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Title:
GLYCOSIDES OF N-ACETYL-6-O-[2,2-BIS(HYDROXYMETHYL)-3-HYDROXYPROPYL]-D-GLUCOSAMINE, METHOD FOR THE OBTENTION THEREOF AND THEIR USES IN THE TREATMENT OF BRAIN TUMORS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2001/079243
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention describes a method for obtaining glycosides from monosaccharide N-acetyl-D-glucosamine derivatives and a research on its glioblastoma inhibiting and cytotoxic activity. Glycosides of general formula (I) have been prepared from monosaccharide N-acetyl-D-glucosamine, wherein aglycone R?1¿ is a hydrophobic radical, preferably a linear or branched hydrocarbonated 8-16 carbon chain. The invention also relates to the use of glycosides of N-acetyl-6-O-[2,2-bis(hydroxymethyl)-3-hydroxypropyl]-D-glucosamine for inhibiting human glioma cultures.

Inventors:
BERNABE PAJARES MANUEL (ES)
FERNANDEZ-MAYORALAS ALVAREZ AL (ES)
NIETO SAMPEDRO MANUEL (ES)
VAQUERO CRESPO JESUS (ES)
ZURITA CASTILLO MERCEDES (ES)
Application Number:
PCT/ES2001/000138
Publication Date:
October 25, 2001
Filing Date:
April 06, 2001
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION (ES)
HOSPITAL UNIVERSITARIO CLINICA (ES)
BERNABE PAJARES MANUEL (ES)
FERNANDEZ MAYORALAS ALVAREZ AL (ES)
NIETO SAMPEDRO MANUEL (ES)
VAQUERO CRESPO JESUS (ES)
ZURITA CASTILLO MERCEDES (ES)
International Classes:
A61K31/7032; C07H15/04; (IPC1-7): C07H15/04; A61K31/7032
Domestic Patent References:
WO1995013061A11995-05-18
Foreign References:
US5708163A1998-01-13
US4738955A1988-04-19
Attorney, Agent or Firm:
Ungria Lopez, Javier (Avenida Ramón y Cajal 78, Madrid, ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES
1. Glicósidos de Nacetil60 [2, 2bis (hidroximetil)3hidroxipropil]Dglucosamina utiles para el tratamiento de tumores cerebrales caracterizados por la formula 1 1 donde R1 es una cadena lineal o ramificada de C8C16alquilo.
2. Procedimiento de obtention de glicósidos de Nacetil60 [2, 2bis (hidroximetil)3 hidroxipropilDglucosamina de formula general 1, caracterizado porque : en una primera etapa tiene lugar una glicosilación de la NacetilDglucosamina con el alcohol derivado de la cadena de C8Cl6alquilo para dar lugar a los correspondientes glicósidos, que en una segunda etapa se someten a una reaction de tritilacion selectiva sobre la position 6 de la glucosamina ; Los 6Otritil derivados se bencilan controladamente sobre los hidroxilos 3 y 4 de la glucosamina en la tercera etapa y, en la cuarta etapa, se someten a una destritilación para dar lugar a los glicósidos con la posición 6 de la glucosamina unicamente libre ; El tratamiento de estos compuestos, en la quinta etapa, con un sulfato ciclico derivado del pentaeritritol de formula general 10 conduce a sulfatos de formula general 7, que en sexta y septimo etapa se desprotegen por desbencilación e hidrólisis del sulfato para dar lugar a los glicósidos de formula general 1.
3. Un procedimiento segun reivindicación 2a caracterizado porque en la primera etapa la glicosilación se Ileva a cabo en presencia de un promotor acido, preferentemente trifluoruro de boro eterato.
4. Un procedimiento begun reivindicación 2a caracterizado porque en la segunda etapa la position 6 de la glucosamina se tritila selectivamente con haluro de tritilo, preferentemente cloruro de tritilo, en piridina en presencia de 4dimetilaminopiridina.
5. Un procedimiento begun reivindicación 2a caracterizado porque en la tercera etapa tiene lugar una bencilación controlada sobre los hidroxilos 3 y 4 empleando un haluro de bencilo, preferentemente bromuro de bencilo, en presencia de una base, como hidruro sódico, y una sal de tetraalquilamonio, preferentemente yoduro de tetrabutilamonio, en tetrahidrofurano como disolvente.
6. Un procedimiento segun reivindicación 2a caracterizado porque en la cuarta etapa la destritilacion se lleva a cabo empleando un acido como catalizador en presencia de un alcohol simple, como metanol.
7. Un procedimiento begun reivindicación 2a caracterizado porque en la quinta etapa la reaction los sulfatos ciclicos derivados de pentaeritritol se lleva a cabo en una mezcla de tetrahidrofuranodimetilformamida en presencia de una base, como hidruro sódico, calentando a 100 °C.
8. Un procedimiento segun reivindicación 2a caracterizado porque en la sexta etapa la desbencilación se realiza utilizando hidrógeno en presencia de una catalizador de paladio sobre carbon activo.
9. Un procedimiento begun reivindicación 2a caracterizado porque en la septimo etapa la hidrólisis del sulfato se lleva a cabo en una mezcla de dioxanometanol en presencia de acido sulfuric 1M para la obtention de los glicósidos de formula general 1.
10. Uso de los glicósidos de Nacetil60 [2, 2bis (hidroximetil)3hidroxipropil]D glucosamina para inhibición de la proliferación de gliomas humanos en cultivo.
Description:
Titulo Glicósidos de N-acetil-6-0- [2, 2-bis (hidroximetil)-3-hidroxipropil]-D-glucosamina, procedimiento de obtention y uso en el tratamiento de tumores cerebrales.

