MISYURIN ANDREY (RU)
FINASHUTINA YULIA (RU)
LYZHKO NATALIA (RU)
SOLOPOVA OLGA (RU)
TURBA ANASTASIA (RU)
MISYURIN VSEVOLOD (RU)
| 1.Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для связывания с белком PRAME человека, характеризующееся следующими свойствами: а) распознающее эпитоп, расположенный в области 160-200 аминокислотных оснований белка PRAME человека; б) не распознающее эпитопы, расположенные за пределами области 160-200 аминокислотных оснований белка PRAME человека; в) по существу, не связывается с белками человека группы PRAME-F, ингибитором рибонуклеаз и белками Toll-подобных рецепторов. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, распознаваемый эпитоп для которого имеет длину не менее 9 аминокислотных оснований. 3.Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, распознающее эпитоп, расположенный в области 160-180 аминокислотных оснований белка PRAME человека. 4.Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, распознающее эпитоп, расположенный в области 180-200 аминокислотных оснований белка PRAME человека. Б.Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, связывающее пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из KVDGLSTEAEQPFIPVEVLVD и DLFLKEGACDELFSYLIEKVK. 6.Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, у которого последовательности CDR легкой и тяжелой вариабельных цепей идентичны соответствующим последовательностям CDR легкой и тяжелой вариабельных цепей антитела 6Н8. 7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, у которого последовательности CDR легкой и тяжелой вариабельных цепей идентичны соответствующим последовательностям CDR легкой и тяжелой вариабельных цепей антитела 5D3. 8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое содержит: CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 1; CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 2; CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 4; CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 9; CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 10, CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 11. 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое содержит: CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 5; CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 6; CDRB вариабельной области тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 8; CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 12; CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: IB, CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 14. 10. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 для получения лекарственного средства для таргетной терапии PRAME-экспрессирующих опухолевых заболеваний. 11. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 для выявления экспрессии белка PRAME в образцах тканей и клеток человека. 12. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 in vivo для стимуляции антителозависимой цитотоксичности против PRAME-экспрессирующих опухолей. 13. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 in vivo для снижения скорости роста PRAME-экспрессирующих опухолей. 14. Фармацевтическая композиция для применения in vivo при состоянии, при котором наблюдается появление на поверхности клеток участков белка PRAME человека, включающих аминокислотную последовательность, выбранную из KVDGLSTEAEQPFIPVEVLVD и DLFLKEGACDELFSYLIEKVK, где композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 в эффективном количестве. |
Количество белка PRAME в опухолевой клетке хорошо коррелирует с уровнем экспрессии мРНК гена PRAME, благодаря чему возможно проводить диагностику как с помощью метода ПЦР с обратной транскрипцией, так и при помощи иммунологических методов. Поскольку экспрессия PRAME является онко-специфичной, её выявление может однозначно свидетельствовать о поражении ткани опухолевыми клетками, что позволяет сделать выводы о степени распространённости опухолевого роста. Кроме этого, выявление белка PRAME может быть полезно при оценке минимальной остаточной болезни после проведения терапии.
Экспрессия белка PRAME опухолевой клеткой может также использоваться для таргетной терапии. PRAME-специфическое антитело может связаться с PRAME-позитивной опухолевой клеткой и инициировать реакцию антитело-зависимой клеточно- опосредованной цитотоксичности либо антитело-зависимой комплемент- опосредованной цитотоксичности, либо антитело можно использовать как молекулу, доставляющую конструкции для уничтожения опухолевой клетки. Поскольку это может приводить к гибели опухолевой клетки, данные антитела могут быть использованы в противоопухолевой терапии.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Вестерн-блоттинг рекомбинантного белка PRAME антителами 5D3 (1) и 6Н8
(2).
Фиг. 2. Схема фрагментов белка PRAME, слитых с тиоредоксином, для картирования эпитопов антител против PRAME.
Фиг. 3. Окрашивание клеток линии ТНР1 при помощи антител 5D3 и 6Н8.
Фиг. 4. Иммуногистохимическое окрашивание клеток ксенографта линии рака лёгкого человека А549 при помощи мышиных и химерных антител в разведении 1:50: А - 5D3, Б - 6Н8, В - 5D3chim, Г - 6H8chim
Фиг. 5. Скорость роста клеток линии А875 in vitro в условиях введения различных антител.
Фиг. 6. Скорость роста клеток линии клеток меланомы B16F10-pCEP4-PRAME in vivo в условиях введения различных антител.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время известно 9 коммерчески доступных моноклональных антитела, связывающих белок PRAME. Четыре антитела - кроличьи, причём два из них поставляются фирмой Abeam в виде одного реагента аЬ244107 для выполнения ELISA. Ещё одно кроличье антитело аЬ219650 от фирмы Abeam предназначено для выполнения вестернблоттинга, иммуногистохимии, иммуноферментного анализа, проточной цитометрии и иммунопреципитации. Наконец, антитело E7I1B от Creative biolabs предназначено для выполнения вестернблоттинга и иммунопреципитации. Пять мышиных антител представлены клонами Н-10 и D-12 от Santa Cruz biotechnology, которые могут быть использованы в протоколах вестернблоттинга, иммуногистохимии, иммуноферментного анализа, проточной цитометрии и иммунопреципитации, клоном 2В4 от Creative biolabs, которые были разработаны для проведения ELISA и вестернблоттинга, и клонами CL5148 и CL5146 от Thermofisher, разработанным для проведения иммуногистохимии и вестернблоттинга. Доступна информация о 282 поликлональных антител, распознающих человеческий белок PRAME, и пригодных использованию при определении наличия белка PRAME различными методами.
Перечисленные антитела имеют ряд ограничений в использовании. Поликлональные антитела могут быть использованы в лабораторной практике, но не могут быть быстро преобразованы в антитела других типов, например, гуманизированных или химерных, без предварительного клонирования. Известные анти-PRAME моноклональные антитела недостаточно специфично распознают целевой белок. Согласно опубликованным данным вестернблоттинга, из девяти клонов только четыре распознают белок с массой, соответствующей массе PRAME около 59 кДа - это клоны аЬ219650, Н-10, CL5148 и CL5146. Клон D-12 распознаёт белок другой массы, равной приблизительно 47 кДа. Данные о массе белков, распознаваемых при помощи продукта аЬ244107 и клонов E7I1B и 2В4 в настоящий момент недоступны. В настоящее время в уровне техники нет информации об эпитопах белка PRAME, которые должны присутствовать в антигене при создании PRAME-направленного антитела. Проблема разработки специфичного антитела против белка PRAME человека осложняется тем, что PRAME имеет значительную степень гомологии с белками группы PRAME-F, а также белком ингибитором рибонуклеаз и белками Toll-подобных рецепторов. Клон аЬ219650 разрабатывался против полипептида, имеющего структуру белка PRAME в положении 410-509 аминокислотных остатков. Клоны, включенные в состав продукта аЬ244107 были разработаны путём иммунизации полноразмерным белком PRAME человека. Клоны Н-10 и D-12 разрабатывались против полипептида, имеющего структуру белка PRAME в положении 126-205 аминокислотных остатков. Клон 2В4 разрабатывался против полипептида, имеющего структуру белка PRAME в положении 1-151 аминокислотных остатков. Наконец, клоны CL5148 и CL5146 разрабатывались против полипептида, имеющего структуру белка PRAME в положении 265-385 аминокислотных остатков. Все представленные полипептидные фрагменты слишком велики, чтобы не иметь значительной гомологии с белками, которыми гомологичен белок PRAME. Таким образом, специфичность перечисленных клонов вызывает сомнения. Более того, в настоящее время пока не было разработано ни одного PRAME-распознающегося антитела, которое было бы введено животным или человеку.
