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Title:
IMMOBILIZED AND STABILIZED MUTATED PENICILLIN G ACYLASE ENZYME, PROCESS FOR OBTAINING IT AND ITS APPLICATIONS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2007/138148
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention describes different PGA enzyme mutants prepared by inserting one (1) Cys (in each mutant) in a different region of the surface of the enzyme which was relatively rich in lysine residues as well as immobilized forms on disulphide/epoxide supports and with additional mutations which increase their stability with respect to the effect of heat and organic solvents (300,000 times more stable than the corresponding soluble enzyme). The excellent stability of these enzymatic derivatives makes them very useful for catalysing different industrial processes of interest in organic and pharmaceutical chemistry: hydrolysis of penicillin, synthesis reactions in the presence or absence of solvents and enantioselective hydrolysis and synthesis reactions.

Inventors:
GRAZU BONAVIA VALERIA (ES)
GUISAN SEIJAS JOSE MANUEL (ES)
FERNANDEZ LAFUENTE ROBERTO (ES)
ABIAN FRANCO OLGA (ES)
MONTES FERNANDEZ TAMARA (ES)
MATEO GONZALEZ CESAR (ES)
GONZALEZ GARCIA RAMON (ES)
HERMOSO DOMINGUES JUAN ANTONIO (ES)
GARCIA LOPEZ JOSE LUIS (ES)
Application Number:
PCT/ES2007/070104
Publication Date:
December 06, 2007
Filing Date:
May 30, 2007
Export Citation:
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Assignee:
CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION (ES)
GRAZU BONAVIA VALERIA (ES)
GUISAN SEIJAS JOSE MANUEL (ES)
FERNANDEZ LAFUENTE ROBERTO (ES)
ABIAN FRANCO OLGA (ES)
MONTES FERNANDEZ TAMARA (ES)
MATEO GONZALEZ CESAR (ES)
GONZALEZ GARCIA RAMON (ES)
HERMOSO DOMINGUES JUAN ANTONIO (ES)
GARCIA LOPEZ JOSE LUIS (ES)
International Classes:
C12N11/08; C12N9/84; C12P37/04
Other References:
GRAZU BONAVIA M.V.: "Resumen de la Tesis Doctoral: Estabilizacion de penicilina G acilasa por inmovilizacion covalente multipuntual dirigida. Mutagenesis de la superficie de la enzima para mejorar la complementariedad enzima-soporte activado", UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID, vol. 90, no. 5, June 2005 (2005-06-01), pages 597 - 605, XP008097374, Retrieved from the Internet
ABIAN O.: "Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 70, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 1249 - 1251, XP002431788
GRAZU V.: "Stabilization of enzymes by multipoint immobilization of thiolated protiens on new epoxy-thiol supports", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 90, no. 5, June 2005 (2005-06-01), pages 597 - 605, XP008090469
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Claims:

REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa basado en Ia promoción de una inmovilización covalente multipuntual muy intensa a través de grupos amino, y de otros nucleófilos, situados en las proximidades del amino ácido 380b de Ia superficie de Ia enzima.

2.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa según reivindicación 1 en el cual el amino ácido GIn 380b de Ia superficie de Ia enzima es reemplazado, por mutagénesis dirigida, por un residuo Cys. 3.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa según reivindicación 2 en el que Ia superficie de Ia enzima, en las proximidades del residuo 380b, es enriquecida en residuos Lys adicionales en Ia superficie de Ia enzima por mutagénesis dirigida.

A - Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa según reivindicación 3 en el que los residuos Lys insertados en Ia superficie de Ia enzima reemplazan a los siguientes amino ácidos de Ia enzima nativa: ArgB437, AspA61 , ThrA121 , AsnB110, AspB381 , AsnB457, GluB468 y ThrB470. 5.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 2 a Ia 4, en los que Ia enzima se inmoviliza sobre soportes disulfuro-epóxido conteniendo una baja concentración (hasta 10 μmoles/gramo) de disulfuros altamente reactivos y una alta concentración de grupos epóxido (desde 25 hasta 200 μmoles / gramo de soporte).

