La présente invention se rapporte à un kit pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant au moins huit amorces spécifiques de séquence SEQ ID NO : 1 à 8, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange d'entre elles.

La présente invention est également relative à l'utilisation du kit dans une méthode de détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel.

Le système Rhésus (RH) est le système de groupe sanguin le plus complexe, car le plus polymorphe et le plus immunogène sur le plan transfusionnel. Le phénotype RH courant comprend l'antigène majeur RH1 (D) codé par le gène RHD, et les antigènes RH2 (C), RH3 (E), RH4 (c) et RH5 (e) codés par le gène RHCE. En fonction des formes alléliques, 8 haplotypes classiques sont distingués.

La détection non invasive de l'antigène majeur RH1 (D) est un enjeu diagnostic majeur, notamment chez les femmes enceintes de phénotype D (RhD) négatif. En effet, l'allo-immunisation anti-D est devenue une pathologie rare, mais dont les conséquences périnatales restent particulièrement graves : risque d'anémie fœtale grave pouvant se compliquer d'anasarque, de mort fœtale in utero (spontanée ou parfois secondaire au traitement par transfusion in utero), d'ictère et d'anémie néonatals graves nécessitant une prise en charge spécialisée. Elle correspond, chez la femme enceinte RhD négatif, à la synthèse d'anticorps IgG anti-D en réponse au passage transplacentaire d'hématies fœtales RhD positif dans la circulation maternelle. Les anti-D maternels traversant le placenta vers la circulation fœtale provoquent en retour une hémolyse et une anémie chez le fœtus RhD positif.

La prévention par immunoglobulines anti-D a fait baisser de manière spectaculaire les nouvelles allo-immunisations. Néanmoins, ces immunoglobulines restent des produits dérivés du sang et leur utilisation devrait être limitée au minimum, qu'elle soit sur signes d'appel (métrorragies, traumatisme abdominal, amniocentèse...), ou réalisée de manière systématique vers 28 semaines d'aménorrhée (SA). La détection, dès la fin du premier trimestre de la grossesse, de la présence de l'antigène majeur RH1 (D) chez le fœtus permettrait d'éviter les injections d'immunoglobulines inutiles aux mères RhD négatif dont l'enfant est lui aussi RhD négatif. Cette situation représente plus du tiers de toutes les femmes enceintes RhD négatif.

Le génotypage RH1 (D) fœtal non invasif sur sang maternel est donc d'un intérêt majeur.

Au niveau génétique, les gènes codant le système RH sont les gènes homologues (i.e. 96 % d'identité) RHD et RHCE, localisés sur le chromosome 1 , et composés de 10 exons organisés de façon similaire. L'organisation très particulière de ces 2 gènes avec une orientation opposée « tête bêche » facilite les réarrangements géniques entre RHD et RHCE, et l'apparition de gènes hybrides. Ces gènes hybrides vont coder pour des protéines appelés «variants RH». Pour le gène RHD, ces modifications génétiques donnent lieu à des phénotypes différents : phénotypes RH:P1 (D partiels) caractérisés par des modifications qualitatives de la protéine RH1. Ces modifications peuvent donner lieu à une allo- immunisation anti-RH1 (anti-D) en cas de stimulation obstétrico- transfusionnelle ;

phénotypes RH:W1 (D faibles) caractérisés par un niveau d'expression membranaire diminué de l'antigène RH1 ;

- enfin, phénotypes RH:-1 (D négatifs) caractérisés par l'absence de l'antigène RH1 (D) à la surface des érythrocytes. La fréquence de ce phénotype RH:-1 (D négatif) n'est pas la même dans toutes les populations :

o 15 % environ chez les populations caucasiennes ;

o 3 % à 5 % chez les populations africaines ; et

o moins de 0,1 % chez les populations d'origine asiatique.

Deux mécanismes sont à l'origine du phénotype RH:-1 (D négatif) : soit il existe une délétion complète de la totalité du gène RHD (mécanisme moléculaire le plus fréquent responsable du phénotype RH: -1 (D négatif) dans les populations européennes et chinoises), et la femme est alors phénotypée RH:-1 (D négatif) et le gène RHD est absent ;

soit le gène RHD est présent mais ne code pas l'antigène RH1 , en raison de mutations ou d'insertions géniques rendant ce gène RHD incapable de synthétiser d'antigène RH1 (D), et on parle alors de pseudo gène RHD^J, ou alors en raison de la constitution d'un gène hybride ne synthétisant pas d'antigène RH1 (D), notamment le gène hybride RHCceS. Dans ces deux situations (pseudo gène RHD^J et gène hybride RHCceS), la femme présente un phénotype RH:-1 (D négatif), mais il existe un gène RHD détectable. Le génotypage serait donc positif, mais aucun risque d'allo-immunisation fœto- maternelle n'existe (faux positif).

