说 明 书 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III, 及其制剂、 制备方法及应用 技术领域

本发明涉及一种大环内酯类基因工程新抗生素 ， 特别是左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III， 其晶体、 其 药用制剂、 制备方法以及在抗感染疾病药物中的应用。 背景技术

大环内酯类抗生素在临床上占有重要地位， 因其对革兰氏阳性菌和支原体有很好的活性， 对部分革兰 氏阴性菌也有作用， 且对一些日趋流行的弓形体、 军团菌等难以控制的病原体有良好的抗菌活性 和组织渗 透性， 口服吸收快， 不良反应少， 对肝、 肾功能基本无影响， 还有潜在的免疫调节作用， 九十年代被认为 在治疗成人呼吸道感染上将会与 β-内酰胺类药物竞争。

手性 （Chirality) 是三维物体的基本属性， 是自然界的本质属性之一。 作为生命活动重要基础的生物 大分子， 如蛋白质、 多糖、 核酸和酶等， 几乎全是手性的， 这些大分子在体内往往具有重要的生理功能。 手性药物 （chiral drug) 是指药物分子结构中引入手性中心后， 得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。 这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是 旋光性有所差别，分别被命名为 R-型（右旋）或 S-型（左旋）、 外消旋。 而近 20年以来随着药学研究工作的深入， 已表明药物对映体的立体选择性 （stereoselectivity) 的 不同， 使其与各受体的亲和力不同而导致药理作用的 极大差异。 人们将手性药物中活性高的对映体称为优 对映体（Eutomer) ; 而活性低的或无活性的对映体称为劣对映体（ Distomer)。 在许多情况下， 劣对映体不 仅没有药效， 而且还会部分抵消优对映体的药效， 有时甚至还会产生严重的毒副反应， 表现出药效差异的 复杂性， 也决定了单一对映体的治疗指数与其消旋体有 着相当的差异， 如熟知的 DL- (+- ) 合霉素的疗效 仅为 D ( - )氯霉素的一半； 普萘洛尔 （propranolol) L-异构体的药物活性比 D-异构体大 100倍； （-)美沙 酮是强止痛剂， 而（+ )无效。 而且毒性也存在差别， 如沙立度胺（thalidomide) 的两个对映体对小鼠的镇 静作用相近， 但只有 S ( -)异构体及其代谢物才有胚胎毒及致畸作用； 氯胺酮为一有特点的广泛应用的麻 醉和镇痛药， 但存在产生幻觉等副作用， 研究发现， S (+) 体作用比 R (- ) 体强 3〜4倍， 而毒副作用明 显与后者有关。 手性药物疗效的极大差异促进了手性药物的研 究开发以及分离分析的发展。 利用"手性"技 术，人们可以有效地将药物中不起作用或有毒 副作用的成分剔除，生产出具有单一定向结构 的纯手性药物， 从而让药物成分更纯， 在治疗疾病时疗效更快、 疗程更短。 因此， 手性药物的研究目前已成为国际新药研 究的新方之一， 各国政府和各大医药公司纷纷投入巨资， 在手性药物制剂、 手性原材料和手性中间体等领 域进行研究开发， 抢占世界手性制药市场。 此外， 随着手性技术的不断改进， 尤其是液相色谱法的迅速广 泛应用， 积极地推动了手性药物对映体的分离分析和测 定。 单一对映体手性药物已得到了广泛的应用。

可利霉素是利用基因工程技术研制的新型螺旋 霉素衍生物， 原命名为必特螺旋霉素， 曾用名为生技霉 素 [专利号： ZL97104440.6 ]。根据"中国药品通用名称命名原则"， 经国家药典委员会技术审核及研究确定， 必特螺旋霉素的中文通用名称更改为可利霉素 ，英文名称为 Carrimyci 可利霉素的化学结构是以 4"-异戊 酰螺旋霉素为主成分，包括 4"-异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III，其次还含有约 6种 4"-位羟基酰基化的螺旋霉素， 故其化学名统称为 4"-酰化螺旋霉素。 可利霉素主成分

( 1 )

其中： 异戊酰螺旋霉素 I中的 R选自 H;

异戊酰螺旋霉素 II中的 R选自 COCH ₃ 、

异戊酰螺旋霉素 ΠΙ中的 RCOCH ₂ CH ₃ 。

可利霉素为 16元环大环内酯类抗生素， 其作用机制是通过与细菌核糖体结合而抑制其 蛋白质合成。 药代动力学研究结果表明， 可利霉素中具活性的有效组分主要为异戊酰螺 旋霉素 I、 II、 III。 可利霉 素进入体内后很快代谢为螺旋霉素， 以母体药物异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III和活性代谢物螺旋霉素 I、 II、 III 的 AUC。— _t 总和计算， 其口服绝对生物利用度平均为 91.6%。 文献报道， 螺旋霉素人体口服绝对生物利用 度为 30~40% (Frydman AM et al J Antimicrob Chemother. l988,22(suppl B):93-103 )。 说明异戊酰螺旋霉素的 结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用 度。 单次服药可利霉素消除较慢， T _1/2 在 23~27小时之间。

体外试验结果表明， 可利霉素对革兰氏阳性菌、 尤其对某些耐药菌（如耐 β-内酰胺金葡菌、 耐红霉素 金葡菌等）有效， 与同类药无明显的交叉耐药性。 同时它对支原体、 衣原体有很好的抗菌活性， 对部分革 兰氏阴性菌也有抗菌活性， 且对弓形体、 军团菌等有良好抗菌活性和组织渗透性， 还有潜在的免疫调节作 用。 其体内抗菌活性明显优于体外 （ZL200310122420.9 )。 临床研究表明， 每日服用可利霉素片剂 200mg~400mg 5~7天， 可适用于治疗化脓性链球菌引起的急性细菌性 咽炎、 急性化脓性扁桃体炎； 敏感细 菌引起的细菌性鼻窦炎、 急性支气管炎； 肺炎链球菌、 流感嗜血杆菌以及肺炎支原体所致的轻症肺炎 ； 支 原体、衣原体引起的非淋球菌性尿道炎； 敏感细菌引起的皮肤软组织感染、牙周炎、 中耳炎等感染性疾病。 其总有效率为 92.68%。

临床研究证明， 可利霉素是一个口服安全有效的抗生素。 然而， 由于可利霉素本身是经过发酵得到 的产品， 为多组分药物， 因此多组分的进一步分离和提纯很困难。 目前建立的高效液相色谱法， 能 将可利霉素样品中的多种酰化螺旋霉素进行分 离， 如异戊酰螺旋霉素 II与（异）丁酰螺旋霉素 III、（异) 丁酰螺旋霉素 II与丙酰螺旋霉素 III、 丙酰螺旋霉素 III与其前面的小组分、 丙酰螺旋霉素 II与乙酰螺旋霉 素 III的分离度达到中国药典规定的 1.5以上； 而乙酰螺旋霉素 III与其前面的小组分的分离度为 1.2。

本发明人通过大量的研究发现， 通过对培养、 发酵条件的调整和优化， 意外的得到了一种左旋可利霉 素， 该左旋可利霉素具有更加优良的抗感染活性。

目前采用高效液相色谱法， 测定可利霉素 9个酰化螺旋霉素组分， 其中异戊酰螺旋霉素（Ι+Π+ΠΙ) 总含量应不低于 60%， 酰化螺旋霉素总含量应不低于 80%。 对于发酵产生的多组分抗生素， 很难达到化学 药品对于注射剂的质量控制标准， 但是对于临床危重病人或不宜口服用药的病人 ， 注射给药见效迅速， 因 此研制异戊酰螺旋霉素的单一组分的制剂则具 有非常深远的意义。本发明通过对左旋可利霉 素的进一步研 究得到了左旋异戊酰螺旋霉素 I的单一组分， 纯度可达到 98wt%。 发明内容

本发明的首要发明目的在于提供左旋异戊酰螺 旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊酰螺旋霉 素 III。

本发明的第二发明目的在于提供一种分别含有 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋 异戊酰螺旋霉素 III的制剂。

本发明的第三发明目的在于提供左旋异戊酰螺 旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊酰螺旋霉 素 III的制备方法。

本发明的第四发明目的在于提供左旋异戊酰螺 旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊酰螺旋霉 素 III的应用。

本发明的第五发明目的在于提供左旋异戊酰螺 旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊酰螺旋霉 素 III的晶体， 以及分别含有该晶体的制剂。 为了实现本发明的发明目的， 本发明采用的技术方案为：

本发明涉及左旋异 构式如式 （I) 所示，

(I)

其比旋光度为 [a] _D =-49°〜- 62°， 优选 -51°〜- 60°， 更优选 -60°〜- 62°， 更优选 -51°〜- 58°， 更优选 -53°〜 -58°， 更优选 -55°〜- 58°， 更优选 -55°〜- 57°， 更优选 -58°〜- 60°， 更优选 -51°〜- 55°， 更优选 -53°〜- 55°， 更 优选 -49°〜- 51° (C=0.02g/ml, CHC1 ₃ ， 25V， ； 熔点为 116〜122， 优选 118〜120°C;

本发明涉及左旋 构式如式（II)所示，；

(II)

其比旋光度为 [a] _D =-55°〜- 61°， 优选 -57°〜- 59° (C=0.02g/ml， CHC1 ₃ ， 25°C， ； 熔点为 120°C〜128°C， 优选 123°C〜125°C;

本发明涉及左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 III的化学结构式如式 （III)所 示，

(III)

其比旋光度为 [a] _D = (-)-49°〜- 51° ( C=0.02g/ml， CHC1 ₃ ， 25 °C , ； 熔点为 116°C〜118°C。 本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素 I的制剂， 其特征在于， 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 I、 异戊 酰螺旋霉素 I的药用盐、 异戊酰螺旋霉素 I与药学上可接受的辅料、 或异戊酰螺旋霉素 I的药用盐与药学 上可接受的辅料， 所述异戊酰螺旋霉素 I的纯度大于 90 wt %， 优选纯度大于 95 wt %， 更优选纯度大于 98

Wt % ;

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素 II的制剂， 其特征在于， 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 II、 异戊 酰螺旋霉素 II的药用盐、 异戊酰螺旋霉素 II与药学上可接受的辅料、 或异戊酰螺旋霉素 II的药用盐与药 学上可接受的辅料， 所述异戊酰螺旋霉素 II的纯度大于 90 wt %， 优选纯度大于 95 wt %， 更优选纯度大于 98 wt % _;