6.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 2 a Ia 4, en los que Ia enzima se inmoviliza sobre soportes epóxido monofuncionales conteniendo una alta concentración de grupos epóxido, entre 20 y 200 μmoles de epóxido/gramo de soporte.

7.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 3 y 4, en los que Ia enzima se inmoviliza sobre cualquier tipo de soporte conteniendo una elevada concentración de grupos glioxil, entre 10 y 200 μmoles de glioxil/gramo de soporte. 8.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 5 a Ia 7 en el que Ia unión multipuntual enzima-soporte activado se optimizaba por incubación de Ia enzima inmovilizada a temperaturas

moderadas, entre 4 y 3O 0 C, y a pHs moderadamente alcalinos, entre pH 8.0 y pH 11.0.

9.- Enzima penicilina G acilasa inmovilizada obtenida según las reivindicaciones 1 a Ia 8. 10. Uso de Ia enzima penicilina G acilasa según Ia reivindicación 9 en procesos industriales de producción de penicilina.

Description:

TITULO

ENZIMA PENICILINA G ACILASA MUTADA INMOVILIZADA y ESTABILIZADA, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIóN Y SUS APLICACIONES

CAMPO DE APLICACIóN

La excelente estabilidad de estos derivados enzimáticos los hace muy útiles para catalizar diferentes procesos industriales de interés en química orgánica y farmacéutica: hidrólisis de penicilina, reacciones de síntesis en presencia o ausencia de disolventes y reacciones de hidrólisis y síntesis enantioselectivas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

Las enzimas son capaces de catalizar los procesos químicos más complejos en las condiciones experimentales y medioambientales más benignas. En Ia mayoría de los casos, por razones económicas y tecnológicas, las enzimas deben de emplearse en forma inmovilizada para poder así re-usarse o utilizarse en reactores continuos. Así pues el empleo de enzimas inmovilizadas durante numerosos ciclos de reacción en reactores industriales implica el desarrollo de métodos muy sencillos de inmovilización de enzimas que permitan además aumentar grandemente Ia estabilidad de estos excelentes, pero generalmente lábiles, catalizadores biológicos.

La inmovilización covalente multipuntual parece ser el método más adecuado para asociar inmovilización y estabilización de enzimas industriales. La participación de numerosos residuos de Ia proteína en Ia unión covalente, a través de brazos espaciadores cortos, a Ia superficie de soportes rígidos debe promover una importante estabilización de las moléculas de enzimas inmovilizadas. Ahora, las distancias relativas entre los diferentes residuos involucrados en Ia inmovilización deben mantenerse prácticamente inalteradas durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente inactivante (calor, codisolventes, etc.). De este modo Ia intensidad de estos cambios conformacionales, y consecuentemente Ia velocidad de inactivación de las enzimas, deberían quedar muy reducidas. La bondad de esta hipótesis ha sido corroborada por diferentes autores y especialmente por el presente grupo de

investigación que desarrolló un método general de estabilización de enzimas por unión covalente multipuntual, a través de sus regiones ricas en residuos lisina, sobre soportes pre-existentes conteniendo una elevada densidad de grupos glioxil (grupos aldehido alifáticos muy próximos a Ia superficie del soporte). La presente patente muestra Ia puesta a punto de un nuevo más eficaz de inmovilización-estabilización de enzimas por unión covalente multipuntual. Este método se basó en las siguientes hipótesis de partida: a.- inmovilizar todas las moléculas de enzima por una única región de su superficie, b.- inmovilizarlas en principio por cada una de las regiones ricas en residuos lisina, c- insertar, mediante mutagénesis dirigida, un residuo Cys en cada una de las regiones por las que se quiere inmovilizar Ia enzima, d.- preparar soportes conteniendo una pequeña cantidad de disulfuros altamente reactivos y una gran cantidad de grupos epoxido, e.- realizar Ia inmovilización uni-puntual orientada de cada una de las enzimas mutadas por intercambio tiol-disulfuro a través de Ia Cys insertada en cada región de Ia enzima y los residuos disulfuro del soporte, y f.- fomentar una posterior inmovilización multipuntual entre los residuos lisina situados en las proximidades de Ia Cys insertada y los grupos epóxido del soporte.

