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Patent Searching and Data


Title:
GLOBULIN PROTEIN 11S, USABLE AS A SEED IMPREGNATION MARKER DURING GERMINATION.
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1997/043418
Kind Code:
A1
Abstract:
A protein of plant origin, globulin 11S is disclosed. It is characterised in that it is derived from the seeds of a plant culture species, expressed in the seeds and not in any vegetative tissue of the plant, and appearing rapidly during the early germination stages (impregnation) and the priming of seeds. It is useful in agriculture as a molecular marker for determining the seed germination stage and to monitor continuously the development of seed priming treatments.

Inventors:
JOB CLAUDETTE (FR)
JOB DOMINIQUE (FR)
KERSULEC ALAIN (FR)
Application Number:
PCT/FR1997/000815
Publication Date:
November 20, 1997
Filing Date:
May 07, 1997
Export Citation:
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Assignee:
RHONE POULENC AGROCHIMIE (FR)
JOB CLAUDETTE (FR)
JOB DOMINIQUE (FR)
KERSULEC ALAIN (FR)
International Classes:
A01C1/00; C07K14/415; C07K14/425; C07K16/16; C12N15/09; C12N15/29; C12P21/08; C12Q1/68; G01N33/53; (IPC1-7): C12N15/29; C07K14/415; C07K16/16; C12N15/82; C12Q1/68; G01N33/53
Foreign References:
EP0658625A21995-06-21
Other References:
KRUSE, E., ET AL.: "EXPRESSION OF HEAT SHOCK PROTEINS DURING DEVELOPMENT OF BARLEY", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 23, pages 111 - 122, XP002025020
ABERNETHY, R.H., ET AL.: "THERMOTOLERANCE IS DEVELOPMENTALLY DEPENDENT IN GERMINATING WHEAT SEED", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 89, pages 569 - 576, XP002025021
COCA, M.A., ET AL.: "EXPRESSION OF SUNFLOWER LOW-MOLECULAR-WEIGHT HEAT-SHOCK PROTEINS DURING EMBRYOGENESIS AND PERSISTENCE AFTER GERMINATION: LOCALIZATION AND POSSIBLE FUNCTIONAL IMPLICATIONS", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 25, pages 479 - 492, XP002024738
CULIANEZ-MACIA, F.A., ET AL.: "DIP: A MEMBER OF THE MIP FAMILY MEMBRANE PROTEINS THAT IS EXPRESSED IN MATURE SEEDS AND DARK-GROWN SEEDLINGS OF ANTIRRHINUM MAJUS", THE PLANT JOURNAL, vol. 4, no. 4, pages 717 - 725, XP002025022
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 107, no. 17, 26 October 1987, Columbus, Ohio, US; abstract no. 152972, LAMBERT, N. ET AL: "Application of high-performance liquid chromatography to the assessment of subunit heterogeneity in plant 11S storage globulins" XP002036527
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 85, no. 17, 25 October 1976, Columbus, Ohio, US; abstract no. 119738, HARA, IKUKO ET AL: "Pumpkin (Cucurbita species) seed globulin II. Alterations during germination" XP002036528
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 109, no. 17, 24 October 1988, Columbus, Ohio, US; abstract no. 143585, HAYASHI, MAKOTO ET AL: "Nucleotide sequence of cloned cDNA coding for pumpkin 11-S globulin.beta. subunit" XP002036578
DATABASE CAB CAB INTERNATIONAL, WALLINGFORD, OXON, GB; LESNEVICH, L.A., ET AL.: "The storage globulins of sugarbeet seeds", XP002036530
DATABASE CAB CAB INTERNATIONAL, WALLINGFORD, OXON, GB; LESNEVICH, L.A., ET AL.: "Proteinmarkers in identification of sugar beet varieties and lines", XP002036531
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 96, no. 15, 12 April 1982, Columbus, Ohio, US; abstract no. 119046, BORISYUK, V. A. ET AL: "Electrophoresis study of Beta vulgaris proteins" XP002036529
BRINEGAR, CHRIS ET AL: "Isolation and characterization of chenopodin, the 11S seed storage protein of quinoa (Chenopodium-uinoa)", J. AGRIC. FOOD CHEM. (1993), 41(2), 182-5 CODEN: JAFCAU;ISSN: 0021-8561, XP002036526
DELL'AQUILA, A., ET AL.: "REGULATION OF PROTEIN SYNTHESIS IN GERMINATING EMBRYOS UNDER POLYETHYLENE GLYCOL AND SALT STRESS", SEED SCIENCE RESEARCH, vol. 2, pages 75 - 80, XP002025023
ISHIBASHI, N., ET AL.: "STORED MRNA IN COTYLEDONS OF VIGNA UNGUICULATA SEEDS: NUCLEOTIDE SEQUENCE OF CLONED CDNA FOR A STORED MRNA AND INDUCTION OF ITS SYNTHESIS BY PRECOCIOUS GERMINATION", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 15, pages 59 - 64, XP002024739
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Claims:
REVENDICATIONS
1. Protéine isolée d'origine végétale, caractérisée en ce qu'elle est issue de semences d'une espèce végétale, qu'elle comprend au moins une unité de 18 à 25 kDa, est exprimée spécifiquement dans les semences, et apparaît rapidement au cours d'un procédé de pré¬ germination.
2. Protéine selon la des revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de chénopodiacées.
3. Protéine selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est issue de la betterave, de l'épinard ou du chénopode blanc.
4. Protéine selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de composées.
5. Protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est issue de la chicorée ou de la matricaire.
6. Protéine larevendications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de labiées.
7. Protéine selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est issue du lamier.
8. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est issue d'une espèce de cucurbitacées.
9. Protéine selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est issue de la courgette.
10. Protéine selon les revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est de plus reconnue spécifiquement par les anticorps dirigés contre la protéine SIP de betterave.
11. Protéines équivalentes à la protéine selon les revendications 1 et 10.
12. Protéine selon l'une des revendications caractérisée en ce qu'elle est constituée essentiellement par la globuline 11 S.
13. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux, dénommés antiSIP, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent au moins un épitope porté par la protéine selon l'une des revendications 1 à 12.
14. Sondes moléculaires, protéiques ou nucléiques, caractérisées en ce qu'elles sont dérivées de la protéine (séquence d'aminoacides de la protéine, séquence en bases de l'ADN complémentaire codant pour la protéine) selon l'une des revendications 1 à 12 et des anticorps antiSIP selon la revendication 13 reconnaissant spécifiquement au moins un épitope porté par la protéine de betterave, .
15. Utilisation de protéines susceptibles d'être induites au cours de tout processus d'imbibition de semences, en particulier au cours de la germination et au cours de procédés de prégermination, selon les revendications 1 à 12, ou de sondes moléculaires selon la revendication 14, comme marqueur du stade d'imbibition des semences et de leur capacité germinative.
16. Utilisation selon la revendication 15 sur un lot de semences pour déterminer si celleci s ont été soumises à un procédé de prégermination.
17. Utilisation selon la revendication 15 sur un lot de semences pour suivre en continu le stade d'imbibition et l'évolution de capacité germinative au cours d'un traitement de prégermination.
18. Utilisation selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisée en ce qu'elle est faite sur un lot de semences de betteraves succrières.
19. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce qu'elle fait appel à la technique ELISA.
20. Dispositif (kit) pour la mise en oeuvre de l'utilisation selon les revendications 15 à 19.
Description:
Protéine globuline 1 IS, utilisable comme marqueur d'imbibition d'une semence au cours de la germination

La présente invention concerne une protéine induite au cours de l'imbibition de semences matures de plantes appartenant à des espèces des familles de chénopodiacées, composées, labiées et cucurbitacées et son utilisation comme marqueur moléculaire de la phase d'imbibition impliquée dans la germination de ces semences et dans les procédés d'osmo- et d'hydro-conditionnement dits de pré-germination de ces semences.