Estado de la Técnica El glioblastoma multiforme representa una neoplasia altamente maligna, constituida por cellas con un elevado grado de desdiferenciación. Su elevada incidencia (representa aproximadamente la mitad de los gliomas) y sus peculiaridades clinicas, le confieren unas caracteristicas especiales. Su histogenesis es aún discutida y se admite la posibilidad de que el glioblastoma multiforme pueda nacer como tal o que a este tumor se llegue como consecuencia de una transformación maligna en un glioma previo.

Suele presentarse en personas mayores de cuarenta anos, con un maximo de incidencia entre los 50 y 55 anos y es mas frecuente entre los varones. Clinicamente presenta un crecimiento muy rapido y sus localizaciones preferentes son los lobules frontal y temporal y, en menor grado, las regiones parietal, occipital y ganglios basales.

En ocasiones la afectación puede ser bilateral como consecuencia de la extension del tumor a través del cuerpo calloso.

Actualmente, cualquier tratamiento utilizado en los pacientes con un glioblastoma multiforme es meramente paliativo y tan solo consigue alargar en escasa medida la supervivencia que suele ser inferior a seis meses tras hacer el diagnóstico, si no se realiza ningún tipo de tratamiento. La cirugia, con extirpación lo mas amplia posible del tumor, seguida de radioterapia, puede lograr una supervivencia media de un ano tras el diagnóstico. La quimioterapia mas habitual (BCNU, CCNU) no parece tener un efecto significativo, aunque en algunas se ha conseguido aumentar algunos meses la supervivencia. Otras técnicas, como la inmunoterapia, radioterapia, etc., estran en fase de evaluation y desarrollo, sin que aun se haya establecido su posible eficacia real, ya sea como técnicas aisladas o en combinación con otras opciones terapéuticas.

La patente espanola 9102522 describe un procedimiento de obtention de oligosacáridos capaces de inhibir la mitosis de cellas tumorales de sistema nervioso central. El procedimiento implica un elevado numéro de etapas de protecci6n y desproteccion y glicosilaciones que emplean catalizadores tóxicos. En esta patente no se hace mention a la actividad in vivo de los compuestos.

Los compuestos objeto de la presente invention son nuevos y por consiguiente no hay nada publicado referente a su sintesis y utilización.

Descripción de la invention En esta patente se describe un procedimiento de obtention de glicósidos derivados del monosacárido N-acetil-D-glucosamina y la investigación sobre su actividad inhibitoria y citotóxica de glioblastomas.

Se han preparado glicósidos de f6rmula general 1 a partir del monosacárido N- acetil-D-glucosamina, donde el aglicón R1 es un resto de naturaleza hidrofóbica, preferentemente una cadena hidrocarbonada de 8-16 carbonos, lineal o ramificada.

