Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
GLYCOSYL PHOSPHOTRIESTER DERIVATIVES AND THEIR UTILIZATION FOR THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/1994/013686
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to compounds having a pharmacological activity in the central nervous system, having the capacity of traversing the blood-brain barrier after peripheral administration of said compound, and having the general formula (I) wherein A is O, N or S; R1 is (1) either: [sugar or desoxy sugar in C5 or C6, substituted or unsubstituted ]n in series D or L: n = 1 to 6, and the junction between the sugar and the phosphorous being on one of the hydroxyls at the apex 2, 3, 4 or 6; (2) or: (Ose) X - O - [(CH2)y - O]z - wherein Ose is a sugar in C5 or C6, D or L, the substitution of the chain 0 - [(CH2)y - O]z bearing on the hydroxyl of apex 1 of the sugar; x is an integer from 1 to 12; y is an integer from 1 to 6; z is an integer from 1 to 4; R2 is an alkyl group having from 6 to 30 carbon atoms, saturated or unsaturated, which may carry branches or cycles; N is a molecule susceptible of acting on the central nervous system.

Inventors:
HUYNH-DINH TAM (FR)
FILLION GILLES (FR)
Application Number:
PCT/FR1993/001253
Publication Date:
June 23, 1994
Filing Date:
December 15, 1993
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
PASTEUR INSTITUT (FR)
HUYNH DINH TAM (FR)
FILLION GILLES (FR)
International Classes:
C07H11/04; C07H15/26; (IPC1-7): C07H15/26; C07H11/04
Domestic Patent References:
WO1989012062A11989-12-14
WO1992000988A11992-01-23
Foreign References:
Other References:
A. NAMANE ET AL.: "Improved Brain Delivery of AZT Using a Glycosyl Phosphotriester Prodrug", J. MED. CHEM., vol. 35, 1992, pages 3039 - 3044
F. IGLESIAS GUERRA ET AL.: "Synthetic 6-Glucosyl Phospholipid as a Drug Transport System", TETRAHEDRON LETT., vol. 28, 1987, pages 3581 - 3584
Download PDF:
Claims:
REVENDICATIONS
1. Composés présentant une activité pharmacologique au niveau du SNC, ayant la capacité de traverser la BHE après administration dudit composé par voie périphérique, et présentant la formule générale : O R.,0 P AM OR2 dans laquelle : A = 0, N, ou S R, représente soit : [sucre ou désoxy sucre en C5 ou C , substitué ou non]n en série D ou L : n = 1 à 6, et la jonction entre le sucre et le phosphore étant sur l'un des hydroxyles des sommets 2, 3, 4 ou 6 ou soit : (Ose) x 0 [(CH2)y 0]z dans lequel Ose représente un sucre en C5 ou C6, D ou L, la substitution de la chaîne 0 [(CH2)y 0]z se faisant sur le sommet 1 du sucre, x est un nombre entier de 1 à 12 ; y est un nombre entier de 1 à 6 ; z est un nombre entier de 1 à 4 ; R2 représente un groupe alcoyle de 6 à 30 atomes de carbone, saturé ou non, pouvant porter des ramifications ou des cycles, M représente une molécule susceptible d'agir au niveau central, on peut citer en particulier les psychotropes, les analgésiques, les régulateurs cérébraux des systèmes immunitaires ou cardiovasculaires ; il peut également représenter un précurseur desdites molécules susceptibles d'être transformées dans le SNC en la molécule active, ladite molécule pouvant être, par exemple, un peptide ou polypeptide ou une protéine glycosylée ou non, une molécule cyclique ou hétérocyclique choisie par exemple dans les différentes familles de psychotropes, cette liste n'étant pas limitative et pouvant inclure tout substance active ayant un radical hydroxyle, thiol ou aminé susceptible d'être estérifie ou amidifié sur une fonction phosphate.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le motif ose est choisi parmi le mannose, le désoxyglucose, le glucose, le galactose, le fructose et le fucose.
3. Composé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que x est égal à 1, y est égal à 2 et z est égal à 1.
4. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit de phosphotriesters glycosylés de formule II : dans laquelle : R2 a la même définition que dans la formule I ci dessus et peut être par exemple un radical cholestryl, phytyl et/ou R a les signification suivantes : R = H : le sucre est alors un désoxyglucose et la formule II générale est codée sous le n° CT15165, R = OH : le sucre est alors un mannose et la formule II générale cidessus est codée n° CT16729, . R = OH : le sucre est alors un glucose et la formule II générale est codée n° CT16731, M est la Nacétyltryptamine.
5. Composé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il s'agit de phosphotriesters glycosylés de formule III : dans laquelle R, R2 et M ont la m me s gn f cat on que dans la formule II.
6. Composé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le groupe R2 représente une chaîne alcoyle renfermant de 2 à 30 atomes de carbone, le cas échéant, substitué par un groupe NH2, NHR1 ou NR'R" dans lesquels R1 et R" représentent un groupe alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone.
7. Procédé de préparation d'un composé selon les revendications 1 à 6 caractérisé par les étapes suivantes : a) phosphorylation d'un sucre convenablement protégé avec un phosphite qui est in situ couplé avec la N acétyl hydroxy5 tryptamine et oxydé en phosphotriester correspondant ; b) enlèvement des groupements protecteurs du sucre et du phosphate en phosphodiester, isolé sous forme de sel de tétrabutyl ammonium ; c) substitution nucléophile d'un halogénure d'alcoyle avec le sel du phosphodiester pour donner le phosphqtriester ; étant bien entendu que les différentes variantes permettant l'obtention des dérivés de formule I, II ou III en utilisant la chimie classique du phosphore trivalent, font également partie de l'invention.
8. Composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de désordres ayant leur origine dans le système nerveux central, comprenant comme principe actif un composé selon l'une des revendications 1 à 5 en association avec un support pharmaceutiquement acceptable.
Description:
DERIVES GLYCOSYL PHOSPHOTRIESTERS ET LEUR UTILISATION AU NIVEAU DU SYSTEME NERVEUX CENTRAL

L'invention a pour objet des dérivés glycosyl phosphotriesters de substances susceptibles de passer la barrière hématoencéphalique (BHE) et possédant une activité pharmacologique au niveau du système nerveux central (SNC) .