Задачей данного изобретения являлась разработка специфических антител, пригодных для элиминации PRAME-экспрессирующих клеток из организма млекопитающего. В примерах изобретения продемонстрировано использование 5D3 и 6Н8 в экспериментах на мышах, которым была привита мышиная опухоль. При этом, ряду мышей была введена опухоль, в которую был введён «пустой» вектор, другим мышам - вектор, позволяющий экспрессировать белок PRAME человека. Были получены результаты, показавшие способность антител 5D3 и 6Н8 замедлять скорость роста PRAME- экспрессирующих клеток мышиной меланомы, но не оказывающих влияния на скорость роста меланомы, не экспрессирующей PRAME. Эти данные свидетельствуют, для проявления противоопухолевой активности антителами 5D3 и 6Н8 необходима экспрессия PRAME в клетках-мишенях. Таким образом, можно использовать антитела не только для лечения меланомы, но и любых других PRAME-экспрессирующих заболеваний.
Связывание антител с клеточной мембраной запускает реакцию клеточно- и комплемент-опосредованной цитотоксичности, что приводит к гибели клетки. Именно этот механизм лежит в основе противоопухолевого эффекта, достигаемого антителами. Поскольку PRAME присутствует на поверхности только опухолевой клетки, здоровые клетки не подвергнутся воздействию антител, и не будут уничтожены. Таким образом, антитела, распознающие белок PRAME, могут быть не только эффективным противоопухолевым препаратом, но также отличаются безопасностью.
Помимо прямой цитотоксичности, циркулирующие в организме антитела могут связывать фрагменты белка RPAME, попавшие кровь или лимфу после разрушения PRAME-экспрессирующих опухолевых клеток. Комплекс антиген-антитело может транспортироваться в периферические лимфоидные органы и презентировать антиген наивным В- и Т-лимфоцитам. В результате может начаться выработка собственного гуморального и клеточного иммунного ответа. Ответ будет направлен против клеток опухоли, и будет проходить по тем же механизмам, что которые используются для атаки инфицированных нормальных клеток. Таким образом, антитела 5D3 и 6Н8 могут быть использованы также для стимулирования собственного иммунного ответа против опухоли.
Поскольку мышиные антитела распознаются иммунной системой человека как чужеродные белки, их можно модифицировать для снижения их иммуногенности. Для достижения этого применяются такие технологии как химеризация и гуманизация, которые позволяют сохранить способность распознавания антигена, но при этом снижающие иммуногенность самих антител.
Список сокращений:
BLAST - онлайн сервис для сравнения, поиска гомологии и определения структурных элементов в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях человека и животных.
V - вариабельный домен
VL - вариабельный домен легкой цепи
VH - вариабельный домен тяжелой цепи
CDR - определяющий комплементарность участок, гипервариабельный участок вариабельной цепи, образующий антигенсвязывающий центр молекулы антитела.
FR - каркасный регион
Fc-фрагмент - кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc, fragment crystallizable region, Fc region).
PBS - фосфатно-солевой буфер.
TPO -торможение роста опухоли.
Антитело - молекула иммуноглобулина, для которого существует антиген.
Аффинность - термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия антигена и антитела; определяется по закону действующих масс как отношение концентрации комплекса антиген - антитело к произведению концентраций компонентов.
Антигенсвязывающий участок антитела - часть антитела, распознающая эпитоп. Имеет несколько названий: активный или антигенсвязывающий центр антител, антидетерминанта или паратоп.
Комплементарность антитела - способность антитела к специфическому взаимодействию с антигеном. За редким исключением антитело взаимодействуют только с тем антигеном, который индуцировал их образование и подходит к ним по пространственной структуре.
Опухолевые антигены - антигены, продуцируемые раковыми клетками и способные вызвать иммунный ответ организма. Являются результатом проявления измененного генома раковой клетки.
Специфичность - способность антитела проявлять различную аффинность по отношению к различным антигенам.
Эпитоп, или антигенная детерминанта - часть макромолекулы антигена, небольшой участок молекулы антигена, который взаимодействует со специфичным к нему антителом. Этот участок распознаётся клетками или молекулами иммунной системы (антителами, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами).
PRAME-экспрессирующая клетка - клетка млекопитающего, в которой экспрессируется белок PRAME.
PRAME-экспрессирующее заболевание - заболевание, при котором опухолевые клетки экспрессируют белок PRAME.
Тяжёлые и лёгкие цепи антител 5D3 и 6Н8 были получены в результате иммунизации мышей рекомбинантным белком PRAME.
Антитела для распознавания антигена PRAME состоят из тяжёлой и лёгкой вариабельных цепей, причём тяжёлая цепь включает области CDRH1, CDRH2, FR3 и CDRH3, которые могут иметь последовательности SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, и лёгкая цепь включает области CDRL1, CDRL2 и CDRL3, которые имеют последовательности SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:ll или SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.
Антитело или фрагмент антитела для связывания PRAME по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1 и вариабельный домен лёгкой цепи, имеющий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2, либо вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:3 и вариабельный домен лёгкой цепи, имеющий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4.
Антитело или фрагмент антитела по изобретению способны связываться с эпитопами PRAME, имеющими следующие последовательности:
KVDGLSTEAEQPFIPVEVLVD (эпитоп, к которому направлено антитело 5D3) DLFLKEGACDELFSYLIEKVK (эпитоп, к которому направлено антитело 6Н8)
Эпитоп с последовательностью KVDGLSTEAEQPFIPVEVLVD имеет координаты 160- 180 в последовательности природного белка PRAME. Для распознавания данного эпитопа антитело должно в тяжёлой цепи содержать последовательности SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 и в лёгкой цепи последовательности SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:ll. Данный эпитоп имеет 5 из 21 совпадающих аминокислотных остатков с белками семейства PRAME, 1 из 21 совпадающих аминокислотных остатков с гомологичным участком последовательности белка ингибитора рибонуклеаз и 3 из 21 совпадающего с последовательностью белков семейства TLR. Эпитоп с последовательностью SEQ ID NO:19 имеет координаты 180-200 в последовательности природного белка PRAME. Для распознавания данного эпитопа антитело должно в тяжёлой цепи содержать последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8 и в лёгкой цепи последовательности SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14. Данный эпитоп имеет 5 из 21 совпадающих аминокислотных остатков с белками семейства PRAME, 1 из 21 совпадающих аминокислотных остатков с гомологичным участком последовательности белка ингибитора рибонуклеаз и 1 из 21 совпадающего с последовательностью белков семейства TLR. Всё это показывает высокую специфичность разработанных антител.
Антитело или его фрагмент по изобретению способны образовывать комплекс с белком PRAME человека, окрашивающийся вторичными антителами, что обеспечивает получение ряда технических результатов - возможность выявления экспрессии белка PRAME в образце опухолевых клеток методами иммуногистохимического окрашивания, возможность выявления белка PRAME в лизатах клеток методами иммуноферментного анализа и возможность белка PRAME в лизатах клеток методами вестерн-блоттинга. Представленные в настоящем изобретении фрагменты антител имеют установленную аминокислотную последовательность, на основании которой можно сконструировать антитела различных вариантов, в том числе Fv, scFv, Fab, F(ab') фрагменты, линейные антитела которые могут быть скомбинированы с другими аминокислотными последовательностями, для ориентированной посадки на сорбент, например, с полилизиновым тагом, различные комбинации фрагментов, их димеры, тримеры (диатела, триатела, тетратела, Bis-scFv, минитела, Fab2, Fab3) и так далее. Эти фрагменты антиген-связывающего участка любого антитела определяют специфичность его связывания с антигеном. Моновалентные F(ab) фрагменты имеют один антиген- связывающий сайт, тогда как двухвалентные F(ab')2 -фрагменты имеют две антигенсвязывающие области, которые связаны дисульфидными связями. Уменьшение F(ab')2 фрагментов дает 2 моновалентных Fab' фрагмента, которые имеют свободную сульфгидрильную группу, которая используется для конъюгации с другими молекулами. Fv фрагмент - это наименьший фрагмент, получаемый в результате ферментативного расщепления антител класса IgG и IgM. Fv фрагмент имеет антиген-связывающий сайт, состоящий из областей VH и ВК, но отсутствуют СН1 и CL области. Цепи VH и VL удерживаются вместе в Fv фрагменте нековалентными взаимодействиями.