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素 in的制剂， 其特征在于， 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 III、 异 戊酰螺旋霉素 III的药用盐、 异戊酰螺旋霉素 III与药学上可接受的辅料、 或异戊酰螺旋霉素 III的药用盐 与药学上可接受的辅料， 所述异戊酰螺旋霉素 III的纯度大于 90 wt %， 优选纯度大于 95 wt %， 更优选纯 度大于 98 wt %。 本发明的第一优选方案为： 本发明的制剂为液体制剂、 固体制剂、 半固体制剂或气体制剂， 所述的液 体制剂选自注射剂、 输液剂、 溶液剂、 合剂、 糖浆剂、 酊剂、 溶胶剂、 芳香水剂、 甘油剂、 胶体溶液剂、 胶浆剂、 混悬剂或乳剂； 所述的固体制剂选自粉针、 冻干粉针、 片剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂、 丸剂、 丹 剂或膜剂； 所述的半固体制剂选自软膏剂、 硬膏剂、 栓剂、 浸膏剂、 凝胶剂； 所述的气体制剂选自气雾剂 或喷雾剂， 优选注射用水针剂、 注射用粉针剂、 冻干粉针剂。

本发明的第二优选方案为：本发明的制剂包含 异戊酰螺旋霉素 I的单位剂量为 10〜1500mg，优选 50〜 lOOOmg,更优选 100〜500 mg _; 本发明的制剂包含异戊酰螺旋霉素 II的单位剂量为 10〜1500mg，优选 50〜 lOOOmg，更优选 100〜500 mg;本发明的制剂包含异戊酰螺旋霉素 III的单位剂量为 10〜1500mg，优选 50〜 lOOOmg, 更优选 100〜500 mg。

本发明的第三优选方案为： 在制剂中， 左旋异戊酰螺旋霉素 I在制剂中的重量百分比为 10〜95%， 优 选 50〜95%，更优选 75〜95%；左旋异戊酰螺旋霉素 II在制剂中的重量百分比为 10〜95%，优选 50〜95%， 更优选 75〜95%；左旋异戊酰螺旋霉素 III在制剂中的重量百分比为 10〜95%，优选 50〜95%，更优选 75〜 95%。 本发明还涉及一种分别含有左旋异戊酰螺旋霉 素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II或左旋异戊酰螺旋霉素 III 的制剂： 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 I和枸橼酸、 己二酸、 马来酸中的至少一种制备的注射用水针剂、 注射 用粉针剂或冻干粉针剂； 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 II和枸橼酸、 己二酸、 马来酸中的至少一种制备的 注射用水针剂、 注射用粉针剂或冻干粉针剂； 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 III和枸橼酸、 己二酸、 马来 酸中的至少一种制备的注射用水针剂、 注射用粉针剂或冻干粉针剂。

其中， 左旋异戊酰螺旋霉素 I与枸橼酸的摩尔比为 1 : 0.8〜1.2， 左旋异戊酰螺旋霉素 I与己二酸的摩 尔比为 1 : 0.8〜1.2、 左旋异戊酰螺旋霉素 I与马来酸的摩尔比为 1 : 0.8- 1.2 ； 左旋异戊酰螺旋霉素 Π与 枸橼酸的摩尔比为 1 : 0.8〜1.2， 左旋异戊酰螺旋霉素 II与己二酸的摩尔比为 1 : 0.8〜1.2、 左旋异戊酰螺 旋霉素 II与马来酸的摩尔比为 1 : 0.8- 1.2； 左旋异戊酰螺旋霉素 III与枸橼酸的摩尔比为 1 : 0.8- 1.2, 左 旋异戊酰螺旋霉素 III与己二酸的摩尔比为 1 : 0.8〜1.2、 左旋异戊酰螺旋霉素 III与马来酸的摩尔比为 1 : 0.8〜1.2。 本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的制备方法： 包括左旋可利霉素的制备、 左旋异戊酰螺 旋霉素 I、 II或 III的纯化。

其中， 左旋可利霉素的制备过程包括将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSP-195培养后进行生物发酵， 并对发酵液进行提取； 在 pH值 6.0〜9.0， 优选 6.0〜8.0， 更优选 6.0〜7. 5 的条件下进行发酵， 且 pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =k _lXl +6. 0， 其 中 0. 0227 ¾≡ki ¾≡0. 1364， 0< _Xl ¾≡22 ;第二阶段满足方程式 y ₂ =k ₂ x ₂ + b ₂ ，其中- 0. 0735 ¾≡k ₂ <0, 6. 5 <b ₂ «≡10. 62 , 22 ¾≡56 ; 第三阶段满足方程式 y ₃ =k ₃ x ₃ + b ₃ ， 其中 0<k ₃ ¾≡0. 0078， 6. 06¾≡b ₃ <6. 5 , 56¾≡x ₃ ¾≡120 _o 本发 明中， 通过对培养发酵条件的调整和优化， 尤其是通过 pH调节剂严格控制发酵过程中的 pH值， 使发酵 过程中 pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶段， 并且每个阶段各满足一定的方程式， 从而得到了具有 光学活性的左旋可利霉素。 进而分别分离得到左旋异戊酰螺旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊 酰螺旋霉素 III。

优选的， 本发明中生物发酵的条件为： 将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆 菌株 WSJ- 195 , 在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基 上，于 pH6.5~7.5、温度 28~38 °C的条件下培养 8~15天，接种于含有黄豆饼粉 1.5%、淀粉 3.0%、 NaCl 0.4%、 CaCO ₃ 0.5%、 鱼蛋白胨 0.3%和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 于 pH6.5~7.5、 25~30°C的条件下培养 40 80 小时， 以 0.1〜20%接种量种入含有葡萄糖 0.5%、 淀粉 6.0%、 酵母粉 0.5%、 鱼粉 2.0%、 NH ₄ N0 ₃ 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaC0 ₃ 0.5%、 KH ₂ P0 ₄ 0.05%、 MgS0 ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 于 pH6.5~7.5、 26~30°C的条件下培养 72 120小时， 获得发酵液；

所述 pH调节剂选自盐酸、 醋酸、 氨水、 氢氧化钠、 氢氧化钾中的至少一种。

优选的， 本发明的生物发酵液的提取的步骤为： 将得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.5〜 9.0， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 分别洗涤， 再用 pH2.0〜2.5水提取， 得水 相提取液， 调 pH至 4.5〜5.5， 挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.5〜9.0， 沉淀， 用 纯化水进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素；

其中， 采用盐酸、 醋酸、 枸橼酸、 氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸氢钠、 碳酸钠中的至少一种来调节 pH 值。

其中， 异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的纯化的步骤包括： 采用色谱分离的方法对左旋可利霉素样品进行 纯化， 采用 ODS色谱柱， 乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 对左旋异戊酰螺旋霉素 I组分目标峰、 左旋 异戊酰螺旋霉素 II组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 III组分目标峰进行分离。

优选的， 在左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的纯化过程中， 采用制备型高效液相色谱、 紫外检测， 记 录分离的紫外谱图， 按照左旋异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 44.759min收集样品， 按照左旋异戊酰螺旋霉 素 II的保留时间 43.34min样品， 按照左旋异戊酰螺旋霉素 III的保留时间 48.009min收集样品。

进一步优选的， 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的纯化过程中， 将收集到的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III分别采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用乙酸乙酯萃取， 蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏状样品； 用石油醚重溶所得样品， 再蒸发除去石油醚， 分别获得左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III白色粉末状固体。

其中， 所述的流动相为乙腈 A和 pH=8.5、 150mM醋酸氨水溶液的混合溶剂。

所述的左旋异戊酰螺旋霉素 Ι、Π或 III纯化的具体条件为：采用线性梯度： 0-60分钟， Α为 25%〜65%； 61〜90分钟， A为 65%〜90%；

流速： 260 mL/min;

进样量： 10mL;

进样浓度： 0.5g/mL;

检测波长： 231nm;

收集方式： 紫外触发收集。 本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 I的晶体化合物， 该左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-Κα射 线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2Θ为 7.6°、 8.0°、 10.0°、 11.4°、 16.4°、 17.0°、 17.5°、 17.9°、 19.5°、 22.7 °、 23.7°和 24.4°显示有特征峰。 其 X-射线粉末衍射图谱如附图 5所示。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法为，先将左旋异戊酰� �旋霉素 I化合物固体溶解于 无甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加完后降 温至 5°C〜15°C， 降温的同时继续搅拌， 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

其中， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法的第一优选技术方案� �， 所加入的纯水的体 积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2〜9倍， 优选 2.5〜7.5倍； 加入纯水的速度为 4〜 10ml/ 分钟， 优选 6〜 8ml/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法的第二优选技术方案� �，所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5- 1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8- 1 =

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法的第三优选技术方案� �， 所加入纯水的搅拌速度为 30〜60转 /分钟， 优选 45〜60转 /分钟； 纯水加完后， 搅拌速度为 10〜30转 /分钟， 优选 10〜20转 /分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法的第四优选技术方案� �， 纯水加完后降温的速度为 每小时 1〜3 °C， 优选每小时 1〜 1.5 °C。 本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 II的晶体化合物， 该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-Ka 射线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2Θ为 10.0°、 11.6°、 16.4°、 17.3°、 19.1°、 21.2°、 22.1°、 22.7°、 26.4° 、 26.9°、 27.5°和 31.5 。显示有特征峰。 其 X-射线粉末衍射图谱如附图 6所示。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法为， 先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解 于无甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的混合溶剂中， 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 纯水加完后降温至 5°C〜 15°C， 降温的同时继续搅拌， 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

其中， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法的第一优选技术方案� ��， 所加入的纯水的体 积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2〜9倍， 优选 2.5〜7.5倍； 加入纯水的速度为 4〜 10ml/ 分钟， 优选 6〜 8ml/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II 晶体化合物的制备方法的第二优选技术方案为 ， 所用混合溶剂中无水甲 醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5- 1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8- 1 =

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法的第三优选技术方案� ��，所加入纯水的搅拌速度为 30〜60转 /分钟， 优选 45〜60转 /分钟； 纯水加完后， 搅拌速度为 10〜30转 /分钟， 优选 10〜20转 /分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法的第四优选技术方案� ��，纯水加完后降温的速度为 每小时 1〜3°C， 优选每小时 1〜1.5°C。 本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 III的晶体化合物，该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Ka 射线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2Θ为 8.0°、 10.0°、 11.2°、 11.7°、 16.4°、 19.1°、 19.6°、 20.0°、 21.4° 、 22.9°、 23.6°和 29.4°显示有特征峰。 其 X-射线粉末衍射图谱如附图 7所示。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的制备方法为， 先将左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶 解于无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合溶 剂中，然后加入纯水，边加入边搅拌，纯水加 完后降温至 5°C〜 15°C， 降温的同时继续搅拌， 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