Un problème important posé en pharmacologie est celui de la disponibilité des médicaments au niveau de leur cible thérapeutique, et dans ce domaine, le passage de la BHE. Parmi ces. substances, on peut citer les psychotropes (antidépresseurs, neuroleptiques ou anxiolytiques) , les analgésiques, voire divers régulateurs du système réticuloendothélial ou du système cardiovasculaire. Un mauvais passage de la BHE constitue un inconvénient majeur à l'administration de substances devant agir au niveau du système nerveux central.

Ces substances sont généralement administrées par voie périphérique (orale, intraveineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale) à des doses massives avec l'objectif qu'une fraction minime atteigne la cible cérébrale. Le résultat en est le plus souvent 1'induction d'effets secondaires importants et handicapants.

Différentes stratégies ont été développées pour permettre le ciblage de substances à effet pharmacologique au niveau du système nerveux central. L'une de celles-ci, développée par N. Bodor et coll. depuis le début des années 1980, est le système redox-dihydropyridine/pyridiniu (cf. notamment les brevets Bodor : US n° 4.479.932, n° 4.540.564, n° 4.617.298, n" 4.727.079, n" 4.824.850, n° 4.829.070, n" 4.863.911, n° 4.880.816, n" 4.880.921, n' 4.900.837,

ainsi que les demandes de brevets PCT WO83/03968 et WO86/00897 au nom de University of Florida.

Ce système, s'il a donné des résultats encourageants au laboratoire, se heurte à des inconvénients majeurs lors de la transposition à la conception d'un médicament : les dérivés contenant la dihydropyridine sont instables, et extrêmement sensibles à l'oxydation. En outre, ce type de composé est insoluble dans une solution aqueuse, ce qui rend problématique son administration systémique.

D'autres approches ont été développées, également par Bodor dans la demande de brevet PCT 092/00988. Dans cette approche, des dérivés phosphonates ont été développés. Ces composés ont un résidu composé d'une substance pharmacologique ayant un groupe réactif fonctionnel, lequel groupe est couplé, directement ou par un groupe de pontage, et via un lien -O-, à l'atome de phosphore du composé ; ces composés sont hydrolyses in situ, permettant la libération de la substance pharmacologique et de son site actif.

La présente invention a pour but la mise au point d'une approche nouvelle et de nouveaux composés dans le but de permettre le ciblage de molécules au niveau central, par un moyen utilisable en tant que médicament chez 1•homme ou 1'animal.

Une substance pharmacologiquement active qui, originellement passe mal ou pas du tout la barrière hématoencéphalique, est modifiée par l'adjonction d'un groupement phosphate estérifié par un sucre et une chaîne lipidique qui lui permettent de franchir cette barrière ; au niveau du système nerveux central (SNC) , des réactions métaboliques permettent de libérer à nouveau la molécule active dans son état initial et ce, au voisinage de ses cibles.

La présente invention est une nouvelle famille de composés présentant une activité pharmacologique

centrale, ayant la capacité de traverser la BHE après administration dudit composé par voie périphérique, et présentant la formule I générale : 0

II

R.,0 - P - AM

I

0R 2 dans laquelle : A = O, N ou S

- R-, représente

1) soit : [sucre ou désoxy sucre en C 5 à C 6 , substitué ou non] n , en série D ou L ; n = 1 à 6, et la jonction entre le sucre et le phosphore étant sur 1'un des hydroxyles des sommets 2, 3, 4, 6, ou

2) soit : (Ose) x - 0 - [(CH 2 ) y - 0] z - dans lequel Ose représente un sucre en C 5 ou C 6 , D ou L, la substitution de la chaîne 0 - [(CH 2 ) y - 0] 2 se faisant sur le sommet 1 du sucre.

- x est un nombre entier de 1 à 12 ;

- y est un nombre entier de 1 à 6 ;

- z est un nombre entier de 1 à 4 ;

- R 2 représente un groupe alcoyle de 6 à 30 atomes de carbone, saturé ou non, pouvant porter des ramifications ou des cycles ;

- M représente une molécule susceptible d'agir au niveau central. On peut citer en particulier les psychotropes, les analgésiques, les régulateurs des systèmes immunitaires ou cardio-vasculaires ; il peut également représenter un précurseur desdites molécules susceptibles d'être transformées dans le SNC en la molécule active.

Ladite molécule peut être, par exemple, un peptide ou polypeptide ou une protéine glycosylée ou non, une molécule cyclique ou hétérocyclique choisie par exemple dans les différentes familles de psychotropes. Cette liste n'est pas limitative et peut inclure tout

substance active ayant un radical hydroxyle, thiol ou aminé susceptible d'être estérifie ou amidifié sur une fonction phosphate.

Pour démontrer l'efficacité de cette méthodologie, l'hydroxy-5 N-acétyltryptamine a été choisie comme modèle. Ce composé est un dérivé de la sérotonine ne présentant qu'une fonction OH chimiquement réactive ; c'est un métabolite de la sérotonine qui est transformé dans le cerveau par une O-méthyl transférase en mélatonine (CT15850) . La mélatonine est une hormone sécrétée par la glande pinéale ; son rôle est assez complexe : elle peut être considérée comme un médiateur impliqué dans la photopériodicité, la thermorégulation, la reproduction et l'activité locomotrice chez un certain nombre d'animaux (L. Tamar in, C.J. Baird and O.F.X. Almeida, Science (1985), 227:714-720 ; S.M. Reppert, D.R. Weaver, S.A. Rivkees and E.G. Stopa, Science (1988), 242.78-81 et V.M. Cassone, TINS (1990), 1_3:457-467 ; D.N. Kranse and M.L. Dubocovitch, TINS (1990), 2^3:464-470. Chez l'homme, la mélatonine a été utilisée pour resynchroniser les rythmes circadiens et pour combattre les effets physiologiques et psychologiques du décalage horaire (jet lag) ; d'autre part, des travaux récents semblent indiquer en plus un rôle immunomodulateur et anti-stress (A. Conti and G. Maestroni, Neuroimmunomodulation in pharmacology, 2nd Course of the Fédération of the European Pharmacological Sociétés, 5-7 February 1992, PARIS). Quand elle est administrée par voie intrapéritonéale (IP) la mélatonine à forte concentration (30 mg/kg) n'a pas d'effet sur la locomotion de la souris (Ducobovitch et al., 1990, Eur. J. Pharmacol. 182:313-325) , alors qu'une injection intracérébrale de faible dose (0.1 à 100 ng) directement dans le noyau accumbens diminue l'activité locomotrice (Gaffori et Van Ree, 1985, Neuropharmacology, 24:237-244) .