Методы генной инженерии позволяют использовать нуклеотидные последовательности, экспрессирующие созданные нами вариабельные домены антител, распознающих PRAME, при конструировании антител различных вариантов. Так, можно создать вариабельные одноцепочечные фрагменты (ScFv), которые представляют собой фрагменты типа Fv и включают домены VH и VL, соединенные гибким пептидом. Когда линкер имеет длину по меньшей мере 12 остатков, фрагменты ScFv в основном мономерные. Манипуляция ориентации V-доменов и длины линкера создает различные формы молекул Fv. Линкеры, которые в длину В-11 остатков, дают ScFv молекулы, которые не могут фолдировать в функциональный домен Fv. Эти молекулы связываются со второй молекулой ScFv, создавая двухвалентное диатело - димер фрагмента антитела формата scFv, "diabody". Диатело может быть и биспецифическое (Бис-scFv), а может и моноспецифическое дивалентное. Если длина линкера составляет менее трех остатков, молекулы scFv объединяться в тритела или тетратела. Мультивалентные scFv обладают большей функциональной аффинностью связывания со своими антигенами-мишенями, чем их аналоги одновалентные из-за связывания с двумя антигенами-мишенями, что уменьшает скорость диссоциации фрагмента антитела. Минитела представляют собой scFv-СНЗ слитые белки, которые собираются в двухвалентные димеры. Миниатюрные фрагменты scFv могут быть сгенерированы с содержанием двух различных вариабельных доменов, что позволяет этим Бис-scFv молекулам одновременно связываться с двумя различными эпитопами. Генетические методы также используются для создания биспецифических (Fab-димеров) и Fab2 триспецифических Fab тримеров (Fab3) Подобные структуры могут создаваться также путём химического конъюгирования Fab-фрагментов. Эти фрагменты антител способны связываться с 2 (Fab2) или 3 (Fab3) различными антигенами сразу. В дополнение, на основании данных о включении данных фрагментов в состав антитела, могут быть созданы камелидные антитела (нанотела, nanobody), которые содержат набор специфических Heavy Chain Antibodies (hcAb), исключительно состоящих из гомодимера тяжелых цепей и не имеют легких цепей. Fab часть этих антител называется VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела), является наименьшей антиген-связывающей областью, найденной в природе. Нанотела представляют собой рекомбинантные домены из VHH, способные связывать антигены. Они очень стабильны и могут быть получены в огромном количестве с помощью традиционных систем, таких как бактерии и, таким образом, представляет собой перспективный инструмент для диагностических и терапевтических целей. Нанотела также могут быть экспрессированы непосредственно in vivo. BiTE антитела, составленные из двух одноцепочечных Fv- фрагментов, одним из которых может быть антитело против PRAME, а другим - ScFv фрагмент любого другого антитела, соединённых гибкими линкерами, содержащими повторы глицина-серина. Короткий линкер предотвращает неправильное спаривание внутри цепочки, но не между цепочками. Длинный гибкий линкер позволяет антигенсвязывающим участкам свободно вращаться. Возможно создание наночастиц, в которых один или несколько Fv-фрагментов конъюгированы с биоразлагаемыми разрешенными для внутривенного введения полимерными гранулами PLGA. Формат Trand позволяет создавать антитела, в которых в одну цепь соединены две пары VL и VH доменов, при этом формируется антитело с четырьмя валентностями. Формат кроссмаб предусматривает перестановку константного домена тяжелой цепи СН1 и константного домен CL легкой цепи для правильной сборки биспецифического антитела. Возможна конъюгация Fv-фрагментов с любыми белками неиммуноглобулиновой природы.
Фрагменты имеют преимущества по сравнению с полноразмерными антителами для некоторых целей - например, они достаточно малы, чтобы проникать в ткани, в которые полноразмерные антитела не могут проникать. Это преимущество используется в терапевтических и иммуногистохимических процедурах. Фрагменты антител, как правило, не имеют гликозилирования, что позволяет их производить в прокариотических системах экспрессии. Отсутствие домена Fc является существенным преимуществом для первичных антител, используемых в иммуногистохимических и других целях, так как они значительно уменьшают неспецифическое связывание с рецептором Fc. Фрагменты антител, не имеющие Fc-области, имеют редуцированное неспецифическое связывание. Нанотела могут быть использованы также для коиммунопреципитации или в сочетании с флуоресцентными белками для отслеживания в реальном времени внутриклеточных мишеней в живых клетках. Для снижения иммуногенности полученных антител для человека могут быть получены различные виды химерных и гуманизированных антител. Одним из таких примеров является способ получения химерного антитела, в котором вариабельный участок (V-участок) антитела получен из исходного антитела, а его константный участок (С- участок) получен из подходящего человеческого антитела. Так как полученное таким образом химерное антитело содержит вариабельный участок исходного мышиного антитела в интактной форме, ожидается, что оно будет связываться с антигеном со специфичностью, идентичной специфичности исходного мышиного антитела. Кроме того, в химерном антителе количество аминокислотных последовательностей, полученных из организма, отличного от человеческого, существенно снижено, и поэтому ожидается, что такое антитело будет обладать пониженной иммуногенностью по сравнению с исходным мышиным антителом. Химерное антитело может связываться с антигеном таким же образом, как и исходное мышиное моноклональное антитело, и может включать иммунологические реакции против вариабельного участка мышиного антитела, несмотря на то, что его иммуногенность понижена (LoBuglio A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989). Второй способ снижения иммуногенности мышиного антитела, хотя и гораздо более сложный, позволяет еще более снизить потенциальную иммуногенность мышиного антитела. В этом способе лишь участок, определяющий комплементарность (CDR) вариабельного участка мышиного антитела трансплантируют в вариабельный участок человеческого антитела, получая вариабельный участок "реконструированного" человеческого антитела. Однако для того чтобы сделать структуру вариабельного участка реконструированного человеческого антитела как можно более близкой к структуре исходного мышиного антитела, необходимо, чтобы часть аминокислотной последовательности каркасного участка (FR), который поддерживает CDR, можно было бы трансплантировать из вариабельного участка мышиного антитела в вариабельный участок человеческого антитела. Затем этот V-участок гуманизированного реконструированного человеческого антитела связывают с константным участком человеческого антитела. Часть, которая получена из отличной от человеческой аминокислотной последовательности в окончательно реконструированном гуманизированном антителе является CDR, и составляет лишь часть FR. CDR состоит из гипервариабельной аминокислотной последовательности, которая не содержит видоспецифических последовательностей. Таким образом, гуманизированное антитело, которое также называют перестроенным, содержащее мышиный CDR, не должно быть более иммуногенным, нежели природное человеческое антитело, содержащее CDR человеческого антитела. Общая технология рекомбинантной ДНК для получения таких антител также известна (см. European Patent Application ЕР 12502В и International Patent Application WO 92-19759).
Активность гена или белка PRAME связана с ранней летальностью, химиорезистентностью, метастазированием и большим риском развития рецидива при хроническом миелоидном лейкозе, раке яичника, раке молочной железы, раке почки, медуллобластоме, меланоме и множестве других онкологических заболеваний. Высокий уровень экспрессии PRAME прямо связан прогрессией остеосаркомы. При меланоме и раке молочной железы гиперэкспрессия PRAME не ассоциирована со стадией заболевания, но значимо ухудшает прогноз. При раке молочной железы доказана независимая негативная прогностическая значимость гиперэкспрессии PRAME. Данные литературы о частоте обнаружения Р/?АМ£-позитивных случаев среди больных показывают, что активация данного гена может происходить при любых онкологических заболеваниях, хотя и с разной частотой. В некоторых случаях она близка к 100%, в иных может не превышать 20% исследованной выборки.
Для белка PRAME характерны такие свойства, которые позволяют ему участвовать в формировании отличительных признаков опухолевых клеток и усугублять течение онкологического заболевания.
Самодостаточность в пролиферативных сигналах. PRAME-экспрессирующие бластные клетки, циркулирующие у больных хроническим миелоидным лейкозом, способны к автономному существованию. В отличие от нормальных гемопоэтических стволовых клеток бласты не зависят от наличия в среде сигнальных молекул. Нокаут гена PRAME в клетках линии К562 приводит к значительному снижению их способности формировать колонии. При эстроген-независимом и трижды негативном раке молочной железы уровень экспрессии гена PRAME в целом выше по сравнению с другими типами опухоли, зависимыми от эстрогена. Таким образом, активность PRAME связана с самодостаточностью опухолевой клетки в пролиферативных сигналах.
