Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
IMPROVED METHOD FOR USING ELECTROCHEMICAL BIOREACTOR MODULE WITH RECOVERY OF COFACTOR
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/160793
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided herein a re composition and process for using an electrochemica l device for the reduction of the oxidized state of phosphorylated or non-phosphorylated nicotinamide adenine dinucleotide to the reduced state in which unwanted products of the electrochemical reduction are recovered as the oxidized state of the phosphorylated or non-phosphorylated nicotinamide adenine dinucleotide and returned to the electrochemical device for reduction.

Inventors:
MORRISON CLIFFORD S (US)
ARMIGER WILLIAM B (US)
DODDS DAVID R (US)
KOFFAS MATTHEOS (US)
Application Number:
PCT/US2017/022241
Publication Date:
September 21, 2017
Filing Date:
March 14, 2017
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
BIOCHEMINSIGHTS INC (US)
International Classes:
C12P19/36; A61K31/7084; C07H19/207; C12P19/26; C12P19/32; H01M8/06
Domestic Patent References:
WO2014039767A12014-03-13
WO2016070168A12016-05-06
Foreign References:
US20150228996A12015-08-13
CA1207691A1986-07-15
US6270649B12001-08-07
US7250288B22007-07-31
US4705704A1987-11-10
US5077217A1991-12-31
Other References:
BEAUPRE ET AL.: "Renalase is an alpha-NAD(P)H Oxidase/Anomerase", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 135, 21 August 2013 (2013-08-21), pages 13980 - 13987, XP055423147
CHAKRAVERTY ET AL.: "1,6 DPNH, An Enzymatically Active Fprm of Reduced DPN", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 15, no. 3, 1964, pages 262 - 268, XP024841025, DOI: doi:10.1016/0006-291X(64)90157-3
DODDS, J. AM. CHEM. SOC., vol. 110, no. 2, 1988, pages 577 - 583
DODDS ET AL., PROCEEDINGS CHIRAL EUROPE'95. LONDON, 1995, pages 55 - 62
A. LIESE, APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 76, 2007, pages 237 - 248
LIESE, A., ENZYME CATALYSIS IN ORGANIC SYNTHESIS, vol. 3, 2002, pages 1419 - 1459
KULA, M. R.KRAGL, U., STEREOSELECT. BIOCATAL., 2000, pages 839 - 866
CHARTRAIN, M.GREASHAM, R.MOORE, J.REIDER, P.ROBINSON, D.BUCKLAND, B., J. MOL. CATAL. B: ENZYM., vol. 11, 2001, pages 503 - 512
PATEL, R. N., ENZYME MICROB. TECHNOL., vol. 31, 2002, pages 804 - 826
PATEL, R. N., ADV. APPL. MICROBIOL., vol. 47, 2000, pages 33 - 78
PATEL, R. N.HANSON, R. L.BANERJEE, A.SZARKA, J. AM. OIL CHEM. SOC., vol. 74, 1997, pages 1345 - 1360
HUMMEL, W. ADV. BIOCHEM. ENG. BIOTECHNOL., vol. 58, 1997, pages 145 - 184
WHITESIDES ET AL., APPL. BIOCHEM. AND BIOTECH., vol. 14, 1987, pages 147 - 197
WHITESIDES ET AL., BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS, vol. 6, September 1988 (1988-09-01)
A. ZAKS ET AL., TETRAHEDRON, vol. 60, 2004, pages 789 - 797
PARKZEIKUS, J. BACTERIOL., vol. 181, 1999, pages 2403 - 2410
CHAKRAVERTY ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES COMM., vol. 15, no. 3, 1964, pages 262 - 268
CHAKREVERTY ET AL., JOUR. BIOL. CHEM, vol. 244, no. 15, 1969, pages 4208 - 4217
BURNETT ET AL., BIOCHEM, vol. 10, no. 7, 1968, pages 3328 - 3333
BIELLMANN ET AL., TETRAHEDRON LETTERS, vol. 7, 1978, pages 683 - 686
KIRKOR ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 267, 2000, pages 5014 - 5022
MORAN, J. AM. CHEM. SOC., vol. 135, 2013, pages 13980 - 13987
MORAN, G.R., BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1864, 2016, pages 177 - 186
FRICKS, ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS, vol. 169, 1973, pages 837 - 841
KONO ET AL.: "Bull. Agr.", vol. 22, 1958, CHEM. SOC. JAPAN, pages: 404 - 410
CZOCHRALSKA, ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 199, 1980, pages 497
CZOCHRALSKA ET AL., PHOTOCHEM. PHOTOBIOL., vol. 51, 1990, pages 401 - 410
BURNETTUNDERWOOD, BIOCHEM., vol. 7, no. 10, 1968, pages 3328 - 3333
PANDINI ET AL., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 72, 2010, pages 244 - 253
See also references of EP 3430155A4
Attorney, Agent or Firm:
XIE, Fang (US)
Download PDF:
Claims:
CLAIMS  1. A system for electrochemically generating NAD(P)H2 reducing equivalents comprising:  a. an electrochemical cell comprising an anode contained in an anode chamber and a  cathode contained in a cathode chamber; 

b. a first process stream containing NAD(P), passing through the cathode chamber  and continuously in contact with the cathode from which electrons are transferred to the NAD(P)  to produce a second process stream containing reduced species 1,4‐NAD(P)H2, 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐ NAD(P)H2, and [NAD(P)]2, while optionally producing hydrogen; 

c. a substrate of an oxidoreductase or P450 enzyme, which, when contacted with the  second process stream in the presence of the oxidoreductase or P450 enzyme, is transformed to a  product while concomitantly consuming the 1,4‐NAD(P)H2 in the second process stream and  producing a first recovered NAD(P) and a third process stream; and 

d. at least one of a renalase enzyme, a Mung Bean Phenol Oxidase enzyme and  illumination at a wavelength of about 254 nm or exceeding about 320 nm, which, when contacted  with the third process stream, convert at least one of the 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2, and 

[NAD(P)]therein to a second and optionally a third recovered NAD(P). 

2. The system of claim 1, comprising the renalase enzyme for converting the 1,2‐NAD(P)H2  and 1,6‐NAD(P)H2 into the second recovered NAD(P). 

3. The system of claim 1, comprising the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme for converting  the 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2, and/or [NAD(P)]2 into the second recovered NAD(P) and/or the  third recovered NAD(P). 

4. The system of claim 1, comprising the illumination for converting the [NAD(P)]2 into  NAD(P). 

5. The system of claim 1, comprising the renalase enzyme and the Mung Bean Phenol  Oxidase enzyme. 

6. The system of claim 5, wherein the third process stream is contacted with the renalase  enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 into the second recovered  NAD(P) and a fourth process stream, wherein the fourth process stream is contacted with the  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme to convert the [NAD(P)]therein to the third recovered  NAD(P). 