La germination est un processus de développement complexe, pour lequel on ne dispose à l'heure actuelle que de peu de données moléculaires précises. Ce programme de développement, au cours duquel les cellules de l'embryon passent d'un état de repos à un état d'activité métabolique intense, est mis en place essentiellement au cours de la phase d'imbibition. Il se termine, au sens physiologique, par la percée d'un organe de la plantule naissante au travers les enveloppes de la graine (Bewley & Black, 1983).

Les principales techniques utilisées pour définir la compétence des semences à germer mettent en oeuvre les tests de germination classiques, c'est-à-dire que l'on mesure, pour un lot de semences donné et dans des conditions codifiées (température, humidité, lumière, substrat), le pourcentage de germination à des temps différents après le semis. Le critère généralement utilisé pour quantifier la germination est la percée de l'enveloppe des graines par un organe de la plante naissante. La plupart des marqueurs biochimiques décrits à ce jour sont corrélés avec cette phase. Il ne s'agit donc pas de marqueurs sensu stricto de la germination, mais plutôt des phases initiales de la croissance (Fincher, 1989). Il faut noter que la phase initiale d'imbibition (c'est à dire de prise d'eau) est réversible jusqu'à un certain point. Suite à une hydratation contrôlée des graines, on peut les sécher, tout en conservant leur intégrité biologique et leur capacité germinative. Dès que la plantule apparaît, l'engagement de celle-ci dans sa croissance devient irréversible. En effet, une déshydratation à ce stade entraîne irrémédiablement la mort des plantules (Bewley & Black, 1983).

Les procédés de pré-germination ("priming") développés par les sociétés de semences sont basés sur la réversibilité de la phase initiale d'imbibition. Les semences sont en général hydratées de manière contrôlée, puis elles sont séchées (Coolbear et al., 1987;

FEUILLE DE REMPLACEMENT {REGLE 26)

Karsen et al., 1989; Tarquis & Bradford, 1992). Ces procédés apportent une réelle valeur ajoutée aux semences car ils permettent :

1 ) d'homogénéiser les lots de semences par rapport à la germination,

2) un gain de temps appréciable pour la levée après le semis, car un certain nombre de processus biochimiques nécessaires à l'accomplissement de la germination seraient déjà réalisés au cours du traitement,

3) une amélioration de la qualité germinative de lots de semences âgées, probablement en raison du fait que des mécanismes de réparation de structures biologiques endommagées au cours de la maturation finale des semences, voire au cours de la conservation, se mettent en place au cours du traitement.

A l'heure actuelle, l'optimisation de tels procédés repose uniquement sur la conduite de tests de germination, qui demandent plusieurs jours d'expérimentation. De plus, si le traitement échoue (les lots de semences étant par nature hétérogènes, il faut donc optimiser le traitement pour chacun des lots), le lot est perdu. La possibilité de suivre en continu la phase d'imbibition, par l'intermédiaire d'un marqueur moléculaire facile à détecter, constituerait donc un progrès considérable, permettant d'adapter le traitement de pré¬ germination à chaque lot de semences.

La présente invention repose sur la mise en évidence de la solubilisation d'une protéine d'origine végétale, induite au cours de l'imbibition des semences, issue d'une espèce de culture végétale, comprenant au moins une unité de 18 à 25 kDa, exprimée chez les semences et dans aucun autre organe de la plante, et qui apparaît intensément au cours de procédés de pré-germination mettant en oeuvre une prise d'eau contrôlée par les semences. La présente invention a plus particulièrement pour objet une protéine pure, isolée appelée protéine SIP, constituée essentiellement par la globuline 1 IS, issue de semences imbibées de chénopodiacées, par exemple la betterave, l'épinard et le chénopode blanc, mais aussi chez d'autres familles comme par exemple les composées telles que par exemple la chicorée et la matricaire, les labiées telles que par exemple le lamier, ou encore les cucurbitacées telles que par exemple la courgette. Dans le cas de la betterave, la protéine est dénommée SIP.

L'invention concerne également de nouveaux anticorps polyclonaux ou monoclonaux, dénommés anti-SIP, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent au moins un épitope porté par la protéine définie ci-dessus. Elle concerne également l'utilisation de la spécificité d'expression tissulaire et du patron de développement de ces marqueurs afin de mesurer le plus précisément possible l'état d'avancement de l'imbibition des semences, soit au cours de la germination, soit au

cours de procédés de pré-germination des semences, en particulier leur utilisation comme marqueur moléculaire de l'imbibition des semences de chénopodiacées, par exemple la betterave et l'épinard, mais aussi chez d'autres familles comme par exemple les composées telles que par exemple la chicorée et la matricaire, les labiées telles que par exemple le lamier, ou encore les cucurbitacées telles que par exemple la courgette. La détection de ces marqueurs est réalisée avec les anticorps spécifiques anti-SIP.

Cette détection peut être faite à l'aide d'un dispositif (kit), qui fait aussi partie de l'invention.

Caractérisation d'une protéine induite par imbibition des semences au cours de procédés de pré-germination :

On utilise la semence de betterave sucrière {Beta vulgaris, variété Univers) et trois techniques connues de pré-germination comme modèle d'études. Les semences utilisées n'ont subi aucun traitement préalable, leur taux d'hydratation moyen est de l'ordre de 12%. Les techniques de pré-germination utilisées sont d'une part l' hydro-conditionnement des semences à basse température et en présence d'eau pure (Coolbear et al., 1987) ,d' autre part l'osmo-conditionnement des semences en présence d'un osmoticum inerte, le polyéthylène glycol (PEG) 6000 (Tarquis & Bradford, 1992), enfin la pré-hydratauon des semences (Hegarty, 1978).

lITechnique de pré-germination par hydro-conditionnement à basse température. Cette technique a été décrite dans le cas des semences de tomate (Coolbear et al., 1987). Son principe consiste à imbiber les semences dans des conditions définies, à une température suffisamment basse pour éviter que les semences ne germent. Après traitement, les semences sont séchées, ce qui permet leur conservation. Cette méthode est adaptée ici au cas des semences de betterave. Les expériences de germination et de pré-germination sont conduites de la manière suivante. Chaque expérience porte sur un lot de cent semences de betterave qui sont placées dans des boîtes de Pétri (12 x 12 cm) sur 3 épaisseurs de papier filtre, imbibées avec 6 ml d'eau distillée. On recouvre les semences d'une feuille de papier filtre qui, faisant office de mèche, permet l'imbibition des semences sur toute leur surface, puis on ferme les boîtes avec leur couvercle de façon à minimiser l'évaporation de l'eau. Les boîtes sont ensuite placées dans des armoires à température contrôlée, à l'obscurité. Les courbes de germination obtenues à chaque température, représentées par l'évolution du taux cumulé de germination (exprimé en % du nombre total de semences analysées) en fonction du temps de germination, sont caractérisées par trois phases. Premièrement, une phase de latence, pendant laquelle aucune germination n'a lieu et pendant laquelle la semence s'hydrate. La durée de cette phase de latence est d'autant plus longue que la température d'incubation est basse. Elle est par exemple de 32 h à 25°C, de 44 h à 20°C, de 65 h à 15°C, de 120 h à 10°C