Изменения метаболизма. Белок PRAME функционирует как модулятор экспрессии генов. Предпочтительно PRAME ассоциируется с мотивом ССААТ, находящимся в составе промоторов и энхансеров, распознающихся транскрипционным фактором NFY. Данная группа промоторов регулирует экспрессию генов, ответственных за активный метаболизм и проонкогенные сигнальные пути. На основании обнаруженных модификаций гистоновых белков НЗК9ас и НЗК4теЗ доказана PRAME-опосредованная активация экспрессии данных генов. Данное свойство позволяет белку PRAME ускорять метаболизм опухолевой клетки.
Ослабление индукции апоптоза. При хроническом миелоидном лейкозе белок PRAME блокирует экспрессию гена TRAIL, важного активатора апоптоза. В клетках острых лейкозов при нокауте экспрессии PRAME прокаспаза-3 преобразуется в активную каспазу, и стимулирует клеточную гибель. В клетках линии HepG2, раке печени, белок PRAME стимулирует экспрессию р21, проводящего арест клеточного цикла в фазах G0/G1, а также подавляет апоптоз посредством блокирования экспрессии р53. Нокаут гена PRAME в линии меланомы А375 и линии рака печени сопровождался снижением скорости пролиферации и увеличением доли клеток, находящихся в процессе апоптоза. Таким образом, в ряде онкологических заболеваний доказана PRAME-опосредованная резистентность клеток к апоптозу.
Генетическая нестабильность. Наблюдается ассоциация экспрессии гена PRAME и наличия множества хромосомных аномалий у больных метастатической увеальной меланомой. У данных больных также наблюдалась значительная активность систем репарации ДНК. В подобных условиях разрывы негомологичных хромосом могут быть быстро восстановлены, что и приводит к формированию хромосомных транслокаций. Прямая связь между гиперэкспрессией PRAME и появлением дополнительных хромосомных аномалий наблюдается также при ХМЛ. PRAME-опосредованное увеличение скорости пролиферации и резистентность к апоптозу позволяет этим аномалиям сохраниться в опухоли. Отсюда следует что белок PRAME опосредует генетическую нестабильность опухолевой клетки.
Нечувствительность к рост-ингибирующим сигналам. Ретиноевая кислота передаёт сигнал, ингибирующий пролиферацию и активирующий программу дифференцировки клеток множества типов, в том числе у эмбриона. Нокаут PRAME в клетках линии К562 приводит к снижению скорости пролиферации и активации сигнальных путей, ответственных за миелоидную дифференцировку. Активность PRAME, что было доказано нокаутом этого гена, связана также с блокированием дифференцировки клеток меланомы А375. В ксенографтной модели наблюдается замедление скорости роста клеток А375, вызванное действием ретиноевой кислоты. Трансфекция гена PRAME человека в клетки мышиной меланомы В16 также приводит к блокированию их дифференцировки и потере чувствительности к ретиноевой кислоте.
Таким образом, PRAME связан с нечувствительностью опухолевой клетки к блокированию пролиферации, опосредованной ретиноевой кислотой.
Изменения морфологии/локомоции клеток, а также инвазия и метастазирование. Известно, что при меланоме глаза больший уровень экспрессии PRAME характерен для метастаза, чем для первичных очагов. У больных метастатической меланомой, остеосаркомой, при раке яичников, а также раке головы и шеи в метастазах и поражённых лимфатических узлах активность PRAME выше, чем в первичной опухоли. При остеосаркоме экспрессия PRAME сопровождается потерей молекул адгезии CNTN1, VEGF, PCDHB9, B4GALT5, GRIN2C, NGFB, SLC12A3, IDUA, THBS4, TSPAN5, SCRG1, ЕРНВ2 и ISLR. Наблюдается связь гиперэкспрессии PRAME с инвазией и метастазированием при раке печени. PRAME стимулирует инвазию и миграцию клеток рака молочной железы и поддерживает эпителиально-мезенхимальный переход путём активации виментина и снижения уровня экспрессии Е-кадгерина. Всё это подтверждает непосредственное участие белка PRAME в метастазировании.
Блокирование дифференцировки. Выявлена ассоциация между гиперэкспрессией PRAME с опухолями, обладающими сравнительно меньшей степенью дифференцировки, как например при опухоли Вильмса, меланоме, острых лейкозах и при семиноме. PRAME подавляет 50Х17-опосредованную программу дифференцировки герминогенных клеток. Мышиный гомолог PRAME поддерживает состояние плюрипотентности эмбриональных клеток и стимулирует их быстрое деление. Таким образом, экспрессия в ней гена PRAME блокирует дифференцировку опухолевой клетки.
Белок PRAME не придаёт опухолевой клетке способность к избеганию иммунного распознавания. Эпитопы белка PRAME распознаются иммунной системой.
Среди раково-тестикулярных генов, спонтанно активных при солидных опухолях, PRAME отличается наибольшей частотой экспрессии, и его транскрипты могут быть обнаружены примерно у половины больных солидными опухолями. При некоторых заболеваниях PRAME активен практически во всех исследованных случаях, при иных - очень редко. Влияние экспрессии, оказываемое на прогноз, в целом негативное.
При меланоме PRAME активен у подавляющего большинства больных. Согласно., PRAME гиперэкспрессируется в 88% случаев первичной меланомы и в 95% случаев метастатической. Исходя из этого, авторами было сделано заключение о связи гена PRAME с метастазированием меланомы. Позднее, используя более чувствительные методы детекции, другие исследователи показали, что PRAME активен в 86% и в 84,6% случаев первичной меланомы. Из этого следует, что активность PRAME в первичном очаге меланомы происходит на очень высоком уровне, детектируемым относительно низкочувствительным методом ОТ-ПЦР, либо не происходит вовсе, и может существовать небольшая популяция первичных PRAME-негативных больных меланомой.
Первичный очаг меланомы может развиваться в глазном яблоке наблюдали экспрессию PRAME в 5 из 9 случаев меланомы такого типа. Позднее Westekemper et al. использовали метод ИГХ, при помощи которого наблюдали активность PRAME как в самой меланоме глаза, так и в кожных метастазах и поражённых лимфатических узлах. В участках инвазии и образцах метастаза уровень экспрессии белка был выше, чем в первичном очаге. Данные ИГХ показали, что белок PRAME в основном сосредоточен в ядрах опухолевых клеток. Влияние уровня экспрессии белка на такие параметры, как время выживаемости или результативность терапии, установить не удалось. В дальнейшем транскриптомный анализ показал, что существует так называемый прогностически благоприятный паттерн экспрессии генов, на основании чего выделили класс I меланомы глаза, и неблагоприятный, выделенный в класс II. У больных с благоприятным паттерном экспрессии генов активность PRAME оказалась значимым признаком, связанным с ухудшением прогноза. Риск метастазирования опухоли у таких больных увеличивается.
При другой опухоли тканей глаза, ретинобластоме, PRAME связан с химиорезистентностью, что было доказано трансфекцией гена PRAME в линии. В опухоли 96,4% больных была обнаружена мРНК. Доказано увеличение уровня экспрессии гена при более продвинутых стадиях заболевания и PRAME-опосредованное ухудшение параметров выживаемости. Было установлено, что PRAME связан с инактивацией NOTCH- сигналинга и потерей клеткой остеосаркомы молекул адгезии, а также блокированием её дифференцировки. Нокаут PRAME в клетках остеосаркомы U-20S и ZOS приводил к снижению скорости их пролиферации и к способности образовывать колонии, а также к повышению уровня экспрессии белка Р27.
При липосаркоме активность PRAME наблюдается в основном в случаях высокодифференцированной опухоли. Следует отметить, что именно высокодифференцированная липосаркома имеет наихудший прогноз. Высокая частота экспрессии PRAME характерна также для миксоидной (сходной по морфологии с жировой тканью эмбриона) липосаркомы, в связи с чем имеются данные об экспрессии PRAME в
90% случаев. Уровень экспрессии гена прямо коррелирует с неблагоприятным прогнозом.
