本发明属于可利霉素原料药及其药物制剂领域 ， 具体地说， 涉及一种大环内酯类基因 工程抗生素， 尤其涉及一种左旋可利霉素药物、 其制备方法及其在制备治疗和预防感染性 疾病药物中的应用。 背景技术

可利霉素是利用基因工程技术研制的新型螺旋 霉素衍生物， 原命名为必特螺旋霉素， 曾用名为生技霉素 [专利号： ZL97104440.6 ]。 根据 "中国药品通用名称命名原则"， 经国家 药典委员会技术审核及研究确定， 必特螺旋霉素的中文通用名称更改为可利霉素 ， 英文名 称为 Carrimycin。

可利霉素为基因工程菌发酵产物， 其化学结构是以 4"-异戊酰螺旋霉素为主成分， 包括 4"-异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III， 其次还含有约 6种 4"-位羟基酰基化的螺旋霉素， 故其化学 名统称为 4"酰化螺旋霉素。

可利霉素主成分的化学结构如式 （1 )所示：

( 1 )

其中：

R R'

异戊酰螺旋霉素 I H COCH ₂ CH(CH ₃ ) ₂ 异戊酰螺旋霉素 II COCH ₃ COCH ₂ CH(CH ₃ ) ₂ 异戊酰螺旋霉素 III COCH ₂ CH ₃ COCH ₂ CH(CH ₃ ) ₂ 可利霉素为 16元环大环内酯类抗生素， 其作用机制是通过与细菌核糖体结合而抑制其 蛋白质合成。 体外试验结果表明， 可利霉素对革兰氏阳性菌、 尤其对某些耐药菌 （如耐 β -内酰胺金 葡菌、 耐红霉素金葡菌等） 有效， 与同类药无明显的交叉耐药性。 同时它对支原体、 衣原 体有很好的抗菌活性， 对部分革兰氏阴性菌也有抗菌活性， 且对弓形体、 军团菌等有良好 抗菌活性和组织渗透性， 还有潜在的免疫调节作用。 其体内抗菌活性明显优于体外

[ ZL200310122420.9 ] ο 临床研究表明， 每日服用可利霉素片剂 0.2-0.4mg5-7天， 可适用于 治疗化脓性链球菌引起的急性细菌性咽炎、 急性化脓性扁桃体炎； 敏感细菌引起的细菌性 鼻窦炎、 急性支气管炎； 肺炎链球菌、 流感嗜血杆菌以及肺炎支原体所致的轻症肺炎 ； 支 原体、 衣原体引起的非淋球菌性尿道炎； 敏感细菌引起的皮肤软组织感染、 牙周炎、 中耳 炎等感染性疾病。 其总有效率为 92.68%, 可利霉素安全有效。 药代动力学研究结果表明， 可利霉素中具活性的有效组分主要为异戊酰螺 旋霉素 I、 II、 III。 可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素， 以母体药物异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III和活 性代谢物螺旋霉素 I、 II、 III 的 AUC。— _t 总和计算， 其口服绝对生物利用度平均为 91. 6%。 文献 报道， 螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为 30- 40% [Frydman AM et al J Antimicrob Chemother. 1988, 22 (suppl B) : 93-103]。 说明异戊酰螺旋霉素的结构明显改善了活性成 分螺 旋霉素的生物利用度。 单次服药可利霉素消除较慢， T _1/2P 在 23-27小时之间。

通过对可利霉素有效组分的研究发现，可利霉 素中具活性的有效组分异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III的分子结构中存在多个手性碳原子。 而手性（Chimlity)是三维物体的基本属性， 是自 然界的本质属性之一。 作为生命活动重要基础的生物大分子， 如蛋白质、 多糖、核酸和酶等， 几乎全是手性的， 这些大分子在体内往往具有重要的生理功能。 手性药物（chiral drug)是指 药物分子结构中引入手性中心后， 得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。 这些对映异构 体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差 别，分别被命名为 R-型（右旋）或 S-型（左旋）、 外消旋。 而近 20 年以来随着药学研究工作的深入， 已表明药物对映体立体选择性 (stereoselectivity)的不同， 使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用的 极大差异。人们将 手性药物中活性高的对映体称为优对映体 （ Eutomer )； 而活性低的或无活性的对映体称为劣 对映体 （Di _S tom _er )。 在许多情况下， 劣对映体不仅没有药效， 而且还会部分抵消优对映体的 药效， 有时甚至还会产生严重的毒副反应， 表现出药效差异的复杂性， 也决定了单一对映体 的治疗指数与其消旋体有着相当的差异， 如熟知的 DL- ( + - )合霉素的疗效仅为 D ( - )氯 霉素的一半； 普萘洛尔 （propranolol) L-异构体的药物活性比 D-异构体大 100倍； （一）美沙 酮是强止痛剂， 而 （+ )无效。 而且毒性也存在差别， 如沙立度胺 （thalidomide) 的两个对映 体对小鼠的镇静作用相近， 但只有 S ( - ) 异构体及其代谢物才有胚胎毒及致畸作用； 氯胺 酮为一有特点的广泛应用的麻醉和镇痛药， 但存在产生幻觉等副作用， 研究发现， S ( + ) 体 药效比 R (—）体强 3〜4倍， 而毒副作用明显与后者有关。手性药物疗效的 极大差异促进了 手性药物的研究开发以及分离分析的发展。 利用"手性"技术， 人们可以有效地将药物中不起 作用或有毒副作用的对映体剔除， 生产出具有单一定向结构的纯手性药物， 从而让药物成分 更纯， 在治疗疾病时疗效更快、 疗程更短。 因此， 手性药物的研究目前已成为国际新药研究 的新方向之一， 各国政府和各大医药公司纷纷投入巨资， 在手性药物制剂、 手性原材料和手 性中间体等领域进行研究开发， 抢占世界手性制药市场。 此外， 随着手性技术的不断改进， 尤其是液相色谱法的迅速广泛应用， 积极地推动了手性药物对映体的分离分析和测 定。 单一 对映体手性药物已得到了广泛的应用。

可利霉素是否也具有光学活性， 本发明人对此进行了大量的研究， 很惊喜地发现， 通过 对培养、 发酵条件的调整和优化， 意外的得到了一种具有旋光活性的可利霉素， 该具有旋光 活性的可利霉素具有更加优良的抗感染活性， 为此， 本发明提供一种左旋可利霉素、 其制备 方法及其在制备预防和治疗感染性疾病药物中 的应用。 发明内容

本发明的第一目的在于提供一种左旋可利霉素 ， 该左旋可利霉素具有旋光性， 同时具 有更加优良的抗感染活性。

本发明的第二目的在于提供一种左旋可利霉素 药物组合物， 该左旋可利霉素药物组合 物含有本发明所提供的具有旋光性的左旋可利 霉素和药学上可接受的载体。

本发明的第三目的在于提供一种左旋可利霉素 的制备方法， 该方法生产工艺简化， 质 量标准易控， 所制备的左旋可利霉素效果优良， 具有旋光性， 同时抗感染活性更加优良。

本发明的第四目的在于提供本发明所述的左旋 可利霉素或左旋可利霉素药物组合物在 制备治疗和预防感染性疾病药物中的应用， 尤其是在抗细菌、 抗衣原体及支原体方面有较 好的疗效， 可以作为感染性疾病的药物。

为实现本发明的第一目的， 本发明采用如下技术方案：

一种左旋可利霉素， 其特征在于， 所述的左旋可利霉素是以异戊酰螺旋霉素 III、 II、 I 三个组分为主的混合物， 含有一定量的异丁酰螺旋霉素 III、 II， 丁酰螺旋霉素 III、 II， 丙酰 螺旋霉素 III、 II和乙酰螺旋霉素 III、 II， 其中异戊酰螺旋霉素 ΙΠ的含量不低于 30wt%， 异戊 酰螺旋霉素 III、 II、 I的总含量不低于 60wt%， 酰化螺旋霉素的含量为 80〜98wt%， 优选 85〜 98wt%， 更优选 90〜98wt%， 最优选 95〜98wt%; 所述的左旋可利霉素在温度 25°C、 0. 02g/ml 氯仿溶液中的比旋度为 [ a ] _D =-52° 〜- 57。 ， 优选 -54° 〜- 56° ， 更优选 -55° 。

