Die vorliegende Erfindung betrifft ein für die Routinediagnostik geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Freisetzung des Peptids Neurotensin in die Zirkulation .

Dabei soll vorausschickend angemerkt werden, dass in der vorliegenden Beschreibung Begriffe wie "Diagnostik" bzw. "Routinediagnostik" aus Gründen der Vereinfachung in der Regel in einem umfassenden Sinne verwendet werden, der die Bestimmung der gemessenen Biomoleküle (Peptide) nicht nur für diagnostische Zwecke im engeren Sinne abdecken soll , sondern auch für andere Zwecke wie z . B . zur Bestimmung des metabolischen Zustands eines Probanden vor Beginn einer Therapie oder einer Untersuchung zu diagnostischen Zwecken oder zur Beobachtung und Überwachung eines Patienten über längere Zeiträume, z . B . zur Kontrolle eines Krankheitsverlaufs oder von Therapiemaßnahmen . Auch Bestimmungen zur Forschungszwecken, z . B . im Zusammenhang mit der Entwicklung von Pharmazeutika, z . B . Neurotensinrezeptor-Agonisten, oder von Produkten für die Ernährung, sollen unter den Begriff "Diagnostik" subsummiert werden, soweit das nicht im Einzelfall aufgrund der diskutierten spezielleren Zusammenhänge ausgeschlossen ist .

Außerdem gilt , dass auch wenn die spezielleren Ausführungen

zur Erfindung in der vorliegenden Anmeldung insbesondere die Humanmedizin betreffen, Anwendungen auf dem Gebiet der Tiermedizin oder Tierzucht grundsätzlich ebenfalls eingeschlossen sein sollen. So ergibt sich für den Fachmann die Übertragbarkeit der meisten Ausführungen zur vorliegenden Erfindung auf nicht-menschliche Säugetiere , ohne dass umfangreiche Erläuterungen nötig sind . Die analoge Anwendbarkeit des für die Humanmedizin näher beschriebenen Verfahrens auf die Tiermedizin folgt z . B. aus der Bekanntheit der entsprechenden Peptidsequenzen für viele andere Säugetiere, und neben tiermedizinischen Anwendungen sind auch Anwendungen denkbar, die eher die Säugetierzucht betreffen, z . B . als Monitoring des Fütterungszustands und der Futterverwertung von Nutztieren .

Neurotensin ist ein in verschiedenen Geweben und der Zirkulation von verschiedenen Säugetieren, einschließlich des Menschen, vorkommendes Tridecapeptid, dessen Primärstruktur bei allen Säugetieren identisch zu sein scheint . Es weist die Aminosäuresequenz auf , die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO : 2 aufgeführt ist .

Neurotensin wird, wie die meisten biologisch aktiven Peptide (5 ; Literaturangaben in Form von Zahlen in Klammern beziehen sich auf die beigefügte Literaturliste) , durch enzymatische Prozessierung aus einem Vorläufermolekül gebildet , das als Preproneurotensin (mit Signalsequenz) bzw . Proneurotensin (PNT; ohne Signalsequenz) bezeichnet wird. Das Preproneurotensin/Proneurotensin der Säuger enthält neben dem Neurotensin (NT) ein weiteres biologisch aktives Peptid, das Hexa- peptid Neuromedin N (NMN; vgl . SEQ ID NO : 3) . Neurotensin- Vorläuferpeptide wurden u . a . aus Hunde- , Rinder- und Nagetier-Geweben und schließlich auch aus humanen Geweben isoliert . Während die reifen Peptide NT und NMN für verschiedene Säugetiere eine identische Aminosäuresequenz aufweisen, unterscheiden sich die Vorläufermoleküle, d.h. die Prepro- bzw. Proneurotensine, von verschiedenen Säugetier-Spezies

bezüglich, einer Anzahl von Aminosäuren. So weist das Pre- proneurotensin der Ratte oder des Rinds z . B . nur 169 Aminosäuren auf , wohingegen das humane Preproneurotensin 170 Aminosäuren aufweist (17) .

Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen des humanen Pre- proneurotensins sind seit einigen Jahren bekannt (SEQ ID N0 : l ; vgl . auch Patent US 6 , 274 , 720 Bl) , genau wie die aus Hund (9) , Ratte (17) und Rind ( 17 ; vgl . auch die Gegenüberstellung verschiedener Preproneurotensinsequenzen in Figur 2 des o . g . US-Patents) . Die Aminosäuren 1 bis 23 des Prepro- neurotensins (SEQ ID NO : 1) stellen die sog . Signalsequenz dar .