et de 320 h à 5°C. Deuxièmement, une phase d'augmentation du taux de germination, dont la vitesse augmente avec la température d'incubation dans la plage étudiée qui va de 5°C à 25°C. Cette vitesse caractérise également l'homogénéité du lot de semences analysé. Plus les semences ont une capacité germinative homogène, plus cette vitesse est grande, et inversement. Troisièmement, l'atteinte d'un plateau caractérisant la valeur maximum de germination du lot de semences considéré. Lorsque les semences de betterave incubées 11 jours à 5°C dans les conditions décrites ci-dessus, et dont aucune n'a germé, sont prélevées, séchées à 20°C jusqu'à les amener à un taux d'hydratation de 10%, ces semences germent beaucoup plus vite que les semences témoins n'ayant subi aucun traitement préalable. Par exemple, pour les semences traitées à 5°C pendant 11 jours, le temps de latence de la courbe de germination à 15°C n'est que de 25 h, en comparaison d'un temps de latence de 65 h pour les semences témoins. Ce procédé, tel que décrit par Coolbear et al. (1987) pour la tomate, permet donc la pré-germination (priming) efficace des semences de betterave. Dans le cas de la betterave, l'utilisation de basses températures (5°C par exemple) est bénéfique car si, à 20 et 25°C, l'hydro-conditionnement est plus rapide, il est aussi plus difficilement maîtrisable, les semences germant aisément aux températures élevées. A 5°C en revanche, on bloque toute percée radiculaire pendant des temps importants s'étalant sur plusieurs jours, tout en permettant l'hydratation contrôlée des semences. Il y a donc, à basse température, un bon découplage dans le temps entre les processus d'imbibition et de germination. Un tel découplage et le blocage intense de la percée radiculaire à 5°C permettent de plus une meilleure maîtrise de la déshydratation ultérieure des semences primées, sans risque de détérioration du lot de semences (l'hydratation est en effet réversible jusqu'au moment où les semences germent). Cette étape de séchage autorise ainsi la conservation des semences traitées pendant plusieurs mois. Parallèlement à ces études de germination, on prélève à des temps différents de l'incubation à température contrôlée une partie des semences pour effectuer des analyses biochimiques. Pour cela, on réalise des extraits bruts de protéines totales et solubles de la manière suivante : broyage des graines dans un mixer type Waring blender pendant 60 sec et en présence d'azote liquide, reprise de la poudre dans un tampon d'homogénéisation (Hepes pH 8,0) contenant divers inhibiteurs de protéases (benzamidine-HCl, phenylmethylsulfonyl fluoride, acide ε-amino caproïque), centrifugation (30 min à 20 000 g en tubes de centrifugation type Eppendorf) pour éliminer les débris cellulaires, réalisation d'essais reposant sur les techniques classiques de séparation des protéines de l'extrait en gel de polyacrylamide en présence de SDS. Cette dernière technique a été optimisée pour permettre l'utilisation de matériels de microanalyse électrophorétique de protéines en gels de polyacrylamide préformés (PhastSystem et PhastTransfer de Pharmacia), qui présentent l'avantage de conduire l'analyse des échantillons de manière très rapide (électrophorèse et coloration des protéines du gel avec le bleu de Coomassie sont réalisés en moins d'une heure

; 16 échantillons sont analysés en une seule fois) et avec peu de matériel (1 μl d'échantillon protéique déposé par piste de gel). Cet appareillage effectue également le transfert électrophorétique des protéines du gel sur feuille de nitrocellulose selon la technique de Towbin et al. (1979), ce qui permet par la suite une révélation de certaines des protéines de l'extrait analysé avec des anticorps spécifiques (méthode de "Western blot").

Utilisant ces méthodes, nous avons observé l'induction massive d'une protéine de masse moléculaire (22 ± 3) kDa au cours de l' hydro-conditionnement des semences de betterave à 5°C. Nous dénommons cette protéine SIP (pour Seed /mbibition Protein). Elle est présente à un niveau basai dans les semences témoin non traitées et devient très abondante chez les semences traitées (5 à 7 fois le niveau basai des témoins), représentant environ de 5 à 10% des protéines solubles des semences pré-germées.

La protéine SIP a été purifiée à l'état d'homogénéité à partir d'un extrait protéique (réalisé comme décrit ci-dessus) de semences de betterave pré-germées grâce au procédé d' hydro-conditionnement à 5°C (réalisé comme décrit ci-dessus). Les protéines de l'extrait sont séparées électrophorétiquement dans un gel préparatif de polyacrylamide à 20% en présence de SDS. Après électrophorèse, la protéine SIP, repérée selon sa masse et sa migration, est électroéluée du gel selon la technique de Teissère et al. (1990). La solution subit alors un passage par centrifugation (6000 g) sur Filtron Green, ce qui permet la concentration de l'échantillon et l'élimination de la majeure partie du SDS.

Cet échantillon a été utilisé pour immuniser un lapin (3 injections successives de 100 μg de SIP en présence de l'adjuvant complet de Freund, la première au temps zéro, les deux suivantes 3 semaines et 7 semaines après la première). Les anticorps ainsi obtenus (anti- SIP), qui font également partie de l'invention, permettent, à une dilution de 1/6000, la détection d'environ 5 ng de protéine SIP selon les techniques classiques ELISA en plaques de micro-titration.

2) Technique de pré- germination par osmo-conditionnement. Cette technique de pré- germination a été décrite par de nombreux auteurs, par exemple par Tarquis & Bradford (1992) dans le cas des semences de laitue. Son principe consiste à incuber les semences en présence d'un osmoticum inerte, le PEG, de façon à inhiber la germination, c'est-à-dire la percée radiculaire, tout en permettant l'hydratation des semences. Puis, les semences ainsi traitées sont séchées, ce qui permet leur conservation. Dans le cas de l'osmo- conditionnement des semences de betterave, on utilise la même technique que pour l'hydro- conditionnement, à la différence près que les semences (cent semences par boîte de 12 x 12 cm) sont incubées à 20°C en présence de 6 ml d'eau distillée contenant du polyéthylène glycol (PEG 6000). L'ajustement de la concentration de PEG 6000 permet d'obtenir des

potentiels osmotiques variables (Michel & Kaufmann, 1973). L'abaissement du potentiel osmotique entraîne un ralentissement progressif de la vitesse de germination. Ainsi, à -7,5, - 10, -15 et -20 bars, il n'y a pas de percées radiculaires observables pendant au moins 200 h à 20°C. Les semences témoins incubées en absence de PEG 6000 germent après une phase de latence de 50 h. Lorsque les semences de betterave incubées 8 jours à 20°C et à -7,5 bars dans les conditions décrites ci-dessus, et dont aucune n'a germé, sont prélevées, lavées brièvement pour éliminer la solution de PEG 6000, séchées à 20°C jusqu'à les amener au taux d'hydratation de 10%, ces semences germent beaucoup plus vite que les semences témoins n'ayant subi aucun traitement préalable. Par exemple, pour les semences traitées à 20 C C et -7,5 bars pendant 8 jours, le temps de latence de la courbe de germination à 20°C est inférieur à 8 h, en comparaison d'un temps de 50 h pour les semences témoins. Ce procédé de traitement, décrit par exemple par Tarquis & Bradford (1992) pour la pré-germination des semences de laitue, permet donc également la pré-germination (priming) efficace des semences de betterave.