7 The system of claim 1 comprising the renalase enzyme and the illumination

8. The system of claim 7, wherein the third process stream is contacted with the renalase  enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 into the second recovered  NAD(P) and a fourth process stream, wherein the fourth process stream is contacted with the  illumination to convert the [NAD(P)]therein to the third recovered NAD(P). 

9. The system of claim 1, comprising the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme and the  illumination. 

10. The system of claim 8, wherein the third process stream is contacted with the Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 into the  second recovered NAD(P) and a fourth process stream, wherein the fourth process stream is  contacted with the illumination to convert the [NAD(P)]therein to the third recovered NAD(P).  11. The system of any one of claims 1‐10, further comprising, in one or more of the process  streams, an electron transfer mediator (ETM) capable of transferring electrons to NAD(P).  12. The system of any one of claims 1‐10, further comprising catalase for decomposing  hydrogen peroxide produced by the renalase enzyme, the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme,  and/or the illumination. 

13. The system of any one of claims 1‐10, wherein the renalase enzyme is a mutant form  having a lower oxidation activity for 1,4‐NAD(P)H2 than the wild type renalase enzyme, and/or a  higher oxidation activity for 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 than the wild type renalase enzyme,  wherein preferably the mutant form is recombinantly expressed from microorganisms such as  Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia  pastoris, and Bacillus megaterium. 

14. The system of any one of claims 1‐10, wherein the renalase enzyme and/or Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme is recombinantly expressed from microorganisms such as Escherichia coli,  Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and  Bacillus megaterium. 

15. The system of any one of claims 1‐10, wherein the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme is a  mutant form having a lower oxidation activity for 1,4‐NAD(P)H2 than the wild type Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme, and/or a higher oxidation activity for 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2 and/or  [NAD(P)]2 than the wild type Mung Bean Phenol Oxidase enzyme, wherein preferably the mutant  form is recombinantly expressed from microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis,  Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Bacillus 

16. A method for electrochemically generating NAD(P)H2 reducing equivalents comprising:  a. providing an electrochemical cell comprising an anode contained in an anode  chamber and a cathode contained in a cathode chamber; 

b. passing through the cathode chamber a first process stream which contains NAD(P)  and is continuously in contact with the cathode from which electrons are transferred to the  NAD(P) to produce a second process stream containing reduced species 1,4‐NAD(P)H2, 1,2‐ NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2, and [NAD(P)]2, while optionally producing hydrogen; 

c. contacting the second process stream with a substrate of an oxidoreductase or  P450 enzyme such that the substrate, in the presence of the oxidoreductase or P450 enzyme, is  transformed to a product while concomitantly consuming the 1,4‐NAD(P)H2 in the second process  stream and producing a first recovered NAD(P) and a third process stream; and 

d. contacting the third process stream with at least one of a renalase enzyme, a Mung  Bean Phenol Oxidase enzyme and illumination at a wavelength of about 254 nm or exceeding  about 320 nm, thereby converting at least one of the 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2, and [NAD(P)] therein to a second recovered NAD(P) and optionally a third recovered NAD(P). 

17. The method of claim 16, further comprising contacting the third process stream with the  renalase enzyme for converting the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 into the second recovered  NAD(P). 

18. The method of claim 16, further comprising contacting the third process stream with the  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme for converting the 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2, and/or 

[NAD(P)]2 into the second recovered NAD(P) and/or the third recovered NAD(P). 

19. The method of claim 16, further comprising contacting the third process stream with the  illumination for converting the [NAD(P)]2 into NAD(P). 

20. The method of claim 16, further comprising contacting the third process stream with the  renalase enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 therein into the  second recovered NAD(P) and a fourth process stream, and further comprising contacting the  fourth process stream with the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme to convert the [NAD(P)] therein to the third recovered NAD(P). 

21. The method of claim 16, further comprising contacting the third process stream with the  renalase enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 therein into the  second recovered NAD(P) and a fourth process stream, and further comprising contacting the  recovered NAD(P). 

22. The method of claim 16, further comprising contacting the third process stream with the  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2  therein into the second recovered NAD(P) and a fourth process stream, and further comprising  contacting the fourth process stream with the illumination to convert the [NAD(P)]therein to the  third recovered NAD(P). 

23. The method of any one of claims 16‐22, further comprising providing, in one or more of  the process streams, an electron transfer mediator (ETM) capable of transferring electrons to  NAD(P). 

24. The method of any one of claims 16‐22, further comprising providing catalase for  decomposing hydrogen peroxide produced by the renalase enzyme, the Mung Bean Phenol  Oxidase enzyme, and/or the illumination. 

25. The method of any one of claims 16‐22, wherein the renalase enzyme is a mutant form  having a lower oxidation activity for 1,4‐NAD(P)H2 than the wild type renalase enzyme, and/or a  higher oxidation activity for 1,2‐NAD(P)H2 and 1,6‐NAD(P)H2 than the wild type renalase enzyme,  wherein preferably the mutant form is recombinantly expressed from microorganisms such as  Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia  pastoris, and Bacillus megaterium. 

26. The method of any one of claims 16‐22, wherein the renalase enzyme and/or Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme is recombinantly expressed from microorganisms such as Escherichia coli,  Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and  Bacillus megaterium. 

27. The method of any one of claims 16‐22, wherein the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme is  a mutant form having a lower oxidation activity for 1,4‐NAD(P)H2 than the wild type Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme, and/or a higher oxidation activity for 1,2‐NAD(P)H2, 1,6‐NAD(P)H2 and/or  [NAD(P)]2 than the wild type Mung Bean Phenol Oxidase enzyme, wherein preferably the mutant  form is recombinantly expressed from microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis,  Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Bacillus 

megaterium. 

28. The method of any one of claims 16‐22, further comprising returning the third process  stream to the cathode chamber. 

Description:
  Improved Method for Using Electrochemical Bioreactor M odule  with Recovery of Cofactor 

 

CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS 

 

[0001] This application claims priority to and the benefit  of U.S. Provisional Application No.  62/308,175 filed March 14, 2016, the disclosure of w hich is incorporated herein by reference in its  entirety.  TECHNICAL FIELD 

 

[0002] The present disclosure relates generally to the use  of biologically mediated reactions that  alter the oxidation state of compounds, and specifica lly the oxidation state of carbon atoms in a  given chemical compound. 

[0003] More specifically, the present disclosure relates to  an improved method of utilizing the  Electrochemical Bioreactor Module (EBM) in which undes ired forms of nicotinamide adenine  dinucleotide cofactor which are produced during the e lectrochemical reduction of the oxidized  form of the nicotinamide adenine dinucleotide cofactor  are recovered for recycling through the  EBM. 

