An Carcinomen erkranken und versterben jährlich mehrere Mil- lionen Menschen weltweit. Diese Sterblichkeitsraten sind seit vielen Jahren unverändert trotz intensiver Therapie-Forschun- gen. Bisher werden die Patienten mit Carcinomen vielfach einer chirurgischen Entfernung der Carcinome bzw. einer Chemo-oder Strahlentherapie unterzogen. Damit sind aber massivste Neben- wirkungen verbunden, die dann zu den Sterblichkeitsraten der Patienten mit Carcinomen beitragen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem gegen Carcinome therapeu- tisch und prophylaktisch vorgegangen werden kann, wobei vor- stehende Nebenwirkungen vermieden werden.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patent- ansprüchen erreicht.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß bei Carcinomen bzw. ihren Vorstufen Zellzyklus- Regulatorproteine in veränderter Form oder Menge vorliegen.

Beispielsweise findet sich in Carcinomen eine Überexpression von Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitoren (vgl. deutsches Pa-

tent 198 29 473 des Anmelders). Ferner hat der Anmelder er- kannt, daß Individuen gegen in Form oder Menge veränderte Zellzyklus-Regulatorproteine immunisiert werden können, wo- durch gegen Carcinome und ihre Vorstufen therapeutisch und prophylaktisch vorgegangen werden kann. Der Anmelder hat dies in invitro-wie auch in invivo-Experimenten gezeigt (vgl. nachstehendes Beispiel).

Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Zellzyklus-Regulatorprotein und/oder eine exprimierbare hierfür kodierende Nukleinsäure in einer für eine Immunisierung eines Individuums gegen Carcinome und ihre Vorstufen geeigneten Menge sowie übliche Hilfsstoffe.

Der verwendete Ausdruck"Zellzyklus-Regulatorprotein"umfaßt Zellzyklus Regulatorproteine jeglicher Art und Herkunft. Bei- spielsweise können es Zykline sein. Besonders können es Zyklin-abhängige Kinasen, wie cdk4 und cdk6, sein, welche die Zykline regulieren. Ganz besonders können es Zyklin-abhängige Kinase-Inhibitoren sein, welche wiederum die Zyklin-abhängigen Kinasen regulieren. Beispiele der Zyklin-abhängigen Kinase- Inhibitoren sind die Proteine pIS, pl6, pl8, pl9, wobei pl6 bevorzugt ist. Die Zellzyklus-Regulatorproteine können in Wildtyp-oder veränderter Form vorliegen. Letztere Form umfaßt Veränderungen der Aminosäuresequenz, wie Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von einer oder mehreren Aminosäuren. Auch können Fragmente von Zellzyklus- Regulatorproteinen als solche oder in Verbindung mit Trägern vorliegen, wobei die Fragmente eine Wildtyp-oder eine ver- änderte Aminosäuresequenz haben können. Günstig ist es, wenn die Träger im Individuum nicht als immunogen wirken. Solche Träger können Individuum-eigene oder-fremde Proteine bzw.

Fragmente davon sein. Bevorzugt sind Träger, wie Serumalbumin, Fibrinogen oder Transferrin bzw. ein Fragment davon. Besonders günstig ist es, wenn die Fragmente der Zellzyklus-Regulator- proteine Epitope enthalten, die von cytotoxischen T-Zellen, z. B. CD8+ T-Zellen, erkannt werden und eine cytotoxische Immun- antwort induzieren können. Solche Epitope von Zellzyklus-Regu-

latorproteinen können durch dem Fachmann bekannte Verfahren, insbesondere durch Verwendung eines Softwaresystems des NIH (NIH bioinformation service http :/bimas. dcrt. nih. gov. cgi- bin/molbio/ken_parker_comboform) ermittelt werden. Von Vorteil kann es ferner sein, wenn unterschiedliche Zellzyklus-Regula- torproteine oder Fragmente davon, für die vorstehenden Aus- führungen entsprechend gelten, gleichzeitig vorliegen. Zur Herstellung vorstehender Zellzyklus-Regulatorproteine wird z. B. auf Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) verwiesen.