本发明人对可利霉素进行了大量的研究， 通过对培养发酵条件的调整和优化， 尤其是通 过 PH调节剂严格控制发酵过程中的 pH值，使发酵过程中 pH值随时间的变化曲线呈三个连续 的阶段， 并且每个阶段各满足一定的方程式， 从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素， 这 可能是由于在此培养发酵条件下导致了具有光 学活性的组分的含量发生了改变， 也可能是由 于在此培养发酵条件下导致其光学构型发生变 化。

本发明的左旋可利霉素比旋度测定方法为： 取本发明制得的左旋可利霉素， 精密称定， 加氯仿溶解并稀释成每 1ml中约含 20mg的溶液， 采用钠光谱的 D线（589. 3nm)测定旋光度， 测定长度为 ldm， 测定温度为 25°C， 使用读数至 0. 000Γ ， 并经过检定的旋光计。

本发明的左旋可利霉素的熔程为 112〜122°C， 优选 114〜120°C， 更优选 116〜118°C。 其测定方法为： 取经干燥的本品适量， 置熔点测定用毛细管中， 进行熔点测定， 重复测 定三次， 取平均值。

本发明的可利霉素具有旋光性， 而根据现代药理学研究， 由于药物对映体的立体选择性 的不同， 使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用发 生很大差异。 而本发明通过体内药效 和体外药效证明本发明的左旋可利霉素具有优 良的抗感染效果， 同时具有很强的药理活性， 从而为感染性疾病的治疗提供了一种新的药物 ， 也为研发可利霉素的手性药物制剂奠定了基 础。

经体内外试验证明， 本发明的左旋可利霉素敏感度高， 耐药性小， 除对耐药的金黄色葡 萄球菌有效外， 尚能对由于滥用抗生素引起的细菌感染具有不 可估量的价值。 如耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌（MRSA)感染； 超光谱 β -内酰胺酶（ESBL)生成的大肠杆菌感染； 艰难梭菌 (C-diff) 引起的传染病均因滥用抗生素所致， 由于左旋可利霉素的问世， 可望得到控制。 本发明所述的左旋可利霉素还含有螺旋霉素 in和其它组分， 其中螺旋霉素 III的含量不大 于 1. 0%, 其它组分的含量总和为 2. 0〜19wt%, 优选 2. 0〜14. 0wt%, 更优选 2. 0〜9. 0wt%, 最 优选 2. 0〜4. 0wt°/。。

本发明中， 所述的其它组分中至少含有 3种改进的螺旋霉素的同系物。

本发明的左旋可利霉素是以异戊酰螺旋霉素 III、 II、 I三个组分为主的混合物， 所述的 异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物， 或者所述的异戊酰螺旋霉素 II为左 旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物， 或者所述的异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶 体化合物；

当异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物时， 该晶体化合物使用 Cu-K α 射线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2 Θ为 8. 0。、 10. 0°、 11. 2°、 11. 7°、 16. 4°、 19. 1°、 19. 6 °、 20. 0°、 21. 4°、 22. 9°、 23. 6°和 29. 4°显示有特征峰；

当异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物时， 该晶体使用 Cu-K α射线测 量得到的 X-射线粉末衍射在 2 Θ为 10. 0°、 11. 6°、 16. 4°、 17. 3°、 19. 1°、 21. 2°、 22. 1°、 22. 7°、 26. 4°、 26. 9°、 27. 5°和 31. 5显示有特征峰；

当异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物时， 该晶体使用 Cu-K α射线测 量得到的 X-射线粉末衍射在 2 Θ为 7. 6°、 8. 0°、 10. 0°、 11. 4°、 16. 4°、 17. 0°、 17. 5°、 17. 9 °、 19. 5°、 22. 7°、 23. 7°和 24. 4°显示有特征峰。

本发明人经过进一步的研究发现， 当将所得到的左旋可利霉素进行纯化分离得到 异戊酰 螺旋霉素 III、 II或 I的单组分后， 再将其中一种组分进行重结晶得到异戊酰螺旋 霉素 III、 II、 I的晶体后再与左旋可利霉素混合得到了异戊� �螺旋霉素 III、 II、 或 I为左旋异戊酰螺旋霉 素 III、 II、 或 I晶体化合物的左旋可利霉素， 经体内药效发现异戊酰螺旋霉素 III、 II、 或 I 为左旋异戊酰螺旋霉素 III、 II、 或 I晶体化合物的左旋可利霉素的药效明显由于� �纯的左旋 可利霉素。

为实现本发明的第二目的， 本发明采用如下技术方案：

一种左旋可利霉素药物组合物， 其中， 所述的左旋可利霉素药物组合物含有上述的左 旋 可利霉素和药学上可接受的载体。

本发明所述的药物组合物中，左旋可利霉素的 含量为安全及治疗有效量的左旋可利霉素， 优选左旋可利霉素的含量为药物组合物的 10〜90wt%，更优选 25〜75wt%，再优选 40〜60wt%。

本发明所用术语 "安全及治疗有效量" ， 是指能减轻或逆转或治疗人体或其它哺乳动物 的疾病而且所服用的药物或药剂对哺乳动物的 组织并无严重伤害的药物、 化合物、 组合物、 产品或药剂的足够用量。

本发明所用术语 "药学上可接受的载体"， 是指药学领域常规的药物载体， 如稀释剂、 赋形剂如水等， 填充剂如淀粉、 蔗糖等； 粘合剂如纤维素衍生物、 藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡 咯垸酮； 润湿剂如甘油； 崩解剂如琼脂、 碳酸钙和碳酸氢钠； 吸收促进剂如季铵化合物； 表 面活性剂如十六垸醇； 吸附载体如高岭土和皂粘土； 润滑剂如滑石粉、 硬脂酸钙和镁、 和聚 乙二醇等。 此外， 还可以在组合物中添加其它辅料如香味剂、 甜味剂等。

本发明的组合物可任选使用安全及有效量的稀 释剂、崩解剂、润滑剂、 填充剂、粘合剂、 润湿剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 赋形剂或任何其它安全及有效量的本领域常用 的药物载 体。

本发明所述的左旋可利霉素药物组合物以适合 药用的制剂形式存在， 该制剂形式为液体 制剂、 固体制剂、 半固体制剂或气体制剂。

所述的液体制剂为注射剂、 输液剂、 溶液剂、 合剂、 糖浆剂、 酊剂、 溶胶剂、 芳香水剂、 甘油剂、 胶体溶液剂、 胶浆剂、 混悬剂或乳剂；

所述的固体制剂为粉针、 冻干粉针、 片剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂、 丸剂、 丹剂或膜剂; 所述的半固体制剂为软膏剂、 硬膏剂、 栓剂、 浸膏剂或凝胶剂；

所述的气体制剂为气雾剂或喷雾剂。

本发明所述的左旋可利霉素药物组合物， 其中， 所述的左旋可利霉素的用量为每单位剂 型为 10〜1500mg， 优选 100〜1000mg， 更优选 200〜500mg。

为实现本发明的第三目的， 本发明采用如下技术方案：

一种左旋可利霉素的制备方法， 该方法包括培养发酵和提取， 其中， 所述的培养发酵为： 将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆 菌株 WSJ-195, 在斜面培养基上培养 后， 将其接种于种子培养基， 培养后， 再将其接种于发酵培养基， 通过 pH调节剂控制发酵过 程， 在 pH值 6. 0〜9. 0， 优选 6. 0〜8. 0， 更优选 6. 0〜7. 5的条件下进行发酵， 且 pH值随时 间的变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =k _lXl +6. 0， 其中 0. 0227 ^ 0. 1364， 0< _Xl ^22; 第二阶段满足方程式 y ₂ =k _2¾ + b ₂ ， 其中- 0. 0735 k ₂ <0， 6. 5<b ₂ ^ 10. 62, 22≤Ξ¾≤≡56; 第三阶段满足方程式 y ₃ =k ₃ ¾+ b ₃ ， 其中 0<k ₃ ≤≡0. 0078, 6. 06≤≡b ₃ <6. 5， 56¾Ξχ ₃ 120。

本发明中，通过对培养发酵条件的调整和优化 ，尤其是通过 pH调节剂严格控制发酵过程 中的 pH值， 使发酵过程中 pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段， 并且每个阶段各满足 一定的方程式， 从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素。

本发明中， 发酵过程是关键， 整个发酵过程中需要不定时的检测 pH值， 而 pH值是通过 添加 pH调节剂进行控制的， 其中， 所述的 pH调节剂为葡萄糖、 枸橼酸、 醋酸、 盐酸、 氨水、 氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或其组合， 优选葡萄糖、 枸櫞酸、 醋酸、 氨水或其组合； 更优 选葡萄糖、 氨水或其组合。