Au final, les mécanismes moléculaires aboutissant à la non-production de la protéine RH1 sont différents en fonction des origines ethniques de la femme : chez les femmes d'origine européenne, le mécanisme prédominant du phénotype RH:-1 (D négatif) est la délétion complète du gène RH1 (D), alors que chez la femme africaine le phénotype RH:-1 (D négatif) est dans 66 % des cas lié au pseudo gène RHD^J, dans 18 % des cas lié à la délétion complète du gène RH1 (D) et dans 15 % des cas lié à la présence du gène hybride RHCceS. L'établissement du génotype est une première étape permettant d'établir la présence ou non du gène RHD. Son absence conduit à un phénotype RH:-1 (D négatif). En revanche, son identification ne suffit pas à la déduction directe du phénotype RH:1 (D positif) ; il convient de s'assurer que ce gène est fonctionnel, donc de rechercher les variants les plus fréquents, avant d'en déduire le phénotype. Les tests existant aujourd'hui sur le marché, tels que le test « Free DNA Fetal Kit® RhD » de Bio-Rad, permettent d'établir la présence ou non du gène RHD chez le fœtus à partir d'un prélèvement sanguin maternel. Ces tests reposent sur la détection des exons 5, 7 et 10 du gène RHD, à l'aide d'amorces et de sondes spécifiques, lesdites sondes étant marquées à l'aide d'un fluorophore. Des PCR sont ensuite réalisées.

Cependant, ces tests sont coûteux et longs à mettre en œuvre (2 semaines sont généralement requises pour obtenir le résultat). En outre, ils nécessitent une certaine technicité et requièrent la présence de fluorophores ; enfin, ils sont réalisés de façon séquentielle. En effet, la détection des exons 5, 7 et 10 se fait, pour un échantillon d'une patiente, de façon indépendante par 3 PCR séparées dans 3 sous- échantillons, dans des puits distincts. Il existe donc un besoin pour disposer d'un test de génotypage du RHD fœtal, qui soit économique, facile et rapide à mettre en œuvre, et dont les résultats soient d'interprétation simple et immédiate.

De façon surprenante, l'inventeur a maintenant mis au point un nouveau test de détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon sanguin maternel, qui est économique, rapide à mettre en œuvre, avec lequel les résultats sont généralement rapides à obtenir (généralement en 24h). Ledit test est en outre très facilement interprétable, et ne requiert aucun fluorophore ni aucune technologie particulière.

L'invention a donc pour objet un kit pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants :

• taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ I D NO : 1 )

· actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2)

• AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)

• ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)

• ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)

• C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)

· CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)

• CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8).

Ledit kit est très utile pour la détection in vitro du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel. En effet, le présent kit permet de détecter plusieurs exons dans une même réaction d'amplification. Plus particulièrement, le kit de l'invention permet d'amplifier les exons 5, 7 et 10 dans la même réaction. En outre, le kit de l'invention contient des amorces permettant d'amplifier le promoteur RASSF1A, lequel fournit un témoin interne d'amplification. Le kit de l'invention permet ainsi de distinguer de façon univoque et rapide entre un ADN fœtal RHD positif et un ADN fœtal RHD négatif. L'invention a également pour objet un procédé in vitro de détection du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel, comprenant les étapes suivantes : a) traitement de l'échantillon de plasma ou de sérum maternel par une enzyme sensible à la méthylation,

b) mélange de l'échantillon traité obtenu en a) avec au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants :

taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ ID NO : 1 ) actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2) AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)

ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)

ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)

C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)

CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)

CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8),

c) raitement du mélange obtenu à l'étape b) par PCR en temps réel,

d) réalisation et analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c).

Les différentes amorces correspondent à des portions complémentaires de parties des gènes RHD et RASSF1A. La méthode de l'invention permet ainsi de détecter les exons 5, 7 et 10 en même temps, c'est-à-dire dans une seule réaction d'amplification, contrairement aux méthodes de l'art antérieur. En outre, elle permet de détecter le promoteur de RASSF1A, ce qui permet de disposer d'un témoin d'amplification dans la même réaction.