Die Expression von Proneurotensin erfolgt vorrangig im zentralen Nervensystem (ZNS) und in speziellen enteroendo- crinen Zellen, den sogenannten N-Zellen im distalen Dünndarm sowie in Nervenfasern, die den Darmtrakt durchziehen (13) . PNT bzw. NT wurden aber auch in den Nebennieren und im Herz- gewebe nachgewiesen (24 ; 23 ) .

Das aus dem Proneurotensin gebildete biologisch aktive Neurotensin (NT) wurde in verschiedenen Säugetier-Geweben nachgewiesen und im Zusammenhang mit zahlreichen unterschiedlichen Funktionen diskutiert . So spielt Neurotensin im Gehirn eine große Rolle als Neurotransmitter und hat analgetische und thermoregulatorische Effekte (6 ; 8) . Des weiteren reguliert NT die Freisetzung der Neurotransmitter Acetyl- cholin und Glutamat (19 ; 18) , stimuliert die Sekretion von Hormonen der Hypophyse (29) und beeinflusst die Dopamin- Neurotransmission (18) , was einen Zusammenhang zur Parkinson' sehen Erkrankung nahe legt (28) .

Die Sekretion von Neurotensin im Gastrointestinaltrakt wird durch Nahrungsaufnahme stimuliert (15) . Dabei kommt es bereits kurz nach dem Essen zu einem signifikanten NT-Anstieg, der über mehrere Stunden erhöht bleibt (14) . Es

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konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von Fett , im Vergleich mit Eiweiß und Glucose, den stärksten Einfluss auf die NT-Produktion hatte (27) . Neurotensin stellt offensichtlich eine Art "Sättigungsfaktor" dar, da die Ausschüttung von NT zur Zügelung des Appetits und somit zur Reduktion der Nahrungsaufnahme führt (34) . Bei adipösen (fettleibigen) Patienten ist die Plasma-Konzentration des NT im Vergleich zu normalgewichtigen Personen reduziert , was vermutlich zu einem gesteigerten Appetit und einer erhöhten Aufnahme von Nahrung führt (35 ; 4) . Interessanterweise zeigten auch Raucher einen signifikant höheren Anstieg der NT-Konzentration nach Nahrungsaufnahme als Nichtraucher (26) . Dies lässt vermuten, dass eine veränderte Neurotensinausschüttung eine mögliche Ursache des gesteigerten Appetits und der häufig zu beobachtenden Gewichtszunahme von ehemaligen Rauchern nach Einstellung des Rauchens ist .

Im Gastrointestinaltrakt stimuliert Neurotensin die Sekretion von Pankreashormonen wie Insulin und Glucagon, inhibiert die Sekretion von Magensäure und stimuliert die Dick- darmmotilität (33 ) . NT fördert das Wachstum von gastrointe- stinalem Gewebe wie Pankreas- , Dick- und Dünndarmgewebe (12 ; 36 ; 10) , was die Hypothese nahe legt , dass NT zur Entstehung von Tumoren in diesen Geweben beiträgt .

Die Funktion des zweiten aus dem gleichen Vorläuferpeptid gebildeten Peptids Neuromedin N (SEQ ID NO : 3) ist weniger gut charakterisiert . Vermutlich hat es ähnliche Effekte wie das Neurotensin, da beide Ähnlichkeiten in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen und an die gleichen Rezeptoren binden (33) .

Durch Untersuchung von verschiedenen Gewebeextrakten unter Verwendung von Radioimmunoassays unter Verwendung von Antikörpern, die für freie C-Termini von NT oder NMN spezifisch sind und daher nicht proteolytisch prozessierte Proneuroten- sin-Formen ohne derartige freigelegte COOH-Temini nicht

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erkennen, teilweise in Kombination mit HPLC-Techniken zur Auftrennung der Fraktionen nach ihrer Molekülgröße , wurde festgestellt , dass neben NT und NMN bei der Prozessierung von PNT in gewebeabhängiger Weise auch unvollständig gespaltene , sog . große ( " large" ) NT- und/oder NMN-Peptide gebildet werden können (7 ; 13 ; 25) .