Utilisant ces méthodes, nous avons observé l'induction massive de la protéine SIP au cours du procédé d'osmo-conditionnement (8 jours d'imbibition à 20°C en présence de PEG 6000 donnant des potentiels osmotiques de -7,5 bars, -10 bars et -15 bars). 3) Technique de prégermination par pré-hydratation La méthode de pré-hydratation utilisée repose sur des protocoles publiés pour la pré¬ germination des semences de Laitue (Tarquis et Bradford, 1992) et pour l'étude du vieillissement accéléré des semences d'Onion (Dearman et al., 1986). Son principe consiste à faire varier le contenu en eau des semences de betterave sucrière de la manière suivante. Des semences matures sèches de betterave sucrière sont introduites dans un tube cylindrique en plastique (h = 7 cm, d = 3 cm) fermé par un bouchon vissé, étanche à l'air. On introduit également dans le tube un morceau de papier absorbant imbibé d'une certaine quantité d'eau. Le tube contenant les semences en contact avec le papier imbibé est alors placé sur un agitateur roulant dans une armoire d'incubation dont la température est réglée à 20°C ± 1°C, à l'obscurité. Suite à l'incubation, les semences sont pesées pour déterminer l'augmentation de leur contenu en eau, puis elles sont séchées à température ambiante (16 heures environ) pour ramener leur contenu en eau à une valeur de l'ordre de 10% sur la base du poids sec. Ce séchage permet la conservation des semences traitées. Dans les conditions standards de pré¬ germination avec le traitement de pré-hydratation, on utilise 2,5 g de semences (sur la base du poids frais) et 0,82 g de papier absorbant imbibé de 0,81 ml d'eau. Le traitement standard dure 2 jours à la température de 20°C ± 1°C, ce qui permet d'amener le contenu en eau des semences traitées à une valeur de 30% ± 1 % sur la base du poids sec. Dans ces conditions, aucune semence n'a germé au cours de l'incubation. Il en est de même si l'incubation est

poursuivie pendant 5 jours. Après 8 jours d'incubation, toutefois, de l'ordre de 29% des semences ont germé.

Un lavage préalable des semences de betterave sucrière s'est avéré nécessaire pour traiter efficacement les semences de betterave sucrière avec la méthode de pré-hydratation. Ce lavage est réalisé dans les conditions suivantes. Les semences matures sèches de betterave sucrière (2,5 g sur la base du poids frais) sont plongées dans 50 ml d'eau avec agitation ménagée. Le lavage dure 4 heures à température ambiante (de l'ordre de 20-21°C). A l'issue du lavage, le contenu en eau des semences est de l'ordre de 55% sur la base du poids sec. Les semences lavées sont alors séchées comme précédemment, à température ambiante pendant 16 heures, ce qui ramène leur contenu en eau à une valeur de l'ordre de 10% sur la base du poids sec. Les semences lavées puis séchées sont alors soumises au traitement de pré-hydratation décrit ci-dessus.

Dans cette partie de l'étude on a utilisé trois types de semences de betterave sucrière : les semences matures sèches non traitées (dénommées témoins), les semences lavées et traitées par pré-hydratation (dénommées lavées pré-germées) et les semences non lavées (c'est-à-dire les semences témoins) mais soumises au traitement de pré-hydratation (dénommées non lavées pré-germées).

Utilisant ces techniques, nous avons observé que les semences de betterave sucrière lavées pré-germées (c'est-à-dire soumises au traitement complet de pré-germination incluant le lavage et le traitement de pré-hydratation) germaient beaucoup plus rapidement que les semences témoins correspondantes. Par contre les semences non lavées pré-germées (c'est- à-dire soumises à un traitement de pré-germination incomplet n'incluant pas le lavage préalable) germent à une vitesse comparable à celle des semences témoins. Seul donc le traitement complet (lavage + pré-hydratation) entraîne un effet physiologique qui est d'augmenter la vitesse de germination des semences de betterave sucrière, caractéristique des semences pré-germées. Il est possible que le lavage préalable élimine des inhibiteurs de germination contenus dans les téguments des semences de betterave sucrière (Snyder et al, 1965; Battle and Whittington, 1969; Khan et al, 1983; Morris et al, 1984).

Parallèlement à ces expériences de germination, on analyse le contenu en SIP soluble des différents échantillons de semences. II a été observé que la protéine SIP (sous-unité β de la globuline 1 IS) était présente en quantité beaucoup plus importante (de l'ordre de 5 fois) dans les extraits de protéines solubles des semences lavées pré-germées en comparaison des mêmes extraits réalisés à partir des semences témoins. La méthode de pré-germination par pré-hydratation conduit

donc aux mêmes résultats que ceux obtenus avec les méthodes d'hydro-conditionnement à 5°C et d'osmo-conditionnement en présence de PEG 6000. Les extraits de protéines solubles des semences non lavées pré-germées ne contiennent, quant à eux, qu'un niveau de protéine SIP soluble faible, équivalent à celui des semences témoins. Ce résultat démontre l'existence d'une corrélation positive entre réussite de la pré-germination des semences de betterave sucrière et présence en quantité abondante de la protéine SIP dans les extraits de protéines solubles.

On a également analysé les extraits de protéines totales des divers échantillons de semences. Pour cela, on a ajouté au tampon d'extraction indiqué ci-dessus du SDS (2% vol/vol). Dans ce cas, il a été observé que les extraits de protéines totales des semences témoins, non lavées pré-germées et lavées pré-germées, contenaient la même quantité de SIP totale (c'est-à-dire extractible par le SDS). La quantité de SIP totale extractible par le tampon d'extraction contenant le SDS représente de l'ordre de 3 fois celle mesurée dans les extraits de protéines solubles des semences lavées pré-germées.

Ces études ont été étendues au cas de 75 lots commerciaux de semences de betterave sucrière. On a observé dans tous les cas que les extraits protéiques des semences de betterave sucrière lavées et pré-germées contenaient une quantité de SIP soluble (c'est-à-dire extractible en l'absence de SDS) représentant environ 30-35% du niveau de protéine SIP totale (c'est-à-dire extractible en présence de SDS). Les extraits de protéines solubles des semences témoins correspondantes ne renferment quant à eux qu'une faible quantité de SIP soluble, inférieur à 10% du niveau de SIP totale. Ceci permet d'optimiser l'utilisation du marqueur SIP telle qu'elle est décrite dans le paragraphe "Conduite d'un procédé de pré¬ germination à l'aide d'un kit de diagnostic" ci-après. Corrélation entre taux d'induction de la protéine SIP et intensité du priming des semences