Aucune publication de l'art antérieur ne décrit une telle méthode alliant une amplification simultanée de 4 séquences nucléotidiques (PCR multiplexe) d'un organisme complexe suivie d'une analyse directe et simultanée de la températures de fusion des 4 amplicons, permettant ainsi une discrimination directe et sans ambiguïté de ces amplicons.

Par exemple, la demande WO 2012/1 12970 décrit une technique comportant plusieurs amplifications séparées réalisées dans une émulsion. D'ailleurs, cette demande préconise d'utiliser pour cela la PCR digitale. Le document Maaskant-van Wijk et al. (Transfusion, 38(1 1 -12) : 1015-1021 , 1998) fournit une méthode pour détecter les exons qui sont spécifiques des gènes RHD, c'est-à-dire qui ne sont pas présents dans le gène homologue RHCE. De ce fait, ce document ne permet pas de détecter le gène hybride RCceS, alors que la présente invention offre cette possibilité.

WO 98/39474 divulgue une méthode de détection du génotype fœtal du gène RHD basée sur une amplification avec une seule paire d'amorces, mais pas une réaction multiplexe telle que celle de l'invention. De la même façon, Aubin et al. (Br J Haematol, 98(2) : 356-364, 1997) ne divulgue pas de test multiplex, mais uniquement des amplifications d'exons individuels dans des réactions distinctes.

La méthode de l'invention permet donc de déterminer le génotype RHD de l'ADN foetal en une seule réaction. Elle fournit ainsi un test de génotypage du RHD fœtal, économique, facile et rapide à mettre en œuvre, et dont les résultats sont d'interprétation simple et immédiate.

Le clonage des gènes du système RH1 (rhésus D) et l'identification d'ADN fœtal circulant dans le sang maternel ont rendu possible la détermination de RH1 fœtal à partir du sérum ou du plasma de femmes enceintes. L'échantillon de plasma ou de sérum maternel est de préférence, selon l'invention, un échantillon de plasma ou de sérum maternel de phénotype RhD négatif. Il provient du sang maternel. Typiquement, un volume de 10μΙ de plasma ou de sérum maternel est suffisant pour le procédé selon l'invention. La préparation de l'échantillon de plasma ou sérum à partir de l'échantillon de sang maternel est réalisée selon des méthodes standard. L'échantillon maternel de départ peut également être constitué de liquide amniotique ou de villosité chorionique.

De préférence, dans le procédé selon l'invention, l'échantillon de plasma ou de sérum maternel est préalablement soumis à une étape d'extraction d'ADN (étape a')), ledit ADN étant ensuite traité selon l'étape a). L'étape d'extraction d'ADN permet d'extraire l'ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel (cell-free circulating fetal DNA ou cffDNA). La concentration en ADN fœtal libre circulant dans le sérum maternel est très élevée comparativement à celle des cellules fœtales, simplifiant la procédure et la rendant plus rapide. La concentration en ADN fœtal augmente constamment tout au long de la grossesse (de 3,4 % au 1 er trimestre à 6,2 % au 3e trimestre). Par ailleurs, cet ADN fœtal est « dilué » au sein d'un ADN largement majoritaire et hautement homologue qu'est l'ADN libre circulant d'origine maternelle, sans qu'on puisse l'isoler spécifiquement actuellement. Ne pourront donc être recherchées et/ou étudiées que les seules séquences géniques fœtales absentes ou différentes du génome maternel, comme cela est le cas du gène RASSF1A. L'extraction d'ADN se fait selon la procédure classique connue de l'art antérieur. Typiquement, elle peut se faire avec tout kit d'extraction commercial, notamment le kit QIAamp DSP Virus de Qiagen ou le kit NucleoSpin Plasma XS de Macherey-Nagel.