 

BACKGROUND 

 

[0004] The use of enzymes which perform a reduction, and a re capable of reducing a provided  substrate to a desired reduced product, has been wid ely reported. (Dodds et al, J. Am. Chem. Soc.,  (1988) 110(2), 577-583; Dodds et al, Proceedings Chir al Europe’95. London, (1995), 55‐62; A. Liese  et al, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:237–248; Liese, A.; 2nd ed. Enzyme Catalysis in Organic  Synthesis, (2002), 3, 1419‐1459; Kula, M. R.; Kragl , U. Stereoselect. Biocatal. (2000), 839–866;  Chartrain, M.; Greasham, R.; Moore, J.; Reider, P.;  Robinson, D.; Buckland, B. J. Mol. Catal. B:  Enzym. (2001), 11, 503–512; Patel, R. N. Enzyme Mi crob. Technol. (2002), 31, 804–826; Patel, R. N.  Adv. Appl. Microbiol. (2000), 47, 33–78; Patel, R. N.; Hanson, R. L.; Banerjee, A.; Szarka, J. Am. Oi l  Chem. Soc. (1997), 74, 1345–1360; Hummel, W. Adv.  Biochem. Eng. Biotechnol. (1997), 58, 145– 184; Whitesides et al, Appl. Biochem. and Biotech. ( 1987) 14, 147‐197; Whitesides et al, 

Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol. 6. September 1988). 

[0005] To accomplish such a reduction of a provided substra te, electrons must be provided to the  reaction.  In biological systems, both in vivo and  in vitro, these electrons, generally called  “reducing equivalents”, are provided by small mole cules generally termed “cofactors”.  The most  common cofactor is nicotinamide adenine dinucleotide,  NAD.  A phosphorylated form of the  cofactoralso exists, and both forms provide reducing  equivalents to the enzymes that catalyze  reactions requiring reducing equivalents. 

[0006] The nicotinamide adenine dinucleotide cofactors exist  in an oxidized state and in a  reduced state, and these are respectively abbreviated as NAD(P)+ and NAD(P)H in the open  literature.  However, these abbreviations will be avo ided here. 

[0007] Most generally, the enzymes accepting reducing equival ents from the reduced state of the  nicotinamide adenine dinucleotide cofactors are termed “oxidoreductases” and are classified by  the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology as  EC 1.n.n.n .  Of particular interest are the enzyme s generally termed “dehydrogenases” or  “ketoreductases”  in the classes EC 1.1.n.n and  EC 1.2.n.n, as well as those termed “mono‐ oxygenases” in the classes EC1.13.n.n and EC.1.14.n. n .  This last group of enzymes are also  termed “P450” enzymes or “CYP” enzymes. 

[0008] When performing reactions catalyzed by such enzymes u sing micro‐organisms growing on  a carbon source such as a carbohydrate, the reducing  equivalents are generated by oxidizing a  portion of the carbohydrate to CO 2 , that is, some of the carbohydrate provided t o the micro‐ organism is sacrificially oxidized in order to provid e electrons for the micro‐organism to use in  various metabolic processes.  While the resulting ele ctrons are desirable and useful to the  microorganism, the carbon atoms sacrificed by oxidatio n to CO 2  are lost.  It is also possible to  provide carbon sources other than carbohydrates that  are also sacrificed to produce the desired  reducing equivalents.  It will be clear that while  such an in vivo process may perform the desired  reaction catalyzed by the oxidoreductase enzyme, recov ering the desired product from the milieu  of the in vivo system, e.g. a fermentation broth, c an be difficult.  It is thus advantageous to utiliz e  an in vitro system for performing the desired reacti on. 

[0009] It is possible to isolate the needed oxidoreductase  enzyme and use it to catalyze reactions  in vitro.  Significantly improved chemical processes  could be achieved by an in vitro system which  allows the use of the plethora of oxidoreductase enz ymes in processes resembling standard  catalytic chemical processes.  Such systems avoid the  issues of recovering the desired product of  the reaction from fermentation broths, and can provid e further advantages by allowing the  enzyme to be used under non‐physiological conditions , and the use of a variety of methods to  immobilize or otherwise contain the enzyme, and allow  it to be used for extended periods of time.   Such immobilization or other containment methods also allow simple and efficient recovery of the  desired product of the reaction from the enzyme syst em.  A further advantage of using isolated  enzymes in a cell‐free system is that multiple enz ymes can be used, allowing a series of reactions  to be performed. 

[0010] Micro‐organisms containing useful oxidoreductases are widely known in nature and can be  found quickly by simple screening (A. Zaks et al, T etrahedron (2004)  60,789–797).  If a particular  oxidoreductase enzyme is required, the enzyme can be readily cloned and over‐expressed in a  standard industrially useful host such as S.cerevisiae  or E.coli, and isolated by standard methods,  and used in an in vitro system. 

[0011] However, the reducing equivalents must still be provi ded to such in vitro systems.   Analogous to in vivo systems, a sacrificial substrate  can be provided, which is oxidized.  This  generates the necessary reduced state of the nicotina mide adenine dinucleotide cofactors for  providing reducing equivalents for the desired reactio n. 

[0012] It will be clear that the need of a sacrificial su bstrate removes at least some of the  advantages of an in vivo system, since a second pro duct, the product of the oxidation of the  sacrificial substrate, must now be separated from the  desired product.  While formate may be  used sacrificial substrate, generating CO 2  as the result, this requires the use of an  additional  enzyme, formate dehydrogenase, which may not be conve nient. 

[0013] Thus it is most desirable to provide the electrons  required for the reaction, that is, the  reducing equivalents required by the oxidoreductase en zyme, in a manner that does not require  sacrificial substrates or additional enzymes. 

[0014] If electrons could be provided from an external sour ce, that is, an electrical current, then  the need to provide a sacrificial substrate to provi de electrons would be eliminated, and  oxidoreductase enzymes could be used as conventional  catalysts, performing reactions without  the need for living cells or associated enzyme syste ms or processes. 

[0015] This situation has been recognized by others, and a number of attempts to deliver  electrons to biological systems by electrochemical met hods have been published. 

[0016] It has been reported by Park and Zeikus in J. Bact eriol. 181:2403‐2410, 1999 that the  compound called Neutral Red would undergo reversible  chemical oxidoreductions with the  nicotinamide adenine dinucleotide cofactor, that is, N eutral Red in its reduced form (NR red ) has a  sufficiently low redox value that it will transfer e lectrons to, and thus reduce, the nicotinamide  adenine dinucleotide cofactor from its oxidized state to its reduced state.  In this process, the  from the cathode and thus return to the reduced for m NR red , which is in turn available to again  reduce the oxidized state of the nicotinamide adenine  dinucleotide cofactor. 

[0017] United States Patent No. 7,250,288 B2 to Zeikus et  al. discusses the need for improving  electrode efficiencies in electrochemical bioreactor sy stem and proposes improvements such as  linking the nicotinamide adenine dinucleotide cofactor   , Neutral Red, and the enzyme fumarate  reductase to the electrode in order to improve elect ron transfer characteristics.  While the above  may improve electron transfer characteristics, it may also be advantageous to improve upon the  electrochemical bioreactor system design and its use  in other ways such as those described  below. 