Наибольший уровень экспрессии PRAME обычно связан с самым неблагоприятным субтипом рака почки. При этом не зависит от стадии заболевания и экспрессии других РТГ, таких как MAGE-A1 и MAGE-A3. Кроме этого, при терапии ингибиторами тирозинкиназ эффективность и прогноз заболевания значительно ухудшаются. Известно о высокой частоте экспрессии PRAME при нейробластоме: ген активен у 93% первичных больных и всех без исключения больных с продвинутыми стадиями. Уровень экспрессии гена выше при большем возрасте больных и прямо коррелирует с тяжестью течения заболевания. Амплификация гена МУС никогда не наблюдалась у больных нейробластомой, имеющих относительно низкий уровень экспрессии PRAME. Параметры бессобытийной (БСВ) и общей (ОВ) выживаемости были значительно хуже у больных с большим уровнем экспрессии PRAME по сравнению со средним и низким уровнями (БСВ 0,45 vs 0,71 vs 0,92, соответственно, р = 0,03; ОВ 0,77 vs 0,86 vs 1,0, соответственно, р = 0,1).
Все использованные расходные материалы коммерчески доступны.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение гибридом для продукции мышиных антител против PRAME человека.
Для получения антител мышей линии BALB/c (самки массой 16 - 18 г.) иммунизировали дважды с интервалом в 2 недели в подушечки задних лап раствором иммуногена в полном (для первой иммунизации) или неполном (для второй иммунизации) адъюванте Фрейнда. В качестве иммуногена использовали рекомбинантный белок PRAME, имеющий в своём составе 509 аминокислотных остатков, соответствующих природному белку PRAME, и б остатков гистидина, введённых в структуру белка для удобства очистки. Во всех случаях на одну иммунизацию брали 25 мкг белка, белок вводили в виде эмульсии, полученной из раствора белка в фосфатно- солевом буфере и равного объёма полного (1-я иммунизация) или неполного (2-я иммунизация) адъюванта Фрейнда.
Тестирование сывороток и культуральных супернатантов проводили при помощи непрямого иммуноферментного анализа (Engvall Е, Perlmann Р. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G., Immunochemistry.
1971, 8(9): P.871-4). Для этого рекомбинантный белок PRAME в концентрации 1 мкг/мл сорбировали в течение ночи при 4°С в фосфатно-солевом буфере и затем вносили сыворотки в серийных разведениях или культуральные супернатанты на 1 ч при 37°С. Связавшиеся с иммобилизованным антигеном МкАт выявляли с помощью вторичных антител козы, разработанных против IgG (Н + L) мыши, конъюгированных с пероксидазой при помощи периодатного метода, в течение 1 ч при 37°С. В качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина (ТМВ) с перекисью водорода. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм.
На 4-й день после второй иммунизации лимфоциты из подколенных узлов гибридизовали с миеломными клетками Sp 2/ 0-Agl4 по стандартной методике с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 (Monoclonal Antibody Production. National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999.). Гибридомы отбирали на селективной среде HAT, тестировали в непрямом ИФА и дважды клонировали методом предельных разведений.
Антитела нарабатывали в асцитных жидкостях мышей, для этого мышам, предварительно праймированных пристаном, вводили внутрибрюшинно по 106 клеток каждого клона. Очистку антител из асцитных жидкостей проводили аффинной хроматографией на колонке с белок-G сефарозой по стандартной методике (Jungbauer, А. и др. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies, J. Chromatogr. 1989, 476: 257-268). Чистоту выделенных антител контролировали при помощи SDS-ПААГ электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS и DTT в ступенчатой буферной системе Лэмлли, используя Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227: 680-685). Чистота всех полученных антител составила не менее 95%.
Всего было получено 2 клона, продуцирующих антитела, распознающие белок PRAME (клоны 5D3 и 6Н8).
Пример 2. Секвенирование антигераспознающих доменов гибридом 5D3 и 6Н8. Для установления CDR антител 5D3 и 6Н8 необходимо было выявить аминокислотные последовательности полученных антител, что можно было достигнуть при помощи секвенирования генов, кодирующих их.
Для секвенирования проводилась наработка клеток гибридом до количества не менее 1 миллиона. Из этих клеток была выделена РНК по методике, предложенной Chomczynski и Sacchi (Chomczynski Р. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal Biochem. - 1987. - 162(1). — P. 156-159). Из на матрице выделенной РНК по общепризнанной методике синтезировалась кДНК. Последовательность кДНК была просеквенирована при помощи сета праймеров, разработанных фирмой Novagen по инструкции, предложенной производителем. Были получены следующие нуклеотидные последовательности лекой и тяжелой цепей антител 5D3 и 6Н8:
Полученные последовательности были загружены в BLAST, в подраздел для выравнивания последовательностей иммуноглобулинов IgBLAST. Инструменты данного сервиса позволили установить первичные белковые структуры вариабельных доменов тяжёлых и легких цепей антител 5D3 и 6Н8. Выравнивание позволило установить аминокислотные замены и определить расположение CDR и FR в антителах 5D3 и 6Н8.
Пример 3. Вестерн-блоттинг белка PRAME при помощи антител 5D3 и 6Н8.
Для доказательства способности полученных антител связываться с белком PRAME был проведён эксперимент по выявлению данного белка методом иммуноблоттинга.
Метод иммуноблоттинга (вестерн-блоттинг) позволяет визуализовать иммунные комплексы антиген-антитело после электрофореза препарата антигена в денатурирующих условиях с последующим переносом на мембрану [Towbin Н. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications / H. Towbin, T. Staffhelint, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979.-Vol. 76(9). -P. 4350- 4354]. Главное отличие этого метода от непрямого ИФА заключается в возможности дискриминировать иммунные комплексы с различной молекулярной массой, например, мономерные и олигомерные формы антигена, а также интактный антиген и продукты его деградации.
Электрофорез белков проводили по методу Лэммли. На одну дорожку 10% ПААГ наносили 1 или 2 мкг рекомбинантного белка PRAME (в буфере с ЮОмМ DTT для восстанавливающих условий либо без DTT для невосстанавливающих), либо 20-50 мкг лизата клеток, экспрессирующих белок PRAME. Для калибровки размеров и контроля переноса белка использовали маркер молекулярных масс белка RainbowFull Range (GE Healthcare). После электрофореза перенос белков из геля на Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare, Великобритания) осуществляли методом полусухого электроблоттинга в течение часа. Мембрану блокировали в 3% БСА в буфере 50мМ трис рН=7,5, 8г/л NaCI, 0,1% Твин 20 в течение 2 часов при комнатной температуре. В качестве первичных антител использовали антитела 5D3hum, 5D3chim, 6H8chim и Fllchim в концентрации 3 мкг/мл в буфере, содержащим 1% БСА, 50мМ трис рН=7,5, 8г/л NaCI, 0,1% Твин 20, инкубировали ночь при +4оС. Затем троекратно отмывали по 15 минут в буфере 50мМ трис рН=7,5, 8г/л NaCI, 0,1% Твин 20 и инкубировали мембрану с вторичным антителом 4G7-HRP (ОАО «ВЦМД/1», Россия) в разведении 1:50000 в течение часа при комнатной температуре. Снова троекратно отмывали по 15 минут. Для визуализации антител, связавшихся с белком, использовали раствор диаминобензидина 1мг в мл в субстратном буфере (50мМ трис рН=7,5,50мМ имидазол, 0,1% перекись водорода), реакцию останавливали избытком дистиллированной воды. Альтернативно для проявления сигнала на мембране использовали двухкомпонентную систему Clarity Western ECL (Bio-Rad). Затем экспонировали сигнал на люминесцентно-чувствительную пленку (Пленка Hyperfilm ECL) 1-10 минут. Пленку проявляли в проявителе Д-76 (Silberra) 30-60 секунд и фиксировали в фиксаже FIXER А1 (Silberra) 1-5 минут.