De este modo, evaluando Ia estabilidad de los diferentes derivados obtenidos frente a diferentes agentes inactivantes se podrá detectar que región de

Ia superficie de Ia proteína es Ia más decisiva en Ia inactivación de Ia enzima y, por Io tanto, Ia zona que más interesa rigidificar, si se pretende aumentar Ia estabilidad de Ia enzima.

Posteriormente, se podría enriquecer (también por técnicas de Biología Molecular) esa región con nuevos residuos lisina y obtener derivados todavía más estabilizados. Finalmente, utilizando estos mutantes altamente enriquecidos en residuos lisina alrededor de una Cys altamente reactiva (no sólo por intercambio tiol- disulfuro) se evaluarán otras alternativas (soportes epóxido monofuncionales, soportes glioxil, etc.) para lograr los máximos efectos estabilizantes.

Esta enzima Penicilina G acilasa es utilizada actualmente en Ia industria farmacéutica para al hidrólisis de Penicilina G y cefalosporina G para producir 6 APA y 7ADCA respectivamente. Además, Ia enzima puede utilizarse en Ia reacción de síntesis de antibióticos betalactámicos semi-sintéticos, tanto en medios con alto contenido en codisolverntes utilizando los sustratos sin activar, como en medio acuosos utilizando el donador de acilo activado. Dada su relativa baja especificidad por los nucleofilos, Ia enzima también tiene interés para resolver mezclas racémicas de aminas y alcoholes, o para Ia síntesis de amidas.

En algunas de estas reacciones Ia estabilidad de Ia enzima reduce el margen de condiciones que pueden utilizarse (fundamentalmente Ia concentración de disolventes orgánicos, pro Io que Ia preparación de enzimas inmovilizadas con mayor estabilidad seria muy importante.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN Descripción Breve

En Ia presente invención se describen diferentes mutantes de Ia enzima PGA preparados mediante Ia inserción de una (1) Cys (en cada muíante) en una región diferente de Ia superficie de Ia enzima que fuese relativamente rica en residuos lisina. Cada muíante se inmovilizó sobre soportes disulfuro-epóxido y de ese modo Ia inmovilización se dirigió selecíivameníe sobre Ia Cys insertada y posíeriormeníe Ia unión covaleníe mulíipuníual enzima-soporte se promovió por reacción eníe los aminos cercanos a cada Cys insertada y los grupos epóxido del soporte. De esíe modo se descubrió que Ia región próxima al amino ácido 380b era una región clave para Ia esíabilización de Ia enzima freníe al efecío del calor y los disolveníes orgánicos. Esía región se enriqueció (por muíagénesis dirigida) en Lys superficiales adicionales y los muíaníes obíenidos se inmovilizaron, a íravés de esía región, sobre difereníes soportes. Los mejores resulíados se obíuvieron sobre soportes coníeniendo grupos glioxil, grupos aldehido alifáíicos de cadena corta. Uíilizando geles de agarosa al 10% acíivados con grupos glioxil se consiguieron derivados que eran 300.000 veces más esíables que Ia correspondieníe enzima soluble. La exceleníe esíabilidad de esíos derivados enzimáíicos los hace muy úíiles para caíalizar difereníes procesos indusíriales de iníerés en química orgánica y farmacéuíica: hidrólisis de penicilina, reacciones de

síntesis en presencia o ausencia de disolventes y reacciones de hidrólisis y síntesis enantioselectivas.

A partir de este planteamiento completamente original y combinando técnicas de Biología Molecular y técnicas de Diseño de Soportes Activados "a medida", se ha logrado finalmente un método muy sencillo de inmovilización y estabilización muy drástica de enzimas industriales. El método ha sido puesto a punto utilizando Ia enzima penicilina G acilasa (de gran interés industrial por las múltiples biotransformaciones que es capaz de catalizar), aunque este nuevo método de inmovilización-estabilización de enzimas sería igualmente valido para Ia inmensa mayoría de enzimas industriales.