L'utilisation des anticorps anti-SIP montre que la protéine SIP est fortement induite (d'un facteur 5 à 7) pendant l'osmo-conditionnement des semences en présence de PEG 6000. Il en est de même lors du procédé d'hydro-conditionnement des semences en présence d'eau seule à 5°C. Dans ce dernier cas, la protéine apparaît après 6,5 jours d'incubation dans ces conditions, le niveau maximum (environ 6 à 7 fois le niveau basai des semences non traitées) étant atteint après 1 1 jours d'incubation. On caractérise l'intensité du traitement de pré-germination des semences comme suit. On prélève des échantillons de semences au cours du traitement d'hydro-conditionnement à 5°C, on les sèche, puis on les remet à germer à 15°C. On mesure alors, pour chacun des échantillons, le taux de germination obtenu à la température de 15°C pour un temps fixe de 63 heures. Ces mesures indiquent que plus le temps d'incubation à 5°C est long, plus le taux de germination à 63 heures et 15°C des semences traitées est élevé, c'est-à-dire que l'intensité du priming augmente avec la durée de l' hydro-conditionnement à 5°C. L'utilisation des anticorps anti-SIP montre l'existence d'une

corrélation positive entre le taux de SIP synthétisée pendant le traitement des semences et l'intensité du traitement de pré-germination. Ces résultats démontrent de plus la possibilité de suivre en continu l'avancement d'un procédé de pré-germination grâce à l'utilisation des anticorps anti-SIP et d'une technique classique ELISA. Dans le cas de la betterave sucrière modèle (variété Univers), une augmentation d'un facteur 6 à 7 du contenu des semences traitées en protéine SIP (par rapport au niveau basai des semences témoins) correspond aux conditions optimales de pré-germination de ces semences. Lorsque ce niveau de SIP est atteint, on doit arrêter le traitement, car si on le prolonge on risque de faire germer une partie des semences, et ces semences traitées trop intensément seront perdues lors de la déshydratation ultérieure nécessaire à la conservation des semences traitées, entraînant donc une perte de qualité du lot de semences traité (la déshydratation n'est pas réversible après la percée radiculaire).

La cinétique d'apparition et la quantification du taux de SIP au cours de la mise en oeuvre d'un quelconque procédé de pré-germination des semences font également partie de l'invention.

Caractérisation de protéines de semences induites au cours de la phase d'imbibition de la germination

Les résultats précédents démontrent l'induction massive de la protéine SIP au cours des procédés de pré-germination des semences de betterave. La question est de savoir si l'induction de cette protéine accompagne normalement la germination, ou si elle s'établit spécifiquement en réponse aux procédés de pré-germination mis en oeuvre. Pour répondre à cette question, on réalise des expériences de germination à température optimale de germination des semences de betterave. Dans les conditions de germination définies (cent semences par boîte de Pétri 12 x 12 cm, 6 ml d'eau par boîte) une telle germination optimale est obtenue dans la plage de 20°C à 25°C. Dans ces conditions, on mesure d'une part le taux de germination cumulé des lots de semences de betterave à divers temps d'incubation dans l'armoire thermostatée, et d'autre part on prélève à des temps différents une partie des semences pour quantifier le taux de SIP, en réalisant des extraits bruts de protéines totales et solubles comme décrit ci-dessus, et en utilisant les anticorps anti-SIP. La protéine est présente à un niveau basai dans les semences matures et sèches, puis elle est fortement induite au cours de la germination, à une vitesse bien plus rapide que n'apparaissent les radicules. Ainsi, pour les semences mises à germer à 20°C, le taux de SIP est environ multiplié par trois, alors qu'aucune semence n'a encore germé. Puis, la quantité de protéine SIP augmente progressivement jusqu'à sa valeur maximum (5 à 7 fois le niveau basai), atteignant sa valeur maximum après 96 h à 20°C, alors que le pourcentage cumulé de germination augmente aussi. Enfin, la protéine SIP disparaît graduellement après 96 h de germination à cette température, et que la croissance de la plantule s'installe.

En conclusion, la protéine SIP est normalement induite au cours de l'imbibition et de la germination des semences de betterave.

Distribution tissulaire de la protéine L'utilisation des anticorps anti-SIP montre que l'expression de la protéine SIP est spécifique des semences. Elle n'est pas détectée dans les organes végétatifs de la plante tels que les feuilles et les racines.

Présence de protéines équivalentes à la protéine SIP chez d'autres espèces de semences On a recherché la présence éventuelle de protéines équivalentes à la protéine SIP chez diverses semences. Ayant observé que, dans le cas de la betterave sucrière (variété Univers), la protéine SIP est induite au cours des phases précoces de la germination à 20°C, on a fait germer divers lots de semences (100 semences par boîte de Pétri, 6 ml d'eau par boîte, T = 20°C). Des échantillons sont prélevés lorsque les lots atteignent 50% de germination dans ces conditions. L'utilisation des anticorps anti-SIP montre que la protéine est présente dans toutes les variétés de semences germées de betterave sucrière (Univers, Adonis, Alizé, Accord), et fourragère (Monoval Géant Rouge, Eckendorf) que nous avons analysées, et chez différentes chénopodiacées (épinard, chénopode blanc), papilionacées (lupin, haricot, pois, luzerne), composées (tournesol, chicorée, matricaire, laitue), labiées (lamier), cucurbitacées (courgette, cornichon), crucifères (colza, moutarde, radis, Arabidopsis thaliana) et solanacées (tomate). Pour l'épinard, la chicorée, la matricaire, le lamier et la courgette, le taux de protéines équivalentes à la protéine SIP augmente fortement au cours de la germination. Pour ces semences, les anticorps révèlent une ou plusieurs protéines (deux pour la chicorée, trois pour l'épinard et la courgette) dont la masse est voisine de 20 kDa (18 à 25 kDa). Il pourrait donc s'agir d'isoformes de la protéine SIP (famille multigénique ou modifications post-traductionnelles). Pour les espèces appartenant à la famille des céréales (orge, maïs, blé, riz) et à la famille des ombellifères (carotte), la réactivité des anticorps anti-SIP est très faible. Identification de la protéine SIP On a identifié la protéine SIP de la manière suivante. La protéine SIP a été purifiée à partir d'un extrait protéique de semences de betterave sucrière pré-germées comme indiqué dans le paragraphe "Caractérisation d'une protéine induite par imbibition des semences au cours de procédés de pré-germination". Le microséquençage de son extrémité N-terminale, réalisé par dégradation d'Edman (Edman, 1956), à l'aide d'un microséquenceur 477A de Applied Biosystems couplé à un analyseur 120A de Applied Biosystems, a donné la séquence d'acides aminés suivante:

LEETIXSAKLTENI

Cette séquence est très proche de celle déterminée pour la sous-unité basique (aussi appelée sous-unité β) de la globuline 1 IS chez de nombreuses espèces de semences. Par exemple, la séquence N-terminale de la sous-unité β de la globuline 1 IS de Pois est

LEETICSAKIRENI (Shewry et al., 1995).

De nombreuses études ont été consacrées à ces globulines 1 IS. Il s'agit de complexes protéiques appartenant à la famille des protéines de réserve des semences de plantes dicotylédones (Bewley et Black, 1994; Shewry et al, 1995; Mϋntz, 1996). Lawrence et al. (1990) ont également montré l'existence d'une globuline 1 IS chez les semences matures de betterave et ont étudié la cinétique de dégradation de cette globuline au cours de la germination.