Размер молекулярной массы рассчитывали методом линейной регрессии [Фармакопейная статья 1.2.1.0023.15 Электрофорез в полиакриламидном геле. -2015. - Государственная фармакопея Российской Федерации. - XIII изд. Т. 1]. Для этого определяли нормализованные расстояние пробега для каждой полосы белка (маркера или образца антитела) от вершины разрешающего геля. Вычисляли отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега, пройденного фронтом красителя (Rs). Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков и обозначаются, как Rf. Строили график зависимости логарифма относительных молекулярных масс белковых стандартных образцов от полученных значений Rf. Параметры для построения калибровочной кривой представлены в таблице 3.4.1 и на рисунке 3.4.2. Молекулярную массу белка, связанного с антителом, определяли с помощью метода линейной регрессии, если значение, полученное для испытуемых образцов, располагалось на линейной части графика. Для сигналов на мембране, соответствующих связыванию антитела с белком, значения Rf составляли 0,446 и 0,464 для разных концентраций нанесенного белка, что по калибровочной прямой соответствует 59,29+1,21 кДа. При этом рассчитанная теоретически с помощью программы VectorNTIAdvance 10.3.0 молекулярная масса рекомбинантного белка составляет 60 кДа. Результаты представлены на фигуре 1.
Таким образом, антител различают белок, имеющий массу, соответствующую массе белка PRAME, что свидетельствует об их специфичности.
Пример 4. Эпитопный анализ антител 5D3 и 6Н8.
Окончательное установить специфичность антител можно проведя поиск эпитопов, которые они распознают.
Эпитопный анализ сначала проводили методом Вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях с использованием лизатов клеток E.coli, экспрессирующих рекомбинантные белки, содержащие фрагменты белка PRAME. Было выбрано 5 фрагментов белка PRAME, которые были экспрессированы в клетках независимо в составе 5 слитых рекомбинантных белков, каждый из которых содержал аминокислотную последовательность тиоредоксина и соответствующий фрагмент белка PRAME. В качестве контроля использовали клетки, экспрессирующие только тиоредоксин (Тгх) и клетки экспрессирующие N-половину белка PRAME (фрагмент PN, в составе которого находятся аминокислотные остатки с 1 по 220 из первичной структуры природного белка PRAME) без тиоредоксина. N-половина белка была разбита на 4 приблизительно равные части с перекрыванием на 20 аминокислот. Фрагмент PN1 представляет собой полипептидную цепочку, в составе которой находятся аминокислотные остатки природного белка PRAME с 1 по 65. Фрагмент PN2 представляет собой полипептидную цепочку, в составе которой находятся аминокислотные остатки природного белка PRAME с 56 по 125. Фрагмент PN3 представляет собой полипептидную цепочку, в составе которой находятся аминокислотные остатки природного белка PRAME с 115 по 180. Фрагмент PN4 представляет собой полипептидную цепочку, в составе которой находятся аминокислотные остатки природного белка PRAME с 160 по 222. 5-й фрагмент (PN4.3) представлял собой гидрофильный полипептид KRKKNVLRLCCKKLK (аминокислотные остатки 200 по 214 из первичной структуры природного белка PRAME), который с высокой вероятностью мог быть эпитопом для антител 5D3 и 6Н8. Схема фрагментов белка PRAME, слитых с тиоредоксином, представлена на фигуре 2. Для получения лизатов клетки E.coli ресуспендировали в буфере для нанесения (60 тМ трис-CI, рН=6,8, 10% глицерин, 2% (w/v) додецилсульфат натрия, ЮОмМ DTT, 0.01% бромфеноловый синий) и прогревали 5 минут при 95°С. Полученные лизаты наносили на 12% ПААГ и проводили электрофорез по методу Лэммли. Для контроля переноса и размеров белков использовали маркер молекулярных масс белка RainbowFullRange (GE Healthcare). После электрофореза перенос белков из геля на Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare) осуществляли методом полусухого электроблоттинга в течение часа. Мембрану блокировали в 3% БСА в буфере 50мМ трис рН=7,5, 8г/л NaCI, 0,1% Твин 20 в течение 2 часов при комнатной температуре. В качестве первичных антител использовали различные антитела 5D3 и 6Н8в концентрации 1,5 мкг/мл в буфере, содержащим 1% БСА, 50мМ трис рН=7,5, 8г/л NaCI, 0,1% Твин 20, инкубировали ночь при +4оС. Затем троекратно отмывали по 15 минут в буфере 50мМ трис рН=7,5, 8г/л NaCI, 0,1% Твин 20 и инкубировали мембрану с вторичным антителом Anti-Mouse-HRP (Dako) в разведении 1:2000 в течение часа при комнатной температуре. Снова троекратно отмывали по 15 минут. Для визуализации антител, связавшихся с белком на мембране, использовали раствор диаминобензидина 1мг в мл в субстратном буфере (50мМ трис рН=7,5, 50мМ имидазол, 0,1% перекись водорода), реакцию останавливали избытком дистиллированной воды.
Результаты частичного картирования эпитопов антител к белку PRAME методом Вестерн-блот представлены в сводной таблице 1.
Таблица 1 - Узнавание фрагментов белка PRAME антителами
Таким образом, эпитопы PRAME, распознаваемые антителом 5D3, с высокой вероятностью находятся в пределах 160-180 аминокислотных остатков, в то время как эпитопы, распознаваемые антителом 6Н8, с высокой вероятностью находятся в пределах 180-222 аминокислотных остатков.
Следующий этап исследования был проведён методом ИФА. Для данного эксперимента готовили лизаты клеток E.coli, экспрессирующих рекомбинантный тиоредоксин, слитый с N-фрагментами белка PRAME, следующим образом: осадок клеток ресуспендировали в RIPA буфере (10 тМ Tris-CI (pH 8.0), 1 тМ EDTA, 1% Triton Х-100, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 140 тМ NaCI, 1 тМ PMSF), замораживали при -70°С, затем оттаивали на льду для максимальной экстракции белков, далее центрифугировали в течение 10 минут при 12000 об/мин и температуре 4°С. Супернатанты отбирали, измеряли в них концентрацию белка, аликвоты супернатантов хранили при -20°С.
Клеточные лизаты E.coli PN3, PN4 и PN4.3 сорбировали на планшет в концентрации 1 мкг/мл в ФСБ (0,01М КН2РО4,0,1М NaCI), pH 7.2-7.4, по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для ИФА в течение ночи при 4°С. Планшет трижды отмывали ФСБ -Т (0,1% Твин 20) по 270 мкл в лунку. Затем титровали антитела к белку PRAME и контрольное антитело G9 в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 10000 нг/мл с шагом 3 по 50 мкл в лунку в ФСБ -АТ (0,01М KH2RO4LIM NaCI; 0,2% бычий сывороточный альбумин; 0,05% Твин 20). Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Антивидовой пероксидазный конъюгат антител против IgG мыши разводили в ФСБ -АТ в соотношении 1:75000 и вносили по 50 мкл в лунки планшета. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет трижды отмывали ФСБ -Т по 270 мкл в лунку. Добавляли субстрат ТМБ по 50 мкл/лунку, инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением по 50 мкл/лунку 0,5М серной кислоты. Измеряли оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.
Результаты подтвердили предположение о том, что эпитопы PRAME, распознаваемые антителом 5D3, находятся в пределах 160-180 аминокислотных остатков, в то время как эпитопы, распознаваемые антителом 6Н8, находятся в пределах 180-200 аминокислотных остатков. Пример 5. Анализ экспрессии поверхностного PRAME при помощи антител 5D3 и 6Н8 методом проточной цитометрии.
Для того чтобы показать возможность связывания антител 5D3 и 6Н8 с поверхностным белком PRAME было выполнено окрашивание клеток линии ТНР1 данными антителами, связывание которых с клетками доказывалось вторичными антимышиными PE-мечеными антителами.