Zahlreiche Untersuchungen befassen sich mit der Bildung bzw . dem Vorkommen von Neurotensin bei verschiedenen Krankheiten, wobei diese Untersuchungen in erster Linie mit Gewebeproben und Gewebeextrakten durchgeführt wurden . Von Untersuchungen, die auf Messungen von Neurotensin in Blutproben von Erkrankten aufbauen, ist z . B . zu nennen, dass die Konzentration von Neurotensin im Plasma von Patienten mit Morbus Parkinson erhöht gefunden wurde (30) . Bei Zöliakiepatienten, die eine Unverträglichkeit gegenüber Getreidegluten aufweisen, wurde im Plasma im Vergleich zu Kontrollpersonen im nüchternen Zustand eine erhöhte Neurotensin-Konzentration nachgewiesen (2) . Die Plasmakonzentrationen von Neurotensin bei Patienten mit einer Pankreatitis sind nach Einnahme einer Mahlzeit im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen erhöht (22 ) . Bei Schilddrüsenerkrankungen wurden im Plasma von Patienten mit zentraler (oder sekundärer) Schilddüsenunterfunktion signifikant niedrigere Neurotensin-Konzentrationen festgestellt (31) . Die sekundäre Schilddrüsenunterfunktion ist bedingt durch eine Störung im Bereich der Hypophyse , welche die Ausschüttung von Schilddrüsenhormonen steuert . Dagegen konnten im Blut von Patienten mit einer peripheren (oder primären) Schilddrüsenunter- bzw . Schilddrüsenüberfunktion im Vergleich mit Kontrollen signifikant höhere Neurotensin- Spiegel (31) festgestellt werden . Bei der primären Schilddrüsenunterfunktion liegt die Ursache in einer Funktionsstörung der Schilddrüse selbst begründet . Patienten mit einer cystischen Fibrose (Mukoviszidose) weisen sowohl vor als auch nach einer Nahrungsaufnahme höhere Neurotensin- Konzentrationen im Plasma auf als gesunde Kontrollpersonen (16 , 1 ; 21) .

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Zur Bestimmung der Neurotensin-Spiegel in Blut wurden ausnahmslos Assays vom Typ Radioimmunoassay eingesetzt , bei denen die Kompetition des zu bestimmenden Neurotensins in der Probe mit einem zugesetzten markierten Neurotensin oder Neurotensinfragment um die Bindungsstellen eines einzigen Antikörpers bestimmt wird, der eine spezifische Bindung mit Neurotensin bzw. bestimmten Teilsequenzen des freien Neurotensins eingeht, z . B . mit einem freien C-Terminus des Neurotensins . Messungen der NMN-Spiegel wurden auf ähnliche Weise durchgeführt .

Die obigen und ähnliche Ergebnisse zum Vorkommen von Neurotensin bei bestimmten Erkrankungen bzw. die nachgewiesene Stimulierbarkeit der Neurotensinbildüng in Abhängigkeit von der Nahrungsaufnahme, die sich außerdem für bestimmte Krank- heitszustände als signifikant unterschiedlich erwies , macht die Bestimmung von Neurotensin in Blutproben an sich zu einem vielversprechenden und klinisch vielseitig anwendbaren diagnostischen Hilfsmittel . So erscheint eine solche Bestimmung z . B . im Rahmen der Routineuntersuchung von Patienten, zu ihrer Überwachung während ihrer klinischen Betreuung, zur Kontrolle ihrer Fähigkeit , Nahrung zu verwerten, im Sinne eines Monitorings der Darmfunktionen, oder als therapiebegleitende Maßnahme zur Kontrolle von Therapieerfolgen, wie auch in anderen Zusammenhängen, die sich aus der o . g . Diskussion der wissenschaftlichen Literatur ergeben, einsetzbar .

Neurotensinbestimmungen in Blutproben haben j edoch bisher keinen Eingang in die medizinische Routinediagnostik gefunden. Ein erster wesentlicher Grund dafür liegt in einer für Routinemessungen zu geringen Stabilität der Neurotensinkon- zentrationen in Blutproben ex vivo bei Umgebungstemperatur (20) (Halbwertszeit von nur 3 bis 4 h) , die in Kombination mit bestehenden Laborlogistiken (von Probenentnahme , Plasmagewinnung, Transport ins Labor bis zur Durchführung von entsprechenden Labortesten) bislang die Verwendung von

Neurotensin in der Routinediagnostik verhinderte . Ein zweiter Grund liegt in der bekannten kurzen Halbswertzeit von nur 2 bis 6 min für Neurotensin im Blut in vivo, die auf eine schnelle und effektive Bindung an Neurotensinrezeptoren und/oder einen Abbau des Neurotensins zurück geführt wird (3) und eine Messung mit einer potentiell schwierig einzuschätzenden Zeitabhängigkeit belastet . Momentan messbare NT-Spiegel in Blutproben stellen kein Maß für die gesamte auf einen stimulierenden Reiz , z . B . eine Nahrungszufuhr, bis zum Messzeitpunkt erfolgte Biosynthese und Freisetzung von NT in die Zirkulation dar, sondern repräsentieren eher einen zufälligen Durchgangszustand, bei dem die NT-Eliminierung durch Bindung an Rezeptoren und durch Abbau die Informationen zur Biosynthese und Freisetzung in die Zirkulation massiv verwässert .