Les globulines 1 IS sont des complexes protéiques formés de deux sous-unités, une sous-unité acide dénommée α et une sous-unité basique dénommée β. Ces deux sous-unités sont liées entre elles de manière covalente par établissement d'un pont disulfure inter-chaîne. Les globulines 1 IS sont stockées au cours de la maturation des semences sur la plante mère, dans des organites cellulaires particuliers appelés corps protéiques (Bewley et Black, 1994). Elles s'assemblent dans ces corps protéiques sous forme d'hexamères regroupant six sous- unités α et six sous-unités β (Shewry et al, 1995). L'une des caractéristiques physico¬ chimiques des globulines est leur insolubilité dans l'eau et dans les tampons de faible force ionique. Elles ne peuvent être solubilisées à partir de semences matures sèches que par extraction des protéines dans des tampons contenant un agent dénaturant (le SDS, sodium dodecyl sulfate, par exemple) ou dans des tampons de haute force ionique (c'est-à-dire contenant une forte concentration en sel; NaCl par exemple) (Bewley et Black, 1994; Shewry et al, 1995). Les globulines 1 IS font partie de la famille des protéines de réserve des semences, dont le rôle est de servir de source de carbone et d'azote à la plantule naissante suite à la germination d'une semence (Bewley et Black, 1994; Miintz, 1996). Elles sont mobilisées (c'est-à-dire subissent diverses attaques protéolytiques par des endoprotéases et des exoproteases) au cours de la germination des semences, ce qui permet leur solubilisation et leur dégradation complète. Ces phénomènes de mobilisation sont en général considérés comme étant des événements post-germinatifs, c'est-à-dire se produisant lors de l'émergence radiculaire ou suite à l'émergence radiculaire.

La protéine SIP est donc la sous-unité β de la globuline 1 IS de betterave. Dans l'ensemble du texte de la présente demande on l'appellera indifféremment protéine SIP ou sous-unité β de la globuline 1 IS.

Cette identification et les résultats précédents montrent que la pré-germination des semences de betterave sucrière induit un phénomène précoce (pré-germinatif) dans la mobilisation de la globuline 11 S, entraînant la solubilisation de sa sous-unité β dans un tampon d'extraction de faible force ionique (tampon Hepes utilisé dans les expériences rapportées dans les Figures 1A, 1B, 2, 3B, 4B, 4D, 5, 6 et 7.

Conduite d'un procédé de pré-germination à l'aide d'un kit de diagnostic

La présente invention concerne également un procédé pour conduire de manière optimale un traitement de pré-germination de semences qui, au cours du traitement, produisent une protéine reconnue par les anticorps anti-SIP de betterave, telles que les semences de la famille des chénopodiacées, par exemple la betterave, le chénopode blanc et l'épinard, mais aussi chez d'autres familles comme par exemple les composées telles que par exemple la chicorée et la matricaire, les labiées telles que par exemple le lamier, ou encore les cucurbitacées telles que par exemple la courgette. Le kit de diagnostic proposé est constitué de ces anticorps spécifiques. Il est complété par des anticorps secondaires anti¬ anticorps de lapin (les anti-SIP étant faits dans le lapin). Ces anticorps secondaires sont disponibles commercialement (par exemple Sigma pour les anticorps anti-anticorps de lapin faits dans la chèvre). Ils sont couplés à la peroxydase, permettant la quantification aisée de la protéine SIP (s'il s'agit de betterave) ou de son équivalent (s'il s'agit de semences autres que la betterave) dans des extraits protéiques conduisant à l'extraction de la totalité des protéines solubles tels que décrits pour la betterave. Cette quantification est réalisée grâce à une méthode ELISA classique, utilisant des plaques de micro-titration et la lecture spectrophotométrique du développement de la réaction peroxydasique en présence de substrats de la peroxydase [H2O2 et 2-2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Aldrich] à l'aide d'un lecteur de plaques de micro-titration (lecteur EL340 de Bio-Tek Instruments par exemple).

La procédure est la suivante.

1) Réaliser des extraits de protéines solubles et totales des semences témoins et des semences traitées au cours du traitement de pré-germination. 2) Mesurer le taux de SIP (sous-unité β de la globuline 1 IS) soluble et totale à l'aide des anticorps anti-SIP et des techniques ELISA décrites dans le brevet initial.

3) Arrêter le traitement de pré-germination lorsque le taux de SIP (sous-unité β de la globuline 1 IS) soluble atteint de l'ordre de 30-35% de celui de SIP totale.

L'invention a encore pour objet un procédé de contrôle de l'imbibition ou de la prise d'eau lors de la germination desesemences soit naturelle soit au cours de traitement de pré-

germination, caractérisé en ce qu'on utilise comme marqueur moléculaire une protéine SIP ou une protéine équivalente.

Les exemples suivants illustrent l'isolement de la protéine SIP. le rôle de la protéine SIP et les protéines équivalentes et leur utilisation pour le contrôle de la l'imbibition lou de la prise d'eau lors de la germination des semences soit naturelle soit au cours d'untraitement de prégermination.

EXEMPLE 1. Evolution des protéines totales et de la protéine SIP au cours de la pré- germination des semences de betterave. Isolement de la protéine SIP

(A) Traitement des semences de betterave par hydro-conditionnement à 5°C

Les expériences de pré-germination sont conduites selon le procédé d'hydro- conditionnement. Les semences de betterave sont incubées pendant 1 1 jours à 5°C en présence de 6 ml d'eau pour cent semences. Les protéines totales et solubles sont extraites par broyage dans un tampon Hepes (pH 8.0) contenant des inhibiteurs de protéases. Ces protéines sont analysées après électrophorèse en gel de polyacrylamide (20%) PhastSystem de Pharmacia en présence de SDS et coloration des protéines au bleu de Coomassie. La figure 1 , piste 1 montre le profil des protéines des semences traitées. La piste 2 est relative aux semences témoins non traitées. La piste 3 correspond à la migration de protéines étalons. Leur masse moléculaire est indiquée en kDa sur la droite de la photographie. La flèche indique la migration de la protéine SIP. On peut constater sa forte induction au cours du procédé de pré-germination des semences.

(B) Traitement des semences de betterave par osmo-conditionnement en présence de PEG 6000

Les expériences de pré-germination sont conduites selon le procédé d'osmo- conditionnement. Les semences de betterave (cent semences par lot) sont incubées pendant 8 jours à 20°C en présence de 6 ml d'eau contenant du PEG 6000 donnant des potentiels osmotiques de -7,5, -10 et -15 bars. Les protéines totales et solubles sont extraites par broyage des semences comme indiqué dans la figure 1. Ces protéines sont analysées après électrophorèse en gel de polyacrylamide (20%) PhastSystem de Pharmacia en présence de SDS et coloration des protéines au bleu de Coomassie. La figure 2, pistes 3, 4 et 5 montre le profil des protéines des semences traitées à -7,5, -10 et -15 bars, respectivement. La piste 2 est relative aux semences témoins non traitées. La piste 1 correspond à la migration de protéines étalons. Leur masse moléculaire est indiquée en kDa sur la droite de la photographie. On peut constater la forte induction de la protéine SIP au cours du procédé de pré-germination des semences.

Ces deux expériences montrent clairement l'induction de la protéone SIP dans des semences soumises à des procédés de pré-germination de nature très différente. (C) Purification de la protéine SIP après traitement des semences de betterave par hvdro- conditionnement à 5°C

Les expériences de pré-germination sont conduites selon le procédé d'hydro- conditionnement comme indiqué dans la figure 1. L'extrait de protéines totales et solubles est réalisé à partir des semences traitées à 5°C pendant 1 1 jours comme indiqué dans la figure 1. Cet extrait est déposé dans un gel de polyacrylamide préparatif à 20% en présence de SDS. Après électrophorèse, une bande du gel correspondant à la protéine SIP est excisée, et la protéine SIP est électroéluée du gel. La figure 3 (pistes 3, 4 et 5) montre l'analyse de la pureté de différentes préparations de la protéine SIP par électrophorèse en gel de polyacrylamide (20%) PhastSystem de Pharmacia en présence de SDS et coloration des protéines au bleu de Coomassie. Les pistes 2 et 6 correspondent aux semences traitées par hydro-conditionnement. La piste 7 correspond aux semences témoins non traitées. Les pistes 1 et 8 correspondent à la migration de protéines étalons. Leur masse moléculaire est indiquée en kDa sur la droite de la photographie.