本发明所述的制备方法， 其中， 所述的提取为： 将培养发酵后的发酵液用硫酸铝处理得 滤液， 调 pH至 8. 5-9. 0， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐水及 l%Na¾P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2. 0-2. 5水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4. 5-5. 5， 挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8. 5-9. 0， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可 利霉素。

本发明所述的制备方法， 其中， 所述斜面培养基中含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0. 5%、 NaCl 0. 4%和琼脂 2%。

本发明所述的制备方法， 其中，所述种子培养基中含有黄豆饼粉 1. 5%、淀粉 3. 0%、 NaCl 0. 4%、 CaC0 ₃ 0. 5%、 蛋白胨 0. 3%和 KH ₂ PO ₄ 0. 05%。

本发明所述的制备方法， 其中， 所述发酵培养基中含有葡萄糖 0. 5%、 淀粉 6. 0%、 酵母 粉 0. 5%、 鱼粉 2. 0%、 NH ₄ NO ₃ 0. 6%、 NaCl 1. 0%、 CaC0 ₃ 0. 5%、 KH ₂ P0 ₄ 0. 05%、 MgSO ₄ 0. 1%、 豆油 0. 5%和消沫剂 0. 02% 本发明所述的制备方法， 其中， 所述在斜面培养基上的培养为在温度 28〜38°C的条件下 培养 8〜15天。

本发明所述的制备方法， 其中， 所述在种子培养基上的培养为在温度 25〜30°C的条件下 培养 40〜80小时。

本发明所述的制备方法， 其中， 所述在发酵培养基上的发酵为在 26〜30°C的条件下培养 72〜120小时。

当左旋可利霉素含有异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的晶体时， 所述的制备方法还包括如下 步骤：

a) 对左旋可利霉素进行分离纯化得到左旋异戊酰 螺旋霉素 I、 II或 ΙΠ;

b) 将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III进行重结晶得到左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体化合物；

c)将步骤 a)分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III组分后的左旋可利霉素采用旋转 蒸发除去乙腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样 品； 用石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得左旋可利霉素；

d)将步骤 b)得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体化合物与步骤 c)得到的左旋可 利霉素混合得到异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III为左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体化合物的 左旋可利霉素。

本发明所述的制备方法， 其中， 步骤 a) 中所述的分离纯化为：

采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的左 旋可利霉素进行纯化，采用 ODS制备色 谱柱， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外谱图， 对左 旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III组分目标峰进行收集：

色谱柱： ODS制备色谱柱；

流动相： 乙腈 (A)， lOOmM醋酸氨水溶液B);

梯度条件：采用线性梯度 0~60分钟， A为 25%〜65%； 61〜90分钟， A为 65%〜90%； 流速： 260 mL/min;

进样量： 10mL;

进样浓度： 0.5g/mL;

检测波长： 231nm;

收集方式： 紫外触发收集；

按照左旋异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT 44.759min,收集左旋异戊酰螺旋霉素 I样品； 或者按照左旋异戊酰螺旋霉素 II的保留时间 RT 43.34min,收集左旋异戊酰螺旋霉素 II样品； 或者按照左旋异戊酰螺旋霉素 III的保留时间 RT 48.009min, 收集左旋异戊酰螺旋霉素 III 样品； 然后采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用 1 倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液 中乙酸乙酯， 得膏状样品； 用石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得左旋 异戊酰螺旋霉素 I、 Π或 III的白色粉末状固体。

本发明所述的制备方法， 其中，

当异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物时， 该晶体采用如下重结晶 方法得到： 先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素 I的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、 无水乙 醇和无水丙酮的混合溶剂中， 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 纯水加完后降温至 5 °C〜15 °C , 降温的同时继续搅拌， 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体， 其中所用混合溶剂中乙酸乙 酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5- 1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8〜1；

其中， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的重结晶方法的第一优选技术方� �为， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2〜9倍， 优选 2.5〜7.5 倍； 加入纯水的速度为 4〜10ml/分钟， 优选 6〜8ml/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的重结晶方法的第二优选技术方� �为， 所用混 合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5-1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8〜1。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的重结晶方法的第三优选技术方� �为， 所加入 纯水的搅拌速度为 30〜60转 /分钟， 优选 45〜60转 /分钟； 纯水加完后， 搅拌速度为 10〜 30转 /分钟， 优选 10〜20转 /分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的重结晶方法的第四优选技术方� �为， 纯水加 完后降温的速度为每小时 1〜； TC , 优选每小时 1〜1. 5°C。

当异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物时， 该晶体采用如下重结晶 方法得到： 先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素 II的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、 无水丙 酮和无水乙醇的混合溶剂中， 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 纯水加完后降温至 5 °C〜15 °C， 降温的同时继续搅拌， 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5—1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8—1；

其中， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的重结晶方法的第一优选技术方� ��为， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2〜9倍， 优选 2.5〜7.5 倍； 加入纯水的速度为 4〜10ml/分钟， 优选 6〜8ml/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的重结晶方法的第二优选技术方� ��为， 所用混 合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5-1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8〜1。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的重结晶方法的第三优选技术方� ��为， 所加入 纯水的搅拌速度为 30〜60转 /分钟， 优选 45〜60转 /分钟； 纯水加完后， 搅拌速度为 10〜 30转 /分钟， 优选 10〜20转 /分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的重结晶方法的第四优选技术方� ��为， 纯水加 完后降温的速度为每小时 1〜3°C， 优选每小时 1〜1. 5°C。

当异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物时， 该晶体采用如下重结晶 方法得到： 先将所得的左旋异戊酰螺旋霉素 III的白色粉末状固体溶解于无水甲醇、 无水乙 醇和无水丙酮的混合溶剂中， 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 纯水加完后降温至 5 °C〜15 。C , 降温的同时继续搅拌， 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5- 1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8〜1。

其中， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的重结晶方法的第一优选技术方 案为， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2〜9倍， 优选 2.5〜7.5 倍； 加入纯水的速度为 4〜10ml/分钟， 优选 6〜8ml/分钟。 所述左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的重结晶方法的第二优选技术方 案为， 所用混 合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5-1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8〜1。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的重结晶方法的第三优选技术方 案为， 所加入 纯水的搅拌速度为 30〜60转 /分钟， 优选 45〜60转 /分钟； 纯水加完后， 搅拌速度为 10〜 30转 /分钟， 优选 10〜20转 /分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的重结晶方法的第四优选技术方 案为， 纯水加 完后降温的速度为每小时 1〜3°C , 优选每小时 1〜1. 5°C。

本发明还提供所述的左旋可利霉素或左旋可利 霉素药物组合物在制备治疗感染性疾病药 物中的应用。

本发明中， 所述的感染性疾病为革兰氏阳性菌、 金黄色葡萄球菌、 肺炎链球菌、 肺炎支 原体、 肺炎衣原体、 解脲支原体、 沙眼衣原体、 化脓性链球菌、 卡他球菌、 淋球菌、 流感杆 菌、 军团菌或厌氧菌感染引起的疾病。

本发明还进一步提供所述的左旋可利霉素或所 述的左旋可利霉素药物组合物在制备抗菌 药物中的应用， 所述的菌为肺炎链球菌、 甲类链球菌、 化脓性链球菌、 肠球菌、 金葡菌、 表 葡菌、 卡他球菌、 淋球菌、 流感杆菌、 大肠杆菌、 产毒大肠杆菌、 致病性大肠杆菌、 侵龚性 大肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、 普通变形杆菌、 伤寒杆菌、 不动杆菌、 枸橼酸杆菌 枸橼酸杆菌、 粘质沙雷氏菌、 宋内氏痢疾杆菌、 福氏痢疾杆菌、 白色念球菌； 军团菌如嗜肺 军团菌、 高曼军团菌、 博茨曼军团菌、 杜莫夫军团菌、 佐丹军团菌、 米克戴德军团菌； 厌氧 菌如脆弱类杆菌、 多形类菌、 普通类杆菌、 吉氏类杆菌、 吉氏类杆菌、 栖瘤胃类杆菌、 不解 糖普氏杆菌、 口腔普氏杆菌、 具核酸杆菌、 拉式梭杆菌、 双岐杆菌、 乳杆菌、 消化链球菌、 疮疱丙酸杆菌、 产气荚膜梭菌、 酵母样真菌。