Der verwendete Ausdruck"exprimierbare für ein Zellzyklus- Regulatorprotein kodierene Nukleinsäure"umfaßt jegliche Nu- kleinsäure, z. B. RNA oder DNA, die in einem Individuum ex- primierbar ist und für ein Zellzyklus-Regulatorprotein, für das vorstehende Ausführungen entsprechend gelten, kodiert. Die Nukleinsäure kann als solche, d. h. zusammen mit für ihre Ex- pression geeigneten Elementen, oder in Verbindung mit einem Vektor vorliegen. Beispiele solcher Elemente sind Promotoren und Enhancer, wie CMV-, SV40-, RSV-, Metallothionein I und Polyhedrin-Promotor bzw. CMV-und SV40-Enhancer. Weitere für die Expression geeignete Sequenzen gehen aus Goeddel : Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) hervor. Darüberhinaus können als Vektoren jegliche für die Expression in Säugerzellen geeignete Vektoren verwendet werden. Dies sind z. B. pcDNA3, pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 sowie von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg stammende Vektoren. Auch können als Vektoren rekombinante Viren, z. B. Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adeno-assoziiertes Virus, verwendet werden. Hinsichtlich der Herstellung vorstehender Nukleinsäuren, insbesondere von Vektoren, die solche Nukleinsäuren enthalten, wird z. B. auf Sambrook et al., supra, verwiesen.

Der verwendete Ausdruck"Carcinome und ihre Vorstufen"umfaßt Carcinome jeglicher Art und Herkunft bzw. Vorstufen dieser.

Beispielsweise können es Carcinome des oberen Respirationstraktes oder Anogenital-Carcinome, insbesondere das Cervix-Carcinom und seine Vorstufen, wie cervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN I-III), Carcinoma in situ (CIS), etc. sein. Ebenso sind auch benigne Veränderungen wie Papillome, Adenome, Hyperplasien oder ähnliche Proliferationen epithelialer, mesenchymaler oder hämatopoetischer Proliferationen hier zuzuordnen.

Der verwendete Ausdruck"Individuum"umfaßt ein Individuum jeglicher Art und Herkunft, das Zellzyklus-Regulatorproteine aufweist und an Carcinomen bzw. ihren Vorstufen erkranken kann. Beispiele eines solchen Individuums sind der Mensch und das Tier sowie Zellen von diesen.

Der verwendete Ausdruck"für eine Immunisierung eines Individuums geeignete Menge"umfaßt jegliche Menge eines Zellzyklus-Regulatorproteins, für das vorstehende Ausführungen entsprechend gelten, bzw. einer exprimierbaren hierfür kodierenden Nukleinsäure, für die vorstehende Ausführungen entsprechend gelten, mit der ein Individuum immunisiert werden kann. Die Menge hängt davon ab, ob ein Zellzyklus- Regulatorprotein oder eine exprimierbare hierfür kodierende Nukleinsäure verwendet wird. Auch hängt die Menge davon ab, ob die Immunisierung des Individuums mehr auf eine Induktion von gegen veränderte Zellzyklus-Regulatorproteine gerichteten Antikörpern oder auf eine Stimulierung von gegen veränderte Zellzyklus-Regulatorproteine gerichteten cytotoxischen T- Zellen, z. B. CD8+ T-Zellen, abzielt. Beide Möglichkeiten der Immunisierung können durch die vorliegende Erfindung erreicht werden. Desweiteren hängt die Menge davon ab, ob die Immunisierung als prophylaktische oder therapeutische Behandlung beabsichtigt ist. Darüber hinaus spricht das Alter, das Geschlecht und das Gewicht des Individuums eine Rolle für die Bestimmung der Menge. Günstig ist es, wenn dem Individuum 100mg-1 g eines Zellzyklus-Regulatorproteins bzw. 106- 1012 MOI eines rekombinanten, eine exprimierbare für ein Zellzyklus-Regulatorprotein kodierende Nukleinsäure

enthaltenden Virus injiziert werden. Die Injektion kann an mehreren Stellen des Individuums intramuskulär, subkutan, intradermal oder in jeder anderen Applikationsform erfolgen.

Ferner kann es günstig sein, ein oder mehrere"Booster- Injektionen"mit ca. gleicher Menge durchzuführen, wobei es besonders günstig sein kann, in den einzelnen Injektionen verschiedene Fragmente der jeweiligen Zellzyklus- Regulatorproteine zu verwenden.

Der verwendete Ausdruck"übliche Hilfsstoffe"umfaßt jegliche Hilfsstoffe, die sich für eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Immunisierung eines Individuums eignen. Solche Hilfsstoffe sind z. B. Immunisierungs-Adjuvantien, wie GM-CSF oder Freund's Adjuvans, gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen, etc.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Individuen, insbesondere den Menschen und Tiere, gegen veränderte Zellzyklus-Regulatorproteine zu immunisieren. Die Immunisierung erfolgt sowohl durch die Induktion von Antikörpern als auch durch die Stimulierung von CD8+-T Zellen, die gegen veränderte Zellzyklus-Regulatorproteine gerichtet sind. Somit ist ein prophylaktisches und therapeutisches Vorgehen gegen Carcinome und ihre Vorstufen möglich.

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.