EXEMPLE 2. Évolution de la protéine SIP au cours de la germination des semences de betterave

Les expériences de germination sont réalisées en boîtes de Pétri (12 x 12 cm), à l'obscurité (cent semences et 6 ml d'eau par boîte) et à la température de 20°C. On mesure d'une part l'évolution du taux cumulé de germination en fonction du temps et d'autre part, on prélève des échantillons pour réaliser des extraits bruts et quantifier le taux de protéine SIP comme indiqué.

La figure 4 représente l'évolution en fonction du temps d'incubation à 20°C du taux cumulé de germination des semences (O), et d'induction de la protéine SIP ('), cette dernière étant révélée spécifiquement en conduisant des tests ELISA avec les anticorps anti-SIP. Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux maximum obtenu à 96 h de germination) et par rapport à une semence. On peut constater que la protéine SIP est présente à un niveau basai (de 10 à 15% du niveau maximum) dans les semences sèches et que son niveau d'expression est multiplié par un facteur 6 à 7 au cours de la germination. Une quantité importante de SIP est synthétisée avant que n'apparaissent les radicules. Enfin, lorsque le lot de semences atteint son pourcentage maximum de germination (entre 90 et 130 h), la protéine SIP disparaît lentement.

La figure 5 représente l'évolution du profil des protéines dans les extraits protéiques au cours de l'imbibition et de la germination à 20°C, après analyse des protéines en gel de

polyacrylamide 20% contenant du SDS (PhastSystem de Pharmacia) et coloration des protéines au bleu de Coomassie. La figure 5, pistes 2, 3. 4, 5 et 6 montre le profil des protéines des semences témoins, et des semences obtenues après 13 h, 24 h, 36 h et 48 h de germination, respectivement. La piste 1 correspond à la migration de protéines étalons. Leur masse moléculaire est indiquée en kDa sur la gauche de la photographie. La flèche noire à droite indique la migration de la protéine SIP. On peut constater sa forte induction au cours de la germination à 20°C.

EXEMPLE 3.- Osmo-conditionnement des semences de betterave en présence de polyéthylène glycol (PEG) et induction de la protéine SIP

Les expériences de germination sont conduites à 20°C et à l'obscurité comme décrit ci-dessus. La figure 6 représente l'évolution du taux cumulé de germination des semences témoins incubées en présence d'eau seule ('), des semences incubées en présence de PEG 6000 dans l'eau donnant des potentiels osmotiques de -3 bars (O) et de -7,5 bars (^). On peut constater le fort ralentissement de la percée radiculaire pour les échantillons incubés en présence de PEG 6000. Ce traitement d'osmo-conditionnement conduit d'une part à l'induction massive de la protéine SIP et d'autre part à la pré-germination des semences de betterave. La figure 7 représente l'évolution du contenu des semences en protéine SIP au cours de l'incubation pendant 200 h à 20°C (aucune semence n'a germé, voir figure 6) en présence de solutions de PEG 6000 donnant des potentiels osmotiques de -7,5 bars, -10 bars, -15 bars et -20 bars. Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux maximum) et par rapport à une semence. On peut constater la forte induction de la protéine SIP au cours du traitement. Les semences incubées à -7,5 bars, 20°C et à l'obscurité pendant 200 h sont prélevées, lavées rapidement pour les débarrasser du PEG, puis séchées pour les ramener à un taux d'hydratation proche de celui des semences témoins non traitées (10% d'eau). Ces semences sont mises à germer à 20°C, en présence d'eau seule, comme décrit ci-dessus. La figure 8 représente l'évolution du taux de germination cumulé des semences ainsi traitées (O) et des semences témoins (*). On peut constater que les semences traitées présentent une forte avance à la germination, attestant de l'efficacité du priming par osmo-conditionnement.

EXEMPLE 4. Hydro-conditionnement des semences de betterave en présence d'eau à différentes températures et induction de la protéine SIP

Les expériences sont conduites à différentes températures et à l'obscurité comme indiqué. La figure 4A représente l'évolution du taux cumulé de germination des semences incubées à 20°C ('), 10°C (O) et 5°C (^). On peut constater le fort ralentissement de la percée radiculaire lorsque la température de l'expérience de germination diminue. Ce traitement d'hydro-conditionnement conduit d'une part à l'induction massive de la protéine

SIP et d'autre part à la pré-germination des semences de betterave. La figure 9 représente la cinétique d'induction de la protéine SIP au cours de l'incubation à 5°C (aucune semence n'a geπné, voir figure 9). Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires ( 100% correspondant au taux maximum mesuré après 1 1 jours de traitement) et par rapport à une semence. On peut constater la forte induction de la protéine SIP au cours du traitement, en comparaison des semences témoins non traitées. Les semences incubées à 5°C et à l'obscurité pendant 1 1 jours sont prélevées, puis séchées pour les ramener à un taux d'hydratation proche de celui des semences témoins non traitées (10%). Ces semences sont mises à germer à 15°C, en présence d'eau seule, comme décrit dessus. La figure 1 1 représente l'évolution du taux de germination cumulé des semences ainsi traitées (O) et des semences témoins ('). On peut constater que les semences traitées présentent une forte avance à la germination, attestant de l'efficacité de cette méthode de pré-germination. On a également prélevé des échantillons de semences au cours de l'incubation à 5°C. Tous ces échantillons ont été séchés pour les ramener au niveau d'hydratation des témoins non traités (10%), puis mis à germer en présence d'eau seule (6 ml pour cent semences) à 15°C. La figure 12 montre l'évolution du taux de germination (exprimé en % des semences analysées) mesuré après 63 h d'incubation à 15°C en fonction du taux de protéines SIP contenu dans les différents échantillons prélevés au cours de la première incubation à 5°C. On peut constater l'existence d'une corrélation positive entre intensité du priming et contenu en SIP.

Exemple 5. Germination des semences de betterave sucrière pré-germées à l'aide du traitement de pré-hydratation

Les expériences de germination sont conduites à 15°C, dans les conditions indiquées dans le brevet initial. Semences lavées pré-germées (J), semences non lavées pré-germées (G) et semences témoins non traitées (E) .

Les résultats sont présentés à la figure 19.

Exemple 6. Quantification des niveaux de protéine SIP (sous-unité β de la globuline US) soluble et totale dans les semences de betterave sucrière pré-germées à l'aide du traitement de pré-hydratation

Les extractions de protéines solubles et totales sont conduites comme indiqué, dans un tampon Hepes pH 8,0, ne contenant pas ou contenant du SDS (2% vol/ vol) respectivement. Les taux de protéine SIP soluble et totale sont alors déterminés en conduisant des tests ELISA avec les anticorps anti-SIP, tel que décrit dans le brevet initial. Colonnes 1 et 4, respectivement SIP soluble et totale des extraits protéiques des semences témoins non traitées.

Colonnes 2 et 5, respectivement SIP soluble et totale des extraits protéiques des semences non lavées pré-germées. Colonnes 3 et 6, respectivement SIP soluble et totale des extraits protéiques des semences lavées pré-germées. Les lésultats sont présentés à la figure 20.