其中， 所述左旋异戊酰螺旋霉素 III 晶体化合物的制备方法的第一优选技术方案为 ， 所加入的纯水的 体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积之 和的 2〜9倍，优选 2.5〜7.5倍；加入纯水的速度为 4〜 10ml/ 分钟， 优选 6〜 8ml/分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 III 晶体化合物的制备方法的第二优选技术方案为 ， 所用混合溶剂中无水甲 醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 0.1〜10： 0.5- 1 , 优选 1 : 2〜8： 0.8- 1 =

所述左旋异戊酰螺旋霉素 III 晶体化合物的制备方法的第三优选技术方案为 ， 所加入纯水的搅拌速度 为 30〜60转 /分钟， 优选 45〜60转 /分钟； 纯水加完后， 搅拌速度为 10〜30转 /分钟， 优选 10〜20转 /分钟。

所述左旋异戊酰螺旋霉素 III 晶体化合物的制备方法的第四优选技术方案为 ， 纯水加完后降温的速度 为每小时 1〜3 °C， 优选每小时 1〜1.5°C。 不同晶型的晶胞内分子在空间构型、 构象与排列不同， 使其溶解性存在显著差异， 导致制剂在体内有 不同的溶出速率， 直接影响制剂在体内的吸收、 分布、 排泄和代谢， 最终因其生物利用度不同而导致临床 药效的差异。 本发明对所制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体、 左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体或左旋异戊酰螺 旋霉素 III晶体分别与左旋异戊酰螺旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II或左旋异戊酰螺旋霉素 III的疗效相 应的进行了比较， 发现本发明所制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体的疗效优于左旋异戊酰螺旋霉素 I， 左 旋异戊酰螺旋霉素 II晶体的疗效优于左旋异戊酰螺旋霉素 II， 左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体的疗效优于左 旋异戊酰螺旋霉素 III。

本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制剂，所述制剂包括异戊酰螺� �霉素 I晶体化合物、 异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的药用盐、 异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物与药学上可接受的辅料、 或异戊酰 螺旋霉素 I晶体化合物的药用盐与药学上可接受的辅料� � 所述异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的纯度大于 99

Wt % ;

本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制剂，所述制剂包括异戊酰螺� ��霉素 II晶体化合物、 异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的药用盐、异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物与药学上可接受的辅料、或异戊� �� 螺旋霉素 II晶体化合物的药用盐与药学上可接受的辅料� �� 所述异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的纯度大于 99 wt % _;

本发明还涉及左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的制剂， 所述制剂包括异戊酰螺旋霉素 III晶体化合 物、 异戊酰螺旋霉素 in晶体化合物的药用盐、 异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物与药学上可接受的辅料、 或 异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的药用盐与药学上可接受的辅料 ， 所述异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的纯 度大于 99 wt %。 本发明还涉及含有异戊螺旋霉素 I或其晶体、 及其制剂在制备治疗和 /或预防抗感染疾病药物中的应 用； 本发明还涉及含有异戊螺旋霉素 II或其晶体、 及其制剂在制备治疗和 /或预防抗感染疾病药物中的应 用； 本发明还涉及含有异戊螺旋霉素 III或其晶体、 及其制剂在制备治疗和 /或预防抗感染疾病药物中的应 用。 所述的感染性疾病为革兰氏阳性菌、 金黄色葡萄球菌、 肺炎链球菌、 肺炎支原体、 肺炎衣原体、 解脲 支原体、 沙眼衣原体、 化脓性链球菌、 卡他球菌、 淋球菌、 流感杆菌、 军团菌或厌氧菌感染引起的疾病。

本发明还涉及含有异戊螺旋霉素 I或其晶体、 及其制剂在制备抗菌药物中的应用， 本发明还涉及含有 异戊螺旋霉素 II或其晶体、 及其制剂在制备抗菌药物中的应用， 本发明还涉及含有异戊螺旋霉素 in或其 晶体、 及其制剂在制备抗菌药物中的应用， 所述的菌为肺炎链球菌、 甲类链球菌、 化脓性链球菌、 肠球菌、 金葡菌、 表葡菌、 卡他球菌、 淋球菌、 流感杆菌、 大肠杆菌、 产毒大肠杆菌、 致病性大肠杆菌、 侵龚性大 肠杆菌、 绿脓杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、 普通变形杆菌、 伤寒杆菌、 不动杆菌、 枸橼酸杆菌枸橼酸杆菌、 粘 质沙雷氏菌、 宋内氏痢疾杆菌、 福氏痢疾杆菌、 白色念球菌； 军团菌如嗜肺军团菌、 高曼军团菌、 博茨曼 军团菌、 杜莫夫军团菌、 佐丹军团菌、 米克戴德军团菌； 厌氧菌如脆弱类杆菌、 多形类菌、 普通类杆菌、 吉氏类杆菌、 吉氏类杆菌、 栖瘤胃类杆菌、 不解糖普氏杆菌、 口腔普氏杆菌、 具核酸杆菌、 拉式梭杆菌、 双岐杆菌、 乳杆菌、 消化链球菌、 疮疱丙酸杆菌、 产气荚膜梭菌、 酵母样真菌。 下面对本发明进行进一步的详细描述。

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素 I， 本发明通过对培养、 发酵条件的调整和优化， 严格控制溶液 的 pH值， 得到了左旋异戊酰螺旋霉素 I。

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素 II， 本发明通过对培养、 发酵条件的调整和优化， 严格控制溶液 的 pH值， 得到了左旋异戊酰螺旋霉素 II。

本发明涉及一种左旋异戊酰螺旋霉素 III， 本发明通过对培养、 发酵条件的调整和优化， 严格控制溶 液的 pH值， 得到了左旋异戊酰螺旋霉素 III。

本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III具有较好的抗菌活性， 为抗生素类药物增加了一个新的可用 于注射的品种， 为现有抗生素耐药性这一技术难题提出了新的 解决方案。

其中， 本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III比旋度测定方法为： 取本品精密称定， 加氯仿溶解并 稀释成每 lml中约含 20mg的溶液， 采用钠光谱的 D线 （589.3nm) 测定旋光度， 测定长度为 ldm， 测定 温度为 25°C， 使用读数至 0.0001°， 并经过检定的旋光计。

本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的熔点的测定方法为： 取干燥的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II 或 III适量， 置熔点测定用毛细管中， 进行熔点测定， 重复测定 3次， 取平均值。

本发明还涉及含有左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III的制剂， 其组成为左旋异戊酰螺旋霉素 I和药学上 可接受的载体和 /或辅料， 其中， 异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III的纯度大于 90wt%， 优选大于 95wt%， 更优 选大于 98wt%。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III或其晶体的制剂优选注射用水针剂、 注射用粉针剂、 冻 干粉针剂。 将本发明的含有单一组分的左旋异戊酰螺旋霉 素 I、 II或 III制剂制成注射用水针剂或粉针剂， 从而使本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III制剂能够更加迅速的为人体所吸收， 从而达到抗感染的作 用。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I的制剂，包含下述单位剂量：左旋异戊酰螺� �霉素 I 10〜1500mg， 优选 50〜1000mg， 更优选 100〜500 mg;

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 II的制剂，包含下述单位剂量:左旋异戊酰螺旋 霉素 II 10〜1500mg， 优选 50〜1000mg， 更优选 100〜500 mg。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 III 的制剂， 包含下述单位剂量： 左旋异戊酰螺旋霉素 III 10〜 1500mg， 优选 50〜1000mg， 更优选 100〜500 mg。 本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物晶体的制剂，包含下述单位剂量:左旋� ��戊酰螺旋霉素 I 晶 体 10〜1500mg， 优选 50〜1000mg， 更优选 100〜500 mg;

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物晶体的制剂， 包含下述单位剂量： 左旋异戊酰螺旋霉素 II 晶体 10〜1500mg， 优选 50〜1000mg， 更优选 100〜500 mg;

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物晶体的制剂， 包含下述单位剂量： 左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体 10〜1500mg， 优选 50〜1000mg， 更优选 100〜500 mg。 本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素 I的重量百分比为 10〜90%， 优选 50〜90%， 更优选 75〜90%；

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 II的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素 II的重量百分比为 10〜90%， 优 选 50〜90%， 更优选 75〜90%；

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 III的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素 III的重量百分比为 10〜90%， 优 选 50〜90%， 更优选 75〜90%。 本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物晶体的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物晶体的重量百 分比为 10〜90%， 优选 50〜90%， 更优选 75〜90%。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物晶体的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物晶体的重量 百分比为 10〜90%， 优选 50〜90%， 更优选 75〜90%。

本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物晶体的制剂中左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物晶体的重量 百分比为 10〜90%， 优选 50〜90%， 更优选 75〜90%。 本发明的口服制剂可含有常用的赋形剂， 如粘合剂、 填充剂、 稀释剂、 压片剂、 润滑剂、 崩解剂、 着 色剂、 调味剂和湿润剂， 必要时可对片剂进行包衣。 其中， 适用的填充剂包括纤维素、 甘露糖醇、 乳糖和 其它类似的填充剂。 适宜的崩解剂包括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物， 例如羟基乙酸淀粉钠。 适宜 的润滑剂包括， 例如硬脂酸镁。 适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸 钠。

本发明的固体口服制剂可通过混合， 填充， 压片等常用的方法制备。

本发明的口服液体制剂的形式， 例如： 水性或油性悬浮液、 溶液、 乳剂、 糖浆剂或酏剂， 或者可以是 一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的 干燥产品。 这种液体制剂可含有常规的添加剂， 如悬浮剂， 例如山梨醇、 糖浆、 甲基纤维素、 明胶、 羟乙基纤维素、 羧甲基纤维素、 硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪， 乳化剂， 例如卵磷脂、 脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶； 非水性载体 （它们可以包括食用油）， 例如杏仁 油、 分熘椰子油、 诸如甘油的酯的油性酯、 丙二醇或乙醇； 防腐剂， 例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙 酯或山梨酸， 并且如果需要， 可含有常规的香味剂或着色剂。

本发明的注射剂中可含有任何常用的药用载体 和 /或赋形剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 络合剂， 还可以含有 药用的防腐剂、 缓冲剂或局部麻醉剂等。 其制备方法采用常用方法制备。

本发明的制剂所采用的药学上可接受的载体选 自： 甘露醇、 山梨醇、 焦亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 硫代 硫酸钠、 盐酸半胱氨酸、 巯基乙酸、 蛋氨酸、 维生素 C、 EDTA二钠、 EDTA钙钠， 一价碱金属的碳酸盐、 醋酸盐、 磷酸盐或其水溶液、 盐酸、 醋酸、 硫酸、 磷酸、 氨基酸、 氯化钠、 氯化钾、 乳酸钠、 木糖醇、 麦 芽糖、 葡萄糖、 果糖、 右旋糖苷、 甘氨酸、 淀粉、 蔗糖、 乳糖、 甘露糖醇、 硅衍生物、 纤维素及其衍生物、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 甘油、 吐温 -80、 琼脂、 碳酸钙、 碳酸氢钙、 表面活性剂、 聚乙二醇、 环 糊精、 β-环糊精、 磷脂类材料、 高岭土、 滑石粉、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁等。 本发明的制剂在使用时根据病人的实际情况确 定用法用量， 可每日口服或注射给药 1〜3次， 每次 1〜 20剂。 本发明的有益效果为：