[0018] The requirements for providing reducing equivalents by  electrochemical methods are  disclosed in PCT publication No. WO2014039767 A1, “ Electrochemical Bioreactor Module and  Methods of Using the Same”.  The use of isolated enzymes in conjunction with the 

electrochemical reduction of the oxidized form of  nicotinamide adenine dinucleotide cofactor to  its reduced form, and considerations to be made, are  disclosed in PCT publication No. 

WO2016070168 A1, “Improved Electrochemical Bioreact or Module and Use Thereof”. 

[0019] When the oxidized state of the nicotinamide adenine  dinucleotide cofactor is 

electrochemically reduced, several different reduced species can result.  These species differ only  in the position on the nicotinamide ring at which t he reduction has formally occurred.  This can be  at the 2‐position, the 4‐position or the 6‐posi tion on the nicotinamide ring, and these species are   termed the 1,2‐dihydro‐NAD, 1,4‐dihydro‐NAD and 1,6‐dihydro‐NAD isomers respectively.   (Chakraverty et al, Biochem. Biophys. Res Comm., (196 4), 15(3), 262‐268; Chakreverty et al, Jour.  Biol. Chem (1969), 244(15), 4208‐4217).  These are shown below in Illustration A.  The carbon  atoms of the nicotinamide ring are numbered in the  oxidized form, with the nitrogen atom as  position 1.  The desired reduced product is the 1,4 ‐dihydro‐NAD isomer, commonly called β‐ NADH, and this is the biologically active form of t he co‐factor required for most dehydrogenase,  ketoreductase and P450 enzymes.  The other isomers,  1,2‐dihydro‐NAD and 1,6‐dihydro‐NAD do  not have known useful biological activity with dehydr ogenase, ketoreductase or P450 enzymes.  [0020] A fourth species, a dimer of the NAD cofactor, can also form during the electrochemical  reduction of the oxidized state of nicotinamide adeni ne dinucleotide. This is termed the 4,4’‐ dimer and is also shown in Illustration A.  Like t he 1,2‐dihydro‐NAD and1,6‐dihydro‐NAD forms of  the cofactor, the dimer has no known useful biologic al activity with respect to oxidoreductase  3328‐3333; Biellmann et al, Tetrahedron Letters (197 8) 7, 683‐686; Kirkor et al, Eur. J. Biochem.  (2000), 267, 5014‐5022). 

 

[0021] In a system where an initial amount of the oxidized  state of the nicotinamide adenine  dinucleotide cofactor is electrochemically reduced for the purpose of providing reducing  equivalents to an oxidoreductase enzyme, the desired, biologically active 1,4‐dihydro‐NAD isomer  will be formed and will provide reducing equivalents to the oxidoreductase enzyme (or enzymes)  in the system, and be oxidized back to the oxidized  nicotinamide adenine dinucleotide cofactor,  ready for another cycle of electrochemical reduction.  However, the two non‐biologically active  isomers, the 1,2‐dihydro‐NAD and the 1,6‐dihydro NAD, as well as the 4,4’‐dimer initially  produced by the electrochemical reduction of the oxid ized nicotinamide adenine dinucleotide  cofactor will not be consumed and will simply remain  in the system.  The oxidized nicotinamide  adenine dinucleotide cofactor resulting from the produ ctive delivery of reducing equivalents to  the oxidoreductase enzyme will be again reduced to g ive a mixture of the three isomers, plus the  dimer, as in the previous reduction process. In this cyclic manner, the amount of oxidized continually, and after a short period of time, essen tially none is left.  This problem was recognized  four decades ago (Whitesides et al, Appl. Biochem. a nd Biotech. (1987) 14, 147‐197; Whitesides et  al, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol . 6. September 1988). 

[0022] Thus, it is useful to remove the undesired 1,2‐dih ydro‐NAD and the 1,6‐dihydro‐NAD  isomers as well as the 4,4’‐dimer should they be  produced during the electrochemical reduction of  oxidized nicotinamide adenine dinucleotide cofactor to the desired 1,4‐dihydro‐NAD species, (i.e.  ^‐NADH).  Further, it is useful to recover the 1, 2‐dihydro‐NAD and the 1,6‐dihydro‐NAD isomers a s  either as the desired 1,4‐dihdro‐NAD isomer, or a s the initial oxidized state of the nicotinamide  adenine dinucleotide cofactor. 

[0023] Provided herein are methods and systems for achieving  the above objectives.  Other  objectives, features, and advantages of the present d isclosure will be apparent on review of the  specification and claims. 

 

SUMMARY 

[0024] The present disclosure, in one aspect, provides a sy stem for electrochemically generating  NAD(P)H 2  reducing equivalents, the system comprising: 

(a) an electrochemical cell comprising an anode contained in an anode chamber and a  cathode contained in a cathode chamber; 

(b) a first process stream containing NAD(P), passing thr ough the cathode chamber and  continuously in contact with the cathode from which  electrons are transferred to the  NAD(P) to produce a second process stream containing reduced species 1,4‐NAD(P)H 2 ,  1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2 , and [NAD(P)] 2 , while optionally producing hydrogen;  (c) a substrate of an oxidoreductase or P450 enzyme, whi ch, when contacted with the  second process stream in the presence of the oxidore ductase or P450 enzyme, is  transformed to a product while concomitantly consuming  the 1,4‐NAD(P)H 2  in the  second process stream and producing a first recovered  NAD(P) and a third process  stream; and 

(d) at least one of a renalase enzyme, a Mung Bean Phe nol Oxidase enzyme and 

illumination at a wavelength of about 254 nm or exc eeding about 320 nm, which, when  contacted with the third process stream, convert at  least one of the 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐ NAD(P)H 2 , and [NAD(P)] therein to a second and optionally a third rec overed NAD(P).  [0025] In some embodiments, the system includes the renalase  enzyme for converting the 1,2‐ NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  into the second recovered NAD(P). 

[0026] In some embodiments, the system includes the Mung Be an Phenol Oxidase enzyme for  converting the 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2 , and/or [NAD(P)] 2  into the second recovered NAD(P)  and/or the third recovered NAD(P). 

[0027] In some embodiments, the system includes the illumina tion for converting the [NAD(P)] 2   into NAD(P). 

[0028] In some embodiments, the system includes the renalase  enzyme and the Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme.  For example, the third proce ss stream can be contacted with the  renalase enzyme resulting in conversion of the 1,2‐ NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  into the second  recovered NAD(P) and a fourth process stream, wherein  the fourth process stream can be  contacted with the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme t o convert the [NAD(P)] therein to the  third recovered NAD(P). 

[0029] In some embodiments, the system includes the renalase  enzyme and the illumination.  For  example, the third process stream can be contacted w ith the renalase enzyme resulting in  conversion of the 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  into the second recovered NAD(P) and a fourth   process stream, wherein the fourth process stream can  be contacted with the illumination to  convert the [NAD(P)] therein to the third recovered NAD(P). 