Ces observations suggèrent fortement un très faible passage de la mélatonine à travers la barrière hématoméningée, après administration périphérique.

La présente invention illustre la capacité des dérivés glycosylphosphotriesters de traverser la barrière hématoméningée et ce, par mesure de l'effet fonctionnel cérébral sur la locomotion des souris. Cet effet a été comparé à celui de la mélatonine seule après administration centrale ou périphérique. La hydroxy-N-acétyltryptamine (CT15166) , a été testé de la même façon.

Un groupe de dérivés phosphotriesters glycosylés de l'invention répond à la formule II suivante :

dans laquelle :

- R 2 a la même définition que dans la formule I ci- dessus et/ou

- R a les signification suivantes :

. R = H : le sucre est alors un désoxyglucose et la formule II générale est codée sous le n° CT15165,

. R = OH : le sucre est un mannose et la formule II générale ci-dessus est codée n° CT16729,

. R = OH : le sucre est un glucose et la formule II générale est codée n° CT16731,

- M est la N-acétyltryptamine.

Les trois dérivés CT15165, CT16729 et CT16731 seront utilisés dans les expériences ci-dessous comme dérivés phosphotriesters glycosylés de la mélatonine.

Cependant, tout autre dérivé sucré dans lequel le sucre est un sucre en C 5 ou en C 6 D ou L répond également aux caractéristiques de l'invention. Parmi celles-ci, on peut citer le fructose, le fucose, les amino hexoses pour les hexoses, ou l'arabinose, le xylose, le ribose, le désoxyribose pour les pentoses.

Un autre composé de 1•invention peut être représenté par la formule III.

dans laquelle R, R 2 et M ont la même signification que dans la formule II.

L'invention concerne également le procédé de préparation de composés de formule I. Ce procédé est un procédé en trois étapes.

La première étape consiste à phosphoryler un sucre convenablement protégé avec un phosphite qui est in situ couplé avec la N-acétyl hydroxy-5 tryptamine et oxydé en phosphotriester correspondant.

La deuxième étape consiste à enlever les groupements protecteurs du sucre et du phosphate en phosphόdiester, isolé sous forme de sel de tétrabutyl ammonium.

La troisième étape consiste en une substitution nucléophile d'un halogénure d'alcoyle avec le sel du phosphodiester pour donner le phosphotriester.

Il est bien entendu que toute variante de ce schéma réactionnel est aussi possible, par exemple phosphorylation de l'hydroxy-5 trypta ine et d'un alcool aliphatique à longue chaîne et alcoylation finale avec un dérivé halogéno-sucre. De même, la chimie décrite ici avec un dérivé du phosphore trivalent (chlorophosphora idite) peut être réalisée avec d'autres dérivés phosphoriques de type phosphotriester (cf. synthèse oligonucléotidique) , phosphonate ou phosphorothioate.

Un exemple particulier de la synthèse des composés CT15165, CT16729 et CT16731 sera donné dans l'exemple I ci-dessous.

Tous les composés obtenus ainsi que les composés intermédiaires ont des caractéristiques spectrales (résonance magnétique nucléaire, ultra-violet, SM) en accord avec les formules proposées. La pureté en a été testée par chromatographie en HPLC (tableau I) .

Les exemples suivants sont destinés à montrer les effets particulièrement avantageux des composés de 1'invention ; une série de glycosyles hexadécylphosphates de 1'hydroxy-5N-acétyltryptamine (CT15165, CT16729 et CT16731) ont été synthétisés. Leur effet sur 1'activité locomotrice chez la souris a été mesuré et comparé avec les effets de la mélatonine seule ' (CT15850) et le précurseur de la mélatonine hydroxy-5 N-acétyltryptamine (CT15166) .

- EXEMPLE I : Synthèse des dérivés CT15165, CT16729 et CT16731 :

A cette fin, on part d'un sucre (désoxyglucose, mannose ou glucose) qui est couplé à une hydroxy-5-N- acétyl tryptamine par un phosphate. La chaîne

hexadécyle est ensuite condensée sur cette structure phosphodiester par l'intermédiaire d'une réaction de substitution nucléophile. , . ,

La chimie du phosphore trivalent (phosphoramidite) a été utilisée afin de permettre des temps de réaction beaucoup plus rapides que ceux du phosphore pentavalent.

Les différentes étapes sont les suivantes et illustrées dans la Figure 1.

Dans ce schéma, a) si R = H :

- le composé de départ (1) est le désoxy-2-D-glucose,

- le composé (6) est le CT15164 (6a) ,

- le composé (7) est le CT15165 (7a) , b) si R = OH, situé à "l'intérieur" du cycle :

- le composé (1) est le mannose,

- le composé (6) est le CT16728 (6b) ,

- le composé (7) est le CT16729 (7b) , c) si R = OH, situé à "l'extérieur" du cycle :

- le composé (1) est le glucose,

- le composé (6) est le CT16730 (6c) ,

- le composé (7) est le CT16731 (7c) .