1 (R = ! quito) La preparación de los compuestos de formula general 1 comienza por la reaction de la N-acetil-glucosamina 2 con el correspondiente alcohol derivado del resto hidrofóbico, en presencia de un promotor acido, para dar lugar a los glicósidos 3. La tritilación selectiva de la position 6 conduce a los compuestos 4 que fueron bencilados en los grupos hidroxilo de las posiciones 3 y 4, dando lugar a los compuestos 5. La metanolisis acida de estos compuestos condujo a los alcoholes 6 que son sometidos a una alquilación con un sulfato ciclico derivado del pentaeritritol (compuestos 10) preparado begun se muestra en el esquema 1. De la reacci6n de alquilación se obtienen los productos 7 que por hidrogenolisis y posterior hidrólisis acida dieron lugar, finalmente, a los compuestos 8 objeto de la presente invencion.

2 R1 = R2 = R3 = R4 = H 3 R1 = C8-C16-alquilo, R2 = R3 = R4 = H 4 Ri = C8-C16-alquilo, R2 = R3 = H, R4 = Tr 5 Ri = C8-C16-alquilo, R2 = R3 = Bn, R4 = Tr Ar 6 Ri = C$-C6-alquilo, R2 = R3 = Bn, R4 = H O O 7 R1 = C8-C16-alquilo, R2 = R3 = Bn, R4 = AOSO3Na 8 Ri = C8-C16-alquilo, R2 = R3 = H, R4 = CH2C (CH20H) 2CH2OSO3Na 1 R1 = C8-C16-alquilo, R2 = R3 = H, R4 = CH2C (CH20H) 2CH20H

Ar Ar OH OH O O O 0 Ar-C (OMe) 2 Im2S02 z OH OH OH OH o. 0 S Pentaeritritol 9 0 0 10 Esquema 1 La actividad inhibitoria del crecimiento de glioblastoma humano de los glicósidos 1 se ha investigado analizando sus efectos sobre la incorporación de timidina al ADN en cultivos de las lineas celulares transformadas U-373 MG, capaces de crecimiento

maligno. Los resultados indican que los compuestos son capaces de inhibir la division celular a concentraciones micromolares.

Zambien se han realizado experimentos in vivo, utilizando ratas como animales de experimentación portadoras de un tumor en el espacio epicraneal. La administración de los compuestos por inyección i. t. durante un periodo de quince dias y analisis del volumen tumoral, muestra que los compuestos 1 son capaces de reducir el volumen tumoral hasta su desaparición.

Los compuestos 1 de la presente invenci6n, a la vista de los resultados obtenidos, poseen una potencial aplicación en el tratamiento de glioblastomas humano.

Los siguientes ejemplos ilustran el proceso sintético y muestran las mediciones de actividad biológica con alguno de los productos preparados. Debe ser entendido, no obstante, que la invention no esta limitada a los reactivos y condiciones mostrados en los ejemplos.

Breve descripción de la figura Figura 1 : Curvas de crecimiento del tumor en las ratas tratadas con suero fisiologico (controles) y con el compuesto 1 (Rl = octilo).

Ejemplos Preparación de octil 2-acetamido-6-0-[2. 2-bis (hidroximetil !-3-hidroxipropil-ot-D- glucopiranósido (1, R = octilo) Una mezcla de N-acetil-D-glucosamina (2 con R1 = octilo, 5 g, 23 mmol), octanol (10. 87 mL, 69 mmol), nitrometano (180 mL) y BF3. 0Et2 (0. 45 mL), se calent6 a 100 °C con agitation durante 5 h. Pasado este tiempo, la mezcla de reaction se dejo enfriar a temperatura ambiente, se concentre y el residuo se fracciono en una columna de gel de silice empleando diclorometano-metanol (20 : 1 c 5 : 1) como eluyente. Se obtuvo una fraction que contiene 3 (con Ri = octilo) (3. 17 g, 42%). P. f. 157-159 °C, [a] +129. 5 ° (c = 1. 0, metanol).

El compuesto 3 (0. 71 g, 2. 13 mmol) se disolvió en piridina (4. 7 mL) y se trató con 4-dimetilaminopiridina (0. 05 g, 0. 43 mmol) y cloruro de tritilo (1. 78 g, 6. 4 mmol), calentándose a 100 °C con agitación bajo atmósfera de argon durante 4. 5 h. Seguidamente

la mezcla de reaction se concentre a sequedad mediante adiciones y evaporaciones sucesivas de tolueno. El residuo se paso a través de una columna de gel de silice utilizando diclorometano-metanol (1 : 0- 15 : 1) como eluyente. Se obtuvo 4 (Rl = octilo) (1. 03 g, 84%) como un sólido. P. f. 61-65 °C, [a] +72. 3 ° (c = 1. 0, metanol).