[0030] In some embodiments, the system includes the Mung Be an Phenol Oxidase enzyme and  the illumination.  For example, the third process st ream can be contacted with the Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme resulting in conversion of the 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  into the  second recovered NAD(P) and a fourth process stream, wherein the fourth process stream can be  contacted with the illumination to convert the [NAD(P )] therein to the third recovered NAD(P).  [0031] In some embodiments, the system can include, in one or more of the process streams, an  electron transfer mediator (ETM) capable of transferri ng electrons to NAD(P).  The system can  also include catalase for decomposing hydrogen peroxid e produced by the renalase enzyme, the  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme, and/or the illuminat ion. 

[0032] Another aspect relates to a method for electrochemica lly generating NAD(P)H 2  reducing  equivalents, the method comprising: 

(a) providing an electrochemical cell comprising an anode contained in an anode chamber  and a cathode contained in a cathode chamber;  and is continuously in contact with the cathode from  which electrons are transferred  to the NAD(P) to produce a second process stream co ntaining reduced species 1,4‐ NAD(P)H 2 , 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2 , and [NAD(P)] 2 , while optionally producing  hydrogen; 

(c) contacting the second process stream with a substrate  of an oxidoreductase or P450  enzyme such that the substrate, in the presence of  the oxidoreductase or P450  enzyme, is transformed to a product while concomitant ly consuming the 1,4‐NAD(P)H 2   in the second process stream and producing a first  recovered NAD(P) and a third  process stream; and 

(d) contacting the third process stream with at least on e of a renalase enzyme, a Mung  Bean Phenol Oxidase enzyme and illumination at a wav elength of about 254 nm or  exceeding about 320 nm, thereby converting at least  one of the 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐ NAD(P)H 2 , and [NAD(P)] therein to a second recovered NAD(P) and option ally a third  recovered NAD(P). 

[0033] The method in some embodiments can further include c ontacting the third process stream  with the renalase enzyme for converting the 1,2‐NAD (P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  into the second  recovered NAD(P). 

[0034] In some embodiments, the method can further include  contacting the third process stream  with the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme for convert ing the 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2 ,  and/or [NAD(P)] 2  into the second recovered NAD(P) and/or the t hird recovered NAD(P). 

[0035] In some embodiments, the method can further include  contacting the third process stream  with the illumination for converting the [NAD(P)] 2  into NAD(P). 

[0036] In some embodiments, the method can further include  contacting the third process stream  with the renalase enzyme resulting in conversion of  the 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  therein  into the second recovered NAD(P) and a fourth proces s stream, and further comprising contacting  the fourth process stream with the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme to convert the [NAD(P)] therein to the third recovered NAD(P). 

[0037] In some embodiments, the method can further include  contacting the third process stream  with the renalase enzyme resulting in conversion of  the 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  therein  into the second recovered NAD(P) and a fourth proces s stream, and further comprising contacting  the fourth process stream with the illumination to c onvert the [NAD(P)] therein to the third  [0038] In some embodiments, the method can further include  contacting the third process stream  with the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme resulting i n conversion of the 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐ NAD(P)H 2  therein into the second recovered NAD(P) and  a fourth process stream, and further  comprising contacting the fourth process stream with  the illumination to convert the [NAD(P)] therein to the third recovered NAD(P). 

[0039] In some embodiments, the method can further include  providing, in one or more of the  process streams, an electron transfer mediator (ETM)  capable of transferring electrons to NAD(P).  [0040] In some embodiments, the method can further include  providing catalase for decomposing  hydrogen peroxide produced by the renalase enzyme, th e Mung Bean Phenol Oxidase enzyme,  and/or the illumination. 

[0041] In some embodiments, the method can further include  returning the third process stream  to the cathode chamber. 

[0042] In any of the systems and methods disclosed herein, the renalase enzyme and/or Mung  Bean Phenol Oxidase enzyme may be recombinantly expre ssed from microorganisms such as  Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium gl utamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia  pastoris, and Bacillus megaterium. 

[0043] The renalase enzyme in certain embodiments can be a mutant form (naturally occurring or  genetically engineered) having a lower oxidation activ ity for 1,4‐NAD(P)H 2  than the wild type  renalase enzyme, and/or a higher oxidation activity f or 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  than the  wild type renalase enzyme.  In some examples, the m utant form can be recombinantly expressed  from microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus  subtilis, Corynebacterium glutamicum,  Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Bacillus  megaterium. 

[0044] The Mung Bean Phenol Oxidase enzyme can be a mutant  form (naturally occurring or  genetically engineered) having a lower oxidation activ ity for 1,4‐NAD(P)H 2  than the wild type  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme, and/or a higher oxi dation activity for 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐ NAD(P)H 2  and/or [NAD(P)] 2  than the wild type Mung Bean Phenol Oxidase  enzyme.  In some  embodiments, the mutant form is recombinantly expresse d from microorganisms such as  Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium gl utamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia  pastoris, and Bacillus megaterium. 

[0045] Also provided herein is a process for providing elec trochemically generated reducing  power via the reduction of an oxidized form of phos phorylated or non‐phosphorylated forms of  catalyzing a transformation of a substrate molecule. 

[0046] The process can include steps for preventing the los s of cofactor material to reduced forms  that are not used by the redox enzyme system for t he purpose of catalyzing a transformation of a  substrate molecule. 

[0047] The process can include the electrochemical reduction of the oxidized state of 

nicotinamide adenine dinucleotide cofactor to give  a mixture of the desired 1,4‐dihydro‐NAD  species with the undesired 1,2‐dihydro‐NAD and 1,6 ‐dihydro‐NAD species, and the undesired 4,4’‐ dimer.  The desired 1,4‐dihydro‐NAD species is co nverted back to the oxidized form of the  nicotinamide adenine dinucleotide cofactor in the cour se of providing reducing equivalents to the  oxidoreductase enzyme which is present to catalyze th e transformation of the substrate molecule.   The remaining mixture of the 1,2‐dihydro‐NAD and  1,6‐dihydro‐NAD species, the 4,4’‐dimer,  together with the oxidized state of the nicotinamide adenine dinucleotide cofactor is acted upon  by the renalase enzyme.  This enzyme oxidizes the 1 ,2‐dihydro‐NAD and 1,6‐dihydro‐NAD species  back to the oxidized state of the nicotinamide adeni ne dinucleotide cofactor in the presence of  oxygen, producing hydrogen peroxide in the process.  The Mung Bean enzyme oxidizes the 4,4’‐ dimer back to two molecules of the oxidized state o f the nicotinamide adenine dinucleotide  cofactor, also by using oxygen and generating hydroge n peroxide.  Thus all species originally  produced by the electrochemical reduction of the oxid ized form of the nicotinamide adenine  dinucleotide cofactor, both desired and undesired, are  returned to the original oxidized state of  the nicotinamide adenine dinucleotide cofactor and no cofactor material is lost.  The 4,4’‐dimer is  photo‐active, and can be returned to the oxidized  state of the nicotinamide adenine dinucleotide  cofactor species by irradiation with the appropriate  wavelength; this may be performed in place  of, or in conjunction with, the Mung Bean oxidase. 