Première étape : Protection du sucre, et phosphorylation avec un phosphyte couplé avec la N- acétyl hydroxy-5 tryptamine et oxydation en phosphotriester : a) Synthèse de Tétra-O-benzoyl-1,3,4,6 désoxy-2-D- glucose (2a) :

10 g (61 mmoles) de désoxy-2-D-glucose co-évaporés avec la pyridine sont redissous dans 100 ml de pyridine anhydre, on ajoute goutte à goutte 58 ml (70,24 g; 500 mmoles) de chlorure de benzoyle en maintenant la température à 0°C. On laisse une nuit à 4°C, puis on ajoute à 0°C du méthanol jusqu'à dissolution complète du précipité formé. Le solvant est évaporé à sec et le résidu est repris dans du dichlorométhane, lavé 2 fois

avec une solution saturée de NaHC0 3 , puis à l'eau. La phase organique est séchée sur Na 2 SO [ et évaporée à sec pour donner un résidu (32,46 g, 92%) qui est lavé plusieurs fois avec de 1 'éther de pétrole. Rf = 0,27 (AcOEt-hexane, 1-2) . F = 131°C. b) Synthèse de Tri-O-benzoyl-3,4,6 benzyloxy-2 éthyl désoxy-2-D-glucopyranoside (3a) :

On fait arriver un dégagement de HC1 gazeux dans une suspension de 32,26 g de 2a dans 12 ml (84,5 mmoles) , de benzyloxyéthanol à température ambiante pendant 2 h 30 jusqu'à dissolution complète. Le mélange est dilué dans du dichlorométhane, lavé deux fois avec une solution saturée de NaHC0 3 , une fois à l'eau. Le résidu est chromatographié sur colonne de silice Merck 9385 éluée avec du dichlorométhane pour donner 78% de 3a (huile) . Rf = 0,07 (CH 2 C1 2 ) .

RMN (CDC1 3 , ppm) = 1 H: 5,05 (H-,) , 2,0 et 2,60 (H 2 , H 2 ') , 5,80 (H 3 ), 5,6 (H 4 ), 3,9 (H 5 ) , 4,45 (H 6 , H 6 ' ) , 3,6-3,75 (CH 2 ) , 4,55 (CH 2 <>) . c) Synthèse de Tri-O-benzoyl-3,4,6 hydroxy-2 éthyl désoxy-2-D glucopyranoside (4a) :

18,5 g (30 mmoles) de 3a en solution dans 250 ml d'acétate d'éthyle sont hydrogénés catalytiquement en présence de Pd-C (10%) pendant 5 h à 30 psi.

Après filtration sur Celite, le solvant est évaporé à sec et le résidu chromatographié sur colonne de silice éluée avec du dichlorométhane pour donner 19,4 g (86%) de 4a. Rf = 0,49 (MeOH-CH 2 Cl 2 , 5-95). F = 42-46°C. SM (IC, NH 3 ) = 538 (M + 18) . RMN (CDCl 3 , ppm) : 1 H: 5,1 (H T ) , 2,05 et 2,55 (H 2 , H 2 ' ) , 5,75 (H 3 ) , 5,6 (H 4 ) , 4,4 (H 6 , H 6 ') , 3,6 (CH 2 CH 2 OH) , 3,8 (CH 2 CH 2 OH) . d) Synthèse de 5-cyanoéthyl (tri-O-benzoyl 3,4,6 désoxy-2-D-glucopyranosidyl) éthyl-2 (N-acétγl tryptarainyl) -5 phosphate (5a) :

A une solution de 2,29 g (4,4 mmoles) de 4a dans 20 ml d'acétonitrile anhydre et 3,3 ml (2,44 g, 19

mmoles) de diisopropyl éthylamine on ajoute sous atmosphère d'azote 975 μl (1,034 g, 4,4 mmoles) de β- cyanoéthyl N,N diisopropyl chlorophosphora idite. On laisse pendant 15 mn à température ambiante puis on ajoute une solution de 1,284 g (18,3 mmoles) de tétrazole et 800 g (3,67 mmoles) d'hydrox-5-N- acétyltrypta ine dissous dans 15 ml d'acétonitrile anhydre. Après 1 h à température ambiante, on oxyde avec 30 ml d'une solution d'iode 0,1 M (H 2 0-pyridine- THF, 1-10-40) dilué avec du dichlorométhane et lavé deux fois avec une solution de NaHS0 3 (5%) et une fois à l'eau. Après évaporation à sec, le résidu est précipité par 1 'éther de pétrole et chromatographié sur colonne de silice Merck 7734 éluée avec du dichlorométhane enrichi en méthanol (0-5%) . Une deuxième chromatographié -sur colonne de Séphadex LH-20 éluée avec un mélange THF-MeOH (95-5) donne 1,78 g 57% de 5a. Rf 0,40 (MeOH-CH 2 Cl 2 , 75-92,5).

. Deuxième étape : Synthèse des CT15164, CT16728 et

CT16730 a) Synthèse de (désoxy-2-D-glucopyranosidyl) éthyl-2

(N-acétyl trypta inyl)-5 phosphate (6a) (CT15164) :

On traite 900 mg (1,06 mmoles) de 5a avec 50 ml de méthylate de sodium (1%) pendant 10 mn à température ambiante. Après neutralisation avec une résine Do ex AG-50 X8, le solvant est filtré et évaporé à sec pour donner un résidu qui est purifié sur colonne de silice Lichroprep RP-18 (Merck 9303) éluée avec de l'eau graduellement enrichie en méthanol (0-100%) pour donner 457 mg (89%) de 6a sous forme de sel d'ammonium. F = 139°C. Rf = 0,62 (isopropanol-NH 4 OH-H 2 0, 7-1-2) .

Analyse C 20 H 32 O 10 N 3 P, H 2 0 (C, H, N) : Cale. 45,89, 6,50, 8,03 ; ïr. 45,66, 6,53, 7,92. HPLC : R t 11,07 mn.

SM (FAB+) : 527,3 (M + Na+) , 506,2 (M + H)+. UV (MeOH) : 222 (27000), 277 (6000) . RMN (tableau) .

b) Synthèse de (D-Mannopyranosidyl) éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (6b) (CT16728) :

La même séquence de réactions est effectuée à partir de 900 mg (1,406 mmoles) l'hydroxy-2 éthyl-D-α- mannopyranoside 4b (Rf = 0.62, CH 2 Cl 2 -MeOH, 95-5) (Y. Hénin et al., J. Med. Chem. 1191, 3_4: 1830-1837 ; C. Gouyette et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30:6019-6022) pour donner 40% de 5b. (Rf = 0.57, CH 2 Cl 2 -MeOH, 90-10) qui est déprotégé par le méthylate en 6b (95%) . Ce phosphate est échangé sous forme N(Bu) 4+ pour la suite des réactions. (Rf = 0.78, isopropranol-NH 4 0H-H 2 0, 7-1-2) SM (FAB+) : 987,4 (M + N (Bu) 4 ) + . UV (MeOH) : 223 (31000) , 276 (6800) .