本领域技术人员通常知道用于治疗所需的活性 成分的量将随各种因素而变化， 包括所治 疗疾病的性质及患者的年龄和病情， 最终由主治医生来判断。 本发明所说的左旋可利霉素药 物组合物以单位剂型给药时， 所述的左旋可利霉素的用量为每单位剂型为 10〜1500mg, 优选 100〜1000mg， 更优选 200〜500mg。 将每日所需要的剂量以单一剂量或分剂量的形 式给药。

体内外药效学试验证明， 本发明提供的左旋可利霉素或左旋可利霉素药 物组合物中其活 性成分具有光学活性， 具有较好的抗感染效果， 不仅对革兰氏阳性菌， 尤其是耐红霉素、 耐 β -内酰胺酶的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、� �脓性链球菌有较好的抗菌活性， 而且对部分 阴性菌如卡他球菌、 淋球菌、 流感杆菌和部分军团菌及厌氧菌也有效， 特别对肺炎支原体、 肺炎衣原体的活性显著。

与现有技术相比， 本发明具有如下优点：

1 )本发明的左旋可利霉素具有旋光性， 而根据现代药理学研究， 由于药物对映体的立体 选择性的不同， 使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用发 生很大差异。 而本发明通过体 内药效和体外药效证明本发明的左旋可利霉素 具有优良的抗感染效果， 同时具有很强的药理 活性， 从而为感染性疾病的治疗提供了一种新的药物 ， 也为研发可利霉素的手性药物制剂奠 定了基础； 而通过体内药效发现， 异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III为左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II 或 III晶体化合物的左旋可利霉素对小鼠感染 12株细菌的疗效显示出更加优良的保护作用； 2)本发明所提供的左旋可利霉素的制备方法， 通过对培养发酵条件的调整和优化， 尤其 是通过 pH调节剂严格控制发酵过程中的 pH值，使发酵过程中 pH值随时间的变化呈三个连续 的阶段， 并且每个阶段各满足一定的方程式， 从而得到了具有光学活性的左旋可利霉素；

3) 本发明所提供的左旋可利霉素的制备方法生产 工艺简化， 适用于大工业规模生产。 附图说明

图 1为本发明实施例 1中发酵过程的 pH值随时间的变化曲线图；

图 2为本发明实施例 2中发酵过程的 pH值随时间的变化曲线图；

图 3为本发明实施例 3中发酵过程的 pH值随时间的变化曲线图；

图 4为可利霉素标准品组分液相色谱图， 其中，

1——螺旋霉素 III

2——单乙酰螺旋霉素 I I

3——单乙酰螺旋霉素 I II

4——丙酰螺旋霉素 II

5——丙酰螺旋霉素 III

6—— (异)丁酰螺旋霉素 II

7——异戊酰螺旋霉素 I

8—— (异)丁酰螺旋霉素 III

9——异戊酰螺旋霉素 Π

10——异戊酰螺旋霉素 I II

图 5为本发明的实施例 4所提供的左旋可利霉素的液相色谱图。

图 6为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的 X射线粉末衍射图谱；

图 7为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的 X射线粉末衍射图谱；

图 8为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的 X射线粉末衍射图谱。 具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式， 所述的实施例是为了进一步描述本发明而不是 限制本 发明。

【实施例 1】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆 菌株 WSJ-195,在斜面培养基上培 养后， 将其接种于种子培养基， 培养后， 再将其接种于发酵培养基， 通过葡萄糖和氨水控制 发酵过程， 在 pH值 6. 0〜9. 0的条件下进行发酵， 发酵时间为 120h， 且 pH值随时间的变化 曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 1364 _Xl +6. 0， 其中 0< _Xl 22; 第二阶段 满足方程式 y ₂ =-0. 0735¾+10. 64， 其中 22 56； 第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078x ₃ +6. 06， 其中 56 120， 曲线变化如图 1所示， 获得发酵液。

2) 提取 将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 9.0， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.5水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.5 , 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.5 , 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 2】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 ,在斜面培养基上培 养后， 将其接种于种子培养基， 培养后， 再将其接种于发酵培养基， 通过葡萄糖和氢氧化钠 控制发酵过程， 在 pH值 6. 0〜8. 0的条件下进行发酵， 发酵时间为 110h, 且 pH值随时间的 变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 0909 _Xl +6. 4， 其中 0< _Xl <22; 第二 阶段满足方程式 y ₂ =-0. 0441 +7. 8，其中 22 < <56 _; 第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078x ₃ +6. 06， 其中 56 ¾ 110， 曲线变化如图 2所示， 获得发酵液。

2 ) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.9， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%Na P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.2水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.2， 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.6， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 3】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 ,在斜面培养基上培 养后， 将其接种于种子培养基， 培养后， 再将其接种于发酵培养基， 通过葡萄糖和枸橼酸控 制发酵过程， 在 pH值 6. 0〜7. 5的条件下进行发酵， 发酵时间为 115h， 且 pH值随时间的变 化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 0682 _Xl +6. 0, 其中 0< _Xl < 22 ; 第二阶 段满足方程式 y ₂ =-0. 029½ ₂ +8. 147，其中 22 < <56；第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078χ ₃ +6. 06, 其中 56< < 115， 变化曲线如图 3， 获得发酵液。

2 ) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.6， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.3水提取， 得水相提取液， 调 pH至 5.2， 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.7， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 4】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 , 在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上， 在温度 28 °C培养 15天，接种于含有黄豆饼粉 1.5%、淀粉 3.0%、 NaC1 0.4%, CaCO ₃ 0.5%、蛋白胨 0.3% 和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 在温度 25 °C培养 80小时， 以 0.1%接种量种入含有葡萄糖 0.5%、淀粉 6.0%、酵母粉 0.5%、鱼粉 2.0%、 NH ₄ N0 ₃ 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaCO ₃ 0.5%、 KH ₂ P0 ₄ 0.05%、 MgS0 ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 通过葡萄糖和氨水控制发酵 过程， 在 pH值 6. 0〜9. 0的条件下进行发酵， 发酵时间为 120h, 且 pH值随时间的变化曲线 呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 1364 _Xl +6. 0， 其中 0< _Xl s≤22; 第二阶段满足 方程式 y ₂ =-0. 0735 +10. 64， 其中 22 56； 第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078 +6. 06， 其中 56 120， 获得发酵液；

2) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.5， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%Na P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.0水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.5， 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.5， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 5】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 , 在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上， 在温度 38 °C培养 8天， 接种于含有黄豆饼粉 1.5%、淀粉 3.0%、 NaCl 0.4%、 CaCO ₃ 0.5%、蛋白胨 0.3% 和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 在温度 30°C培养 40小时， 以 20%接种量种入含有葡萄糖 0.5%、淀粉 6.0%、酵母粉 0.5%、鱼粉 2.0%、 NH ₄ N0 ₃ 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaCO ₃ 0.5%、 KH ₂ P0 ₄ 0.05%、 MgS0 ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 通过葡萄糖和氨水控制发酵 过程， 在 pH值 6. 0〜7. 5、 温度 30°C的条件下进行发酵， 发酵时间为 115h， 且 pH值随时间 的变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 0682 _Xl +6. 0， 其中 0< _Xl <22; 第 二阶段满足方程式 y ₂ =-0. 0294¾+8. 147， 其中 22 < ¾ < 56； 第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078x3+6. 06, 其中 56<x ₃ < 115， 变化曲线如图 3， 获得发酵液。

2) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 9.0， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%Na¾P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.5水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.5-5.5， 挥发除去残余 乙酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH9.0， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 6】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 , 在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上， 在温度 30 °C培养 12天，接种于含有黄豆饼粉 1.5%、淀粉 3.0%、 NaCl 0.4%、 CaCO ₃ 0.5%、蛋白胨 0.3% 和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 在温度 28°C培养 60小时， 以 10%接种量种入含有葡萄糖 0.5%、淀粉 6.0%、酵母粉 0.5%、鱼粉 2.0%、 NH ₄ N0 ₃ 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaCO ₃ 0.5%、 KH ₂ P0 ₄ 0.05%、 MgS0 ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 通过葡萄糖和氨水控制发酵 过程， 在 pH值 6. 0〜7. 5、 温度 28 °C的条件下进行发酵， 发酵时间为 90h， 且 pH值随时间的 变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 0682 _Xl +6. 0， 其中 0< _Xl <22; 第二 阶段满足方程式 y ₂ =-0. 0294 +8. 147 , 其中 22 < < 56； 第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078x3+6. 06 , 其中 56 < <90， 变化曲线如图 3， 获得发酵液。

2) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.7, 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.2水提取， 得水相提取液， 调 pH至 5.0， 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.7， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 7】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 , 在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上， 在温度 35 °C培养 10天，接种于含有黄豆饼粉 1.5%、淀粉 3.0%、 NaC1 0.4%, CaCO ₃ 0.5%、蛋白胨 0.3% 和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 在温度 26°C培养 55小时， 以 15%接种量种入含有葡萄糖 0.5%、淀粉 6.0%、酵母粉 0.5%、鱼粉 2.0%、 NH ₄ N0 ₃ 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaCO ₃ 0.5%、 KH ₂ P0 ₄ 0.05%、 MgS0 ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 通过葡萄糖和氨水控制发酵 过程， 在 pH值 6. 0〜7. 5、 温度 27°C的条件下进行发酵， 发酵时间为 115h， 且 pH值随时间 的变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 0682 _Xl +6. 0， 其中 0< _Xl < 22 ; 第 二阶段满足方程式 y ₂ =-0. 0294¾+8. 147， 其中 22 < ¾ < 56； 第三阶段满足方程式 y ₃ =0. 0078x3+6. 06 , 其中 56 <¾< 110， 变化曲线如图 3， 获得发酵液。

2) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.6， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.3水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.8， 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.8， 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 8】左旋可利霉素的制备

1 ) 培养发酵

将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195 , 在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上， 在温度 36 °C培养 13天，接种于含有黄豆饼粉 1.5%、淀粉 3.0%、 NaCl 0.4%、 CaCO ₃ 0.5%、蛋白胨 0.3% 和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 在温度 27°C培养 75小时， 以 0.5%接种量种入含有葡萄糖 0.5%、淀粉 6.0%、酵母粉 0.5%、鱼粉 2.0%、 NH4NO3 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaCO ₃ 0.5%、 KH ₂ P0 ₄ 0.05%、 MgS0 ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 通过葡萄糖和氨水控制发酵 过程， 在 pH值 6. 0〜8. 0、 温度 29°C的条件下进行发酵， 发酵时间为 98h， 且 pH值随时间的 变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0. 0909 _Xl +6. 4， 其中 0< _Xl <22; 第二 阶段满足方程式 y ₂ =-0.0441¾+7.8，其中 22<¾<56：第三阶段满足方程式 y ₃ =0.0078χ ₃ +6.06， 其中 56 110， 曲线变化如图 2所示， 获得发酵液。

2) 提取

将发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.9， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐 水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.4水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.6， 挥发除去残余乙 酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.6, 得沉淀， 用纯化水对沉淀物进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

【实施例 9】左旋可利霉素的 HPLC定量测定方法

照高效液相色谱法 （中国药典 2005年版二部附录 V D) 测定。

采用 Venusil XBP C18(L)150A ( 200mm X 4.6mm， 5um ) 色谱柱 （ AGELA TECHNOLOGIES); 流动相 A为乙睛， 流动相 B为 0.01 mol.L- ¹ 醋酸铵溶液 （用氨水调节 pH值至 7.0)， 按下表梯度洗脱； 波长 232nm; 流速为 l.OmL.min- 柱温 25°C; 进样量 20 μ 1。

5 35 65

15 50 50

50 65 35

51 35 65

5 65 色谱条件和系统适用性试验， 参照可利霉素标准品组分液相色谱图 （图 4)， 调节色谱 条件， 必要时可改变流动相的梯度洗脱条件， 使进样的左旋可利霉素组分与可利霉素标准 品组分图谱 （图 4) 一致。

标准品溶液： 精密称取标准品适量， 以 O. Olmol/L醋酸铵溶液（用氨水调节 pH至 7.0) 一乙腈 （65: 35) 混合液稀释至 0.4mg/ml-0.6mg/ml作为标准品溶液， 摇匀， 备用。

供试品溶液： 精称本品 50mg， 以 0.01mol/L醋酸铵溶液 （用氨水调节 pH至 7.0)一乙 腈 （65: 35) 混合液稀释至 50ml作为供试品溶液， 摇匀， 备用。

按外标法以异戊酰螺旋霉素 III的峰面积计算。 异戊酰螺旋霉素 ΠΙ应不低于 30%; 异戊 酰螺旋霉素 （ Ι +Π+ΙΠ ) 应不低于 60%; 酰化螺旋霉素 9个组分总含量应不少于 80%， 螺 旋霉素 III的量应不大于 1.0%， 其他未知组分的总和应不大于 5.0%。 计算公式如下：

异戊酰螺旋霉素 ΠΙ%=Α异戊顧 X W _s X P /(A _s XW _T )X 100%

异戊酰螺旋霉素（ I + II +III ) %= (A _mm +A异雌 _Π +Α异戊顧 ) XW _S X P/(A _S X W _T ) X 100% 酰化螺旋霉素总含量 °/o= (A乙蘇 +A乙膨 π+Α丙蒙 +A _HS[II +A异丁 +A异戊 si+A异丁酰 [π+Α异戊 sii+A异戊 顧） X W _s X P/(A _S XW _T )X100%

螺旋霉素 ΙΠ。/ο=Α _mm XW _S XP /(A _s XW _T ) 100%

未知组分 °/。=A» XW _S XP /(A _s X W _T ) X 100%

式中： 一标准品的重量， g; A _s —标准品中异戊酰螺旋霉素 III的峰面积；

W _T —供试品的重量， g;

A _w —供试品中未知组分的峰面积之和；

P_标准品中异戊酰螺旋霉素 III的纯度。

【实施例 10】左旋可利霉素成品组分的 HPLC检测

按实施例 4提供的左旋可利霉素提取流程及实施例 9提供的 HPLC定量检测方法， 对 左旋可利霉素发酵 8批次发酵液进行提取，所获产品各组分的 HPLC检测情况如表 1所示， 液相色谱图如图 5所示。

表 1、 8批次左旋可利霉素成品组分的 HPLC检测情况

对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素也 进行了上述检测， 其获得的液相色谱图 如 5所示。

【实施例 11】左旋可利霉素比旋度的测定

取本发明实施例所制备的左旋可利霉素，精密 称定，加氯仿溶解并稀释成每 1ml中约含 20mg的溶液， 采用钠光谱的 D线 （589.3nm) 测定旋光度， 测定长度为 ldm， 测定温度为 25 Ό， 使用读数至 0.000Γ 并经过检定的旋光计。

表 2、 比旋度考察结果

【实施例 12】左旋可利霉素素片 （按 10000片计算）

处方： 实施例 4的左旋可利霉素原粉 1000g 低取代羟丙基纤维素 （5%) 92. 5g

羧甲基淀粉钠 （3%) 55. 5g

硬脂酸镁 （1%) 18. 5g

淀粉 总重-其它原辅料重 j

1850g

制备工艺： 称取适量淀粉，稀释至 15%浓度，加热至糊状，制成粘合剂； 主料可利霉素、 辅料淀粉、 低取代羟丙基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 硬脂酸镁分别过 100 目筛， 按处方量， 称取所需主料和辅料； 可利霉素、 淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后， 用 15%淀粉 浓度的淀粉糊制成软材， 14目筛制粒， 50-6CTC干燥， 水份控制在 3-5%， 14目筛整粒， 加 羧甲基淀粉钠， 硬脂酸镁混合， 测定颗粒含量； 根据颗粒含量， 计算片重， 压片 （Φ 9™浅 凹冲头）， 检测片重差异； 经检验合格后进行包装。

【实施例 13】左旋可利霉素胶囊剂 （按 10000粒计算）

处方： 实施例 4的左旋可利霉素原粉 1000g

淀粉 （药用） 1080-可利霉素原粉重量 药用 3号胶囊 1000粒

液体石蜡 50ml

制备工艺： 将主料可利霉素、 辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后， 装入混合器充 分混合后 1. 5-2小时； 取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致 （每粒胶囊所装重量 约为 0. 105g)，将经检验合格的药用 3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机� �作要求， 分别填入装料器进行填充， 将填充好的胶囊进行差异检验 （± 10%以内， <0. 3g)， 溶出度 符合要求， 将检验后符合要求的胶囊， 放入打光机内加入液体石蜡进行 15-20分钟的打光， 然后取出进行成品包装盒检验。

【实施例 14】左旋可利霉素糖衣片 （按 10000片计算）

处方： 同实施例 12。

制备工艺： 按照实施例 12的方法操作， 将检验合格后的片芯放入糖衣锅中， 将配好的 糖浆（浓度为 65-70%)慢慢放入锅中， 然后将温度升至 40°C左右， 加入适量滑石粉， 鼓风 干燥 25-30分钟反复几次粉衣层包平后， 再进行糖衣层 15-20分钟进行糖衣层包衣， 待糖衣 层包平后进行所需色调的包衣层包衣， 将色浆调好后放入糖浆中搅匀倒入锅内， 每次约 15-20分钟， 搅拌均匀。