Descripción Detallada

Diseño de soportes disulfuro-epóxido a medida

El primer paso es detectar las zonas mas relevantes para Ia estabilidad de Ia enzima, para ello es preciso dirigir Ia inmovilización por las diferentes zonas ricas en residuos reactivos, de forma que se puedan detectar las zonas en las que Ia estabilización conseguida sea mayor.

Los soportes epoxido reaccionan muy lentamente con los grupos nucleófilos de las enzimas, de hecho si las proteínas no se adsorben al soporte por algún motivo, en principio Ia inmovilización sobre soportes epóxido no es significativa. De esta forma, los soportes epóxidos requieren de algún tipo de grupo o propiedad que permita al adsorción previa de las enzimas sobre Ia superficie, p.e. Ia mayoría de los soportes comerciales son hidrofóbicos y se recomienda su uso a elevada fuerza iónica. Para ello se modificaron los soportes epóxido comerciales (Eupergit C de

Róhm-Hass) con diferentes concentraciones de dos reactivos diferentes (ditiotreitol (DTT) y sulfuro sódico). De este modo se obtuvieron soportes parcialmente modificados con diferentes concentraciones de grupos tiol situados a diferente distancia de Ia superficie del soporte: con un brazo espaciador (modificación con DTT) y sin brazo espaciador (modificación con sulfuro sódico). Posteriormente, los soportes se activaron con 2,2 ' dipiridil disulfuro (2PDS) y así se obtuvieron grupos disulfuro altamente reactivos sobre el soporte, rodeados de muchos grupos epóxido. Se comprobaron que estos soportes no podían

inmovilizar enzimas que carecieran de grupos tiol (naturales o insertados) y que Ia velocidad de inmovilización sobre los mismos era varios ordenes de magnitud mayor a Ia observada con grupos que solo tenían grupos tiol.

De esta forma disponíamos de un soporte capaz de inmovilizar de proteínas específicamente por grupos tiol insertados en Ia superficie de Ia proteína

2.- Diseño de mutaciones dirigidas de Ia superficie de Ia PGA para insertar grupos Cys en distintas zonas: Se estudió Ia superficie de Ia enzima penicilina G acilasa (PGA) y se detectaron todas las regiones ricas en residuos Lys, más o menos cercanas al centro activo de Ia enzima. En tres regiones se encontraron residuos Ser (B9, B201y A84) que se reemplazaron por Cys (unas mutaciones muy conservadoras) (Figura 1 ). En otros tres o casos no se encontró ningún residuo Ser superficial y se tuvo que optar por reemplazamientos menos conservadores (GlnB380, GlnB112 y AlaB361 ) (Figura 2).

Las enzimas mutadas tenían una actividad específica muy similar a Ia enzima sin mutar (del orden de 25-30 Ul/mg de proteína) y además poseían Ia misma estabilidad térmica e idénticos perfiles actividad-pH. Parece que, tal como predecía Ia simulación matemática, las mutaciones realizadas apenas afectaban a Ia estructura-función de Ia PGA.

3.- Inmovilización- Estabilización de las enzimas mutadas por unión covalente multipuntual sobre soportes disulfuro-epóxido Se comprobó que Ia PGA nativa no se inmovilizaba de forma significativa sobre los nuevos soportes tiol epóxido. Sin embargo, las distintas enzimas con una Cys superficial si se inmovilizaban sobre el soporte.

Se realizó Ia inmovilización dirigida de las enzimas mutadas sobre soportes disulfuro epóxido a pH neutro para favorecer Ia inmovilización por intercambio tiol- disulfuro. Posteriormente, se promovió Ia posterior interacción covalente multipuntual incubándolos derivados a pH alcalino para aumentar Ia reactividad de los residuos lisina situados en el entorno de las Cys insertadas e involucradas en Ia inmovilización dirigida. Finalmente, los grupos epóxidos remanentes se

bloquearon con glicina para evitar efectos indeseables promovidos por una cierta hidrofobicidad de los soportes empleados. Como blancos de referencia se utilizaron soportes disulfuro-epóxido bloqueados con glicina donde solo era posible Ia inmovilización dirigida de las enzimas mutadas a través de una única unión enzima-soporte.