( 1 ) 本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊酰螺旋霉素 III具有良好的 抗菌性能。 根据现代药理学研究， 由于药物对映体的立体选择性的不同， 使其与各受体的亲和力不同而导 致药理作用发生很大差异， 因此本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 II、 左旋异戊酰螺 旋霉素 in具有很强的药理活性；

(2 ) 不同晶型的晶胞内分子在空间构型、 构象与排列不同， 使其溶解性存在显著差异， 导致制剂在 体内有不同的溶出速率， 直接影响制剂在体内的吸收、 分布、 排泄和代谢， 最终因其生物利用度不同而导 致临床药效的差异。 本发明对所制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体与左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II 或 III的疗效进行了比较， 发现本发明所制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体的疗效优于左旋异戊 酰螺旋霉素 I、 II或 ΙΠ;

( 3 ) 本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III单一组分的注射剂， 含有左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III晶体的单一组分的注射剂， 为临床危重病人或不宜口服给药的病人提供了 见效迅速、 易于接受的 用药剂型的可能性； (4 ) 本发明的含有左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II或 III单一组分的制剂， 含有左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II 或 III晶体的单一组分的制剂， 其生产工艺稳定、 质量标准易控， 适用于大规模工业化生产。 附图说明

图 1为实施例 1中左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III紫外触发收集所得的色谱图；

图 2为本发明实施例 1发酵过程的 pH值随时间的变化曲线图；

图 3为本发明实施例 2中发酵过程的 pH值随时间的变化曲线图；

图 4为本发明实施例 3中发酵过程的 pH值随时间的变化曲线图；

图 5 为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 I的 X-射线粉末衍射图谱；

图 6 为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 II的 X-射线粉末衍射图谱；

图 7 为本发明的左旋异戊酰螺旋霉素 III的 X-射线粉末衍射图谱。 以下具体实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例 1 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II和 III的分离制备

( 1 )生物发酵：将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195,在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、淀粉 3%、 CaCO ₃ 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上，于 pH6.5~7.5、温度 28~38°C 的条件下培养 8~15天， 接种于含有黄豆饼粉 1.5%、 淀粉 3.0%、 NaCl 0.4%、 CaC0 ₃ 0.5%、 鱼蛋白胨 0.3%和 KH ₂ P0 ₄ 0.05%的种子培养基， 于 pH6.5~7.5、 25~30°C的条件下培养 40 80小时， 以 0.1〜20% 接种量种入含有葡萄糖 0.5%、淀粉 6.0%、酵母粉 0.5%、鱼粉 2.0%、 NH ₄ N0 ₃ 0.6%、 NaCl 1.0%、 CaC0 ₃ 0.5%、 KH ₂ PO ₄ 0.05%、 MgSO ₄ 0.1%、 豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 于 pH6.5~7.5、 26-30°C 的条件下培养 72 120小时， 获得发酵液；

其中， 通过对培养、 发酵条件的调整和优化， 严格控制溶液的 pH值， 在 pH值 6.0〜9.0条件下 进行发酵， 在 pH值 6.0〜9.0的条件下进行发酵， 发酵时间为 120h， 且 pH值随时间的变化曲线呈三 个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0.1364 _Xl +6.0， 其中 0 < _Xl ≤22 ; 第二阶段满足方程式 y ₂ =-0.0735x ₂ +10.64, 其中 22≤x ₂ ≤56; 第三阶段满足方程式 y ₃ =0.0078x ₃ +6.06， 其中 56≤x ₃ ≤120， 曲线变 化如图 2所示， 获得发酵液。

(2 )生物发酵液的提取： 将步骤（1 )将得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.5， 用乙酸丁酯提 取， 乙酸丁酯提取液用无盐水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 分别洗涤， 再用 pH2.0水提取， 得水相提取液， 调 pH至 4.5， 挥发除去残余乙酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.5， 沉淀， 用纯化水进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素；

( 3 ) 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III纯化： 采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样 品进行纯化， 采 用 ODS制备色谱柱， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外谱图， 对 异戊酰螺旋霉素 I组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 II组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 III组分目标 峰进行收集：

色谱柱： ODS制备色谱柱；

流动相： 乙腈 (A)， lOOmM醋酸氨水溶液 (B); 梯度条件： 采用线性梯度 0~60分钟， A为 25%〜65%； 61〜90分钟， A为 65%〜90%；

流速： 260 mL/min;

进样量： 10mL;

进样浓度： 0.5g/mL;

检测波长： 231nm;

收集方式： 紫外触发收集；

按照异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT 44.759min, 收集的异戊酰螺旋霉素 I样品， 按照左旋异戊酰螺 旋霉素 II的保留时间 43.34min样品， 按照左旋异戊酰螺旋霉素 III的保留时间 48.009min收集样品； 分别采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏 状样品； 用石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 分别获得异戊酰螺旋霉素 I的白色粉末状固 体、 异戊酰螺旋霉素 II的白色粉末状固体、 异戊酰螺旋霉素 III的白色粉末状固体。 实施例 2·· 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 Π和 III的分离制备

( 1 )生物发酵：将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋酶素产生菌克隆 菌株 WSJ-195,在含有黄豆饼粉 2%、 葡萄糖 1%、 淀粉 3%、 CaC03 0.5%、 NaCl 0.4%和琼脂 2%的斜面培养基上， 于 pH7.2、 温度 32°C的 条件下培养 12天， 接种于含有黄豆饼粉 1.5%、 淀粉 3.0%、 NaCl 0.4%, CaC03 0.5%、鱼蛋白胨 0.3% 和 KH2P04 0.05%的种子培养基， 于 pH7.2、 27°C的条件下培养 70小时， 以 12%接种量种入含有葡萄 糖 0.5%、 淀粉 6.0%、 酵母粉 0.5%、 鱼粉 2.0%、 NH4N03 0.6% ^ NaCl 1.0%、 CaC03 0.5%、 KH2P04 0.05%、 MgSO4 0.1%、豆油 0.5%和消沫剂 0.02%的发酵培养基， 于 pH6.0~9.0、 26°C的条件下培养 100 小时， 获得发酵液； 在 pH值 6.0〜8.0的条件下进行发酵， 发酵时间为 110h， 且 pH值随时间的变化 曲线呈三个连续的阶段， 第一阶段满足方程式 _yi =0.0909 _Xl +6.4， 其中 0< _Xl <22; 第二阶段满足方程 式 y ₂ =-0.0441x ₂ +7.8， 其中 22<x ₂ <56; 第三阶段满足方程式 y ₃ =0.0078x ₃ +6.06， 其中 56≤x ₃ ≤110， 曲 线变化如图 3所示， 获得发酵液。 具体控制曲线见附图 3。

(2 )生物发酵液的提取： 将步骤（1 )得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.6， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.3水提取， 得水相提取液， 调 pH至 5.0， 挥发 除去残余乙酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.6， 沉淀， 用纯化水进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左 旋可利霉素。

( 3 ) 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III纯化： 采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样 品进行纯化， 采 用 ODS制备色谱柱， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外谱图， 对 左旋异戊酰螺旋霉素 I组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 II组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 III组分 目标峰进行收集：

色谱柱： ODS制备色谱柱；

流动相： 乙腈 (A)， lOOmM醋酸氨水溶液 (B);

梯度条件： 采用线性梯度 0~60分钟， A为 25%〜65%； 61〜90分钟， A为 65%〜90%；

流速： 260 mL/min;

进样量： 10mL;

进样浓度： 0.5g/mL; 检测波长： 231nm;

收集方式： 紫外触发收集；

按照左旋异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT 44.759min, 收集的左旋异戊酰螺旋霉素 I样品， 按照左旋 异戊酰螺旋霉素 II的保留时间 43.34min收集样品， 按照左旋异戊酰螺旋霉素 III的保留时间 48.009min收 集样品；

采分别采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得 膏状样品； 用石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 分别获得异戊酰螺旋霉素 I的白色粉末状 固体、 异戊酰螺旋霉素 II的白色粉末状固体、 异戊酰螺旋霉素 III的白色粉末状固体。 实施例 3 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III的分离制备

( 1 ) 培养发酵： 将含有 4"-异戊酰基转移酶基因的螺旋霉素产生菌克隆 菌株 WSJ-195, 在斜面培养基上培 养后， 将其接种于种子培养基， 培养后， 再将其接种于发酵培养基， 通过葡萄糖和枸橼酸控制发酵过 程， 在 pH值 6.0〜7.5的条件下进行发酵， 发酵时间为 115h， 且 pH值随时间的变化曲线呈三个连续的阶 段， 第一阶段满足方程式 =0.0682 ^+6.0， 其中 0< _Xl <22 _; 第二阶段满足方程式 y ₂ =-0.0294x ₂ +8.147， 其中 22<x ₂ <56; 第三阶段满足方程式 y ₃ =0.0078x ₃ +6.06， 其中 56<x ₃ < 115， 变化曲线如图 4， 获得发 酵液。

(2 )生物发酵液的提取： 将步骤（1 )得到的发酵液用硫酸铝处理得滤液， 调 pH至 8.6， 用乙酸丁酯提取， 乙酸丁酯提取液用无盐水及 l%NaH ₂ P0 ₄ 洗涤， 再用 pH2.3水提取， 得水相提取液， 调 pH至 5.0， 挥 发除去残余乙酸丁酯得水提取液， 过滤， 滤液调 pH8.6， 沉淀， 用纯化水进行淋洗， 得湿品， 干燥， 得左旋可利霉素。

(3 ) 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III纯化： 采用制备型高效液相色谱对初步分离得到的样 品进行纯化， 采 用 ODS制备色谱柱， 用乙腈和醋酸氨缓冲液进行梯度洗脱， 通过紫外检测， 记录分离的紫外谱图， 对左旋异戊酰螺旋霉素 I组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 II组分目标峰、 左旋异戊酰螺旋霉素 III 组分目标峰进行收集：

色谱柱： ODS制备色谱柱；

流动相： 乙腈 (A)， lOOmM醋酸氨水溶液 (B);

梯度条件： 采用线性梯度 0~60分钟， A为 25%〜65%； 61〜90分钟， A为 65%〜90%；

流速： 260 mL/min;

进样量： 10mL;