Экспрессия гена и белка PRAME в клетках ТНР1 предварительно было доказано методами ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттингом. Перед проведением поверхностного окрашивания клетки трижды были отмыты от культуральной среды раствором PBS до получения осадка. Полученный осадок разводился раствором PBS до суспензии, содержащей 500000 клеток в мл. К 50 мкл суспензии клеток добавлялось по 10 мкл антител 5D3 или 6Н8 или изотипического контроля в концентрации 1 мг/мл. Инкубирование с первичными антителами проводилось в течение 25 минут, после чего проводилась отмывка раствором PBS от несвязавшихся антител. После этого к клеткам добавлялись по 2 мкл вторичных антимышиных PE-меченых антител. После инкубирования в течение 25 минут в темноте проводилась отмывка раствором PBS от несвязавшихся вторичных антител и анализ на проточном цитометре АСЕА NovoCyte. Полученные результаты показывают, что связывание первичных антител с поверхностным белком PRAME прошло успешно. Интенсивность окрашивания контроля без использования первичных антител составила 2905 единиц, окрашивания с использованием изотипического контроля - 2798 единиц, окрашивания антителом 5D3 - 10511 единиц, окрашивания антителом 6Н8 - 10066 единиц. Результаты представлены на фигуре 3.
Таким образом, антитела 5D3 и 6Н8 могут быть использованы в экспериментах, где ожидается их связывание с белком PRAME, в том случае, если он экспрессируется на поверхности клеток. Связавшиеся антитела могут быть выявлены стандартными иммунохимическими методами. В случае отсутствия PRAME на поверхности клеток неспецифического связывания не происходит. Высокая специфичность антител позволяет их использовать в качестве диагностических антител для выявления экспрессии PRAME на поверхности клеток.
Пример 6. Иммуногистохимический анализ экспрессии PRAME при помощи химерных антител 5D3 и 6Н8. Данный эксперимента был проведён для доказательства пригодности различных вариантов синтетических антител, направленных на эпитопы PRAME 160-180 и 180-200, в работе по выявлению экспрессии белка PRAME в различных гистологических препаратах опухолевых клеток.
Химерные антитела 5D3chim и 6H8chim были получены известными методами путем объединения последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены данных антител с последовательностями, кодирующими константные домены IgGl человека. Причём последовательности, кодирующие вариабельные домены лёгких цепей были объединены с последовательностями генов, кодирующих константные домены лёгких цепей, и последовательности, кодирующие вариабельные домены тяжёлых цепей были объединены с последовательностями генов, кодирующих константные домены тяжёлых цепей. Каждая из полученных конструкций была интегрирована в вектор рСЕР4. Пары векторов, кодирующих компоненты антител 5D3chim и 6H8chim были трансфицированы в клетки СНО. Эти клетки продуцировали готовые антитела 5D3chim и 6H8chim среду, из которой они в дальнейшем очищались методом аффинной хроматографии.
Приготовление парафиновых блоков из материала опухоли проводилось следующим образом. Кусочки опухоли фиксировали в забуференном 10% формалине в течение 12 часов при 4°С. После извлечения из формалина кусочки материала (0,5х 0,5 мм) промыли под проточной водой в течение 12 часов. Далее материал поместили в этиловый спирт, с содержанием не менее 50% на 1 час при комнатной температуре. После этого материал перенесли в 70% этиловый спирт и оставили в нем на ночь при комнатной температуре. На следующем этапе материал обезводили, проведя его по батарее спиртов, содержащих 80%, 96% (I), 96% (II), 100% этилового спирта. Время инкубации материала в каждом из них в течение 1 часа при комнатной температуре. В дальнейшем материал провели через хлороформ (I), хлороформ (II) по 2 часа в каждом при комнатной температуре, после чего поместили в хлороформ-парафиновую смесь (1:1) в термостат с температурой 40°С. После инкубирования материал провели через парафин (I), а затем парафин (II) в течение 1 часа в термостате при 52-54°С. Затем перенесли материал в заливочный парафин при 54-56°С. Пропитанный парафином материал залили в специальные формочки. Затем полученные парафиновые блоки насадили на деревянную подложку (кубики). С помощью микротома были сделаны срезы с блоков толщиной в 3-4 мкм и помещены на предметные стекла с адгезивным покрытием. Далее полученные препараты подсушили на термостолике при температуре не более 37°С.
Иммуногистохимическое окрашивание препаратов было выполнено согласно стандартной методике [Tuffaha M.S.A., Guski Н., Kristiansen G. Immunohistochemistry in Tumor Diagnostics / M.S.A. Tuffaha, H. Guski, G. Kristiansen, Cham: Springer International Publishing, 2018.] [Renshaw S. Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Essential Methods / Wiley-Blackwell, 2017.] [«Правила надлежащей лабораторной практики», утвержденные Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации Ns 199н от 1 апреля 2016 г.].
Оценку результатов окрашивания провели с применением светового микроскопа Nikon 80i с фотокамерой NikonDs-lFi и программным обеспечением NikonNISBasicResearch (Nikon) при увеличении хЮО, х200 и х400, получая серию фотографий для дальнейшего анализа. Определение интенсивности окрашивания проводили путем подсчета количества положительно окрашенных CD8+ лимфоцитов не менее чем в 5 репрезентативных полях зрения в областях наиболее интенсивного окрашивания («high- powerfields»). Работы проводились двумя независимыми исследователями. Для определения результатов использовали систему балльной оценки. Для оценки цитоплазматического окрашивания применялась следующая шкала: 0 - отсутствие окрашивания, 1+ - окрашивание слабой интенсивности, 2+ - окрашивание средней интенсивности, 3+ - окрашивание высокой интенсивности.
Было проведено исследование ИГХ окрашивания ксенографта линии рака лёгкого человека А549 при помощи мышиных и химерных антител в разведении 1:50: А - 5D3, Б - 6Н8, В - 5D3chim, Г - 6H8chim. Результаты представлены на фиг. 4.
Для подтверждения возможности специфического выявления PRAME на поверхности клеток, полученных из различных видов тканей и различных опухолей, было проведено исследование иммуногистохимического окрашивания при помощи химерных антител на ксенографтах других видов опухолей человека - рака яичников SK-OV-3, аденокарциномы А549, рака толстого кишечника НТ-29, гепатокарциномы Huh-7, рака предстательной железы 22Rvl.
При изучении окрашивания на ксенографте аденокарциномы А549 было получено окрашивание более 80% опухолевых клеток антителами обоих исследованных клонов. При этом наибольшая интенсивность окрашивания наблюдалась при разведении антител 1:50. При большем разведении 1:100 наблюдали снижение интенсивности окраски опухолевых клеток. Интенсивность окраски опухолевых клеток при разведении 1:50 составила 2+ для обоих клонов. На ксенографте аденокарциномы толстого кишечника НТ- 29 было получено позитивное окрашивание у более чем 90% опухолевых клеток с интенсивностью 2+ при разведении обоих клонов антител 1:50. Наблюдается окрашивание стромальных клеток ксенографта. При изучении иммуногистохимического окрашивания с химерными антителами на ксенографте гепатокарциномы, не экспрессирующей PRAME по данным ПЦР-анализа, не было выявлено взаимодействия PRAME со всеми клонами антител. На линии рака яичников SK-OV-3 можно было дифференцировать окраску в цитоплазме и на клеточной стенке.
Данный пример подтверждает возможность использования антител 5D3 и 6Н8 в экспериментах по иммуногистохимическому окрашиванию белка PRAME.
Пример 7. Цитотоксическая активность мышиных антител 5D3 и 6Н8 in vitro.
В данном эксперименте оценивали цитотоксическую активность антител 5D3 и 6Н8 в различных концентрациях против PRAME-экспрессирующей линии клеток человека. Проверялось развитие клеточно-опосредованной цитотоксичности антител 5D3 и 6Н8 против опухолевых клеток в присутствии мононуклеаров периферической крови здорового добровольца. В качестве отрицательного контроля использовали гуманизированное антитело против HER2 человека трастузумаб и эквивалентный объём раствора, не содержащего никаких антител. Эксперимент проводили на клеточной линии меланомы А875, экспрессирующей ген PRAME на высоком уровне.
Клетки А875 культивировали в полной ростовой среде DMEM с добавлением 4% телячьей сыворотки до образования 80% монослоя. Суспензии клеток готовили непосредственно перед экспериментом. Для приготовления клеточной суспензии использовали буфер ФСБ с добавлением 1мМ ЭДТА и 0,025% трипсина.