En todos los casos se comprobó Ia formación de una unión covalente multipuntual entre las enzimas mutadas y los soportes disulfuro epóxido (al menos un enlace amino-epóxido por cada una de las dos subunidades de Ia enzima más el enlace disulfuro). A pesar de ello Ia estabilización de los diferentes derivados era muy diferente: en algunos casos Ia inmovilización multipuntual apenas tenia efectos estabilizantes y en el mejor de los casos (muíante B380 cercano al centro activo de Ia enzima) se obtuvieron unos factores de estabilización de 12-20 veces frente al efecto desestabilizante del calor y los codisolventes. También este muíante exhibió unas propiedades catalííicas muy iníeresaníes (basíaníe mejores que las de Ia enzima naíiva) en bioíransformaciones de iníerés: hidrólisis enaníioselecíiva de mezclas racémicas de esíeres quirales y Ia síníesis cinéíicameníe conírolada de enlaces amido.

4.- Enriquecimienlo en grupos amino de Ia superficie de Ia PGA en lomo al residuo B380

Gracias al planíeamienío realizado pudimos descubrir una región de Ia enzima (alrededor del amino ácido B380) que era clave para Ia esíabilización y Ia mejora de sus propiedades caíalííicas. Posíeriormeníe procedimos a enriquecerla en 8 nuevos residuos lisina para mejorar su rigidificación por unión covaleníe mulíipuníual sobre soportes disulfuro-epóxido.

Las muíaciones realizadas fue cambiar por Lys los siguieníes residuos: ArgB437, AspA61 , ThrA121 , AsnB110, AspB381 , AsnB457, GluB468 y ThrB470 (Figura 3).

Esías muíaciones reducían Ia acíividad específica de Ia enzima en un 50% y su íermo-esíabilidad a pH 7 por un facíor de 40. Al enriquecer una en Lys una zona ya rica en Lys, se puede asumir que posiblemeníe esa nueva zona sea Ia más rica en residuos aminos de íoda Ia superficie de Ia enzima. De esía forma,

ahora había dos características de esta zona que permitían orientar Ia molécula en el entorno al residuo B380: Ia Cys y Ia mayor densidad de grupos Lisina.

5.- Inmovilización sobre diferentes soportes (Epóxido, tiol-epoxido o Glioxil) La presencia, incluso de bajas concentraciones, de grupos disulfuro en Ia superficie del soporte puede impedir un perfecta congruencia geométrica entre las nuevas enzimas mutadas (enriquecidas en aminos en Ia zona más sensible para Ia estabilidad de Ia enzima) y los soportes epóxido altamente activado. Además, los soportes Eupergit puede que no presenten superficies internas demasiado grandes (sean más bien mallas de fibras relativamente finas) y por ello no sean los soportes ideales para una unión covalente multipuntual muy intensa entre enzimas y soportes. Por ello, se evaluó otros métodos de inmovilización de estas enzimas altamente aminadas para ver si mejorábamos su estabilidad térmica: a.- inmovilización covalente de sobre soportes epóxido mono-funcionales a pH neutro. Las enzimas conteniendo un grupo tiol (Ia Cys insertada) reaccionan lentamente con los soportes epóxido monofuncionales pero Io hacen mucho más rápidamente que las enzimas nativas sin Cys insertada. Los derivados obtenidos por este procedimiento tenían un factor de estabilización de 1 ,500 con respecto a los derivados unipuntuales en experimentos de inactivación térmica. Parece que efectivamente Ia presencia de grupos disulfuro puede reducir Ia intensidad de Ia rigidificación de Ia enzima. b.- inmovilización sobre soporte glioxil-agarosa. Esta inmovilización ocurre a través de las regiones de Ia enzima ricas en residuos lisina con soportes formados por fibras muy gruesas que pueden promover una intensa multi- interacción con enzimas. De hecho, Ia enzima mutada enriquecida se inmoviliza mucho más rápidamente que Ia enzima nativa (unas 15 veces más rápido) y ello parece indicar que efectivamente se está inmovilizando mayoritariamente Ia enzima a través de Ia nueva región enriquecida en residuos Lys (alrededor del amino ácido B380). Ahora los derivados mostraban un factor de estabilización de un factor de varios cientos de miles veces más estable con respecto a los derivados unipuntuales. De hecho, esta enzima mutada comparada en forma libre con al enzima nativa era 40 veces menos estable que Ia enzima nativa, mientras

que comparando las enzimas inmovilizadas, este derivado era dos ordenes de magnitud mas estable que Ia enzima nativa inmovilizada sobre un soporte similar.