Le procédé selon l'invention comprend une étape a) de traitement de l'échantillon de plasma ou de sérum maternel (ou de l'ADN extrait si l'étape a') est présente) par une enzyme sensible à la méthylation. Cette étape a) permet de différencier le promoteur du gène RASSF1A fœtal, qui est hyperméthylé, du promoteur du gène RASSF1A maternel, hypométhylé. La méthylation de ce promoteur est donc différente entre l'ADN fœtal et l'ADN maternel. Ce traitement consiste en une digestion enzymatique de l'ADN à analyser par une enzyme sensible à la méthylation, par exemple BstU I (endonucléase de restriction issue de Bacillus stearothermophilus U458), Bsh1236l (endonucléase de restriction issue de Bacillus sphaericus RFL1236), Accll (endonucléase de restriction issue d'Acinetobacter calcoaceticus), BstFNI (endonucléase de restriction issue de Geobacillus stearothermophilus FN) ou Mvnl (endonucléase de restriction issue de Methanococcus vannielii). Cette étape a) se fait classiquement selon des méthodes de routine, et selon les recommandations d'usage des fournisseurs d'enzymes sensibles à la méthylation.

Aussi, de préférence, le procédé in vitro de détection du gène RHD fœtal dans un échantillon de plasma ou de sérum maternel selon l'invention comprend les étapes suivantes : a') extraction d'ADN à partir d'un échantillon de plasma ou de sérum maternel, a) traitement de l'ADN extrait obtenu à l'étape a') par une enzyme sensible à la méthylation,

b) mélange de l'échantillon traité obtenu en a) avec au moins les huit amorces suivantes, ou des variants desdites amorces ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec ces dernières, ou un mélange entre certaines des huit amorces suivantes et certains variants :

• taggaggggattCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACT (SEQ I D NO : 1 ) • actgggacccacatgcCATTGCCTTCTCCGACGGTATCAA (SEQ ID NO :2)

• AG CCTG AG CTCATTG AG CTG (SEQ ID NO :3)

• ACCAGCTGCCGTGTGGGGTT (SEQ ID NO :4)

• ATCGAAAGGAAGAATGCCGTG (SEQ ID NO :5)

• C G CTG ACTG CTAC AG C ATATTAG G (SEQ ID NO :6)

• CCTCTCACTGTTG CCTG C ATT (SEQ ID NO :7)

• CTCCAGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO :8),

c) traitement du mélange obtenu à l'étape b) par PCR en temps réel,

d) réalisation et analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c).

Le kit et le procédé selon l'invention peuvent également être modifiés en ce que les deux amorces SEQ ID NO :3 et 4 sont remplacées par deux amorces complémentaires d'un promoteur de gène présentant un état de méthylation différent pour l'ADN fœtal et pour l'ADN maternel, lesdites deux amorces complémentaires étant capables d'amplifier par PCR un segment ayant un pourcentage de CG compris entre 70 et 90 %, de préférence entre 70 et 80%.

Les amorces SEQ ID NO :1 et 2 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur l'exon 7 du gène RHD.

Les amorces SEQ ID NO :5 et 6 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur l'exon 5 du gène RHD.

Les amorces SEQ ID NO :7 et 8 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur l'exon 10 du gène RHD.

Ces amorces sont spécifiques du gène RHD, et sont optimisées pour améliorer la spécificité de l'amplification enzymatique lors de la PCR en temps réel et/ou obtenir une température de fusion adéquate. Les amorces SEQ ID NO :1 et 2 ont en outre été optimisées pour présenter une température de fusion directement lisible.

Les amorces SEQ ID NO :3 et 4 correspondent aux amorces, respectivement forward et reverse, situées sur le promoteur du gène RASSF1A.

Le promoteur du gène RASSF1A est ici utilisé comme témoin ; si une amplification est observée en PCR en temps réel, alors de l'ADN fœtal est présent dans l'échantillon. En effet, grâce à leur optimisation, les amorces spécifiques SEQ ID NO :3 et 4 sont très sensibles et spécifiques du promoteur de RASSF1A, et constituent un très bon témoin de la présence d'ADN fœtal.

En effet, les résultats obtenus avec les kits actuellement disponibles sur le marché ne peuvent faire de différence entre un résultat RHD négatif, et un résultat RHD négatif dû à l'absence d'ADN fœtal. Par conséquent, en cas de résultat négatif, un nouveau prélèvement sanguin chez la femme enceinte est nécessaire 2 semaines plus tard environ, pour pouvoir refaire le test. Cela est bien évidemment très contraignant.

Avec le procédé et le kit selon l'invention, ce problème se trouve résolu grâce à la présence des amorces SEQ ID NO :3 et 4, qui permettent d'identifier spécifiquement la présence d'ADN fœtal. La différence entre un résultat RHD négatif et un résultat RHD négatif dû à l'absence d'ADN fœtal est donc directement visible lors de l'analyse des résultats.