A una disolución del compuesto 4 (2. 64 g, 4. 6 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (26 mL) enfriada a 0°C, se adicionó hidruro sódico (0. 35 g, 14. 7 mmol) agitandose hasta que cesa el burbujeo de hidrógeno gas. A continuación se anadio yoduro de terabutilamonio (0. 85 g, 2. 3 mmol) y bromuro de bencilo (1. 20 mL, 10. 1 mmol). La mezcla de reaction se calent a 80 °C con agitation bajo atmósfera de argon durante 1. 5 h. Pasado este tiempo, se adiciono metanol y la mezcla se agité a temperatura ambiente durante 0. 5 h. Se adicionó agua y la mezcla se extrajo con eter etilico (2 veces). La fase organic se secó sobre sulfato sódico y se concentre a sequedad. El residuo se cromatografió en columna de gel de silice empleando hexano-acetato de etilo (8 : 1" 1 : 1) como eluyente. Se obtuvo una fraction que contiene 5 (Rl = octilo) (3. 1 g, 89%) como un solido. P. f. 52-54 °C, [a] +68. 2 ° (c = 1. 0, cloroformo).

Una disolución del compuesto 5 (0. 53 g, 0. 70 mmol) en diclorometano-metanol (1 : 2, 7 mL) se trató con acido p-toluensulfónico (0. 027 g, 0. 14 mmol) a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacci6n se neutralize con trietilamina y se concentre.

El residuo se redisolvio en diclorometano y se lavo con agua. La fase organic se secó (sulfato sódico) y se evaporo. El residuo resultante se pas6 a través de una columna de gel de silice (diclorometano-metanol 30 : 1) para dar lugar a 6 (Rl = octilo) (0. 34 g, 95%). P. f. 130-132 °C, [a] +100. 0 ° (c= 1. 0, cloroformo).

Una mezcla de 6 (0. 2 g, 0. 4 mmol), tetrahidrofurano (8. 4 mL) y N, N- dimetilformamida (1. 2 mL) se trató con hidruro sódico (0. 019 g, 0. 8 mmol) y compuesto 10 (Ar = p-metoxifenilo) (0. 189 g, 0. 6 mmol) calentándose a 100 °C con agitation durante 1. 5 h. Pasado este tiempo se de) 6 enfriar a temperatura ambiente, se adicionó metanol (0. 1 mL) y se concentre. El residuo se paso a través de una columna de gel de silice (diclorometano-metanol 30 : 1 + 10 : 1) para dar lugar a 7 (R1 = octilo, Ar = p- metoxifenilo) (0. 325 g, 98%). P. f. 125-129 °C, [a] +57. 3 ° (c = 1. 4, cloroformo).

Una mezcla de 7 (0. 29 g, 0. 34 mmol), metanol (21 mL) y catalizador de paladio sobre carbon activado al 10% (0. 23 g) se agité en atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 2 h. La suspension se filtro sobre celita y se concentre a sequedad

obteniéndose el compuesto 8 (Rl = octilo) (0. 14 g), el cual se disolvió en una mezcla de dioxano-metanol 3 : 1 (10 mL) y se trató con acido sulfuric 1M (0. 0115 mL), agitandose a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se neutralize con bicarbonato sódico y se concentré. El residuo se eluyo a través de una columna de gel de silice (diclorometano-metanol 8 : 1- 5 : 1) para dar lugar a 1 (Rl = octilo) (0. 138 g, 99%). P. f.

35 °C, [a] +74. 7 ° (c = 1. 2, metanol). 1H-RMN (400 MHz, CD30D) : 8 4. 96 (d, 1H, J3. 5 Hz, H-1), 4. 07 (dd, 1H, J3. 6 y 10. 7 Hz, H-2), 3. 81-3. 92 (m, 5H) 3. 79 (s, 6H, 3CH20H) 3. 65-3. 72 (2d, J 9. 1 Hz, OCH2C (CH20H) 3), 3. 60 (m, 2H, OCH2 octilo), 2. 18 (s, 3H, CH3CO) 1. 80 (m, 2H, octilo), 1. 40-1. 60 (m, 10H, octilo), 1. 10 ppm (m, 3H, CH3 octilo).