 

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS 

[0048] FIG.  1  illustrates, in a schematic, the utilization of renal ase, Mung Bean Phenol Oxidase,  and optionally illumination to recover and recycle co factor material from the mixture of the  desired 1,4‐dihydro‐NAD species plus the undesired 1,2‐dihydro‐NAD and 1,6‐dihydro‐NAD  species and the undesired 4,4’‐dimer which are fo rmed via the electrochemical reduction of the  oxidized state of nicotinamide adenine dinucleotide co factor.  In Figure 1, the 1,2‐dihydro‐NAD,  1,4‐dihydro‐NAD and the 1,6‐dihydro‐NAD species of the nictotinamide adenine dinucleotide  dimer is named [NAD(P)] 2  and the oxidized form is named NAD(P). 

 

DETAILED DESCRIPTION  

[0049] The current literature most commonly uses the descrip tor “NAD(P)+” to indicate the  oxidized state of the phosphorylated and non‐phospho rylated forms of the nicotinamide adenine  dinucleotide, and “NAD(P)H” to indicate the reduce d state.  The reduced state of the 

phosphorylated and non‐phosphorylated forms of the  nicotinamide adenine dinucleotide are  produced by adding two electrons and two protons to the oxidized state.  This common  nomenclature is misleading, as plain reading of the  common descriptors “NAD(P)+” and  “NAD(P)H” show the oxidized state of the phosphor ylated and non‐phosphorylated forms of the  nicotinamide adenine dinucleotide to be a positively  charged species “NAD(P)+”, while the  reduced state of the phosphorylated and non‐phosphor ylated forms of the nicotinamide adenine  dinucleotide, “NAD(P)H”, is shown to have only on e hydrogen added relative to the oxidized state.   Neither of these representations is true.  The oxidi zed state of the phosphorylated and non‐ phosphorylated forms of the nicotinamide adenine dinuc leotide is a neutral molecule in which the  nitrogen of the nicotinamide ring bears a formal pos itive charge with is balanced by a negative  charge one of the deprotonated phosphate linkages, th us forming an internal salt or zwitterion.   The reduced state of the phosphorylated and non‐pho sphorylated forms of the nicotinamide  adenine dinucleotide has formally accepted a hydrogen molecule, H 2 , relative to the oxidized  state, and this achieved by two one‐electron transf ers balanced by two protons.  This is shown  formally by the following balanced chemical reaction:

NAD(P) + 2H + + 2e- → NAD(P)H 2

[0050] The published molecular weights of the oxidized and  reduced states of the non‐

phosphorylated form of the nicotinamide adenine din ucleotide indicate the reality of this reaction  clearly, the molecular weights being 663.43 Da and 6 65.44 Da respectively and the difference  being the molecular weight of a single hydrogen mole cule, H2.

[0051] In the present disclosure, the descriptor “NAD(P)”  indicates the oxidized state of the  phosphorylated and non‐phosphorylated forms of the n icotinamide adenine dinucleotide, while  the descriptor “NAD(P)H 2 ” indicates the reduced state of the phosphor ylated and non‐

phosphorylated forms of the nicotinamide adenine di nucleotide.  Further, the descriptors “1,2‐ NAD(P)H 2 ”,“1,4‐NAD(P)H 2 ”and“1,6‐NAD(P)H 2 ”are used to indicate the three stereoisomers of been formally added across the 1,2‐, 1,4‐ and 1, 6‐positions of the nicotinamide ring.  It will be clear to those skilled in the art that 1,4‐NAD(P)H 2  is commonly called β‐NADH, and is the  stereoisomer of the reduced state of the phosphorylat ed and non‐phosphorylated forms of  nicotinamide adenine dinucleotide which is active with  oxidoreductase and P450 enzymes. 

[0052] In the present disclosure, the 4,4’‐dimer that is  also known to form as a consequence of a  one‐electron transfer to NAD(P) is indicated by the  descriptor “[NAD(P)] 2 ”. 

[0053] The present disclosure, in some embodiments, is direc ted to an improved version and  improved use of the “Electrochemical Bioreactor Modu le” (EBM) previously described in PCT  Patent Application Publication Nos. WO2014039767 A1 an d WO2016070168 A1, which are  incorporated herein by reference in its entirety.  

[0054] An EBM can include one or more of the following co mponents:  

a. an anode contained in an anode chamber and a cathod e contained in a cathode 

chamber; 

b. deionized water in the anode chamber in contact with  the anode; 

c. a proton permeable membrane that separates the anode and cathode chambers;  d. a liquid phase in the cathode chamber continuously i n contact with the cathode, said  liquid phase optionally comprising an electron transfe r mediator (ETM) capable of  transferring reducing equivalents to a redox enzyme s ystem, said redox enzyme system  comprising a redox enzyme and a cofactor; 

e. a process stream containing a substrate  to be tran sformed via catalysis by the redox  enzyme system into a desired product;  

f. a membrane located between the cathode and  the pro cess stream, said membrane  capable of preventing the optional ETM and the redox  enzyme system from  significantly entering into the process stream; and 

g. an external power source providing a voltage between the anode and the cathode.  [0055] In certain embodiments, an improved EBM or process u sing the EBM of the present  disclosure can include the enzyme renalase, the Mung Bean Phenol Oxidase, and illumination to  recover the undesired forms of cofactor that result  from electrochemical reduction of NAD(P).  [0056] The enzyme renalase (Moran et al, J. Am. Chem. Soc.  (2013), 135, 13980−13987; Moran,  G.R., Biochimica et Biophysica Acta 1864 (2016) 177 186), is capable of oxidizing the 1,2‐dihydro‐ NAD and 1,6‐dihydro‐NAD species back to the oxidi zed state of the nicotinamide adenine  [0057] Another enzyme isolated from Mung Bean and currently termed “Mung Bean Phenol  Oxidase” (Fricks et al, Arch. Biochem. Biophys, (19 73)169, 837‐841).  This enzyme oxidizes the  4,4’‐dimer, [NAD(P)] 2 ,  that can be formed under electrochemically  reducing conditions back to  the oxidized state of nicotinamide adenine dinucleotid e.  This enzyme has also been reported as  having the same activity as renalase and being able to oxidize the 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2   species back to the oxidized state of nicotinamide a denine dinucleotide as well (Kono et al, Bull.  Agr. Chem. Soc. Japan, (1958) 22(6) 404‐410).   

[0058] It has also recently been shown that illumination of  electrochemically prepared 4,4’‐dimer  at about 254 nm or at wavelengths exceeding 320 nm leads to regeneration of the oxidized state  of nicotinamide adenine dinucleotide. (Czochralska et  al, (1980) Arch. Biochem. Biophys. 199, 497;  Czochralska et al, (1990) Photochem. Photobiol. 51, 4 01‐410). 