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine routinetaugliche Möglichkeit zur Bestimmung der Neurotensin-Frei- setzung in Proben vom Säugetier-Probanden, insbesondere menschlichen Patienten, zu schaffen, die es ermöglicht , das oben skizzierte Potential einer Bestimmung der Neurotensin- freisetzung für die medizinische Diagnostik auszunutzen und für die medizinisch/klinische Routine umzusetzen.

Diese Aufgabe wird durch ein immundiagnostisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Freisetzung von Neurotensin in die Säugetier-Zirkulation gelöst , das in seiner allgemeinsten Form gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet ist , dass man in einer Serum- oder Plasmaprobe eines Säugetier- Probanden selektiv eine Immunreaktivität des N-terminalen Teils eines Säugetier-Proneurotensins (PNT-Immunreaktivität) bestimmt , die keine Neurotensin- oder Neuromedin N-Immun- reaktivität ist .

Vorteilhafte Ausgestaltungen eines solchen Verfahrens werden durch die Ansprüche 2 bis 16 in Verbindung mit den Ausführungen zu bevorzugten Ausführungsformen in der Beschreibung

wiedergegeben .

Die Aufgabe wird ferner durch einen Kit für eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Verfahrens gemäß Anspruch 1 gelöst , wie er in den Ansprüchen 17 und 18 beschrieben wird .

Nachfolgend werden die der Erfindung zugrunde liegenden neuen Erkenntnisse, und die daraus abgeleiteten erfindungsgemäßen Anwendungen, unter Bezugnahme auf konkrete Versuchsergebnisse und Figuren noch näher erläutert .

Dabei bedeutet "Immunreaktivität des N-terminalen Teils eines Säugetier-Proneurotensins" eine Immunreaktivität , die im Bereich von der Aminosäure in Position 24 (Position 1 nach dem Signalpeptid) bis zur drittletzten Aminosäure vor der ersten Aminosäure des Neuromedin N (Lys) des j eweiligen Säugetier-Preproneurotensins lokalisiert ist . Der angesprochene Bereich umfaßt in allen bekannten Fällen mindestens die j eweiligen Aminosäuren 24 bis 139 bzw. 140 , d . h. eine Sequenz , wie sie für das humane Peptide in SEQ ID NO : 6 gezeigt ist .

In den Figuren zeigen:

Figur 1 : Ergebnisse der Messung der ex vivo Stabilität der Immunreaktivität , die N-terminalen Sequenzen des humanen PNT zuzuordnen ist , in aus Probandenblut gewonnenen Serum- , EDTA-Plasma- und Heparin-Plas- ma-Proben bei Raumtemperatur über Zeiträume von bis zu 7 Tagen;

Figur 2 : Die Standardkurve eines PNT-Sandwichassays , wie er im experimentellen Teil näher beschrieben wird;

Figur 3 : Die Ergebnisse der Messung der PNT-Immunreaktivität in Plasma bei normal ernährten Normalpersonen und künstlich ernährten Patienten mittels des

beschriebenen Sandwich-Assays ;

Figur 4 : Die Ergebnisse der Messung zeitlicher Veränderungen der PNT-Immunreaktivität im Plasma von normal ernährten Normalpersonen in Abhängigkeit von der Nahrungszufuhr mittels des beschriebenen Sandwich- Assays ;

Figur 5 : Die Ergebnisse der Messung der PNT-Immunreaktivität in Plasma bei normal ernährten Normalpersonen, Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn/Colitis ulcerosa) und Hepatitis-Patienten mittels des beschriebenen Sandwich- Assays .

Zur Überprüfung der Frage, ob bei einer Bestimmung einer Immunreaktivität , die dem N-terminalen Teil des humanen Proneurotensins zuzuordnen ist , und zwar einem Teil , der weder NMN noch NT enthält und bei der proteolytischen Prozessierung unter Bildung von freiem NMN bzw. NT abgespalten wird und dann eine Art Abfallprodukt darstellt , in einer Blutprobe bzw. Serum- oder Plasmaprobe reproduzierbar Ergebnisse erhalten werden können, die den Literaturangaben zum Auftreten von NT entsprechen, wurde ein für diesen N-Termi- nus des PNT spezifischer Sandwich-Assay entwickelt , wie er im experimentellen Teil näher beschrieben wird . Dieser Assay erkennt spezifisch nur N-terminale Peptide des humanen PNT, die sowohl die Aminosäuren 67 bis 85 als auch die Aminosäuren 121 bis 140 des humanen Preproneurotensins enthalten.