【实施例 15】左旋可利霉素干糖浆 （按 10000袋计算）

处方： 实施例 4的左旋可利霉素原粉 1250g

柠檬酸 （0. 5%) (枸橼酸） 15g

蔗糖 总重 -其它原辅料

总重约 500g

色素 （姜黄素） 约 lg

制备工艺： 可利霉素原粉， 柠檬酸、 蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒 85%通过 300目， 15%通过 180目， 然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合 1-1.5小时， 测其 含量， 计算装量 （理论装量为每袋 500mg)， 然后将混合物装入袋装机中， 装好铝箔纸， 按 分装机操作要求分装， 装量差异在 ± 5%以内， 装好后进行检验合格后外包装。

【实施例 16】左旋可利霉素肠溶片 （按 10000片计算）

处方： 参照实施例 12。

制备工艺： 片芯制备按实施例 12操作， 将符合要求的片芯放入糖衣锅中， 用 60-70% 浓度的糖浆和滑石粉进行底衣层包衣三层， 然后进行隔离层包衣， 加入 10%玉米朊酒精溶 液，滚转法 10-15分钟吹干，再用苯二甲酸二乙酯、丙酮、� ��苯二甲酸醋酸纤维、酒精溶液， 即肠溶液滴入锅内，滚转法 10-15分钟吹干 2-3次。检验合格后，按实施例 7进行糖衣包衣。 【实施例 17】左旋可利霉素胃溶片 （按 10000片计算）

处方： 参照实施例 12。

制备工艺： 片芯制备按实施例 12操作， 将符合要求的片芯放入高效包衣机中， 然后将 符合标准的包衣粉 （包括脂溶性和水溶性） 按要求配制成包衣液， 再将包衣液放入胶体磨 粉碎、过滤待用。将装好片芯的高效包衣锅预 热，转速控制在 5-10转 /分，温度控制在 45-60 V， 用气雾喷头 （〉300 目）将包衣孔液喷入锅内， 然后干燥 25-35分钟， 反复进行 8-12 次， 直至包匀， 晾干检验合格后包装。

【实施例 18】左旋可利霉素颗粒剂 （按 10000袋计算）

处方： 实施例 5的左旋可利霉素原粉 1250g

糖粉 20000g

糊精 9000g

5%PVP-K30

制备工艺： 可利霉素原粉、 糖粉、 糊精过 120 目筛， 按处方量称取可利霉素、 糖粉、 糊精混合均匀， 将混合均匀的上述物料用 5%PVP-K30胶浆制成软材， 摇摆式颗粒剂制粒 70 °C干燥、 整粒， 送检合格后分装。

【实施例 19】左旋可利霉素冻干粉针剂

称取实施例 6的左旋可利霉素原粉 500mg与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于 5ml水 中， 可得到淡黄色澄明溶液， pH在 4. 6-5. 6之间。 再加入甘露醇 40mg作为冻干支撑剂， 低 温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物， 使用前用 10ml无菌水溶解。

【实施例 20】左旋可利霉素冻干粉针剂

称取实施例 4的左旋可利霉素原粉 500mg与等摩尔的枸橼酸混合均匀后溶解于 5ml水 中， 可得到淡黄色澄明溶液， pH在 4. 6-5. 6之间。 再加入甘露醇 40mg作为冻干支撑剂， 低 温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物， 使用前用 10ml无菌水溶解。

【实施例 21】左旋可利霉素冻干粉针剂

称取实施例 5的左旋可利霉素原粉 500mg与等摩尔的马来酸混合均匀后溶解于 5ml水 中， 可得到淡黄色澄明溶液， pH在 4. 6-5. 6之间。 再加入甘露醇 40mg作为冻干支撑剂， 低 温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物， 使用前用 10ml无菌水溶解。

【实施例 22】异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

将实施例 1所得到的左旋可利霉素进行分离纯化。

左旋异戊酰螺旋霉素 I 纯化： 采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样 品进行纯 化， 采用 ODS制备色谱柱， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分 离的紫外谱图， 对左旋异戊酰螺旋霉素 I组分目标峰进行收集：

色谱柱： ODS制备色谱柱；

流动相： 乙腈 (A)， lOOmM醋酸氨水溶液 (B);

梯度条件：采用线性梯度 0~60分钟， A为 25%〜65%； 61〜90分钟， A为 65%〜90%； 流速： 260 mL/min;

进样量： 10mL;

进样浓度： 0.5g/mL;

检测波长： 231nm;

收集方式： 紫外触发收集；

按照左旋异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT 44.759min,收集左旋异戊酰螺旋霉素 I样品， 采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品； 用石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得左旋异戊酰螺旋霉 素 I白色粉末状固体。

将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I白色粉末状固体进一步重结晶制备成晶体， 其重结 晶的方法如下：

( 1 )先将实施例 1中得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水 乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比 为 1 : 10： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 2.5倍； 加入纯水的速度为 4ml/分钟； 加入纯水时的搅拌速度为 30转 / 分钟；

(3 ) 纯水加完后降温至 5°C， 降温的速度为每小时 1 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-Κ α射线测量得到的 X-射线 粉末衍射在 2 Θ为 7. 6 ⁰ 、 8. 0 ^ο 、 10. 0。、 11. 4° . 16. 4°、 17. 0°、 17. 5。、 17. 9。、 19. 5。、 22. 7 °、 23. 7°和 24. 4°显示有特征峰， 其 X-射线粉末衍射图谱如图 6所示。

将上述分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素 I组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙 腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品； 用石 油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得左旋可利霉素； 再将所得到的左旋可 利霉素与上述得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物混合得到异戊酰螺旋霉素 I为左旋 异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素。

【实施例 23】异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作歩骤同实施例 22， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 10： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 9倍； 加入纯水的速度为 10ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 / 分钟；

(3 )纯水加完后降温至 15°C , 降温的速度为每小时 3°C , 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 6相似。

【实施例 24】异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作歩骤同实施例 22， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 ) 先将左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 5： 0.8；

(2 ) 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 7.5倍； 加入纯水的速度为 6ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 40转 / 分钟；

(3 ) 纯水加完后降温至 10°C， 降温的速度为每小时 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 6相似。

【实施例 25】异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 22， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 ) 先将左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 2： 1；

(2 ) 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 7.5倍； 加入纯水的速度为 8ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 45转 / 分钟；

(3 ) 纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 2. 5°C， 降温的同时继续搅拌， 搅 拌速度为 20转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 6相似。

【实施例 26】异戊酰螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 22， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 5： 0.8；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 5倍； 加入纯水的速度为 7ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分 钟； ( 3 )纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 1. 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅 拌速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 6相似。

【实施例 27】异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

将实施例 2所得到的左旋可利霉素进行纯化， 具体操作步骤同实施例 22， 所不同的是 按照左旋异戊酰螺旋霉素 II的保留时间 RT 43.34， 收集左旋异戊酰螺旋霉素 II样品。

将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素 II白色粉末状固体进一歩制备成晶体， 其制备方法如 下：

( 1 )先将实施例 2中得到的左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无水甲醇、无水 乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比 为 1 : 10： 1；

(2 )然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 2.5倍； 加入纯水的速度为 4ml/分钟； 加入纯水时的搅拌速度为 30转 / 分钟；

( 3 ) 纯水加完后降温至 5 Ό， 降温的速度为每小时 C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉 末衍射在 2 Θ为 10. 0。、 11. 6。、 16. 4。、 17. 3°、 19. 1°、 21. 2°、 22. 1°、 22. 7。、 26. 4°、 26. 9

°、 27. 5°和 31. 5显示有特征峰， 其 X-射线粉末衍射图谱如图 7所示。

将上述分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素 Π 组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙 腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品； 用石 油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得左旋可利霉素； 再将所得到的左旋可 利霉素与上述得到的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物混合得到异戊酰螺旋霉素 II为左 旋异戊酰螺旋霉素 Π晶体化合物的左旋可利霉素。

【实施例 28】异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 27， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无� ��丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 10： 0.8；

(2 )然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 9倍； 加入纯水的速度为 10ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 / 分钟；

( 3 )纯水加完后降温至 15 °C， 降温的速度为每小时 3°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 7相似。 【实施例 29】异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作歩骤同实施例 27, 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无� ��丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 5： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 7.5倍； 加入纯水的速度为 6ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 40转 / 分钟；