进样浓度： 0.5g/mL;

检测波长： 231nm;

收集方式： 紫外触发收集；

按照左旋异戊酰螺旋霉素 I的保留时间 RT 44.759min收集样品，按照左旋异戊酰螺旋霉素 II的保留时 间 43.34min收集样品， 按照左旋异戊酰螺旋霉素 III的保留时间 48.009min收集样品；

分别采用旋转蒸发除去乙腈， 然后用 1倍量乙酸乙酯萃取， 用旋转蒸发除去萃取液中乙酸乙酯， 得膏 状样品； 用石油醚重溶所得样品， 再用旋转蒸发除去石油醚， 分别获得异戊酰螺旋霉素 I的白色粉末状固 体、 异戊酰螺旋霉素 II的白色粉末状固体、 异戊酰螺旋霉素 III的白色粉末状固体。 实施例 4左旋异戊酰螺旋霉素 I注射用水针剂的制备

(1) 将异戊酰螺旋霉素 I lOOmg与等摩尔数的己二酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄明溶 液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 在无菌条件下灌封、 灭菌、 检査和包装。 实施例 5 异戊酰螺旋霉素 I注射用水针剂的制备

(1) 将异戊酰螺旋霉素 I lOOmg与等摩尔数的枸橼酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄明溶 液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 在无菌条件下灌封、 灭菌、 检査和包装。 实施例 6异戊酰螺旋霉素 I注射用水针剂的制备

(1) 将异戊酰螺旋霉素 I lOOmg与等摩尔数的马来酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄明溶 液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 在无菌条件下灌封、 灭菌、 检査和包装。 实施例 7 左旋异戊酰螺旋霉素 I注射用粉针剂的制备

(1) 将左旋异戊酰螺旋霉素 I lOOmg与等摩尔数的枸橼酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄 明溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 再加入甘露醇 30〜150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物,在 无菌条件下压盖、 检査和包装。 实施例 8 左旋异戊酰螺旋霉素 I注射用粉针剂的制备

(1) 将左旋异戊酰螺旋霉素 I lOOmg与等摩尔数的马来酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄 明溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 再加入甘露醇 30〜150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物,在 无菌条件下压盖、 检査和包装。 实施例 9 左旋异戊酰螺旋霉素 I注射用粉针剂的制备

(1) 将左旋异戊酰螺旋霉素 I lOOmg与等摩尔数的枸橼酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄 明溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤； (3) 再加入甘露醇 30〜150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物,在 无菌条件下压盖、 检査和包装。 实施例 10左旋异戊酰螺旋霉素 I片 （按 1000片计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 I 100g

低取代羟丙基纤维素 （5% ) 9.25g

羧甲基淀粉钠 （3%) 5.55g

硬脂酸镁 （1%) 1.85g

淀粉 总重-其它原辅料重量

总重 185g

制备工艺： 称取适量淀粉， 稀释至 15%浓度， 加热至糊状， 制成粘合剂； 主料可利霉素、 辅料淀粉、 低取代羟丙基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 硬脂酸镁分别过 100目筛， 按处方量， 称取所需主料和辅料； 左旋 异戊酰螺旋霉素 I、 淀粉、 低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后， 用 15%淀粉浓度的淀粉糊制成软材， 14 目筛制粒， 50-60°C干燥， 水份控制在 3-5%， 14目筛整粒， 加羧甲基淀粉钠， 硬脂酸镁混合， 测定颗粒含 量； 根据颗粒含量， 计算片重， 压片 （Φ9ιηιη浅凹冲头）， 检测片重差异； 经检验合格后进行包装。 实施例 11 左旋异戊酰螺旋霉素 I胶囊剂 （按 1000粒计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 I原粉 100g

淀粉 （药用） 108-左旋异戊酰螺旋霉素 I原粉重量

药用 3号胶囊 100粒

液体石蜡 5ml

制备工艺： 将主料左旋异戊酰螺旋霉素 I、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后， 装入混合器充分混 合后 1.5〜2小时； 取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致 （每粒胶囊所装重量约为 0.105g)， 将经检 验合格的药用 3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机� �作要求， 分别填入装料器进行填充， 将填充 好的胶囊进行差异检验 （±10%以内， <0.3g)， 溶出度符合要求， 将检验后符合要求的胶囊， 放入打光机 内加入液体石蜡进行 15-20分钟的打光， 然后取出进行成品包装盒检验。 实施例 12左旋异戊酰螺旋霉素 I糖衣片 （按 1000片计算）

处方： 同实施例 10。

制备工艺：按照实施例 11的方法操作，将检验合格后的片芯放入糖衣� ��中，将配好的糖浆（浓度为 65〜 70%)慢慢放入锅中， 然后将温度升至 40°C左右， 加入适量滑石粉， 鼓风干燥 25-30分钟反复几次粉衣层包 平后， 再进行糖衣层 15〜20分钟进行糖衣层包衣， 待糖衣层包平后进行所需色调的包衣层包衣， 将色浆调 好后放入糖浆中搅匀倒入锅内， 每次约 15〜20分钟， 分别几次搅拌均匀。 实施例 13 左旋异戊酰螺旋霉素 I糖浆 （按 1000袋计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 I原粉 125g

柠檬酸 （0.5%) (枸橼酸） 1.5g 蔗糖 总重 -其它原辅料

总重约 50g

色素 （姜黄素） 约 O. lg

制备工艺： 左旋异戊酰螺旋霉素 I原粉， 柠檬酸、 蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒 85%通过 300 目， 15%通过 180目， 然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合 1 1.5小时， 测其含量， 计算装量 （理 论装量为每袋 500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔 纸，按分装机操作要求分装，装量差异在 ±5% 以内， 装好后进行检验合格后外包装。 实施例 14 左旋异戊酰螺旋霉素 I肠溶片 （按 1000片计算）

处方： 参照实施例 10。

制备工艺： 片芯制备按实施例 5操作， 将符合要求的片芯放入糖衣锅中， 用 60~70%浓度的糖浆和滑石 粉进行底衣层包衣三层， 然后进行隔离层包衣， 加入 10%玉米朊酒精溶液， 滚转法 10 15分钟吹干， 再用苯 二甲酸二乙酯、 丙酮、邻苯二甲酸醋酸纤维、 酒精溶液， 即肠溶液滴入锅内， 滚转法 10 15分钟吹干 2~3次。 检验合格后， 按实施例 13进行糖衣包衣。 实施例 15 左旋异戊酰螺旋霉素 I胃溶片 （按 1000片计算）

处方： 参照实施例 10。

制备工艺： 片芯制备按实施例 11操作， 将符合要求的片芯放入高效包衣机中， 然后将符合标准的包衣 粉（包括脂溶性和水溶性） 按要求配制成包衣液， 再将包衣液放入胶体磨粉碎、 过滤待用。 将装好片芯的 高效包衣锅预热， 转速控制在 5~10转 /分， 温度控制在 45~60°C， 用气雾喷头（>300目）将包衣孔液喷入锅 内， 然后干燥 25~35分钟， 反复进行 8-12次， 直至包匀， 晾干检验合格后包装。 实施例 16 左旋异戊酰螺旋霉素 I颗粒剂 （按 1000袋计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 I原粉 125g

糖粉 2000g

糊精 900g

5%PVP-K30 适量

制备工艺： 左旋异戊酰螺旋霉素 I 原粉、糖粉、糊精过 120目筛， 按处方量称取左旋异戊酰螺旋霉素 I、 糖粉、 糊精混合均匀， 将混合均匀的上述物料用 5%PVP-K30胶浆制成软材， 摇摆式颗粒剂制粒 70°C干燥、 整粒， 送检合格后分装。 实施例 17 左旋异戊酰螺旋霉素 Π注射用水针剂的制备

(1) 将异戊酰螺旋霉素 II lOOmg与等摩尔数的己二酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄明 溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 在无菌条件下灌封、 灭菌、 检査和包装。 实施例 18 左旋异戊酰螺旋霉素 II注射用水针剂的制备

(1) 将异戊酰螺旋霉素 II lOOmg与等摩尔数的枸橼酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄明 溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 在无菌条件下灌封、 灭菌、 检査和包装。 实施例 19 左旋异戊酰螺旋霉素 II注射用粉针剂的制备

(1) 将左旋异戊酰螺旋霉素 II lOOmg与等摩尔数的枸橼酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色 澄明溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 再加入甘露醇 30〜150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物,在 无菌条件下压盖、 检査和包装。 实施例 20左旋异戊酰螺旋霉素 II片 （按 1000片计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 II 100g

低取代羟丙基纤维素 （5%) 9.25g

羧甲基淀粉钠 （3% ) 5.55g

硬脂酸镁 （1%) 1.85g

淀粉 总重-其它原辅料重量

总重 185g

制备工艺： 称取适量淀粉， 稀释至 15%浓度， 加热至糊状， 制成粘合剂； 主料可利霉素、 辅料淀粉、 低取代羟丙基纤维素、 羧甲基淀粉钠、 硬脂酸镁分别过 100目筛， 按处方量， 称取所需主料和辅料； 左旋 异戊酰螺旋霉素 II、 淀粉、 低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后， 用 15%淀粉浓度的淀粉糊制成软材， 14 目筛制粒， 50-60°C干燥， 水份控制在 3-5%， 14目筛整粒， 加羧甲基淀粉钠， 硬脂酸镁混合， 测定颗粒含 量； 根据颗粒含量， 计算片重， 压片 （Φ9ιηιη浅凹冲头）， 检测片重差异； 经检验合格后进行包装。 实施例 21 左旋异戊酰螺旋霉素 II胶囊剂 （按 1000粒计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 II原粉 100g

淀粉 （药用） 108g-左旋异戊酰螺旋霉素 II原粉重量

药用 3号胶囊 100粒

液体石蜡 5ml

制备工艺： 将主料左旋异戊酰螺旋霉素 II、 辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后， 装入混合器充分 混合后 1.5〜2小时； 取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致 （每粒胶囊所装重量约为 0.105g)， 将经 检验合格的药用 3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机� �作要求， 分别填入装料器进行填充， 将填 充好的胶囊进行差异检验 （±10%以内， <0.3g)， 溶出度符合要求， 将检验后符合要求的胶囊， 放入打光 机内加入液体石蜡进行 15-20分钟的打光， 然后取出进行成品包装盒检验。 实施例 22异戊酰螺旋霉素 III注射用水针剂的制备

(1) 将异戊酰螺旋霉素 III lOOmg与等摩尔数的马来酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色澄明 溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 在无菌条件下灌封、 灭菌、 检査和包装。 实施例 23 左旋异戊酰螺旋霉素 III注射用粉针剂的制备