Messungen von humanen Blutproben mit diesem Assay, die nachfolgend in näheren Einzelheiten beschrieben werden, zeigten, dass damit PNT-Immunreaktivitäten gemessen werden, die nach Auftreten und Dynamik die Bildung/Freisetzung von NT widerspiegeln.

Bei der wiederholten Messung von aus derartigen Blutproben

gewonnenen Serum- und Plasmaproben bei einer Lagerung bei Raumtemperatur über längere Zeiräume zeigte sich ferner, dass die Stabilität der PNT-Immunreaktivität in Plasma ex vivo überraschend hoch ist . Da selbst nach 7 Tagen noch kein erkennbarer Verlust an bestimmbarer Immunreaktivität feststellbar war, liegt ihre Halbwertszeit bei Raumtemperatur bei weit mehr als 7 Tagen und damit weit über der ex vivo Stabilität des reifen Neurotensins (vgl . 3) bzw . derj enigen eines der großen ( "large" ) , unvollständig prozessierten Proneurotensinpeptide .

Die Ergebnisse der Stabilitätsmessungen sind in Figur 1 gezeigt .

Somit ist die Bestimmung von Proneurotensin bzw . PNT-Frag- menten in Blutproben voll routinetauglich und geeignet , die NT/NMN/PNT-Freisetzungsrate im Blut der medizinischen Routinediagnostik zugänglich zu machen.

Die Herstellung des verwendeten Assays , sein Verwendung bei Messungen sowie die mit ihm erhaltenen Messergebnisse werden im nachfolgenden experimentellen Teil und den Beispielen und den zugehörigen Erläuterungen noch genauer beschrieben.

Experimenteller Teil :

Bestimmung einer N-terminalen Proneurotensinsequenzen zuzuordnenden Immunreaktivität im Plasma

1. Herstellung von Antikörpern

1.1. Immunogene

Es wurden 2 verschiedene Peptid-TeilSequenzen des humanen Preproneurotensins (SEQ ID N0 : l) , nämlich PNT3 (SEQ ID NO : 4) bzw . PNT4 (SEQ ID NO : 5) , ausgewählt und von der Firma Jerini (Berlin, Deutschland) als synthetische Peptide syntheti-

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siert . Jedes Peptid wurde zusätzlich mit einem aminotermi- nalen Cysteinrest (CysO) versehen.

1.2. Antikörpergewinnung

Für Immunisierungszwecke wurden die durch N-terminale Cy- stein-Reste ergänzten Peptide PNT3 (SEQ ID NO : 4) und PNT4 (SEQ ID NO : 5) mit dem Hämocyanin aus Limulus polyphemus konjugiert und zur Immunisierung von Kaninchen nach Standardverfahren verwendet , von denen Antiseren gegen die PNT- Peptid-Konjugate gewonnen wurden .

1.3. Reinigung der Antikörper

Die polyklonalen Antikörper der Kaninchen-Antiseren wurden mittels ligandenspezifischer Affinitätsreinigung aufgereinigt . Hierfür wurden die Cys ( 0 ) -Peptide PNT3 (SEQ ID NO : 4) bzw. PNT4 (SEQ ID NO : 5) zunächst an SuIfoLink-Gel der Firma Pierce (Boston, USA) gekoppelt . Die Bindung erfolgte nach der Vorschrift des Herstellers wie folgt :

Polycarbonat-Säulen (15mm x 80mm) wurden mit 5ml Affinitäts- matrix befüllt . Nach Äguilibrierung der Säulen mit PBS ( 136mM NaCl , l , 5mM KH ₂ PO ₄ , 20 , 4mM Na ₂ HPO ₄ *2H ₂ O, 2 , 7mM KCl , pH 7 , 2) wurden 5 mg der j eweiligen o . g . Peptide abgewogen, in PBS gelöst , auf die verschlossenen Säulen gegeben, und das Gelmaterial wurde durch Schwenken homogenisiert . Nach 15mi- nütiger Inkubation bei Raumtemperatur und Absetzen des Gelmaterials wurden die Säulen mit 5mal 3ml PBS gewaschen . Zur Absättigung freier Bindungsstellen wurden dem Säulenmaterial j e 5ml einer 5OmM L-Cysteinlösung hinzugegeben und das Gelmaterial wurde nach Homogenisierung erneut bei Raumtemperatur für 15min inkubiert . Nach Absetzen des Gelmaterials wurde j ede Säule mit 6mal 5ml einer IM NaCl-Lösung gespült und anschließend nochmals mit PBS gespült .