Les huit amorces selon la présente invention peuvent être utilisées en tant que telles, i.e. sous forme de mélange des séquences SEQ ID NO :1 à 8.

Alternativement, on peut utiliser des variants ayant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec lesdites huit amorces. Dans ce cas, un mélange de variants de chacune des huit amorces de SEQ ID NO :1 à 8 peut être utilisé, lesdits variants présentant au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec lesdites huit amorces.

Enfin, on peut également utiliser un mélange entre certaines des huit amorces SEQ ID NO :1 à 8, et certains variants. Dans ce cas, chacune des huit amorces SEQ ID NO :1 à 8 est présente soit en tant que telle, soit sous forme de variant.

Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acide nucléique au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de bases nucléiques identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981 , J. Mol Evol., 18:38-46), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, PNAS, 85: 2444-2448), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl).

En outre, les huit amorces, leurs variants ou leurs mélanges, sont utilisées simultanément en mélange avec l'échantillon de plasma ou de sérum maternel (ou de l'ADN extrait si étape a')), dans l'étape b) du procédé selon l'invention. Il résulte qu'un seul et unique mélange est nécessaire pour réaliser simultanément les différentes PCR en temps réel. On parle alors de PCR multiplex en temps réel. Le mélange de l'étape b) se fait typiquement dans un milieu aqueux, typiquement dans de l'eau stérile.

Après cette étape de mélange, le mélange est soumis à une étape c) d'amplification par PCR en temps réel. Du fait d'un mélange initial unique entre les amorces et l'échantillon maternel (étape b)), la PCR en temps réel effectuée amplifie simultanément les exons 5, 7 et 10 du gène RHD, et le promoteur de RASSF1A, s'ils sont présents.

Typiquement, la PCR en temps réel se fait par les étapes successives suivantes : une étape de dénaturation initiale à une température comprise entre 90° C et 100°C, de préférence comprise entre 93°C et 98°C, pendant un temps compris entre 1 et 10 minutes ;

une étape d'amplification en deux phases :

Première phase : dénaturation à une température comprise entre 90° C et 100°C, de préférence comprise entre 93°C et 98°C, pendant un temps compris entre 5 et 20 secondes ; Seconde phase : hybridation / élongation à une température comprise entre 55° C et 65° C, de préférence comprise entre 57° C et 62° C, pendant un temps compris entre 5 et 20 secondes ; lesdites première et seconde phases étant répétées 50 à 60 fois, et - une étape de refroidissement à une température comprise entre 60° C et 70° C, pendant un temps compris entre 1 et 10 minutes.

On obtient ainsi, après 50 à 60 cycles identiques d'amplification des fragments d'intérêt, les amplicons souhaités.

La PCR en temps réel peut se faire sur tout appareil adapté. Typiquement, on peut utiliser la plateforme Bio-Rad CFX96, ou le LightCyler LC 480 de Roche.

A la fin de l'étape c) de PCR en temps réel, du fait du choix des amorces spécifiques, on obtient des amplicons spécifiques, caractérisés par une température de fusion unique. Cette température de fusion est significativement différente (i.e. d'au moins 1 °C) pour chaque amplicon. Aussi, le procédé selon l'invention comprend une étape d) de réalisation et d'analyse de la courbe de température de fusion des produits amplifiés à l'étape c). Cette étape d) de réalisation et d'analyse de la courbe de fusion est de préférence effectuée comme suit : une courbe de fusion haute résolution des produits amplifiés est réalisée à partir d'une température de 60°C jusqu'à 100°C avec des incréments de température compris entre 0,01 °C et 0,5° C, de préférence compris entre 0,04° C et 0,2°C.

De préférence, l'analyse de la courbe de température de fusion de l'étape d) s'effectue entre 65° C et 95° C. Puisque chaque amplicon spécifique a une température de fusion unique, qui est significativement différente pour chaque amplicon, la courbe de température de fusion est composée de 4 pics pour un ADN fœtal RHD positif : un pour l'amplicon de l'exon 5 de RHD, un pour l'amplicon de l'exon 7 de RHD, un pour l'amplicon de l'exon 10 de RHD, et un pour l'amplicon du promoteur de RASSF1A.