La inmovilización sobre soportes disulfuro-epóxido permite detectar las regiones claves para Ia estabilización de enzimas y sin embargo, una vez optimizadas estas regiones (enriquecidas en residuos lisina) Ia inmovilización sobre soportes glioxil permite obtener unos efectos estabilizantes mucho mayores.

DESCRIPCIóN DE LA FIGURAS Figura 1 : Representación en Grasp de Ia superficie de Ia PGA. En verde: serinas a mutar por las cisteínas. En azul usinas; amarillo cadena α de Ia PGA y en gris cadena β de Ia PGA.

Figura 2: Representación en Grasp de los residuos seleccionados para ser reemplazados por cisteína. En rojo residuos a mutar por cisteínas, en azul usinas, amarillo cadena α de Ia PGA y en gris cadena β de Ia PGA.

Figura 3: Representación en Grasp de los residuos seleccionados para ser reemplazados por usinas cara frontal PGA cerca de Ia CysB380. En verde CysB380, negro AspA61 , rosa ThrA121 , naranja AsnB110, marrón AspB381 , celeste ArgB437, azul asnB457, rojo Glub468, violeta ThrB470, amarillo cadena α de Ia PGA y en gris claro cadena β de Ia PGA.

Figura 4: Cinética de inactivación térmica de derivados bifuncionales de los distintos mutantes de cisteína. La inactivación se realizó a pH 7 (fosfato de sodio 50 mM) y 55 0 C. Derivados bifuncionales: (») CysA86-PGA, ( ) CysB9-PGA, O CysB112-PGA, (») CysB201-PGA,, (*) CysB361-PGA, ( ) CysB380-PGA; Derivado control: ( ) CysB380-PGA.

Figura 5: Inactivación frente a dioxano de derivados bifuncionales de los distintos mutantes de cisteína. La inactivación se realizó con 60% dioxano a pH 7 (fosfato de sodio 10 mM) y 4 0 C. Derivados bifuncionales: (•) CysA86-PGA, ( ) CysB9-PGA, O CysB112-PGA, (a) CysB201-PGA,, (#) CysB361-PGA, ( ) CysB380-PGA; Derivado control: ( ) CysB380-PGA.

Figura 6: Curso de síntesis cinéticamente controlada (SCC) de L-mandelil- glicinamida. Catalizada por: ( ) derivado monofuncional y ( ) bifuncional de CysB380-PGA y O derivado bifuncional de CysB112-PGA. Los derivados control

y bifuncionales de los demás mutantes presentaron cursos de reacción similares a los de los derivados control de CysB380-PGA y el derivado bifuncional de CysB112-PGA. Las reacciones se realizaron a 25 0 C, pH 7.5 y las concentraciones de sustratos fueron 5OmM de glicinamida y 1OmM (R) de mandelato de metilo. Figura 7: Cinética de inmovilización sobre soporte glioxil-agarosa. ( ) CysB380-PGA, (s) CysB380(4Lys)-PGA, (•) CysB380(4Lys)-PGA, y (*) CysB380(8l_ys)-PGA. La inmovilización se realizó con una relación volumen de enzima:g de soporte 50:1 en tampón bicarbonato de sodio pH 10 0.1 M a 4 0 C. Figura 8: Cinética de Ia cinética de inactivación frente a dioxano del derivado CysB380 (8 Lys)-PGA-glioxil y de derivados reportados como muy estables en Ia literatura. La inactivación se realizó con 60% dioxano a pH 7 (fosfato de sodio 10 mM) y 4 0 C. Derivados glioxil-agarosa de: (φ) PGA nativa, (φ)CysB380(6Lys)-PGA, (*) Derivado de Ia PGA nativa preparado sobre Eupergit C preparado a alta fuerza iónica. (#) Derivado comercial de PGA (Fluka).