[0059] Thus it is useful to incorporate the renalase and M ung Bean Phenol Oxidase enzymes, and  the illumination of the [NAD(P)] 2  dimer of nicotinamide adenine dinucleotide in  a process for the  recovery of cofactor material, and for the prevention  of the loss of cofactor material to forms  which are not used by oxidoreductase enzymes such as  dehydrogenases, ketoreductases or P450  enzymes. 

[0060] In one embodiment, the present disclosure provides a process that comprises: 

a) a process stream containing NAD(P) which is passed t hrough the cathode chamber  of an electrochemical cell such that the desired, bi ologically active 1,4‐NAD(P)H 2  is  produced, together with the undesired 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2  and [NAD(P)] 2   species; 

b) providing a substrate molecule that is to be transfo rmed via the catalytic reaction  of an oxidoreductase enzyme, such as a dehydrogenase or ketoreductase, or a  P450 enzyme, to produce a desired product molecule; 

c) contacting the process stream containing both the des ired and undesired cofactor  species with an oxidoreductase, such as a dehydrogena se or ketoreductase, or a  P450 enzyme, capable of using the reducing equivalent s presented by the 1,4‐ NAD(P)H 2  to perform a desired reaction in which a sub strate molecule is  transformed to a desired product molecule, while the 1,4‐NAD(P)H 2  is  concomitantly transformed back to NAD(P); 

d) recovering the cofactor material from the undesired ,  leaving the undesired 1,2‐ contacting the process stream with the renalase enzym e in the presence of oxygen  for a sufficient time that the renalase enzyme can  catalyze the oxidation of the  undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  species that may be present in the  process stream to the oxidized form of the cofactor,  NAD(P); 

e) recovering the cofactor material from the undesired a nd [NAD(P)] 2  species present  in the process stream by contacting the process stre am with Mung Bean Phenol  Oxidase in the presence of oxygen for a sufficient  time that the Mung Bean Phenol  Oxidase enzyme can catalyze the oxidation and any [N AD(P)] 2  present in the  process stream to the oxidized form of the cofactor NAD(P); 

f) returning the process stream now containing all of t he original nicotinamide 

adenine dinucleotide as the oxidized form NAD(P) to  the cathode chamber of the  electrochemical cell for reduction. 

[0061] In one embodiment, a process stream containing NAD(P)  is passed through the cathode  chamber of the electrochemical cell such that 1,2‐N AD(P)H 2 , 1,4‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2  and the  4,4’‐dimer, [NAD(P)] 2  are produced.  The process stream containing  the mixture of NAD(P)H 2   species is then contacted with an oxidoreductase enzy me (e.g. a dehydrogenase, ketoreductase,  or P450 enzyme) capable of using the reducing equiva lents from the 1,4‐NAD(P)H 2  to perform a  desired reaction in which a substrate molecule is tr ansformed to a desired product molecule,  while the 1,4‐NAD(P)H 2  is concomitantly transformed back to NAD(P).  The enzyme utilizing the  1,4‐NAD(P)H 2  may be present in the process stream, immobil ized on beads or other suitable  material and held in a packed column, or contained  by a membrane as described in PCT Patent  Application Publication No. WO2016070168 A1, which is incorporated herein by reference in its  entirety. 

[0062] The process stream, after contacting the oxidoreductas e enzyme and after the 1,4‐ NAD(P)H 2  has been transformed back to NAD(P), is then contacted with the renalase enzyme.  In  the presence of oxygen, the renalase enzyme oxidizes the undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐ NAD(P)H 2  species that may be present back to NAD(P) w ith the concomitant production of  hydrogen peroxide. An enzyme such as catalase, or a suitable inorganic catalyst (e.g. MnO 2 ), may  be present to decompose the hydrogen peroxide and th us prevent deleterious effects by the  hydrogen peroxide. 

[0063] The renalase enzyme may be immobilized on beads or  a suitable support, immobilized on,  standard methods known to those skilled in the art  of enzymatic reactions.  As the renalase  enzyme has some activity towards the desirable 1,4‐ NAD(P)H 2  species and will oxidize this back to  NAD(P), it is better if the renalase enzyme is not freely circulating in the process stream, and that  the process stream is contacted with the renalase af ter the 1,4‐NAD(P)H 2  present in the process  stream has been consumed by the oxidoreductase enzyme , and has been used to perform a useful  reaction on a substrate.   

[0064] The process stream is then brought into contact with  the Mung Bean Phenol oxidase in the  presence of oxygen and any undesired 4,4’‐dimer,  [NAD(P)] 2 , present is thus oxidized back to  NAD(P) with the concomitant production of hydrogen pe roxide.  The Mung Bean Phenol Oxidase  may be immobilized on beads or a suitable support,  immobilized on, or contained by, a membrane  or kept from freely circulating in the process strea m by other standard methods known to those  skilled in the art of enzymatic reactions.  As the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme has some  activity towards the desirable 1,4‐NAD(P)H 2  species and will oxidize this back to NAD(P),  it is  better if the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme is no t freely circulating in the process stream,  and that the process stream is contacted with the M ung Bean Phenol Oxidase after the desirable  1,4‐NAD(P)H 2  present in the process stream has been consum ed by the oxidoreductase enzyme.  [0065] In another embodiment, the process stream, after cont acting the oxidoreductase enzyme,  may be contacted first with the Mung Bean Phenol Ox idase enzyme for oxidation of the undesired  [NAD(P)] 2  back to NAD(P), and then subsequently with th e renalase enzyme for oxidation of the  undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  species back to NAD(P). 

[0066] In another embodiment, the process stream, after cont acting the oxidoreductase enzyme  may be contacted with the renalase enzyme and subseq uently irradiated with light at 254 nm or  at wavelengths exceeding 320 nm for decomposing the  undesired [NAD(P)] 2  dimer back to  NAD(P). 

[0067] In another embodiment, the process stream, after cont acting the oxidoreductase enzyme,  may be contacted not only with the Mung Bean Phenol  Oxidase enzyme for oxidation of the  undesired [NAD(P)] 2  dimer back to NAD(P), and also for oxidation of the undesired 1,2‐NAD(P)H 2   and 1,6‐NAD(P)H 2  species to NAD(P) as the Mung Bean Phenol Ox idase enzyme is known to have  activity for the oxidation of the undesired 1,2‐NAD (P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2  species back to NAD(P).  [0068] It will be clear to those skilled in the art that the order of the steps in the process for  recovering cofactor material as NAD(P) from the undes ired 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2 , and  Mung Bean Phenol Oxidase or illuminating it with lig ht at 254 nm or at wavelengths exceeding 320  nm may be done in any order or combination. 

[0069] It will be clear to those skilled in the art that the Mung Bean Phenol Oxidase and the  renalase enzymes may be engineered by known methods  to allow greater stability and therefore  lifetime in the process, or to allow greater activit y, or to allow increased ease and efficiency of  immobilization, or to allow the more efficient expres sion and isolation of these enzymes. 

[0070] It will be equally clear to those skilled in the a rt of enzymatic reactions that the Mung Bean  Phenol Oxidase enzyme may be engineered to allow inc reased activity for the oxidation of the  undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐NAD(P)H 2 , species to NAD(P), in addition to its activi ty for  oxidizing the undesired [NAD(P)] 2  dimer to NAD(P). 