Preparación de 3, 3-dioxo-9- (p-metoxifenil)-2. 4. 8. 10-tctraoxo-3-tiaespiro [5. 5] decano 10 (Ar = p-metoxifenilo) Una mezcla de pentaeritritol (10 g, 73. 4 mmol) y agua (72 mL) se calent6 hasta su completa disolución y se dejo enfriar a temperatura ambiente sin agitacion. A continuación, se comenzó a agitar y se adicionó acido clorhidrico concentrado (0. 37 m) y anisaldehido (1 mL). Cuando en el matraz de reaction empezó a precipitar un solid blanco, se anadio mas anisaldehido (8. 32 mL) gota a gota durante aproximadamente 2 h y la reaction se continue durante 3 h. El precipitado se filtro y se lav6 con agua-hielo ligeramente alcalinizado con carbonato s6dico. Se sec6 sobre pentóxido de fósforo en un desecador, onteniéndose 9 (Ar =p-metoxifenilo) como un solid (15. 7 g, 84%). P. f. 163- 166 °C.

A una suspension de 9 (2 g, 7. 84 mmol) en TIE anhidro (40 mL) se anadio hidruro sódico (0. 42 mg, 17. 6 mmol) y 1, 1'-sulfonildiimidazol (2. 3 g, 11. 7 mmol) disuelto en THF (30 mL). La mezcla reaccionante se agit6 a temperatura ambiente durante 2 h. Transcurrido este tiempo se adicionó metanol y se evaporo a sequedad. El residuo se purifico por cromatografia en columna (hexano-diclorometano 5 : 1) para dar 10 (Ar =p-metoxifenilo) como un solido. P. f. 181-184 °C.

Actividad In Vitro de los Compuestos La inhibition de la mitosis por los compuestos sintetizados se comprobó in vitro midiendo la incorporación de timidina tritiada [M. Nieto-Sampedro (1987). Astrocyte mitogenic activity in aged normal and alzheimer's human brain. Neurobiol. Aging. 8 :

249-252] en cultivos de cellas de glioma humano U-373 MG [J. Ponten y E. H.

Macintyre (1968) Long-term culture of normal and neoplastic human glia. Acta Pathol.

Microbiol. Scand. 74 : 465-486]. Como ejemplo concreto, los valores de ICso (concentración de inhibidor que produce el 50% de inhibición) encontrados para el compuesto 1 (Rl = octilo) en cuatro experimentos independientes a diferentes concentraciones del compuesto (cada una de ellas realizada por triplicado) fueron : 30, 33, 50 y 60 (valor calculado de IC50 promedio = 43 i 14 uM).

Actividad In Vivo de los Compuestos Para el estudio in vivo se utilize un total de 45 ratas Wistar (90-100 g), machos y hembras de 30 dias de edad. Al inicio del experimento todos los animales eran portadores de un tumor en el espacio epicraneal, con un tamano de 0. 032 cm2. Dicha neoplasia corresponde a un tumor experimental murino inducido mediante la administración de etil- nitrosourea transplacentariamente, que ha sido tipificado como un tumor neuroectodérmico indiferenciado.

Los animales fueron separados al azar en dos grupos experimentales. Un grupo de 25 animales recibió durante 15 dias seguidos una inyección i. t. del compuesto 1 (Rl = octilo), a la dosis de 4 mg/dia en un volumen de 0. 1 cm2 de suero fidsiologico (dosis total por animal, 60 mg). Los animales del grupo control recibieron durante 15 dias inyecciones i. t. de 0. 1 cm2 de suero fisiologico.

El volumen tumoral fue medido a lo largo del estudio utilizando un calibrador y aplicando la formula de Houchens et al. [The therapy of human tumors in athymic (nude) mice. In : Houchens DP and Ovejera AA (eds), Proceedings of the symposium on the use of athymic (nude) mice in Cancer Res. pp : 267-280. Gustav Fischer, New York, 1978] : Vol (cm2) = 0. 5 x L x W2 L : diámetro maxim del tumor W : diametro minimo del tumor La figura 1 recoge las curvas de crecimiento obtenidas de las sucesivas medidas del tumor.

A los 15 dias de tratamiento, se tomo un grupo de 5 animales pertenecientes a los tratados con el compuesto 1 y se dejaron evolucionar sin ningún tipo de tratamiento. A los 30 dias de evolucibn, estos animales no presentaron ninguna lesion en la zona de administración del compuesto y no se evidenciaron signos de recurrencia tumoral.