(3 )纯水加完后降温至 10°C， 降温的速度为每小时 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 Π晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 7相似。

【实施例 30】异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 27， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 ) 先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 3： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 7.5倍； 加入纯水的速度为 8ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 45转 / 分钟；

(3 )纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 2. 5°C， 降温的同时继续搅拌， 搅 拌速度为 20转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 7相似。

【实施例 31】异戊酰螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 27， 所不同的是重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无水甲醇、无水乙醇和无� ��丙酮的 混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 6： 0.8；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 5倍； 加入纯水的速度为 7ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分 钟；

(3 )纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 1. 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅 拌速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-K α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱 与图 7相似。

【实施例 32】异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素的制 备 将实施例 3所得到的左旋可利霉素进行纯化， 具体操作步骤同实施例 22, 按照左旋异 戊酰螺旋霉素 III的保留时间 RT 48.009, 收集左旋异戊酰螺旋霉素 III样品。

将所得到的左旋异戊酰螺旋霉素 III白色粉末状固体进一歩制备成晶体， 其制备方法如 下：

( 1 )先将实施例 3中得到的左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶解于无水甲醇、 无 水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积 比为 1 : 10： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 2.5倍； 加入纯水的速度为 4ml/分钟； 加入纯水时的搅拌速度为 30转 / 分钟；

(3 ) 纯水加完后降温至 5 Ό , 降温的速度为每小时 C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κ α射线测量得到的 X-射线 粉末衍射在 8. 0°、 10· 0。、 11. 2。、 11. 7。、 16. 4。、 19. 1° 19. 6。、 20. 0。、 21. 4° , 22. 9° 23. 6°和 29. 4°显示有特征峰， 其 X-射线粉末衍射图谱如图 8所示。

将上述分离纯化左旋异戊酰螺旋霉素 III组分后的左旋可利霉素采用旋转蒸发除去乙 腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品； 用石 油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 获得左旋可利霉素； 再将所得到的左旋可 利霉素与上述得到的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物混合得到异戊酰螺旋霉素 III为左 旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素。

【实施例 33】异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 32， 所不同的重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶解于无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮 的混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 10： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 9倍； 加入纯水的速度为 10ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 / 分钟；

(3 )纯水加完后降温至 15°C， 降温的速度为每小时 3°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κ α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图 谱与图 8相似。

【实施例 34】异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作歩骤同实施例 32， 所不同的重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶解于无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮 的混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 5： 0.8;

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 7.5倍； 加入纯水的速度为 6ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 40转 / 分钟；

(3 )纯水加完后降温至 10°C , 降温的速度为每小时 2°C , 降温的同时继续搅拌， 搅拌 速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κ α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图 谱与图 8相似。

【实施例 35】异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作歩骤同实施例 32， 所不同的重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶解于无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮 的混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 2： 1；

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 7.5倍； 加入纯水的速度为 8ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 45转 / 分钟；

(3 )纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 2. 5°C， 降温的同时继续搅拌， 搅 拌速度为 20转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κ α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图 谱与图 8相似。

【实施例 36】异戊酰螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素的制 备

其它操作步骤同实施例 32， 所不同的重结晶的方法如下：

( 1 )先将左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶解于无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮 的混合溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 5： 0.8;

(2)然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无 水丙酮体积之和的 5倍； 加入纯水的速度为 7ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分 钟；

(3 )纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 1. 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅 拌速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κ α射线测量得到的 X-射线粉末衍射图 谱与图 8相似。

【实施例 37】含有左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体的左旋可利霉素素片

处方及制备工艺同实施例 12，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例 22得到的异戊酰 螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素原粉。

【实施例 38】含有左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体的左旋可利霉素素片

处方及制备工艺同实施例 12，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例 27得到的异戊酰 螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 Π晶体化合物的左旋可利霉素原粉。

【实施例 39】含有左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体的左旋可利霉素素片

处方及制备工艺同实施例 12,所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例 32得到的异戊酰 螺旋霉素 in为左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的左旋可利霉素原粉。

【实施例 40】含有左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体的左旋可利霉素胶囊剂

处方及制备工艺同实施例 13，所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例 23得到的异戊酰 螺旋霉素 I为左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的左旋可利霉素原粉。

【实施例 41】含有左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体的左旋可利霉素胶囊剂

处方及制备工艺同实施例 13 ,所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例 28得到的异戊酰 螺旋霉素 II为左旋异戊酰螺旋霉素 Π晶体化合物的左旋可利霉素原粉。

【实施例 42】左旋异戊酰螺旋霉素 III为晶体的左旋可利霉素胶囊剂

处方及制备工艺同实施例 13 ,所不同的是左旋可利霉素原粉为实施例 33得到的异戊酰 螺旋霉素 III为左旋异戊酰螺旋霉素 III为晶体化合物的左旋可利霉素原粉。

异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III为左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体化合物的左旋可利 霉素的其它制剂所用的辅料和制备方法同前。

【试验例 1】体内药效

试验方法： 感染菌液制备： 将 -80°C冰箱保存的试验菌液取出放在室温 lh左右， 然后将 肺炎链球菌、化脓性链球菌、肠球菌吸取 0.1ml菌液分别接种于 2ml MH汤中（加 10%灭活 马血清）， 金葡菌也按上述方法接种 0.1ml菌液于 2ml MH汤中， 置 37°C孵箱中培养 18h后 为原菌液， 用 5%胃膜素稀释原菌液， 使动物感染 100%致死菌数作为感染菌液。

左旋可利霉素的临床用药途径拟为口服， 因此左旋可利霉素试验选择灌胃给药。 将小 鼠腹腔注射 0.5ml致死菌量后动物出现活动明显减少、 静卧、 毛松等症状。 感染后分别在 0.5-6h每一只小鼠灌胃一次 0.2ml， 无任何不良反应。 观察七日动物死亡数， 用 Bliss程序， 分别计算各药对小鼠感染后的半数保护剂量 （ED50), 与各药物比较保护效果。

体内试验结果见表 3和表 4:

表 3、 4种抗生素对小鼠腹腔感染 6株链球菌的疗效比较

可利霉素 0. 12

异戊酰 I为晶体 0. 06

异戊酰 II为晶体 0. 06

8.8 X 10 ⁴

肺炎链球菌 ₅₇ 异戊酰 ΠΙ为晶体 0. 06

阿奇霉素 0. 25

乙酰螺旋霉素 1

红霉素 0. 25

可利霉素 0. 12 26. 30 异戊酰 I为晶体 0. 06 26. 15 异戊酰 II为晶体 0. 06 23. 37 化脓性

6.9 X 10 ³ 异戊酰 ΠΙ为晶体 0. 06 23. 37 链球菌 772

阿奇霉素 0. 25 46. 89 乙酰螺旋霉素 0. 25 98. 11 红霉素 0. 5 101. 33 可利霉素 0. 25 87. 84 异戊酰 I为晶体 0. 12 69. 67 异戊酰 II为晶体 0. 12 64. 10 化脓性 7.8 X 10 ⁴

异戊酰 III为晶体 0. 12 64. 10 链球菌 102

阿奇霉素 0. 5 159. 06 乙酰螺旋霉素 0. 5 227. 07 红霉素 0. 5 361. 01 可利霉素 0. 25 68. 48 异戊酰 I为晶体 0. 12 61. 87 异戊酰 II为晶体 0. 12 59. 91 化脓性 4.9 X 10 ⁴

异戊酰 III为晶体 0. 12 59. 91 链球菌 119 ¾ ^ ^ ^ ^ ^ "

阿奇霉素 0. 5 98. 98 乙酰螺旋霉素 0. 5 117. 53 红霉素 0. 5 233. 72 表 4、 4种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的� �效比较 攻击量 MIC ED ₅₀ 试验菌 药 物

(CFU/0.5ml/鼠） ( H g/ml) (mg/kg)

可利霉素 0. 5 89. 29 异戊酰 I为晶体 0. 5 85. 15 异戊酰 II为晶体 0. 25 68. 54 肠球菌 32 5.4 X 10 ⁴ 异戊酰 ΠΙ为晶体 0. 25 68. 54 阿奇霉素 1 146. 51 乙酰螺旋霉素 1 130. 34 红霉素 2 175. 23 可利霉素 0. 5 31. 98 异戊酰 I为晶体 0. 5 25. 97 异戊酰 II为晶体 0. 25 26. 02