Analyse 0 3 ^ 4 0^ 3 ?, 1/2 H 2 0. (C, H, N, P) : Cale. 57,29, 8,62, 5,57, 4,11 ; Tr. 57,27, 8,67, 5,35, 4,28. HPLC: R t 11,07 mn. RMN (tableau I) . c) Synthèse de (D-glucopyranosidyl)éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (6c) (CT16730) :

Le penta-0-benzoyl-l,2, 3,4 , 6 glucose est transformé en bromo-1 tétra-0-benzoyl-2 , 3 ,4 , 6 glucose suivant R.K. Ness et al. (JACS, 1950, 7^:2200-2205) .

On laisse tourner à température ambiante pendant 1 h 30 une suspension de 4,6 g de bro o-glucose (7 mmoles) avec 2,14 g de Hg(CN) 2 , 3,05 g de Hg(Br) 2 , 670 mg de tamis moléculaire 4Â et 1 ml de benzyloxyéthanol dans 40 ml d'un mélange toluène-nitrométhane (1/1) . Après filtration, la solution est diluée avec du dichlorométhane, lavée 3 fois avec H 2 0, NaHC0 3 , H 2 0. Après chromatographié sur colonne de silice Merck 9385 avec du dichlorométhane, on obtient 60% de 3c. (Rf = 0.35, AcEt-Hexane, 1-2) (huile) qui est hydrogéné sur Pd/C pour donner 85% de 4c. (Rf = 0.76, CH 2 Cl 2 -Me0H, 95-5) .

La suite de réactions analogues que pour les séries précédentes donne 5c (9%) Rf = 0.42 (CHC1 2 -

MeOH, 10-90) qui est déprotégée en 6c (78%) . (Rf = 0.40, isopropranol-NH 4 OH-H 2 0, 7-1-2)

Analyse C 36 H 64 0 11 N 3 P, 1/2 H 2 0 (C, H, N) : Cale. 57,29, 8,62, 5,57; Tr. 57,20, 8,78, 5,60. HPLC: R t : 7,05 mn. SM (FAB+) : 987,5 (M + N(Bu)4)+. RMN (tableau) .

Troisième étape : substitution nucléophile d'un halogène d'alcoyle ; synthèse des CT15165, CT16729, et CT16731. a) Hexadécyl (désoxy-2-D-glucopyranosidyl)éthyl-2 (N- acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (7a) (CT15165) :

On passe le phosphodiester 6a sur une colonne de Dowex AG-50 X8, N(Butyl)+ pour obtenir le sel de tétrabutylammonium. 260 mg (0,537 mmoles) du phosphodiester dans 17 ml de CH 3 CN anhydre et'^1,7 ml (1,9 g, 5,4 mmoles) d'iodo-16 hexadécane sont chauffés à 80°C pendant une nuit. Après évaporâtion du solvant, le résidu est précipité avec l'éther de pétrole et chromatographié sur colonne de silice Merck 9385 éluée au dichlorométhane enrichi progressivement au méthanol pour donner 86% de 7a. (Rf = 0.44, CH 2 Cl 2 -Me0H, 80-20).

Analyse C 36 H 61 O 10 N 2 P, 1/2 H 2 0 ; (C, H, N, F) : Cale. 59,92, 8,60, 3,88, 4,30 ; Tr. 60,06, 8,66, 3,89, 3,97. HPLC: R t 15,35 mn. SM (FAB+) : 735,7 (M + Na+) . RMN (tableau) . b) Synthèse de hexadécyl (α-D-mannopyranosidyl)éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (7b) (CT16729) :

Le même protocole que pour 7a sur 250 mg de 6b (0,336 mmoles) donne 74% de 7b. (Rf = 0,32, CH 2 C1 2 - MeOH, 80-20) .

Analyse C j ^^O^^P, H 2 0 (C, H, N, P) . Cale: 57,91, 8,44, 3,75, 4,16 ; Tr. 58,51, 8,45, 3,82, 4,59. UV (MeOH) : 224 (34000) , 286 (5700) .

HPLC: R t 13,19 mn. SM (FAB+) : 751,6 (M + Na+) , 728 (M+) . RMN (tableau 1) .

c) Synthèse de hexadécyl (D-glucopyranosidyl-éthyl-2 (N-acétyl tryptaminyl)-5 phosphate (7c) (CT16731) :

La réaction avec 1 ' iodohexadécane sur 6c donne 69% de 7c. (Rf = 0.35, CH 2 C1 2 - MeOH, 80-20) .

Analyse C^H^N^E, H 2 0 (C, H, N, PJ .Calc: 57,91, 8,44, 3,75, 4,16; Tr.: 58,45, 8,5, 3,83, 4,12. HPLC: R t : 13,11 mn. SM (FAB+) : 751,8 (M + Na+) , 729,7 (MH+) , 728 (M+) . RMN (tableau 1) . Conditions chromatographiques HPLC :

Tampon TEAA : acétate de triéthylam onium 10 *2 M pH 6,5.

Acétonitrile Merck (ACN) .

Durée du gradient : 20 minutes.

Colonne Nucléosil 5-C18 (Macherey-Nagel) (15 cm x 0, 46 cm) .

Débit 1 ml/min.

- EXEMPLE II : Mesure de l'activité pharmacologique des cinq produits CT15165, CT16729, CT16731, CT15850 et CT15166 sur l'activité locomotrice des souris :

Les animaux utilisés sont des souris Swiss de 15 à 18 g (Iffa Credo) . Les souris utilisées sont conservées en animalerie dans un cycle lumière-obscurité 12 h-12 h à 22 °C, et disposant de nourriture et de boisson ad libitum.