Chacun de ces amplicons a une plage de température de fusion spécifique : de préférence, l'amplicon de l'exon 5 de RHD a une température de fusion comprise entre 74,5 et 77,1 °C ; de préférence, l'amplicon de l'exon 10 de RHD a une température de fusion comprise entre 79,5 et 82,4° C ; - de préférence, l'amplicon de l'exon 7 de RHD a une température de fusion comprise entre 83,5 et 85,3°C ; et de préférence, l'amplicon du promoteur de RASSF1A a une température de fusion comprise entre 91 ,9 et 94,0° C.

La figure 1 montre un exemple de résultat obtenu pour un ADN fœtal RHD positif (Figure 1A ; 4 pics), pour lequel la mère devra être traitée par des anti-D, et pour un ADN fœtal RHD négatif (Figure 1 B ; 1 pic), pour lequel aucun traitement de la mère n'est nécessaire.

En outre, la courbe de température de fusion n'est composée que d'un seul pic pour un ADN fœtal RHD négatif, à savoir celui de l'amplicon du promoteur de RASSF1A. Si la courbe de température de fusion comprend le pic de l'amplicon du promoteur de RASSF1A, et comprend aussi le pic de l'amplicon de l'exon 10, mais pas celui de l'exon 5 et/ou celui de l'exon 7, alors l'ADN fœtal est RHD négatif, et se trouve dans les cas de mutations type pseudo gène RHD^J ou gène hybride RHCceS.

Si aucun pic n'est détecté, alors aucun ADN fœtal, ou de l'ADN fœtal en quantité indétectable, n'est présent dans l'échantillon, et qu'il est donc nécessaire de refaire le test.

La lecture du résultat est donc instantanée, et la décision quant au traitement de la mère en découle directement.

Dans un mode de réalisation complémentaire, afin de détecter spécifiquement le pseudo gène RHD^J (donc RHD négatif) dans l'ADN fœtal, des amorces spécifiques de cette mutation sont utilisées. Ces dernières confèrent à l'amplicon une température de fusion comprise entre 86,30° C et 90,08° C, idéalement une température de fusion comprise entre 87° C et 88° C. Ces amorces sont choisies pour d'hybrider à tout ou partie des 37 paires de bases insérées en amont de l'exon 4 du gène RHD, responsables de la mutation, et donc de la formation du pseudo gène RHD^J.

Les exemples qui suivent, illustrent, mais ne visent pas à limiter la portée de l'invention. Il sera évident pour l'homme de l'art que des variantes et modifications sont possibles et entrent dans le cadre et l'esprit de l'invention.

Les légendes des figures sont les suivantes :

Figure 1 : Courbes des températures de fusion obtenues pour un ADN fœtal RHD positif (A), ou RHD négatif (B).

EXEMPLE :

Des échantillons sanguins de 5 ml sont prélevés sur deux femmes enceintes A et B. Le plasma est extrait à l'aide d'un kit commercial selon les indications du fournisseur (Kit NucleoSpin Plasma XS de Macherey-Nagel).

Les deux échantillons de plasma ainsi récupérés, de 40 μΐ, sont traités avec l'enzyme BstU I, selon le protocole donné par le fabriquant (New England Biolabs).

Puis chacun des échantillons ainsi traités est mélangé avec une composition comprenant les 8 amorces SEQ ID NO : 1 à 8, dans une solution aqueuse, pour obtenir un volume final de 20μΙ.

Les deux échantillons sont ensuite soumis à une PCR en temps réel, selon les conditions spécifiées dans la description ci-dessus, et avec les spécifications suivantes : dénaturation initiale : à 98° C pendant 2 minutes ;

amplification en deux phases : Première phase : dénaturation à 98° C pendant 10 secondes ;

Seconde phase : hybridation / élongation à 57° C pendant 5 secondes ; lesdites première et seconde phases étant répétées 55 fois, et refroidissement à 65° C, pendant 1 minute. Enfin, une courbe de fusion (en haute résolution) des produits amplifiés en PCR est réalisée à partir d'une température de 60° C jusqu'à 100°C avec des incréments de température de 0,2° C.

Les résultats sont présentés en Figure 1 : La courbe de température de fusion issue de l'échantillon de la patiente A est en Figure 1A : 4 pics sont observés, donc l'ADN fœtal est RHD positif. La patiente A doit donc être traitée par des anti-D.

La courbe de température de fusion issue de l'échantillon de la patiente B est en Figure 1 B : un seul pic est observé, celui de RASSF1A. L'ADN fœtal est donc RHD négatif, et aucun traitement de la mère n'est nécessaire.