Beispiel : Stimulierung von CD8'-T Zellen gegen den Zyklin- abhänigen Kinase-Inhibitor pl6 und Lyse von pl6- überexprimierenden Carcinom-Zellen.

(A) Stimulierung von CD8'-T Zellen gegen pl6.

Von einem gesunden Spender werden periphere mononukleäre Zellen gewonnen und einer sog. ELISPOT-Analyse unterzogen. Das Prinzip dieses Experimentes ist, daß Lymphozyten in Kulturgefäßen mit spezifischen Antigenen stimuliert werden.

Kommt es zur Aktivierung der Lymphozyten, da diese das Antigen

erkennen, setzen die aktivierten Lymphozyten Zytokine frei, die ihrerseits an spezifische Antikörper binden, welche auf der Bodenfläche der Kulturgefäße immobilisiert sind. Nach dem Auswaschen der Lymphozyten können dann die gebundenen Zytokine in den Kulturgefäßen mit Hilfe eines zweiten Antikörpers, der in einer nachgeschalteten Farbreaktion sichtbar gemacht wird, nachgewiesen werden.

Periphere Blutlymphozyten (PBL) werden von einem HLA-A0201 positiven gesunden Probanden durch Dichtezentrifugation über einen Ficoll Paque@-Gradienten aufgereinigt. T-Lymphozyten werden durch Abtrennung der B-Lymphozyten bzw. der Monozyten mit Hilfe Antikörper gekoppelter Magnetobeads (CD11, CD16, CD19, CD36 und CD56) (Pant T cell isolation Kit@, Milteny, Bergisch Gladbach, Germany) gewonnen. Aus 30 ml Blut werden etwa 2 x 107 T-Zellen gewonnen werden.

HLA-A0201 restringierte Peptide von pl6 werden mittels eines Softwaresystems des NIH (NIH bioinformation service [http :/bimas. dcrt. nih. gov. cgi-bin/molbio/ken_parker_combOform) identifiziert. Es handelt sich um die nachstehenden Peptide : 9mer Peptide : 10mer Peptide : score 1 : VMMMGSARV score 1 : MMGSARVAEL score 2 : VLHRAGARL score 2 : LLLHGAEPNC score 3 : TLTRPVHDA score 3 : GVMMMGSARV score 4 : LLHGAEPNC score 5 : SMEPSADML Die isolierten T-Zellen werden mit T2-Zellen inkubiert, die (a) mit einem Gemisch der vorstehenden 9mer Peptide (10pg/Peptid) und (b) mit einem Gemisch der vorstehenden 10mer Peptide (10yg/Peptid) beladen worden sind. Die T-Zellen werden über 6-Wochen jeweils wöchentlich restimuliert. Jeweils 107 T- Zellen werden mit 2 x 106 Peptid-beladenen T2-Zellen in 24 Lochplatten cokultiviert.

Die Reaktivität gegenüber den Peptid-beladenen T2-Zellen wird

wöchentlich bestimmt, beginnend am Tag 0 des Experiments, indem eine IFN-y Elispotanalyse durchgeführt wird. Am Tag 28 wird eine Reaktivität durch das Gemisch von (a) (400 spezifische Zellen pro Million Zellen) beobachtet. Die Hauptreaktivität ist dabei gegen das Peptid VMMMGSARV (1000 spezifische Zellen/1 000 000 Zellen) gerichtet (Fig. 1).

Eine schwächere Aktivität wird gegen das Gemisch von (b) (150 spezifische Zellen/1 000 000 Zellen) beobachtet. Hier zeigt das Peptid MMGSARVAEL die höchste Reaktivität (600 spezifische Zellen/1 000 000 Zellen).

Somit wird deutlich, daß gegen pl6 aktivierte CD8+-T Zellen stimuliert werden können.

(B) Lyse von pl6-uberexprimierenden Carcinom-Zellen Nach einer weiteren Restimulierung werden die aktivierten CD8+- T Zellen mit den HLA A0201+ Zervixkarzinomzellen Caski, die pl6 überexprimieren, inkubiert. Als Kontrollen werden die Kolonkarzinomzellen SW480 verwendet, die pl6 nicht überexprimieren. 106 Caski-Zellen werden mit slCr (100yCi) für 1 h bei 37°C markiert und mit steigenden Zahlen an aktivierten CD8+-T Zellen für 3 Stunden kokultiviert. Die spezifische Lyse der Caski-Zellen wird durch die Menge der freigesetzten Radioaktivität im Überstand bestimmt.

Es zeigt sich, daß Caski-Zellen durch die aktivierenden CD8+-T Zellen, nicht aber die Kontrollzellen SW480 lysiert werden (Fig. 2).