Les injections intrapéritonéales (IP) sont effectuées sous un volume de 0,5 ml pour 20 g d'animal, correspondant à 1,10 ou 30 mg/kg pour le mélatonine ou les doses équivalentes pour les dérivés phosphotriesters glycosylés.

Les animaux restent ensuite 15 mn au repos dans leur cage avant de commencer la mesure de leur activité motrice dans un activomètre, selon un procédé décrit ci-dessous.

Les injections intracérébroventriculaires (ICV) sont réalisées à main levée dans le troisième ventricule de l'hémisphère cérébrale droit sous un volume maximum de 5 μl . Le temps de l'injection est de 30 secondes. Les doses utilisées varient de 5 à 50 ng/kg de mélatonine ou de leur équivalence pour les dérivés phosphotriesters glycosylés.

Les animaux sont observés et laissés au repos pendant 15 mn dans leur cage avant de commencer la mesure de leur activité motrice.

L'activité locomotrice des animaux est mesurée dans un activomètre à six compartiments dans lequel l'activité des animaux est mesurée par leur passage dans deux faisceaux lumineux disposés à 90° et dirigés vers deux cellules photoélectriques. La seule locomotion horizontale est enregistrée et ce, pendant 15, 30, 45 et 60 mn.

Les résultats sont exprimés en pourcentage de locomotion mesurée par rapport à des souris témoins ayant reçu du NaCl sous un volume équivalent et mesuré 15, 30, 45 et 60 mn après l'injection, lesquels résultats sont obtenus à des doses variables de composé injecté.

EXEMPLE III : Comparaison des effets de la mélatonine, de la N-acétyltryptamine et du dérivé glycosyl phosphotriester de la N-acétyltryptamine de formules suivantes :

. dérivés phosphotriesters : CT15165 a) R = H desoxyglucose CT16729 b) R = OH annose CT16731 c) R = OH glucose

CT15850 mélatonine :

CT15166 hydroxy-5N-acétyltryptamine

3.1. Injection intracérébroventriculaire (ICV) :

L'injection est réalisée dans les conditions décrites ci-dessus.

Deux doses ont été utilisées 5 ou 50 ng/kg de poids d'animal, en équivalent mélatonine.

La Figure 2 indique les résultats obtenus pour chacune de ces doses avec CT15850, CT15165 et CT15166.

Chacun des trois composés a un effet sur la locomotion.

L'administration ICV des produits étudiés a permis d'observer à la dose de 5 ng/kg un effet inhibiteur de la locomotion progressant avec le temps pour le CT15850, ainsi que le CT15165. Le précurseur de la mélatonine n'a pas montré dans les mêmes conditions d'effet significatif.

A 50 ng/kg, le mélatonine elle-même a montré un effet inhibiteur marqué après 60 minutes, son précurseur CT15166 a également induit un effet

inhibiteur progressant avec le temps ; il en a été de même avec le dérivé ester.

3.2. Administration en périphérie :

Une administration intrapéritonéale a été réalisée dans les conditions décrites plus haut.

Quatre doses ont été utilisées : 0.01, 1, 10 et 30 mg/kg.

Les résultats des tests de locomotion obtenus sont représentés dans la Figure 3a.

La mélatonine elle-même et son précurseur la N- acétyltryptamine, n'ont eu aucun effet significatif pour augmenter ou inhiber la locomotion des animaux et ce, aux quatre périodes de temps analysées après injection. Une faible réduction de l'activité a été observée après 45 et 60 minutes à 10 mg/kg de N- acétyltrypta ine, mais cet effet n'était pas significatif et il n'a pas été confirmé à la dose supérieure de 30 mg/kg.

Au contraire, le dérivé ester CT15165 a réduit l'activité aux trois doses étudiées, de façon modérée à 1 mg/kg et 10 mg/kg et de façon très marquée, à 30 mg/kg.

La Figure 3b indique que 1•administration intrapéritonéale des deux dérivés CT16729 et CT16731 sont aussi efficaces, injectés à la dose de 30 mg d'équivalent mélatonine par kg de souris que le CT15165.

Les résultats obtenus dans cette série expérimentale ont montré que par voie intrapéritonéale, le seul dérivé ester était capable d'inhiber l'activité locomotrice chez la souris aux 3 doses étudiées (1, 10, 30 mg/kg) , alors que dans les mêmes conditions, aucun effet significatif n'était observé pour la mélatonine elle-même ou son précurseur N-acétyltryptamine. Ces résultats suggèrent fortement que le seul dérivé ester a été capable de franchir la barrière

hématoencéphalique pour induire les effets locomoteurs. Cette hypothèse est confortée par le fait que les trois substances étudiées réduisent 1'activité locomotrice lorsqu'elles sont administrées directement au niveau central.

Cette dernière observation indique aussi que les effets locomoteurs observés sont bien d'origine centrale puisque la mélatonine et son précurseur n'ont pas eu d'effet après leur administration au niveau périphérique.

La grande différence que 1'on peut observer entre les doses actives du dérivé ester lorsqu'il est administré ICV (5 à 50 ng/kg) et IP (1 à 30 mg/kg) provient vraisemblablement du fait que ce produit lipophile est séquestré de façon extrêmement importante dans un grand nombre de compartiments périphériques ; en dépit de cette inactivation par sa séquestration ou un métabolisme rapide qui le dénature sous sa forme de mélatonine native, un pourcentage faible mais fonctionnellement très significatif est capable d'atteindre des cibles cérébrales. Dans les mêmes conditions, la mélatonine elle-même ne montre aucune activité à ces mêmes doses.

Ces résultats indiquent donc qu'une molécule active au niveau central mais dont les propriétés physicochimiques préviennent le passage de la BHE peut recevoir un groupement chimique lui conférant la propriété de passer cet obstacle.

Sur la base de ces résultats, il n'a pas été recherché si l'ester pouvait agir en tant que tel ou en tant que mélatonine générée par la dégradation de cette molécule. Cependant, il y a tout lieu de penser que la molécule est métabolisée puisque le cerveau contient vraisemblablement en grand nombre les enzymes nécessaires à cette opération.