Das Gelmaterial wurde mit 25ml des j eweiligen Kaninchen-

Antiserumpools gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubiert . Die Serum-Gel-Gemische wurden in Polycarbonat-Säulen überführt , und überschüssiges Serum wurde entfernt . Die Säulen wurden anschließend mit 250 ml PBS gewaschen, um nicht gebundene Serumproteine zu entfernen . Die Desorption der gebundenen Antikörper erfolgte durch Elution der Säule mit 5OmM Citronensäure (pH 2 , 2 ) . Das Eluat wurde in Fraktionen ä ImI aufgefangen. Die Proteinkonzentration j eder Fraktion wurde mit Hilfe des BCA-Pro- teinassay-Kits der Firma Perbio (Bonn, Deutschland) bestimmt , und Fraktionen mit einem Proteingehalt > lmg/ml wurden vereinigt . Die affinitätsgereinigten Antikörper wurden mittels Dialyse in PBS umgepuffert , der Proteingehalt erneut bestimmt . Anschließend wurde bei 4°C gelagert .

2. Assayherstellung

2.1. Festphase

Der affinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen das Peptid PNT3 wurden auf Polystyrolröhrchen (Startu- bes , 12mm x 75mm, Firma Greiner, Deutschland) immobilisiert . Hierfür wurde die Antikörperlösung auf eine Proteinkonzentration von 6 , 7 μg/ml mit PBS verdünnt , und davon wurden 300μl pro Röhrchen pipettiert (entspricht 2μg Antikörper pro Röhrchen) . Diese wurden für 20h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3mal mit j e 4 ml PBS gewaschen. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Röhrchen bei 4 ⁰ C gelagert .

2.2. Markierter Antikörper

Der äffinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen PNT4 (lmg/ml in PBS) wurde mit Acridiniumester-N- Hydroxy-Succinimid (lmg/ml in Acetonitril , Firma InVent , Hennigsdorf Deutschland) lumineszenzmarkiert . Für die Markierung wurden 200μl Antikörper mit 4μl Acridiniumester gemischt , für 20min inkubiert , und freie Acridiniumesterbin-

düngen wurden durch Zugabe von 40μl einer 5OmM Glycin-Lösung abgesättigt . Der Markierungsansatz wurde mittels HPLC an einer BioSil 400 -Gelfiltrations-Säule (Firma BioRad, München, Deutschland) von freiem Acridiniumester getrennt . Als Laufmittel wurde PBS verwendet .

3. Durchführung von PNT-Bestimmungen

3.1. Messbedingungen

Pro Antikörper-beschichtetes Röhrchen (2.1) wurden 50μl einer zu untersuchenden Plasma-Probe sowie 150μl Assaypuffer (PBS-Puffer, 1OmM EDTA) pipettiert und 16h bei Raumtemperatur inkubiert . Anschließend wurden die Röhrchen 5mal mit j e ImI PBS gewaschen . Zu den Röhrchen wurden dann j e 20 ng des markierten Antikörpers (2.1. ) (in lOOμl PBS-Puffer, 1OmM EDTA) zugegeben. Die Röhrchen wurden für 2h bei RT inkubiert , und anschließend wurde ungebundener Tracer-Antikörper durch 5maliges Waschen mit je ImI PBS entfernt .

Am Röhrchen gebundener markierter Antikörper wurde mittels Lumineszenzmessung in einem handelsüblichen Luminometer (Berthold LB 952T/16) quantifiziert .

3.2. Kalibrierung

Um die Konzentrationen bzw. Immunreaktivitäten von Proneuro- tensin in den zu vermessenden Proben bestimmen zu können, wurden 50 EDTA-Plasmen von augenscheinlich gesunden Menschen auf PNT gescreent , und Plasmen mit den höchsten PNT-Immunre- aktivitäten wurden gepoolt . Aus diesem Plasmapool wurden mehrere Verdünnungsstufen mit Pferdeserum (Sigma, Deutschland) hergestellt . Dem höchsten Standard (unverdünntes EDTA- Plasma) wurde eine fiktive Konzentration von 100 Units/ml zugeordnet . In Figur 2 ist eine PNT-Standardkurve gezeigt . Die analytische Sensitivität des Proneurotensin-Assays liegt bei ca . 1 U/ml .

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4. Ergebnisse von Messungen

4.1. Proneurotensin -Immunreaktivität in Plasmen von augenscheinlich gesunden Menschen

Augenscheinlich gesunde Kontrollpersonen weisen im Blut hohe PNT-Messwerte auf . Es ergibt sich eine Häufigkeitsverteilung, die in Figur 4 gezeigt ist . Der Median wurde mit 35 , 1 U/ml ermittelt .