EJ EMPLOS DE LA INVENCIóN

Ejemplo 1.- Prueba de Ia inmovilización dirigida.

Inmovilización de enzimas con Cys insertadas y enzima nativa en soportes tiol reactivo-epoxido La enzima nativa no se inmoviliza a pH 7 y 10 mM de fosfato en los soportes tiol reactivos, mientras que las enzimas con Cys si que se inmovilizaban en los soportes tiol reactivo, tanto solo con grupos tiol reactivos como tiol-epoxido, a una velocidad idéntica. Esto demuestra que se está inmovilizando fundamentalmente las enzimas por Ia nueva Cys.

Inmovilización de distintos imitantes en soportes bifuncionales de eupergit (7 μmol grupos tiol-reactivos/g soporte). La inmovilización se realizó a pH 7 (fosfato de sodio 50 mM) y temperatura ambiente, o soporte monofuncional bloqueado con glicina

2.- Inactivación térmica y en presencia de disolventes de los diferentes derivados.

Las enzimas solubles presentan exactamente Ia misma termoestabilidad, actividad y actividad/pH. Las Figuras 4 y 5 muestran las inactivaciones térmicas y en presencia de disolventes de las distintas enzimas mutadas sobre soportes epoxido-tiol reactivo, donde se ha conseguido cierta unión covalente multipuntual (demostrada por electroforesis en SDS donde no se liberan subunidades de Ia PGA, hay que destacar que el puente disulfuro debería de romperse en esas condiciones, así que al menos hay 3 uniones entra las enzimas y el soporte). Se observa que el muíante con Ia Cys en Ia posición 380 B era el más estable tanto en medio orgánico como en inactivaciones térmicas.

3.- Síntesis cinéticamente controlada catalizada por diferentes derivados de PGA nativa o mutada.

La Figura 6 muestra que el muíante com el aá. B 380 sustiíuido por urna Cys e inmovilizado sobre soportes tiol-epóxido presenta mejores comportamientos en SCC que Ia enzima mutada en Ia posición B112 (que es similar a Ia forma

nativa) o el derivado en el que el muíante Cys B380 se une a soportes que tan sólo tiene grupos tiol-reactivos.

4.- Enantioselectividad de Ia enzima.

El muíante Cys B 380 inmovilzada sobre soportes epoxido-íiol-reacíivo fue el único que vio mejoradas de forma significaíiva de Ia E de Ia enzima

Enantioselectividad frente a (R) y (S) 2-fenilpropionato de etilo de los derivados bifuncionales de los distintos mutantes de Cys de PGA. Las condiciones de hidrólisis fueron 1 mM ( R) o (S) 2-fenilpropionato de etilo en fosfato de sodio 10 mM pH 7.0 a 25°C.

5.- Inmovilización sobre sopones glyoxyl de las enzimas enriquecidas en grupos KLys en el enlomo del residuo B 380.

La Figura 7 muesíra como las enzimas con Lys adicionales se inmovilzan mucho mas rápido que Ia enzima naíiva, confiormando que sobre esíos soproíes esíos muíaníes se inmovilizan de forma prefereníe por Ia zona B 380.

6.- Estabilidad de los derivados de enzimas enriquecidas en Lys en el entorno de el residuo B 380 inmovilizadas sobre soportes glyoxyl agarosa. Estas enzimas esíán mucho más esíables que las enzimas solubles o que

Ia enzima unida a soportes íiolreacíivos, Eupergií or Eupergoií con grupos íiol reacíivos y epóxido, en íodas las condiciones de pH, T y presencia de ageníes disíorsionaníes esíudiados. A modo de ejemplo, se presenía en Ia Figura 8 Ia

inactivación del nuevo derivado y los derivados glyoxyl-agarosa de Ia enzima nativa, as como otros derivados comerciales. Puede apreciarse que el nuevo biocatalizador es mucho más estable que cualquiera de las otras preparaciones ensayadas.