EXEMPLE 7 Distribution tissulaire de la protéine SIP au cours du cvcle des plantes de betterave

Les semences de betterave matures (variété Univers) sont mises à germer (T = 20°C) au temps zéro soit sur papier filtre en boîtes de Pétri (100 semences et 6 ml d'eau par boîte), soit sur terreau pour obtenir des plantes. Dans ce dernier cas, elles sont arrosées chaque jour avec de l'eau. Des extraits bruts de protéines totales et solubles sont préparés à partir de divers organes (graines sèches, graines germées après 96 h, cotylédons après 8 jours de germination, racines et feuilles après 48 jours de germination). Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100%) correspondant au taux maximum mesuré dans les graines germées après 96 h) et par rapport à un mg de protéines totales dans chacun des extraits.

EXEMPLE 8. Présence de protéines équivalentes à la protéine SIP chez d'autres espèces de semences Différents lots de semences appartenant aux chénopodiacées (betterave, épinard), papihonacées (lupin, haricot, pois, luzerne), composées (tournesol, chicorée, matricaire, laitue), labiées (lamier), cucurbitacées (courgette, cornichon), crucifères (colza, moutarde, radis), céréales (orge, maïs, blé, riz), solanacées (tomate), ombellifères (carotte) sont mis à germer à 20°C en boîtes de Pétri comme décrit pour la betterave. Lorsque chaque lot atteint un pourcentage de germination de 50%, les semences sont prélevées et on réalise des extraits bruts protéiques comme décrit pour la betterave. Ces extraits sont analysés grâce à une technique ELISA pour quantifier leur niveau de réactivité vis-à-vis des anticorps anti-SIP de betterave. Les résultats concernant la protéine SIP sont exprimés en unités arbitraires (100% correspondant au taux mesuré chez la betterave) et par rapport à un mg de protéines totales dans chaque extrait. La figure 14 montre l'existence de protéines reconnaissant les anticorps anti-SIP chez de nombreuses espèces, à l'exception des céréales. La figure 15 montre que, pour l'épinard la chicorée, le lamier et la courgette, le taux de protéines équivalentes à SIP augmente fortement au cours des phases précoces de la germination.

EXEMPLE 9. Comparaison de la masse moléculaire de la protéine SIP chez la betterave sucrière et d'autres espèces de semences

Différents lots de semences (betterave sucrière, épinard, chicorée, matricaire, lupin, lamier) sont mis à germer à 20°C en boîtes de Pétri comme décrit pour la betterave. Lorsque

chaque lot atteint un pourcentage de germination de 50%. les semences sont prélevées et on réalise des extraits bruts protéiques comme décrit pour la betterave. Ces extraits sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide 20% en présence de SDS (PhastSystem de Pharmacia) et coloration au bleu de Coomassie ou révélation avec les anticorps anti-SIP après électrotransfert des protéines du gel sur feuille de nitrocellulose selon Towbin et al. (1979).

(A) La figure 16 montre l'analyse des semences de betterave et d'épinard après coloration au bleu de Coomassie. La piste 2 correspond aux semences de betterave témoins. La piste 3 correspond aux semences de betterave germées. La piste 4 correspond aux semences d'épinard témoins. La piste 5 correspond aux semences d'épinard germées. On peut constater que, comme pour la betterave, les semences d'épinard germées contiennent une protéine soluble majoritaire d'environ 22 kDa. La masse moléculaire de protéines étalons est indiquée en kDa (piste 1).

(B) La figure 17 montre les mêmes échantillons que dans la figure 16, après transfert électrophorétique des protéines sur feuille de nitrocellulose et réaction avec les anticorps anti-SIP. La numérotation des pistes est la même que dans la figure 16. La révélation est effectuée avec les anticorps secondaires anti-anticorps de lapin couplés à la peroxydase (Sigma) et développement de la réaction peroxydasique.

(C) La figure 18 montre l'analyse des semences germées de chicorée (piste 1), courgette (piste 2). épinard (piste 3), lupin (piste 4), lamier (piste 5), matricaire (piste 6) et betterave (piste 7) après électrophorèse, transfert des protéines sur feuille de nitrocellulose et réaction avec les anticorps anti-SIP. La révélation est effectuée avec les anticorps secondaires anti¬ anticorps de lapin couplés à la peroxydase (Sigma) et développement de la réaction peroxydasique. La masse moléculaire de protéines étalons est indiquée en kDa. Dans le cas de la chicorée, de la courgette, de l'épinard, les anticorps anti-SIP révèlent un petit groupe de protéines (doublet ou triplet), de masses moléculaires très voisines de celle de la protéine SIP de betterave. La synthèse de ces protéines est fortement induite au cours de la germination.

L'ensemble de ces résultats suggère un rôle de la protéine SIP dans la prise d'eau contrôlée des semences au cours de la germination et au cours des traitements de priming (osmo-conditionnement, hydro-conditionnement et préhydratation). Notons que la protéine SIP représente la protéine soluble majoritaire des semences de betterave et d'épinard imbibées. Elle pourrait donc être impliquée dans la distribution des molécules d'eau (et/ou de solutés) au sein des différentes parties constitutives de la semence.

Dans le cadre de cette hypothèse, il est intéressant de comparer les propriétés de la protéine SIP avec celles de protéines végétales récemment décrites par l'équipe de Chrispeels aux États-Unis [voir par exemple Chrispeels & Maurel (1994) pour une revue]. Ces chercheurs ont en effet mis en évidence l'existence chez les plantes (haricot, Arabidopsis thaliana) de protéines membranaires liées au tonoplaste, qu'ils ont dénommées aquaporines ou protéines TIP (Tonoplast Intrinsic Proteins'). C'est une famille multigénique et certaines de ces protéines sont exprimées spécifiquement dans les semences. On les trouve notamment dans le système membranaire entourant les vacuoles où se retrouvent stockées les protéines de réserve de la semence, et leur rôle serait de maintenir l'intégrité du tonoplaste au cours de la déshydratation des semences en fin de maturation, et au cours de leur hydratation pendant la germination (Johnson et al., 1991). Ces aquaporines possèdent des masses moléculaires de l'ordre de 27 kDa, très proches de la masse de la protéine SIP. Toutefois, plusieurs éléments indiquent que les deux types de protéines diffèrent radicalement, a) La protéine SIP est facilement extractible en solvant aqueux, alors que les protéines TIP sont extrêmement hydrophobes et ne peuvent être extraites des tissus végétaux qu'en présence de détergents (Triton par exemple), b) Les protéines TIP spécifiques des semences sont abondantes dans les semences matures et disparaissent rapidement au cours de la germination (Màder & Chrispeels, 1984; Johnson et al., 1989). En revanche, la protéine SIP est à un niveau basai dans les semences matures et est induite de manière considérable au cours des phases précoces de la germination.

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L'invention a encore pour objet des sondes moléculaires, protéiques ou nucléiques, caractérisées en ce qu'elles sont dérivées de la protéine (séquence d'amino-acides de la protéine, séquence en bases de l'ADN complémentaire codant pour la protéine) ci-dessus. La présente invention a encore pour objet un procédé d'obtention de plantes transformées, caractérisé en ce qu'on insère dans le génome de plantes qui n'exprimeraient pas naturellement la protéine SIP (ou une protéine équivalente) , ou qui exprimeraient cette protéine mais à un niveau faible, une ou plusieurs copies du gène codant pour la protéine SIP selon l'invention, afin d'exprimer ou de surexprimer cette protéine chez les semences de plantes transformées au moment de la germination et d'augmenter la capacité germinative de ces semences.