ADN de un único gameto mediante ésta técnica para su empleo posterior en estudios de informatividad genética

La siguiente descripción general se refiere al método de Ia presente invención en caso de utilizarse una muestra seminal como material biológico de partida para Ia obtención de los gametos únicos individualizados:

Tras lavado de Ia muestra para eliminar el plasma seminal que pueda interferir en pasos sucesivos se realizará Ia individualización de un único espermatozoide. Para ello se utilizan técnicas de micromanipulación, aspirando los espermatozoides, uno a uno mediante pipetas estándares de microinyección a 400 aumentos bajo el microscopio invertido. Los espermatozoides individualizados se introducirán en tubos para termocicladores que contienen tampón de lisis alcalino que junto con un choque térmico se conseguirá desestructurar Ia membrana plasmática con su consiguiente rotura dejando disponible el material genético del espermatozoide. Este paso no sólo permite Ia lisis del espermatozoide sino también Ia descompactación de Ia cromatina que deja accesible Ia molécula de ADN para los pasos sucesivos. La lisis alcalina debe ser neutralizada para poder realizar Ia amplificación con Ia ADN polimerasa del bacteriófago phi29 cuyo pH óptimo esta cerca de Ia neutralidad. Una vez, equilibrado el pH y disponible Ia molécula de ADN del espermatozoide se lleva a cabo Ia amplificación del ADN con una incubación a temperatura constante durante toda una noche que finaliza con Ia inactivación de Ia enzima. El producto de Ia amplificación se purificará para eliminar sales o reactivos que puedan

interferir en el análisis posterior. Una vez purificado ya disponemos de gran cantidad de ADN de un solo espermatozoide que se podrá emplear para realizar los estudios genéticos descritos anteriormente: análisis de polimorfismos y estudios mutacionales.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos.

En el contexto de Ia presente invención, y tal y como se conoce en el estado de Ia técnica, el término "informatividad" se define como estudios genéticos que permiten establecer el haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad en una familia.

Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

EXPOSICIóN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIóN

Ejemplo 1. Procedimiento de manipulación y amplificación del ADN de espermatozoides únicos para estudios de informatividad genética.

Como material biológico de partida se empleó una muestra seminal. Se realizó el lavado de Ia misma para eliminar el plasma seminal que pudiera interferir empleando PBS en proporción 1 :2 centrifugando a 1.700 rpm durante 5 minutos. Tras el centrifugado se eliminó el plasma seminal y se resuspendió en un volumen de 400 μl. En una placa de Petri para ICSI se colocaron dos gotas de 2 μl del semen lavado junto con 2 μl de PVP para conseguir ralentizar Ia movilidad de los espermatozoides. En esa misma gota se colocaron gotas 5 μl de tampón MOPS para el lavado de los espermatozoides individualizados. Se emplearon técnicas de micromanipulación, aspirando los espermatozoides, uno a uno mediante pipetas estándares de microinyección a 400 aumentos bajo el microscopio invertido.

Los espermatozoides individualizados se introdujeron en tubos para termocicladores de 0.2 mi que contenían 0.5 μl tampón de lisis alcalino (200 mM NaOH, 5OmM DTT). Los tubos se incubaron a -80 0 C durante 30 minutos. Y posteriormente a 65 0 C durante 10 minutos. Finalmente con Ia adición de

0.5 μl del tampón 200 mM Tricina pH 4.95 se consiguió neutralizar Ia lisis.

Los usados celulares se emplearon directamente para Ia reacción de amplificación con Ia ADN polimerasa del bacteriófago ph¡29. Se añadieron los reactivos para Ia reacción siguiendo las recomendaciones del kit comercial Genomiphi de Amersham Biosciences, UK en un volumen final de 20 μl. La reacción se incubó a 30 0 C durante toda una noche. Tras Ia incubación Ia reacción se detuvo a 65 0 C durante 10 minutos. El ADN amplificado se almacenó a -20 0 C.

Para llevar a cabo los diferentes estudios genéticos se llevó a cabo Ia purificación del ADN amplificado empleando cualquier kit comercial de purificación de productos de PCR. Una vez purificado se dispuso de gran cantidad de ADN de un solo espermatozoide que se pudo emplear para realizar los estudios genéticos descritos anteriormente: análisis de polimorfismos y estudios mutacionales.

Ejemplo 2. Estudio de ¡nformatividad del Síndrome de Carney Complex tipo 1.

Dado que Ia aplicación principal del procedimiento es el DGP se expone como ejemplo Ia realización de Ia invención en un estudio de informatividad del Síndrome de Carney complex tipo 1 (CNC1 ; OMIM #160980). El síndrome de Carney complex tipo 1 es una enfermedad autosómica dominante que afecta al gen PRKAR1A localizado en el brazo largo del cromosoma17 (17q23-q24) causando neoplasias múltiples.

El estudio se realizó en un varón que es portador de Ia mutación

(C769T) responsable del síndrome sin antecedentes familiares de Ia enfermedad que desea tener descendencia libre del síndrome. Por ello, se propuso realizar un DGP en el que el estudio de polimorfismos no podría realizarse debido a que se trata de un caso de novo, teniendo que emplear

estrategias de diagnóstico que implican un elevado porcentaje de error. El empleo del procedimiento de Ia invención nos permite poder utilizar estudios de segregación en el DGP realizando diagnósticos más seguros y fiables.

Se buscaron polimorfismos que estén localizados flanqueando Ia mutación. Concretamente se emplearon D17S189 y D17S1821 ((Dib, C. y col. "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites" Nature 380 (6570), 152-154 (1996)) que permitieron establecer el haplotipo de riesgo de Ia enfermedad.

Se llevó a cabo el procedimiento de acuerdo con el ejemplo 1 , empleando una muestra seminal que tras ser lavada, una alícuota de Ia misma fue empleada para Ia individualización de los espermatozoides en tubos de termociclador que contenían el tampón de lisis, tras el choque térmico se neutralizó y se procedió a Ia amplificación y purificación del ADN de cada espermatozoide individualizado.

Como resultado de Ia amplificación se obtuvo ADN suficiente para poder amplificar, del mismo espermatozoide, los polimorfismos y el exón en el que se localiza Ia mutación responsable del Carney. De este modo Ia mitad de los espermatozoides fueron portadores de un haplotipo determinado que en el que no se identificó Ia mutación, mientras que Ia otra mitad fue portador de otra combinación de polimorfismos en el que si se identificó Ia mutación pudiendo establecer el haplotipo de riesgo asociado al Síndrome de Carney en este individuo. Esta información únicamente se podría haber obtenido utilizando este procedimiento y es por tanto Ia única estrategia para poder realizar el DGP del síndrome de Carney complex tipo 1 de forma totalmente fiable.