(1) 将左旋异戊酰螺旋霉素 III lOOmg与等摩尔数的马来酸混合均匀， 溶解于 l〜5ml蒸熘水中， 得到淡黄色 澄明溶液， pH为 4.6〜5.6。

(2) 在步骤 （1 ) 所配制好的溶液中加入溶液体积 0.1%的活性炭， 过滤；

(3) 再加入甘露醇 30〜150mg作为冻干支撑剂， 低温快速冷冻 9h后， 冷冻干燥， 获得淡黄色疏松块状物,在 无菌条件下压盖、 检査和包装。 实施例 24 左旋异戊酰螺旋霉素 III胶囊剂 （按 1000粒计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 III原粉 100g

淀粉 （药用） 108g-左旋异戊酰螺旋霉素 III原粉重量

药用 3号胶囊 100粒

液体石蜡 5ml

制备工艺： 将主料左旋异戊酰螺旋霉素 III、 辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后， 装入混合器充分 混合后 1.5〜2小时； 取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致 （每粒胶囊所装重量约为 0.105g)， 将经 检验合格的药用 3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机� �作要求， 分别填入装料器进行填充， 将填 充好的胶囊进行差异检验 （±10%以内， <0.3g)， 溶出度符合要求， 将检验后符合要求的胶囊， 放入打光 机内加入液体石蜡进行 15-20分钟的打光， 然后取出进行成品包装盒检验。 实施例 25 左旋异戊酰螺旋霉素 III糖浆 （按 1000袋计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 III原粉 125g

柠檬酸 （0.5%) (枸橼酸） 1.5g

蔗糖 总重 -其它原辅料

总重约 50g

色素 （姜黄素） 约 O. lg

制备工艺：左旋异戊酰螺旋霉素 III原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机 粉碎成颗粒 85%通过 300 目， 15%通过 180目， 然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合 1 1.5小时， 测其含量， 计算装量 （理 论装量为每袋 500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔 纸，按分装机操作要求分装，装量差异在 ±5% 以内， 装好后进行检验合格后外包装。 实施例 26 左旋异戊酰螺旋霉素 III颗粒剂 （按 1000袋计算）

处方： 左旋异戊酰螺旋霉素 III原粉 125g 糖粉 2000g

糊精 900g

5%PVP-K30 适』

制备工艺： 左旋异戊酰螺旋霉素 III 原粉、 糖粉、 糊精过 120目筛， 按处方量称取左旋异戊酰螺旋霉素 III、 糖粉、 糊精混合均匀， 将混合均匀的上述物料用 5%PVP-K30胶浆制成软材， 摇摆式颗粒剂制粒 70°C干 燥、 整粒， 送检合格后分装。 实施例 27

将实施例 1中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法：

1. 先将实施例 1 中得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的混 合溶剂中， 所用混合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 10： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2.5 倍； 加入纯水的速度为 4ml/分钟； 加入纯水时的搅拌速度为 30转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 5°C， 降温的速度为每小时 1 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 10转 /分钟； 得 到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2Θ为 7.6°、 8.0°、 10.0°、 11.4°、 16.4°、 17.0°、 17.5°、 17.9°、 19.5°、 22.7°、 23.7°和 24.4°显示有特征峰， 其

X-射线粉末衍射图谱如图 5所示。 实施例 28

将实施例 1中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 I化合物固体溶解于乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混 合溶剂中乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 10： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为乙酸乙酯、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 9 倍； 加入纯水的速度为 10ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 15 °C， 降温的速度为每小时 3 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与图 5相似。 实施例 29左旋异戊酰螺旋霉素 I 晶体化合物的注射用水针剂的制备

取实施例 27制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I 晶体化合物制备注射用水针剂， 制备方法同前。 实施例 30 左旋异戊酰螺旋霉素 I 晶体化合物注射用粉针剂的制备

取实施例 28制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I 晶体化合物制备注射用粉针剂， 制备方法同前。 实施例 31 左旋异戊酰螺旋霉素 I 晶体化合物的片剂的制备

取实施例 27制备的左旋异戊酰螺旋霉素 I 晶体化合物制备片剂， 制备方法同前。 实施例 32

将实施例 1中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法：

1. 先将实施例 1中得到的左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水� ��酮的混合 溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 10： 1；

2. 然后加入纯水，边加入边搅拌，所加入的纯水 的体积为无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮体积 之和的 2.5 倍； 加入纯水的速度为 4ml/分钟； 加入纯水时的搅拌速度为 30转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 5°C， 降温的速度为每小时 1 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 10转 /分钟； 得 到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2Θ 为 10.0°、 11.6°、 16.4°、 17.3°、 19.1°、 21.2°、 22.1°、 22.7°、 26.4°、 26.9°、 27.5°和 31.5°显示有特征峰， 其 X-射线粉末衍射图谱如附图 6所示。 实施例 33

将实施例 1中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法：

1.先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合溶 剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 10： 0.8；

2.然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、无水乙醇和 无水丙酮体积之和的 9倍； 加入纯水的速度为 10ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分钟；

3.纯水加完后降温至 15°C， 降温的速度为每小时 3 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 10转 /分钟； 得 到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 6相似。 实施例 34

将实施例 2中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合 溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 5： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 7.5 倍； 加入纯水的速度为 6ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 40转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 10 °C， 降温的速度为每小时 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 6相似。 实施例 35

将实施例 3中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合 溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 3： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 7.5 倍； 加入纯水的速度为 8ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 45转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 2.5°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 20转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 6相似。 实施例 36

将实施例 3中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 II化合物固体溶解于无甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的混合溶剂中， 所用混合 溶剂中无水甲醇、 无水丙酮和无水乙醇的体积比为 1 : 6： 0.8；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 5 倍； 加入纯水的速度为 7ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 1.2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 5相似。 实施例 37 左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的注射用水针剂的制备

取实施例 34制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备注射用水针剂， 制备方法同前。 实施例 38 左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的注射用水针剂的制备

取实施例 33制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备注射用水针剂， 制备方法同前。 实施例 39 左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物注射用粉针剂的制备

取实施例 36制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备注射用粉针剂， 制备方法同前。 实施例 40左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物注射用粉针剂的制备

取实施例 35制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备注射用粉针剂， 制备方法同前。 实施例 41 左旋异戊酰螺旋霉素 Π晶体化合物的片剂的制备

取实施例 36制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备片剂， 制备方法同前。 实施例 42 左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的胶囊剂的制备

取实施例 32制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备胶囊剂， 制备方法同前。 实施例 43 左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物的颗粒剂的制备

取实施例 33制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物制备颗粒剂， 制备方法同前。 实施例 44

将实施例 1中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 in晶体化合物的制备方法：

1. 先将实施例 1中得到的左旋异戊酰螺旋霉素 III化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水 丙酮的混合 溶剂中， 所用混合溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 10： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 2.5 倍； 加入纯水的速度为 4ml/分钟； 加入纯水时的搅拌速度为 30转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 5°C， 降温的速度为每小时 1 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 10转 /分钟； 得 到左旋异戊酰螺旋霉素 in晶体化合物。

将制备得到的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射在 2Θ 为 8.0°、 10.0°、 11.2°、 11.7°、 16.4°、 19.1°、 19.6°、 20.0°、 21.4°、 22.9°、 23.6°和 29.4°显示有特征峰， 其 X-射线粉末衍射图谱如附图 7所示。 实施例 45

将实施例 2中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 in化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水� ��酮的混合溶剂中， 所用混合 溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 10： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 9 倍； 加入纯水的速度为 10ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 60转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 15 °C， 降温的速度为每小时 3 °C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 10转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 7相似。 实施例 46

将实施例 2中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 in化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水� ��酮的混合溶剂中， 所用混合 溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 5： 0.8；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 7.5 倍； 加入纯水的速度为 6ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 40转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 10 °C， 降温的速度为每小时 2°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 15转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 7相似。 实施例 47

将实施例 3中制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III白色粉末状固体进一步制备成晶体。

左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的制备方法：

1. 先将左旋异戊酰螺旋霉素 in化合物固体溶解于无甲醇、无水乙醇和无水� ��酮的混合溶剂中， 所用混合 溶剂中无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮的体积比为 1 : 2： 1；

2. 然后加入纯水， 边加入边搅拌， 所加入的纯水的体积为无水甲醇、 无水乙醇和无水丙酮体积之和的 7.5 倍； 加入纯水的速度为 8ml/分钟； 所加入纯水的搅拌速度为 45转 /分钟；

3. 纯水加完后降温至 12°C， 降温的速度为每小时 2.5°C， 降温的同时继续搅拌， 搅拌速度为 20转 /分钟； 得到左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物。

该左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物使用 Cu-Κα射线测量得到的 X-射线粉末衍射图谱与附图 7相似。 实施例 48 左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的注射用水针剂的制备

取实施例 44制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物制备注射用水针剂， 制备方法同前。 实施例 49 左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物注射用粉针剂的制备

取实施例 45制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物制备注射用粉针剂， 制备方法同前。 实施例 50左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的片剂的制备

取实施例 46制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物制备片剂， 制备方法同前。 实施例 51 左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物的胶囊剂的制备

取实施例 47制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物制备胶囊剂， 制备方法同前。 实验例 1 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III的急性毒性试验

一、 试验方法：

小鼠、 大鼠口服给药 (实施例 1制得的左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III)

小鼠和大鼠试验前观察 2天， 动物未见异常者进行试验。 试验前小鼠和大鼠禁食过夜。 根据预试结 果， 试验药分别给小鼠和大鼠灌胃给药 4000mg/kg， 未见动物死亡。 本试验按 4000mg/kg分别给小鼠和大 鼠灌胃给药， 小鼠按 100mg/ml， 灌胃容量为 0.6-0.8ml/只； 大鼠按 173mg/ml, 灌胃容量 0.8〜1.0ml/50克。 灌胃给药后观察一周的动物毒性反应和死亡数 。

二、 试验结果见表 1、 表 2

表 1. 试验药小鼠口服急性毒性 (LD _5< 试验药 剂量 (mg kg) 动物数 （只） 死亡动物数 （只） 死亡率 （％) LD ₅₀ (mg kg) 左旋异戊 I 4000 20 35 >4000

左旋异戊 II 4000 20 35 >4000

左旋异戊 III 4000 20 35 >4000

表 2. 试验药大鼠口服急性毒性 (LD ₅₍ Q

试验药 剂量 (mg kg) 动物数 （只） 死亡动物数 （只） 死亡率 （％) LD ₅₀ (mg/kg) 左旋异戊 I 4500 20 15 >4500

左旋异戊 II 4500 20 15 >4500

左旋异戊 III 4500 20 15 >4500 对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋 霉素 I、 II、 in或左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III制剂也 进行了相同的试验， 其获得的结果相似。 实验例 2左旋异戊酰螺旋霉素 I及其晶体的体内药效