4.2. Bestimmung der PNT-Immunreaktivität in der Zirkulation von gesunden Probanden vor, während und nach der Nahrungsaufnähme

Es ist bekannt , dass die Bildung bzw . Freisetzung von Neuro- tensin durch Nahrungsaufnahme stimuliert wird ( 15 ; 14) . Um zu ermitteln, ob auch die PNT-Konzentration im Blut von der Nahrungsaufnahme beeinflusst wird, und ob die Dynamik der eventuellen Veränderung der PNT-Immunreaktivität parallel zu der vorbeschriebenen von NT verläuft , wurde folgender Versuch durchgeführt : 6 Probanden (je drei männliche und weibliche Personen) fasteten für 14h. Dann wurde ihnen eine Blutprobe entnommen . Die Probanden nahmen dann zu vorgegebenen Zeitpunkten eine definierte Menge an Flüssigkeit bzw. Nahrung zu sich, und zu bestimmten Zeitpunkten wurden erneut Blutproben genommen wurden. Der Ablauf des Versuchs ist in Tabelle 1 zusammengefasst .

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Tabelle 1 : Ablauf des Nahrungsstimulationsversuchs

Es zeigt sich, dass die Ausschüttung von PNT durch Aufnahme von Flüssigkeit nicht stimuliert wird. Kurz vor der Nahrungsaufnahme , also nach der längsten Fastenzeit , ist die PNT-Konzentration am geringsten. Sie wurde für j eden einzelnen Probanden als 100% definiert , und alle anderen Messpunkte des j eweiligen Probanden wurden auf diesen Wert bezogen. Diese prozentualen Veränderungen der gemessenen PNT- Immunreaktivität der 6 Probanden wurden gemittelt und sind in Figur 3 graphisch dargestellt (P<0 , 05) . Sofort nach dem Essen steigt die PNT-Konzentration im Blut signifikant an. Die letzten beiden AbnahmeZeitpunkte 3h und 4h nach der Nahrungsaufnahme weisen die höchsten Messwerte auf . Insgesamt steigt die PNT-Konzentration nach dem Essen um das 4 , 5- bis 8fache an .

Mit dem o . g . Assay bestimmbare Immunreaktivität , die einem oder mehreren N-terminalen Proneurotensinfragment (en) mit Bindungsstellen für beide verwendeten Antikörper zuzuordnen ist , nimmt somit , wie für das reife Peptid NT beschrieben, aufgrund von Stimulation durch Nahrungsaufnahme zu.

Die Messung von PNT-Immunreaktivität kann somit anstelle des reifen Neurotensins für die Bewertung des metabolischen Status eines Patienten/einer Testperson herangezogen werden. Durch Gabe einer definierten Menge an Nährstoffen kann die individuelle Stimulierbarkeit der PNT-Freisetzung als Unterschied Δ eines Messwerts zu einem vorgegebenen Zeitpunkt nach der Nahrungsaufnahme und einem Basiswert ( z .B . PNT _{3h nach Nah} run _gsa u _f n _ah m _e und PNT _nuchtern ) oder als Verhältnis bzw. Faktor solcher Werte bestimmt werden . Tabelle 2 zeigt beispielhaft eine entsprechende Auswertung .

Tabelle 2 : PNT-Immunreaktivitäten (in U/ml) vor und nach Nahrungsstimulation sowie Angabe von absoluten Differenzen und Faktoren

In der Tabelle bedeuten :

PNT _B = PNT-Immunreaktivität nach 18 h Fasten (Basiswert) PNT _5rain = PNT-Immunreaktivität 5 min nach Nahrungsaufnahme PNT _3h = PNT-Immunreaktivität 3 h nach Nahrungsaufnahme

4.3. Bestimmung der PNT-Konzentrationen in der Zirkulation von künstlich ernährten Patienten

Wie bereits gezeigt , weisen gesunde Personen eine gewisse PNT-Konzentration im Blut auf , die sich durch Nahrungsaufnahme stimulieren lässt . Bei einer entsprechden Messung der PNT-Immunreaktivität in Plasmen von parenteral (mittels Venenkatheter) künstlich ernährten, zumeist intensivpflichtigen Patienten (z . B . mit einer bestehenden Sepsis oder einem Polytrauma) wurde gefunden, dass diese signifikant niedrigere PNT-Konzentrationen aufweisen als normal ernährte Kontrollen. Bei derartigen Messungen konnte eine um den Faktor 13 verringerte mediane relative PNT-Immunreaktivität von 2 , 7 U/ml festgestellt werden (siehe Figur 4 ) .