[0071] In certain embodiments, the renalase enzyme and the  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme  may be engineered to have insignificant (e.g., lower than wide‐type) activity on the desirable 1,4‐ NAD(P)H 2  species, but useful (e.g., higher than wide‐ type) activity on the undesired 1,2‐NAD(P)H 2 ,  1,6‐NAD(P)H 2 , and [NAD(P)] 2  species resulting from the electrochemical redu ction of NAD(P).   These enzymes may then be circulated with the proces s stream, or the enzymes may be  immobilized or otherwise contained and contacted with the process stream in any order that is  convenient, including prior to contacting the process stream with the oxidoreductase or P450  enzyme which is acting upon the provided substrate. 

 

EXAMPLES 

Example I 

[0072] This example describes an exemplary process in which the undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and  1,6‐NAD(P)H 2  isomers are re‐oxidized to NAD(P) by renalas e, and the undesired [NAD(P)] 2  dimer is  oxidatively cleaved to NAD(P) by Mung Bean Phenol Ox idase. 

[0073] To demonstrate the process described in the present  disclosure, Mung Bean Phenol  Oxidase is extracted from Mung Bean seedlings as des cribed by Burnett and Underwood 

(Biochem. 7(10), 3328‐3333, 1968).  The gene hum an renalase isoform 1 is cloned onto a plasmid  for expression in E.coli, including codon optimization .  The sequence of the renalase is revealed by  Pandini et al. (Protein Expression and Purification 7 2 (2010) 244–253).  The enzyme is expressed  as an inclusion body, the inclusion bodies collected and refolded as described by Padini et al  (Protein Expression and Purification 72 (2010) 244–2 53).  The renalase enzyme (MW = 35 KDa) is  between the inlet and the outlet that is of a suff iciently low molecular weight cutoff to prevent  the renalase from passing through it, but also havin g a sufficiently high molecular weight cutoff  that all species of the nicotinamide adenine dinucleo tide present in the process stream can pass  through it.  A membrane with a molecular weight cut off of 10KDa is used.  In a similar manner, the  Mung Bean Phenol Oxidase enzyme is held in a separa te container with an inlet and an outlet and  that also includes a membrane between the inlet and the outlet that is permeable, having a  sufficiently low molecular weight cutoff that the Mun g Bean Phenol Oxidase cannot pass through  it, but a sufficiently high molecular weight cutoff  that all species of the nicotinamide adenine  dinucleotide present in the process stream can pass  through it.  A membrane with a molecular  weight cutoff of 10KDa is used.  To allow the use of an oxidoreductase enzyme that demonstrates  the presence of useful amounts of the desired 1,4‐ NAD(P)H 2  cofactor, the membrane system  described in published PCT Patent Application WO201607 0168 A1 published 6 May 2016, and  which is also described in United States Patent Nos.  4,705,704 and 5,077,217 for the purpose of  containing an enzyme.  The enzyme Horse Liver Alcoho l Dehydrogenase is used, with 

cyclohexanone or benzaldehyde used as the substrate  for the alcohol dehydrogenase enzyme.  A  process stream containing 1 to 2 mM of NAD(P) is p repared and buffered to a pH suitable for all  three enzymes; a pH of 7.5 is used.  The process  stream containing the NAD(P) is pumped through  the cathode chamber of the electrochemical cell, whic h is energized at approximately 2 volts, and  the NAD(P) cofactor is reduced to give the desired  1,4‐NAD(P)H 2  form of the cofactor, and also the  undesired 1,2‐NAD(P)H 2 , 1,6‐NAD(P)H 2  and 4,4’‐dimer, [NAD(P)] 2  forms of the cofactor.  Exiting  the cathode chamber, the NAD(P) process stream goes  through the membrane system containing  the alcohol dehydrogenase, where the desired 1,4‐NAD (P)H 2  form of the cofactor provides  reducing equivalents to the alcohol dehydrogenase, the  cyclohexanone or benzaldehyde substrate  is reduced to cyclohexanol or benzyl alcohol product respectively, thus consuming the 1,4‐ NAD(P)H 2  form of the cofactor and producing the oxidiz ed form NAD(P).  The process stream then  proceeds to the inlet of the container holding the  renalase enzyme.  The process stream mixes  with the renalase enzyme and the renalase enzyme oxi dizes the undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and 1,6‐ NAD(P)H 2  forms of the cofactor to NAD(P).  The proces s stream then passes through the  membrane but the renalase enzyme is held in its con tainer by the membrane.  After passing  through the membrane the process stream proceeds to  the outlet of the container holding the  renalase enzyme.  From here the process stream passe s to the inlet of the container holding the  Oxidase enzyme and the enzyme oxidizes the undesired 4,4’dimer, [NAD(P)] 2  form of the cofactor  to NAD(P).  The process stream then passes through  the membrane but the Mung Bean Phenol  Oxidase enzyme is held in its container by the memb rane.  The process stream exits through the  outlet of the container holding the Mung Bean Phenol  Oxidase enzyme, and now contains only  NAD(P)as the other forms of the cofactor have all b een oxidized by the alcohol dehydrogenase,  the renalase and the Mung Bean Phenol Oxidase enzyme s.  The process stream is returned to the  pump, and sent into the cathode chamber to repeat t he cycle. 

 

Example II 

[0074] This example describes an exemplary process in which the undesired 1,2‐NAD(P)H 2  and  1,6‐NAD(P)H 2  isomers are re‐oxidized to NAD(P) by renalas e, and the undesired [NAD(P)] 2  dimer is  oxidatively cleaved to NAD(P) by illumination with UV  light at 254 nm. 

[0075] The process described in Example I is used, exceptin g the container holding the Mung Bean  Phenol Oxidase is replaced by a quartz tube through which the process stream can flow  unimpeded by any membrane.  Outside the quartz tube an ultraviolet lamp is present, and  illuminates the tube with light at 254 nm which pas ses through the quartz and photolytically  cleaves the 4,4‐dimer of the cofactor, [NAD(P)] 2 , to NAD(P).  Upon exiting the quartz tube, t he  process stream is returned to the pump, and sent in to the cathode chamber to repeat the cycle.   

EQUIVALENTS 

[0076] The present disclosure provides among other things no vel methods and devices for  providing reducing equivalents to biological systems.   While specific embodiments of the subject  disclosure have been discussed, the above specificatio n is illustrative and not restrictive.  Many  variations of the disclosure will become apparent to those skilled in the art upon review of this  specification.  The full scope of the disclosure sho uld be determined by reference to the claims,  along with their full scope of equivalents, and the specification, along with such variations.   

INCORPORATION BY REFERENCE 

[0077] All publications, patents and patent applications cite d above are incorporated by reference  herein in their entirety for all purposes to the sa me extent as if each individual publication or  patent application were specifically indicated to be  so incorporated by reference.