Мононуклеары периферической крови выделяли, наслаивая свежую кровь человека на поверхность раствора Фиколла 1077 (Diacoll, плотность 1,077 г/мл, Диаэм, Россия). Центрифугировали при 3500 об/мин в течение 20 минут без принудительной остановки центрифуги. Интерфазу отбирали, клетки дважды отмывали в ФСБ с добавлением 1мМ ЭДТА центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Клетки подсчитывали в камере Горяева и замораживали в парах жидкого азота. Перед использованием ампулы с МПК размораживали, клетки отмывали дважды в холодной бессывороточной среде, подсчитывали и готовили суспензии с требуемой концентрацией клеток в полной ростовой среде с содержанием 2% телячьей сыворотки.
Готовили серийные разведения антител в полной ростовой среде с 2% телячьей сывороткой.
В лунки 96-луночного культурального планшета вносили растворы антител до конечных концентраций 0 - 100 мкг/мл, суспензии опухолевых клеток до концентрации 5 тыс/лунку и МПК до концентрации 50 тысяч/лунку. В качестве контрольных оставляли лунки без антител (краевые дорожки каждого планшета). Все суспензии и растворы наносили минимум в четырех повторах.
Инкубировали в течение 7 суток при 37°С в атмосфере 5% СОг.
После инкубирования в лунки добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0,5%. Инкубировали в течение 4 часов при 37°С в атмосфере 5% СОг.
Супернатанты вытряхивали, в лунки добавляли ДМСО по 100 мкл/лунку, инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.
Оптические плотности в лунках измеряли прибором Мультискан при длине волны
560нм.
Считали средние значения оптической плотности по 4-м повторам.
% ингибирования считали по формуле (1):
% = 100% - (Ai - 0,1)/(Ао - 0,1) х 100% (1) где Ai - среднее значение оптической плотности в лунках с i-той концентрацией антител;
0,1 - средняя оптическая плотность в лунках с МПК без опухолевых клеток (бланк); Ао - среднее значение оптической плотности в лунках без антител.
При помощи программного обеспечения MS Excel 2016 строили графики с указанными областями погрешностей.
В результате установлено, что в условиях in vitro антитела 5D3 и 6Н8 снижают скорость пролиферации PRAME-экспрессирующей линии клеток на 50% и более (Фиг. 5). Диапазон действующих концентраций составляет приблизительно от 10 мкг/мл до более чем 100 мкг/мл, предпочтительно приблизительно от 50 мкг/мл до 100 мкг/мл.
Пример 8. Противоопухолевый эффект использования антител 5D3 и 6Н8 in vivo. Поскольку антитела способны распознавать поверхностный белок PRAME, они могут in vivo стимулировать антителозависимую цитотоксичность против PRAME- экспрессирующих опухолей.
20 мышам линии C57BI/6 вводили клетки меланомы мыши B16F10-pCEP4-PRAME, трансфицированные плазмидой с геном PRAME человека и экспрессирующие соответствующий белок, в дозе 5*10 4 на мышь. Экспрессия человеческого белка PRAME в трансфицированных клетках B16F10 перед прививанием мышам была подтверждена методом иммуноблота. За три дня до введения опухолевых клеток, а также на 4, 7, 14 и 21 день после введения клеток меланомы, животным внутрибрюшинно вводили либо 500 мкл раствора без антител, либо 500 мкл раствора, содержащего антитела. Мышам первой контрольной группы вводили раствор PBS. Мышам второй контрольной группы вводили по 300 мкг мышиных моноклональных антитела 4G1-D2, разработанных против опухолевого антигена GAGE. Мышам третьей группы вводили по 300 мкг мышиных моноклональных антител 5D3. Мышам четвёртой группы вводили по 300 мкг мышиных моноклональных антител 6Н8. В каждой группе было по 5 мышей. На 14, 18 и 21 день после введения опухолевых клеток проводили измерение размеров опухоли в кубических мм. Противоопухолевый эффект оценивали по степени торможения роста опухоли (ТРО). ТРО вычисляли по следующей формуле (2):
TPO (%) = (VK- VP)/VK*100 (2) где VK и Vp - средний объем опухоли в контрольной группе и группе препарата соответственно.
Опухоль B16F10-pCEP4-PRAME реагировала на введение мышам антител 5D3 и 6Н8, распознающих антиген PRAME. Наименьшая скорость роста по сравнению с контролем без применения антител наблюдалась при введении мышам антитела 6Н8, и несколько большая - при введении антител 5D3. Скорость роста опухоли B16F10-pCEP4-PRAME у мышей, получивших антитело 4G1-D2, была меньшей по сравнению с контролем. Результаты представлены в таблице 1 и на фигуре 6. Таким образом, при введении анти- PRAME антител достигалось снижение скорости роста PRAME-позитивной опухоли.
В отличие от контроля, в эксперименте in vivo при введении анти-PRAME антител наблюдался регресс PRAME-экспрессирующей опухоли, что подтверждает наличие противоопухолевого эффекта именно антител 5D3 и 6Н8. В данном эксперименте в качестве модели использовалась опухолевая линия клеток, в которые при помощи вектора была введена конструкция, экспрессирующая белок PRAME человека.
Таким образом, антитела 5D3 и 6Н8 могут быть основой для создания противоопухолевого препарата, использующегося в таргетной терапии PRAME- экспрессирующих онкологических заболеваний человека.
Талица 2 - влияние анти-PRAME антител на рост опухоли B16F10-pCEP4-PRAME у мышей линии C57BI/6
Пример 9. Сравнение противоопухолевого эффекта антител in vivo на модели PRAME-позитивной и PRAME-негативной опухоли.
Эксперимент проводился аналогично эксперименту, приведённому в примере 1, но с добавлением трёх групп мышей, которым были введены клетки B16F10-pCEP4. Эти клетки были получены из клеток линии меланомы B16F10, широко используемой в качестве экспериментальной модели перевиваемых опухолей человека. В клетки был электропорирован вектор рСЕР4, не экспрессирующий PRAME. Мышам первой группы вводили раствор PBS и клетки B16F10-pCEP4-PRAME. Мышам второй контрольной группы вводили по 300 мкг моноклональных антител 4G1-D2, разработанных против опухолевого антигена GAGE, и клетки B16F10-pCEP4-PRAME. Мышам третьей группы вводили по 300 мкг моноклональных антител 5D3 и клетки B16F10-pCEP4-PRAME. Мышам четвёртой группы вводили по 300 мкг моноклональных антител 6Н8 и клетки B16F10-pCEP4-PRAME. Мышам пятой группы вводили раствор PBS и клетки B16F10-pCEP4. Мышам шестой группы вводили по 300 мкг моноклональных антител 5D3 и клетки B16F10-pCEP4. Мышам седьмой группы вводили по 300 мкг моноклональных антител 5D3 и клетки B16F10-pCEP4. Введение препаратов проводили три дня до введения опухолевых клеток, а также на 4, 7, 14 и 21 день после введения. Измерение размеров опухоли в кубических мм проводили на 14, 18 и 21 день после введения опухолевых клеток. На основании полученных результатов проводили расчёт ТРО по формуле (2).
Результаты представлены в таблице 2. Для мышей, которым вводили клетки B16F10-pCEP4-PRAME, были получены результаты, аналогичные результатам примера 1. Скорость роста клеток линии B16F10-pCEP4-PRAME не зависела от введения раствора PBS или раствора мышиных антител.
Таким образом, введение PRAME-распознающих антител 5D3 и 6Н8 в эффективном количестве не повлияло на скорость роста PRAME-негативных клеток линии B16F10-pCEP4. Поскольку PRAME не экспрессируется также в неопухолевых клетках, мы предполагаем, что антитела 5D3 и 6Н8 и их производные не окажут влияния на данные клетки, что свидетельствует о высокой специфичности антител 5D3 и 6Н8 в отношении PRAME- экспрессирующих злокачестенных клеток человека.
Таблица 3 - сравнение противоопухолевого эффекта анти-PRAME антител на рост опухоли B16F10-pCEP4-PRAME и B16F10-pCEP4 у мышей линии C57BI/6