4.4 Bestimmung der PNT-Immunreaktivität in der Zirkulation von Patienten mit inflammatorischen Darmerkrankungen

(Morbus Crohn bzw . Colitis ulcerosa)

Bei der Messung von Proben von Patienten mit einer inflammatorischen Darmerkrankung, wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, zeigte sich, dass auch hier die mediane messbare PNT-Immunreaktivität mit 10 U/ml unter der der Kontrollpersonen liegt (Figur 5) . Einzelne der Patienten wiesen j edoch auch deutlich höhere Messwerte (über 100 U/ml) auf .

4.5 Bestimmung der PNT-Immunreaktivität in der Zirkulation von Patienten mit einer Hepatits A bzw. C

Bei der Messung von Proben von Patienten mit einer Hepatitis A oder C wurden dagegen im Vergleich zu den gesunden Kontrollen höhere PNT-Konzentrationen in der Zirkulation gefunden, mit einem Median von 112 U/ml (Figur 5) .

5. Isolierung und. Charakterisierung von Proneurotensin- Immunreaktivität in Human-Serum

5.1. Herstellung der Affinitätssäule

5mg des aufgereinigten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das PNT3 -Peptid (SEQ ID NO : 4 ; vgl . 1.1. ) wurden nach Vorschrift des Herstellers an 2ml CarboLink-Gel (Firma Pierce, Boston, USA) gekoppelt und in eine Polycarbonatsäule (15mm x 80mm) überführt . Anschliessend wurde das Gel mit 20ml PBS gewaschen.

5.2. Affinitätsreinigung von PNT-Immunreaktivität

Eine Serum-Mischprobe aus 10 individuellen Seren ä 100ml mit einer relativen Konzentration von 32 U/ml wurde mit Na-EDTA versetzt (Endkonzentration 1OmM) und anschliessend über einen O , 2μm-Filter filtriert . Die aufbereitete Serum-Mischprobe wurde bei 4 ⁰ C und einer Durchflussrate von 2ml/min sechsmal hintereinander über die Affinitätssäule gepumpt . Anschliessend wurde die Säule mit 50ml PBS gewaschen und die gebundene PNT-Immunreaktivität mit einer 5OmM Glycin/ HCl- Lösung (pH 2 , 0) eluiert . Der Säulenausfluß wurde kontinuierlich auf Absorption bei 280nm überwacht und die von der Glycin/HCl-Lösung eluierte Proteinfraktion (Endvolumen 3ml) wurde weiter mittels HPLC analysiert .

5.3. Reversed-Phase-HPLC-Analyse

Das durch Affinitätsreinigung gewonnene Material wurde über Reversed-Phase-HPLC an einer C ₁₈ -Säule μ Bondapak 0 , 4x30mm der Firma Waters (Eschborn, Deutschland) gereingt . Die Durchflussgeschwindigkeit betrug ImI/min. Die verwendeten Laufmittel und Elutionsbedingungen sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3 : Elutionsbedingungen der RP-HPLC von Proneuroten- sin- IR

Der Säulenausfluss wurde kontinuierlich auf seine Absorption bei 214nm vermessen und in Fraktionen von 0 , 5ml gesammelt . Mit Hilfe des in den obigen Abschnitten 2. und 3. beschriebenen PNT-Assays wurden diej enigen Fraktionen bestimmt, in denen eine PNT-Immunreaktivität nachweisbar war . Es zeigte sich, dass die Haupt-Immunreaktivität in der Fraktion 67 eluiert wurde .

Die Fraktion 67 , die eine positive PNT-Immunreaktivität aufwies , wurde durch Begasen mit Stickstoff getrocknet . Anschliessend wurden die Proben massenspektrometrisch analysiert .

5.4. Massenspektrometrische Analyse

Das Peptid wurde mittels Protease GIu-C bzw . Trypsin verdaut , die entstandenen Fragmente wurden auf an sich bekannte Weise über SMART-HPLC gewonnen und anschliessend massenspektrometrisch untersucht .

Bei der massenspektrometischen Analyse wurde eine Sequenz (SEQ ID NO : 6) ermittelt , die vollständig mit der Sequenz der

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Aminosäuren 24 - 140 des bekannten Preproneurotensins 1-170 (SEQ ID NO : 1) übereinstimmte . Damit wurde nachgewiesen, dass im Blut von Menschen ein Proneurotensin-Peptid zirkuliert , das 117 Aminosäuren umfasst und als Preproneurotensin 24-140 zu bezeichnen ist . Es ergab sich keinerlei Hinweis darauf , dass die mittels des beschriebenen Verfahrens als Immunreaktivität bestimmte Spezies noch die C-terminalen reifen Peptide Neuromedin N und Neurotensin enthält .

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