试验方法： 感染菌液制备： 将 -80°C冰箱保存的试验菌液取出放在室温 lh左右， 然后将肺炎链球菌、 化脓性链球菌、肠球菌吸取 0.1ml菌液分别接种于 2ml MH汤中（加 10%灭活马血清）， 金葡菌也按上述方 法接种 0.1ml菌液于 2ml MH汤中， 置 37°C孵箱中培养 18h后为原菌液， 用 5%胃膜素稀释原菌液， 使动 物感染 100%致死菌数作为感染菌液。

可利霉素的临床用药途径拟为口服， 因此可利霉素试验选择灌胃给药。 左旋异戊酰螺旋霉素 I (实施 例 1制得）、 左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体 （实施例 27制备） 采用肌肉注射给药。

将小鼠腹腔注射 0.5ml致死菌量后动物出现活动明显减少、静卧� ��毛松等症状。感染后分别在 0.5〜6h 每一只小鼠灌胃一次 0.2ml， 无任何不良反应。 观察七日动物死亡数， 用 Bliss 程序， 分别计算各药对小鼠 感染后的半数保护剂量 （ED ₅ 。)， 与各药物比较保护效果。

体内试验结果：

表 3 : 5种抗生素对小鼠腹腔感染 6株链球菌的疗效比较

异戊 I 0.03 9.51 异戊 I晶体 0.03 8.65 可利霉素 0.03 10.06 肺炎链球菌 18 9.6X104

阿奇霉素 0.06 14.87 乙酰螺旋霉素 0.06 37.93 红霉素 0.06 57.08 异戊 I 0.06 13.86 异戊 I晶体 0.06 12.82 可利霉素 0.12 16.02 肺炎链球菌 57 8.8X104

阿奇霉素 0.12 19.02 乙酰螺旋霉素 1 398.01 红霉素 0.25 102.33 异戊 I 0.06 26.15 异戊 I晶体 0.06 23.37 化脓性 可利霉素 0.12 26.30

6.9X103

链球菌 772 阿奇霉素 0.25 46.89 乙酰螺旋霉素 0.25 98.11 红霉素 0.5 101.33 异戊 I 0.12 66.40 异戊 I晶体 0.12 60.99 化脓性 可利霉素 0.25 87.84

7.8X104

链球菌 102 阿奇霉素 0.5 159.06 乙酰螺旋霉素 0.5 227.07 红霉素 0.5 361.01 异戊 I 0.12 57.25 异戊 I晶体 0.12 54.58 化脓性 可利霉素 0.25 68.48

4.9X104

链球菌 119 阿奇霉素 0.25 68.48 乙酰螺旋霉素 0.5 117.53 红霉素 0.5 233.72 表 4: 5种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的� �比较

异戊 I 0. 5 23. 54

异戊 I晶体 0. 5 21. 33

可利霉素 0. 5 31. 98

金葡菌 16 5. 2 X 103

阿奇霉素 0. 5 31. 98

乙酰螺旋霉素 1 43. 58

红霉素 1 82. 36

异戊 I 0. 5 24. 40

异戊 I晶体 0. 5 22. 26

可利霉素 0. 5 31. 50

金葡菌 76 5. 8 X 104

阿奇霉素 1 58. 79

乙酰螺旋霉素 1 66. 63

红霉素 1 64. 17

异戊 I 1 110. 24

异戊 I晶体 1 107. 46

可利霉素 2 120. 35

金葡菌 12 4. 8 X 104

阿奇霉素 2 120. 35

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 256 266. 11

异戊 I 0. 5 42. 67

异戊 I晶体 0. 5 38. 00

可利霉素 1 59. 30

金葡菌 21 4. 2 X 104

阿奇霉素 4 142. 99

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 4 213. 67 体内试验结果：

异戊酰螺旋霉素 I对小鼠感染 12株细菌的疗效见表 3和表 4， 显示有良好的保护效果； 而异戊酰螺旋 霉素 I晶体化合物对小鼠感染 12株细菌显示出更加优良的保护效果。

对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋 霉素 I、 左旋异戊酰螺旋霉素 I晶体或含有左旋异戊酰 螺旋霉素 I或其晶体的制剂也进行了相同的试验， 其获得的结果相似。 实验例 3: 左旋异戊酰螺旋霉素 II及其晶体化合物的体内药效

采用实施例 1制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II， 以及实施例 36制备的左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合 物， 试验方法同实验例 2。

体内试验结果见表 5和表 6:

表 5: 5种抗生素对小鼠腹腔感染 6株链球菌的疗效比较 异戊 Π 0.12 8.99 异戊 II晶体 0.12 7.69 可利霉素 0.12 10.41 肺炎链球菌 ₃ 6.4x l0 ⁴

阿奇霉素 0.12 18.29 乙酰螺旋霉素 0.5 66.96 红霉素 1 85.08 异戊 Π 0.03 8.98 异戊 II晶体 0.03 8.09 可利霉素 0.03 10.06 肺炎链球菌 ₁₈ 9.6x l0 ⁴

阿奇霉素 0.06 14.87 乙酰螺旋霉素 0.06 37.93 红霉素 0.06 57.08 异戊 Π 0.06 13.10 异戊 II晶体 0.06 12.04

8.8x l0 ⁴ 可利霉素 0.12 16.02 肺炎链球菌 ₅₇

阿奇霉素 0.12 19.02 乙酰螺旋霉素 1 398.01 红霉素 0.25 102.33 异戊 Π 0.06 24.61 异戊 II晶体 0.06 21.90 化脓性 可利霉素 0.12 26.30

6.9x l0 ³

链球菌 772 阿奇霉素 0.25 46.89 乙酰螺旋霉素 0.25 98.11 红霉素 0.5 101.33 异戊 Π 0.12 63.21 异戊 II晶体 0.12 58.00 化脓性 7.8x l0 ⁴ 可利霉素 0.25 87.84 链球菌 102 阿奇霉素 0.5 159.06 乙酰螺旋霉素 0.5 227.07 红霉素 0.5 361.01 异戊 Π 0.12 52.77 异戊 II晶体 0.12 49.94 化脓性 4.9x l0 ⁴ 可利霉素 0.25 68.48 链球菌 119 阿奇霉素 0.25 68.48 乙酰螺旋霉素 0.5 117.53 红霉素 0.5 233.72 表 6 : 5种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的� �比较

攻击量 MIC ED ₅₀ 试验菌 药物

(CFU/0. 5ml/鼠） ( μ g/ml) (mg/kg) 异戊 II 0. 25 70. 16

异戊 II晶体 0. 25 56. 16

可利霉素 0. 5 89. 29

肠球菌 5. 4 X 10 ⁴

阿奇霉素 1 146. 51

乙酰螺旋霉素 1 130. 34

红霉素 2 175. 23

异戊 II 0. 25 20. 87

异戊 II晶体 0. 25 16. 18

5. 2 X 10 ³ 可利霉素 0. 5 31. 98

金葡菌

阿奇霉素 0. 5 31. 98

乙酰螺旋霉素 1 43. 58

红霉素 1 82. 36

异戊 II 0. 25 22. 26

异戊 II晶体 0. 25 18. 71

可利霉素 0. 5 31. 50

金葡菌 5. 8 X 10 ⁴

阿奇霉素 1 58. 79

乙酰螺旋霉素 1 66. 63

红霉素 1 64. 17

异戊 II 1 108. 04

异戊 II晶体 1 104. 67

4. 8 X 10 ⁴ 可利霉素 2 120. 35

金葡菌

阿奇霉素 2 120. 35

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 256 266. 11

异戊 II 0. 5 38. 90

异戊 II晶体 0. 5 36. 09

4. 2 X 10 ⁴ 可利霉素 1 59. 30

金葡菌

阿奇霉素 4 142. 99

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 4 213. 67 体内试验结果：

异戊酰螺旋霉素 II晶体化合物对小鼠感染 12株细菌的疗效见表 13和表 14， 显示有良好的保护效果， 并优于异戊酰螺旋霉素 II化合物。

对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋 霉素 II晶体化合物或左旋异戊酰螺旋霉素 II晶体化合 物的制剂也进行了相同的试验， 其获得的结果相似。 实验例 4 ： 左旋异戊酰螺旋霉素 III及其晶体化合物的体内药效

采用实施例 1制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III和实施例 45制备的左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物， 试验方法同实验例 2。

体内试验结果见表 7和表 8 :

表 7: 5种抗生素对小鼠腹腔感染 6株链球菌的疗效比较 攻击量 MIC ED ₅ „ 试验菌 药 物

(CFU/0.5ml/鼠） (μ g/ml) (mg/kg) 异戊 III 0.12 8.99 异戊 ΠΙ晶体 0.12 6.45 可利霉素 0.12 10.41 肺炎链球菌 6.4X10 ⁴

阿奇霉素 0.12 18.29 乙酰螺旋霉素 0.5 66.96 红霉素 1 85.08 异戊 III 0.03 8.98 异戊 ΠΙ晶体 0.03 8.68 可利霉素 0.03 10.06 肺炎链球菌 ₁₈ 9.6X10 ⁴

阿奇霉素 0.06 14.87 乙酰螺旋霉素 0.06 37.93 红霉素 0.06 57.08 异戊 II 0.06 13.10 异戊 II晶体 0.06 11.08

8.8X10 ⁴ 可利霉素 0.12 16.02 肺炎链球菌 ₅₇

阿奇霉素 0.12 19.02 乙酰螺旋霉素 1 398.01 红霉素 0.25 102.33 异戊 III 0.06 24.61 异戊 ΠΙ晶体 0.06 22.81 化脓性 可利霉素 0.12 26.30

6.9X10 ³

链球菌 阿奇霉素 0.25 46.89 乙酰螺旋霉素 0.25 98.11 红霉素 0.5 101.33 异戊 III 0.12 63.21 异戊 ΠΙ晶体 0.12 52.91 化脓性 7.8X10 ⁴ 可利霉素 0.25 87.84 链球菌 阿奇霉素 0.5 159.06 乙酰螺旋霉素 0.5 227.07 红霉素 0.5 361.01 异戊 III 0.12 52.77 异戊 ΠΙ晶体 0.12 49.94 化脓性 4.9X10 ⁴ 可利霉素 0.25 68.48 链球菌 阿奇霉素 0.25 68.48 乙酰螺旋霉素 0.5 117.53 红霉素 0.5 233.72 表 8: 5种抗生素对小鼠腹腔感染肠球菌和金葡菌的� �比较 攻击量 MIC ED ₅ „

试验菌 药 物

(CFU/0.5ml/鼠） (μ g/ml) (mg/kg)