Cet exemple n'est pas limitatif de l'importance de 1•invention en terme de moyen nouveau pour cibler une molécule effectrice au niveau de récepteurs spécifiques du SNC.

- EXEMPLE IV : Comparaison des effets d'un peptide analgésique et de ses dérivés glycosylphosphoesters sur les manifestations de la douleur :

Cet exemple est relatif à la mesure de la capacité de transport intracérébral des dérivés de 1'invention pour un peptide présentant un effet analgésique.

Les essais entrepris ont consisté à rechercher chez la souris, par exemple la souris EOPS les propriétés de 1'enképhaline naturelle (TyrGlyGlyPheLeu) et de divers dérivés après administration directement dans le cerveau (injection ICV) ou après administration périphérique (injection IP) .

La mesure de l'activité analgésique de ces substances est mesurée par le test de tail-flick. Brièvement, les animaux sont placés dans une cage individuelle où ils ne peuvent se déplacer. Leur queue est alors exposée pendant une courte durée (maximum 7 secondes) sous un faisceau lumineux dont l'intensité est contrôlée (1=8OmA) et correspond à un apport significatif de chaleur. Le temps mis par la souris pour retirer la queue en dehors du faisceau par un mouvement bref (tail-flick) est mesuré (deux ou trois secondes chez un animal normal) .

L'animal qui reçoit un analgésique réagit en un temps plus long : on fixe le temps maximum d'exposition ("eut off") à 7 secondes, considéré comme suffisant pour indiquer un état d'analgésie.

Dans cette étude, l'effet d'injections IP ou ICV de la [D-Ala 2 -D-Leu 5 ] enképhaline amide YAGFL-NH 2 et du dérivé désoxy-2 glycoside phosphodiester ont été comparés.

Le peptide YAGFL-NH 2 est proche de 1'enképhaline naturelle TyrGlyGlyPheLeu (YGGFL) .

Méthode d'obtention des dérivés diesters et triesters de YAGFL-NH 2 :

Elle se fait par les différentes étapes décrites ci-dessous.

Première étape :

H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-NH 2 > Z-Tyr-D-Ala-Gly-

Phe-D-Leu-NH 2 (1)

95 mg de (D-Ala-D-Leu 5 ) enképhaline amide (0,31015 mmole) sont mis en solution dans 5,5 ml d'eau et 43 μl de triéthylamine (1 éq) . La réaction est suivie en HPLC : CH 3 CN/CH 3 COO " NH 4 + 0.05 M ; λ = 230 nm : colonne C 18 . On injecte 1 μl du mélange reactionnel dans un gradient I5 20n >100% t r =9,55 mn) .

On additionne 78 mg (0,31015 mmole) de N-(benzyloxycarbonyoxy) succinimide dans 5,5 ml de méthanol. Agitation pendant 1 h 30. Injection 1 μl du mélange reactionnel t r =l,88 mn (hydroxysuccinimide libérée) t r =12,4 mn Z(D-Ala 2 -D-Leu 5 ) enképhaline amide. Le mélange reactionnel est évaporé à sec et purifié sur colonne de Sephadex LH 20 (THF 80/MeOH 20) . On obtient 198 mg de (1) (84%) . ccm: 1O% MeOH/CH 2 Cl 2 ; Rf : 0,25, RMN H-, (DMSO-d 6 ) :<5(ppm), CH 3 L : 0,5 et 0,7 (doublet), CH 3 A : 1 (doublet), CH 7 L : 1,1, CH 2/? L : 1,2, CH 2;5 Y : 2,5 et 2,7, CH2 F : 2,8, CH 2 G : 3,5, CH ff L : 3,9, CH.-A : 4,1, CH β Y : 4,2, CH α F : 4,3, CH 2 Benzyl : 4,8, Aromatiques Y : 6,4 et 6,9, Aromatiques F : 7 à 7,2, Aromatiques Benzyl, NH Y : 7,3, NH F-NH G-NH L : 7,9 à 8,1, NH A-OH Y : 9

Deuxième étape :

Z-Tyr-vD-Ala-Gly-Phe-D-Leu-NH 2

AGF -NH.

OBz (2)

272 mg de (hydroxy-2 éthyl) -désoxy-2-D-glucopyrannoside perbenzoylé (0,523 mmole) sont dissous dans 2,3 ml d'acétonitrile anhydre et 387 μl de diisopropyléthylamine. On ajoute 120 μl (0,541 mmole) de 2 cyanoéthyl N,N diisopropylchlorophosphoramidite à l'aide , d'une seringue et agite à la température ambiante 30 mn (CCM : MeOH 05/CH 2 Cl 2 95 Rf : 0,8) .

Après addition de 180 mg de tétrazole (2,535 mmole), de 198 mg de (1) (0,2816 mmole) et 3,4 ml d'acétonitrile anhydre, on remet le milieu sous azote et laisse agiter pendant 1 h 30 (CCM : MeOH 05/CH 2 Cl 2 95 Rf : 0,2) .

On oxyde avec une solution d'iode 0,1 M dans pyridine/eau (addition jusqu'à persistance de la coloration d'iode). Après extraction avec CH C1 2 , le produit brut est chromatographié sur colonne de silice MERCK 7734 (CH 2 Cl 2 /MeOH) .

(CCM : MeOH 10/CH 2 C1 2 90 Rf : 0,3) . On obtient 227 mg de (2) (60%) .

Les caractéristiques en sont les suivantes : SM (FAB + ) : 1337, RMN H. (DMS0-d 6 ) : δ (ppm) , CH 3 L : 0,7 et 0,8, CH 3 A : 1,15, CH y L> : 1,2, CH/3L : 1,4, H' 2 H" 2 : 2,1 et 2,45, CH 23 Y : 2,7 et 2,9, CH 23 F : 2,9, CH 2 G : 3,7, [C 2 ] chaîne : 3,7 ; 3,9 et 4,4, CH α L : 4,1, CH α A-CH α Y : 4,3, CH α F : 4,5, H' 3 : 5,2, H'-, : 5,6, Cyanoéthyl : 4,4

et 5,5, CH 2 Benzyl : 4,9, Aromatiques Y : 6,4 et 6,9, Aromatiques F-Aromatiques Benzyl-Aromatiques Benzoyle : 6,9 à 8, NH Y : 7,3, NH F : 7,6, NH G : 8,1, NH L : 8,15, NH A : 8,25.