5.2 X 10 ³

金葡菌 16 异戊酰 ΠΙ为晶体 0. 25 26. 02 阿奇霉素 1 75. 80 乙酰螺旋霉素 1 43. 58 红霉素 1 82. 36 可利霉素 0. 5 31. 50

异戊酰 I为晶体 0. 5 26. 50

异戊酰 II为晶体 0. 25 25. 16

金葡菌 76 5.8 X 10 ⁴ 异戊酰 ΠΙ为晶体 0. 25 25. 16

阿奇霉素 1 58. 79

乙酰螺旋霉素 1 66. 63

红霉素 1 64. 17

可利霉素 2 120. 35

异戊酰 I为晶体 1 114. 53

异戊酰 II为晶体 1 109. 59

4.8 X 10 ⁴

金葡菌 12 异戊酰 ΠΙ为晶体 1 109. 59

阿奇霉素 4 217. 36

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 256 266. 11

可利霉素 1 59. 30

异戊酰 I为晶体 0. 5 42. 67

异戊酰 II为晶体 0. 5 47. 65

4.2 X 10 ⁴

金葡菌 21 异戊酰 III为晶体 0. 5 47. 65

阿奇霉素 4 142. 99

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 4 213. 67 体内试验结果表明： 左旋可利霉素对小鼠感染 12株细菌的疗效见表 3和表 4， 显示都 有良好的保护效果； 而异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III为左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体 化合物的左旋可利霉素则显示出更加优良的保 护效果。

对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或 左旋可利霉素制剂也进行了相同的试 验， 其获得的结果相似。

【试验例 2】体外药效

临床分离菌的测定：

试验方法： 采用平皿二倍稀释法： 将熔化琼脂培养基定量倒入含系列药物浓度的 平皿 内与药液混匀 （链球菌和肠球菌加入 5%去纤维羊血做成血培基、 流感杆菌加入 7%、 淋球 菌用淋球菌培养基加入 7%去纤维羊血做成巧克力培基）， 待凝固后， 再将新鲜培养菌液稀 释成 106CFU/mL, 用多点接种仪接种于含本发明实施例 4的左旋可利霉素和对照用阿奇霉 素、 乙酰螺旋霉素和红霉素的平皿琼脂上， 经 37°C培养 18h; 淋球菌置 5%C0 ₂ 培养箱中孵 育 24h; 军团菌置 5%C0 ₂ 培养箱中培养 48h;厌氧菌置厌氧箱内， 37°C厌氧培养 48h。 观察 抗菌药抑制细菌生长的最低浓度即为最低抑菌 浓度 （MIC ) , 并计算药物 MIC ₅ 。和 MIC ₉ o与 对照药比较。

附注：

MIC ₅ 。抑制 50%细菌生长最低的抑菌浓度；

MIC ₉ G抑制 90%细菌生长最低的抑菌浓度。

试验结果见表： 表 5、 可利霉素对临床分离菌敏感分布

对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或 左旋可利霉素制剂也进行了相同的试 验， 其获得的结果相似。

【试验例 3】体外抗沙眼衣原体和肺炎衣原体的测定

试验方法：

1. 将 HEp-2和 McCoy细胞系分别种植在 96孔细胞培养板 （ Costar公司） 内， 37°C， 5 %C02培养 48小时成为单层细胞。

2. 将待接种菌种稀释为 10000 20000 ifu (包涵体形成单位） /ml, 0.1ml/孔接种。 沙眼 衣原体血清型 B/TW-5/OT、 D/UW-3/Cx接种 McCoy细胞培养板， 肺炎衣原体 CWL-029接 种 HEp-2细胞培养板。 首先吸去 96孔培养板内的细胞培养液， 然后按 0.1ml/孔进行接种。 其中 A11〜D11的 4个孔， C12和 D12的 1个孔不接种菌种。

3.菌种接种完毕离心 96孔细胞培养板，使用 Beckman-Coulter公司的 J-6MC 离心机， 离心力 xl500g， 离心温度 35°C， 离心时间 60分钟。

4. 离心完毕后， 吸取接种的沙眼衣原体或肺炎衣原体， 分别加入系列稀释的 4种抗生 素药物 （即本发明实施例 4所制备的左旋可利霉素、 对照用乙酰螺旋霉素、 红霉素和阿奇 霉素）， 0.1ml/孔。 5. 37°C , 5 %C02培养， 沙眼衣原体药敏试验板培养 48小时， 肺炎衣原体药敏试验板 培养 72小时。 培养完毕， 吸取抗生素药物溶液， PBS ( 0.01M, pH 7.4)洗涤 2次， 100 %甲 醇室温固定 15分钟。

6. 间接免疫荧光染色鉴定： 沙眼及肺炎衣原体药敏试验板分别加入纯化的 抗沙眼衣原 体单克隆抗体 （N54克隆） 和肺炎衣原体单克隆抗体 （P33克隆）， 50μ1/孔， 37°C湿盒内温 育 30分钟， 然后洗板机洗板 4次， 再加入兔抗鼠荧光抗体 （Sigma公司）， 50μ1/孔， 同样 方法及条件温育及洗板。 加入封片甘油， ΙΟΟμΙ/孔， 在 Nikon倒置荧光显微镜 (Diaphot-200) 下观察结果。

7. MIC的定义： 96孔试验板中沙眼衣原体或肺炎衣原体包涵体� ��长完全被抑制孔（全 孔未发现荧光染色的包涵体） 的最小抗生素稀释浓度。

试验结果如下：

表 6、 四种大环内脂类抗生素对沙眼及肺炎衣原体体 外作用的最小抑菌浓度 （MIC)

1、 对于沙眼血清型 B/TW-5/OT, 可利霉素 MIC为 0.25 g/ml、 红霉素、 阿奇霉素 （0.5 g/ml) 次之， 乙酰螺旋霉素 （MIC为 4 g/ml) 较差。

2、 对于沙眼血清型 D/UW-3/Cx, 可利霉素、 阿奇霉素体外作用相同， MIC为 0.25 g/ml， 属敏 感；、 红霉素 （0.5 g/ml) 次之， 乙酰螺旋霉素 （MIC为 2 g/ml) 较差。

3、 对于肺炎衣原体 CWL-029, 可利霉素和红霉素体外作用最敏感， MIC≤0.016 g/ml， 阿奇 霉素 （MIC为 0.032 g/ml) 较敏感； 乙酰螺旋霉素 （MIC为 0.5 g/ml)较差。

4、 总体来看本发明所制备的左旋可利霉素对衣原 体的效果优于其他试验药物。

对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或 左旋可利霉素制剂也进行了相同的试 验， 其获得的结果相似。

【试验例 4】体外抗解脲支原体和肺炎衣原体

1、 试验方法：在无菌 12孔细胞培养板各孔加入 U-PPLO 0.8ml (菌液对照孔加入 0.9ml， 培 养基对照孔加入 1.0ml)。

2、 在各实验孔中加入 10 ⁴ CCU/ml的 Uu菌液 0.1ml， 孔中的最终菌量为 10 ³ CCU/ml (培养 基对照孔不加菌液）。

3、 分三组（ 100 μ g/ml、 10 μ g/ml、 1 μ g/ml抗生素原液）按照二倍递降浓度梯度用无� � Tip 向各实验孔加入实验用抗生素（本发明实施例 6的左旋可利霉素、 乙酰螺旋霉素、 红霉 素和阿奇霉素）： 100 μ ΐ, 50 μ ΐ, 25 μ ΐ, 12.5 μ 1。 （菌液对照孔、培养基对照孔不加抗生 素， 同时设抗生素对照孔） 4、 上述各孔混匀， 培养版用胶带封口， 放 37°C温箱培养。

5、 于实验后 17-24h观察记录 Uu生长情况。 当 Uu菌液对照孔呈现阳性生长时， 此时能抑 制 Uu 生长的最低抗生素浓度为该药样的最低 MIC, 实验结束时的 MIC 为最终 MIC

(24h) o

对抗解脲支原体菌株进行 MIC测定， 进行 4次测定， 结果显示如下：

可利霉素 0.025-0.125 μ g/ml,

乙酰螺旋霉素 0.5 μ g/ml,

红霉素 5 μ g/ml,

阿奇霉素 0.025-0.125 μ g/ml。

上述结果表明， 可利霉素有良好的抗 Uu作用， 与阿奇霉素作用相似， 优于乙酰螺旋霉 素， 红霉素在本组试验中抗 Uu作用效果最差。

对本发明其它实施例所制备的左旋可利霉素或 可利霉素制剂也进行了相同的试验， 其 获得的结果相似。