Troisième étape :

227 mg (0,1698 mmole) de (2) sont solubilisés dans 9,2 ml de méthanol et 1,65 ml d'une solution de methylate de sodium 1% (0,3054 mmole). On agite pendant 2 h (CCM: Isopropanol 70/ammoniaque 10/eau 20 Rf : 0,7) puis neutralise avec une résine H + AG50 -X8. La purification sur Sephadex G10, puis HPLC (CH 3 CN/CH 3 COO " NH 4 + 0,05 M, C 18 : λ=230 nm; gradient 0 20 E2>60% t r =13,5 mn) donne 112 mg (67%) de (3). Quatrième étape :

70 mg de ( 3 ) ( 0 , 07078 mmole) sont solubilisés dans 8 ml de méthanol et hydrogénés sur palladium-C pendant 1 h

(CCM : Isopropanol 70/ammoniaque 10/eau 20 Rf : 0,6) .

Après filtration et évaporation du solvant, on obtient

56 mg de produit (92%) de (4) , dont les caractéristiques sont les suivantes :

SM (FAB + ) : 838, RMN E^ (DMSO-d 6 ) : δ (ppm) , CH 3 L : 0,7 et 0,8, CH 3 A : 1,15, CH 7 L : 1,25, CH 2/3 L : 1,4, H' 2 H" 2 :

1,4 et 1,9, CH /3 Y-CH 2/3 F 2,8 à 3, H' 4 : 3, H' 3 : 3,6, CH 2 G : 3,6, CH α L 4,1, CH j A : 4,3, CH a Y : 4, CH α F : 4,5, H', : 4,8, OH c , 4 4,9, Aromatiques Y-Aromatiques F : 6,9 à 7,4, NH F 8,1, NH G : 8,35, NH L : 8,2, NH A : 8,75, NH 2 Y : 7,9 à 8,3 Cinquième étape :

112 mg de (3) (0,1132 mmole) sont échangés sur résine Dowex (tétrabutylammonium) . Après lyophilisation, on obtient 137 mg de sel qui est solubilisé dans 3,5 ml CH 3 CN anhydre. On ajoute 355 μl d' iodohéxadécane (1,13 mmole) et agite à 80°C la nuit. (CCM : 15 MeOH/85 CH C1 2 Rf : 0,5) . Après évaporation et trituration à l'éther de pétrole, on purifie sur Sephadex LH 20 (THF 80/MeOH 20) et obtient 62 mg de produit (45%) , dont les caractéristiques sont les suivantes :

SM (FAB + ) : 1197, RMN H-, (DMSO-d 6 ) : δ (ppm) , CH 3 L : 0,5 et 0,6 (doublet) , CH 3 [C 16 ] : 0,65 (triplet) , CH 3 A : 0,95 (doublet) , CH 2 [C 16 ] : 1 à 1,15 ; 1,4 ; 3,9, CH 23 L : 1,2,

H' 2 H" 2 : 1,3 et 1,7, CH 2/3 Y : 2,55 à 2,75, CH 2/J F : 3,3 et

3,45, CH 2 G : 3,5, CH a L : 3,9, CH α Y et A : 4,1, CH α F :

4,3, H 1 , : 4,65, OH : 4,6, OH : 4,75, CH 2 benzyl : 4,8,

Aromatiques Y-Aromatiques F-Aromatiques Benzyl : 6,7 à

7,2, NH Y : 7,35, NH F : 7,9, NH G : 8, NH L : 7,95, NH

A : 8,1.

Sixième étape :

62 mg de (5) (0,0518 mmole) sont dissous dans 4 ml de méthanol et hydrogénés sur palladium-C pendant 1 heure. (CCM : 15 MeOH/85 CH 2 C1 2 Rf : 0,15) . La purification sur Sephadex LH 20 (THF 80/MeOH 20) donne 38 mg de (6) (70%) , dont les caractéristiques sont les suivantes :

SM (FAB + ) : 1064, RMN H, (DMSO-d 6 ) : δ (ppm) , CH 3 L : 0,6 et 0,7 r CH 3 [C 16 ] : 0,75, CH 3 A : 1,05, CH 2 [C 16 ] : 1 à 1,15 ; 1,5 ; 4, CH 7 L : 1,15, CH 2/? L : 1,3, H' 2 H" 2 : 1,3 et 1,7, H' 3 : 3,5, H 1 , : 3,5, OH : 4,80, H' 4 : 2,95 CH 2/? Y : 3,45 à 3,65, CH 2/J F : 3,5, CH 2 G : 3,55, CH a L : 4,1, CH α A : 4,1, CH a Y : 4,1, CH a F : 4,35, Aromatiques Y-Aromatiques F : 6,6 à 7,2, NH F : 8, NH G : 8,15, NH L : 8,02, NH A : 8,1.

24

Traitement des animaux : a) avec le peptide YAGFL-NH 2 :

Les souris reçoivent en injection ICV 3 μg du peptide, de 50 mg/kg en injection IP. b) avec le dérivé (4) :

Le tableau suivant indique que l'activité analgésique du dérivé phosphodiester est observée, que l'injection soit réalisée en ICV, avec un effet maximum à 25 μg par souris, ou en IP à la dose de 30 mg/kg.

EFFET ANALGESIQUE DE L » ENKEPHALINE OU DU DIESTER

c) avec le dérivé 6 :

Les premiers résultats obtenus avec le dérivé phosphotriester (6) confirment l'effet analgésique d'une injection icv.

Ces résultats suggèrent très fortement que l'effet analgésique observé après administration des dérivés phosphoesters de 1 'enképhaline est dû au passage à travers le BBB du complexe estérifie et de la libération du peptide dans le cerveau à partir de ces "prodrogues" .