异戊 III 0.25 70.16

异戊 ΠΙ晶体 0.25

可利霉素 0.5 89.29

肠球菌 5.4X10 ⁴

阿奇霉素 1 146.51

乙酰螺旋霉素 1 130.34

红霉素 2 175.23

异戊 III 0.25 20.87

异戊 ΠΙ晶体 0.25 19.29

5.2X10 ³ 可利霉素 0.5 31.98

金葡菌

阿奇霉素 0.5 31.98

乙酰螺旋霉素 1 43.58

红霉素 1 82.36

异戊 III 0.25 22.26

异戊 ΠΙ晶体 0.25 18.71

可利霉素 0.5 31.50

金葡菌 5.8X10 ⁴

阿奇霉素 1 58.79

乙酰螺旋霉素 1 66.63

红霉素 1 64.17

异戊 III 1 108.04

∞

异戊 ΠΙ晶体 1 105.24

4.8X10 ⁴ 可利霉素 2 120.35

金葡菌

阿奇霉素 2 120.35

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 256 266.11

异戊 III 0.5 38.90

异戊 ΠΙ晶体 0.5 36.09

4.2X10 ⁴ 可利霉素 1 59.30

金葡菌

阿奇霉素 4 142.99

乙酰螺旋霉素 2048 >500

红霉素 4 213.67 体内试验结果：

异戊酰螺旋霉素 III晶体化合物对小鼠感染 12株细菌的疗效见表 7和表 8， 显示有良好的保护效果， 并优于异戊酰螺旋霉素 III化合物。

对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋 霉素 III晶体化合物或左旋异戊酰螺旋霉素 III晶体化合 物的制剂也进行了相同的试验， 其获得的结果相似。 实验例 5 体外药效实验：

一、 临床分离菌的测定： 试验方法：采用平皿二倍稀释法：将熔化琼脂 培养基定量倒入含系列药物浓度的平皿内与药 液混匀（链 球菌和肠球菌加入 5%去纤维羊血做成血培基、 流感杆菌加入 7%、 淋球菌用淋球菌培养基加入 7%去纤维 羊血做成巧克力培基）， 待凝固后， 再将新鲜培养菌液稀释成 10 ⁶ CFU/mL,用多点接种仪接种于含抗菌药物 的平皿琼脂上，经 37°C培养 18h;淋球菌置 5%C0 ₂ 培养箱中孵育 24h;军团菌置 5%C0 ₂ 培养箱中培养 48h; 厌氧菌置厌氧箱内， 37°C厌氧培养 48h。 观察抗菌药抑制细菌生长的最低浓度即为最低 抑菌浓度 （MIC)， 并计算药物 MIC ₅ 。和 MIC ₉ 。与对照药比较。

附注： MIC ₅ 。抑制 50%细菌生长最低的抑菌浓度；

MIC ₉ 。抑制 90%细菌生长最低的抑菌浓度。

试验结果见表 9:

表 9 ： 异戊酉 fe螺旋霉素 I、 II、 III与其他抗生素 1 床分离菌敏感分布的比较

MIC范围 （μ MICso MIC90

菌种及株数 药物

g/ml ) ( μ g/ml ) ( μ g/ml )

异戊 I 0. 005- >32 0. 12 2

异戊 II 0. 005- >32 0. 12 2

异戊 i n 0. 005- >64 0. 12 4

肺炎链球菌

可利霉素 0. 005- >64 0. 12 4

( 112 )

阿奇霉素 0. 005- >64 0. 25 8

乙酰螺旋霉素 0. 005- >64 0. 12 >64

红霉素 0. 005- >64 0. 25 64

异戊 I 0. 06- >32 0. 25 32

异戊 II 0. 06- >32 0. 25 32

异戊 i n 0. 06- >32 0. 25 32

化脓性链球菌

可利霉素 0. 06- >64 0. 25 64

(93 )

阿奇霉素 0. 25- >64 0. 5 >64

乙酰螺旋霉素 0. 005- >64 0. 25 >64

红霉素 0. 06- >64 0. 5 >64

异戊 I 0. 12->32 1 32

异戊 II 0. 12->32 1 16

异戊 i n 0. 12- >64 2 64

肠球菌

可利霉素 0. 5- >64 2 64

( 106 )

阿奇霉素 0. 25- >64 8 >64

乙酰螺旋霉素 0. 12- >64 4 >64

红霉素 0. 5- >64 4 >64

异戊 I 0. 06- >64 1 64

异戊 II 0. 06- >64 1 32

异戊 i n 0. 06- >64 2 32

金葡菌

可利霉素 0. 06- >64 2 64

丄 )

阿奇霉素 0. 5- >64 2 >64

乙酰螺旋霉素 0. 12- >64 64 >64

红霉素 0. 12- >64 1 >64

表葡菌 异戊 I 0. 12->32 1 32

( 115 ) 异戊 II 0. 12->64 1 64 异戊 I I I 0. 12->32 1 32

可利霉素 0. 12- >64 2 >64

阿奇霉素 0. 12- >64 8 >64

乙酰螺旋霉素 0. 03- >64 64 >64

红霉素 0. 06- >64 8 >64

异戊 I 0. 03-32 0. 12 1

异戊 II 0. 03-32 0. 12 1

异戊 I I I 0. 03-32 0. 12 1

流感杆菌

可利霉素 0. 03-32 0. 12 1

(37 )

阿奇霉素 0. 03- >64 0. 25 2

乙酰螺旋霉素 0. 03- >64 0. 12 4

红霉素 0. 03- >64 0. 06 32

异戊 I 0. 12-16 1 4

异戊 II 0. 12-16 1 4

异戊 i n 0. 12-16 1 4

淋球菌

可利霉素 0. 12-16 2 8

( 10 )

阿奇霉素 0. 12-64 2 8

乙酰螺旋霉素 0. 12-64 4 8

红霉素 0. 12-64 1 8

二、 体外抗沙眼衣原体和肺炎衣原体的测定

试验方法：

1. 将 HEp-2和 McCoy细胞系分别种植在 96孔细胞培养板 （Costar公司） 内， 37°C， 5 %C0 ₂ 培养 48 小时成为单层细胞。

2. 将待接种菌种稀释为 10000 20000 ifu (包涵体形成单位） /ml, 0.1ml/孔接种。 沙眼衣原体血清型 B/TW-5/OT, D/UW-3/Cx接种 McCoy细胞培养板， 肺炎衣原体 CWL-029接种 HEp-2细胞培养板。 首先吸 去 96孔培 ¾内的细胞培养液， 然后按 0.1ml/孔进行接种。其中 Al 1〜D11的 4个孔， C12和 D12的 2个孔不接种菌 种。

3. 菌种接种完毕离心 96 ¾ffl胞培 ¾， 使用 Beckman-Coulter公司的 J-6MC 离心机， 离心力 xl500g， 离 心温度 35°C， 离心时间 60分钟。

4. 离心完毕后， 吸取接种的沙眼衣原体或肺炎衣原体， 分别加入系列稀释的 4种抗生素药物， 0.1ml/ 孔。

5. 37°C， 5 %C0 ₂ 培养， 沙眼衣原体药敏试验板培养 48小时， 肺炎衣原体药敏试验板培养 72小时。 培养完毕， 吸取抗生素药物溶液， PBS (0.01M, pH 7.4) 洗涤 2次， 100%甲醇室温固定 15分钟。

6. 间接免疫荧光染色鉴定： 沙眼及肺炎衣原体药敏试验板分别加入纯化的 抗沙眼衣原体单克隆抗体 (N54克隆） 和肺炎衣原体单克隆抗体 （P33克隆）， 50μ1/孔， 37°C湿盒内温育 30分钟， 然后洗板机洗板

4次， 再加入兔抗鼠荧光抗体（Sigma公司）， 50μ1/孔， 同样方法及条件温育及洗板。加入封片甘油， ΙΟΟμΙ/ 孔， 在 Nikon倒置荧光显微镜 (Diaphot-200)下观察结果。

7. MIC的定义： 96孔试验板中沙眼衣原体或肺炎衣原体包涵体� ��长完全被抑制孔 （全孔未发现荧光 染色的包涵体） 的最小抗生素稀释浓度。

表 10: 5种大环内脂类抗生素对沙眼及肺炎衣原体体� �作用的最小抑菌浓度的比较 （MIC) 异戊 ic实施 异戊 lie实施 异戊 m实 可利霉素 乙酰螺旋霉 红霉素 阿奇霉素 例 1制得） 例 1制得） 施例 1制得） 素（AT-SPM) (EM) (AM) 沙眼衣原体 0.25 g/ml 0.25 g/ml 0.25 g/ml 0.25 g/ml 4 g/ml

B/TW-5/OT

沙眼衣原体 0.25 g/ml 0.25 g/ml 0.25 g/ml 0.25 g/ml 2 g/ml 0.25 g/ml DUW-3/Cx

肺炎衣原体 0.016 g/ml 0.016 g/ml 0.016 g/ml ≤0.016 g

CWL-029 /ml 1

1、 对于沙眼血清型 B/TW-5/OT, 异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III优于可利霉素、 红霉素、 阿奇霉素， 乙酰螺旋 霉素 （MIC为 4 g/ml) 较差。

2、 对于沙眼血清型 D/UW-3/Cx, 异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III和可利霉素、 阿奇霉素体外作用类似， MIC 为 0.25 g/ml， 属敏感； 红霉素 （0.5 g/ml) 其次， 乙酰螺旋霉素 （MIC为 2 g/ml) 较差。

3、 对于肺炎衣原体 CWL-029,异戊 II和红霉素体外作用最敏感， MIC≤0.016 g/ml， 阿奇霉素和可利霉素、 异戊 I、 异戊 III较敏感； 乙酰螺旋霉素 （MIC为 0.5 g/ml) 较差。

4、 总体来看异戊酰螺旋霉素对衣原体的效果优于 其他试验药物。

三、 体外抗解脲支原体和肺炎支原体

1、 试验方法： 在无菌 12孔细胞培养板各孔加入 U-PPLO 0.8ml (菌液对照孔加入 0.9ml， 培养基对照孔 加入 1.0ml)。

2、 在各实验孔中加入 10 ⁴ CCU/ml的 Uu菌液 0.1ml, 孔中的最终菌量为 10 ³ CCU/ml (培养基对照孔不加菌 液）。

3、 分三组 （100μ _§ /ιη1、 10μ _§ /ιηΚ l g/ml抗生素原液） 按照二倍递降浓度梯度用无菌 Tip向各实验孔加入 实验用抗生素： ΙΟΟμΙ, 50μ1， 25μ1， 12.5μ1。 （菌液对照孔、 培养基对照孔不加抗生素， 同时设抗生素 对照孔）

4、 上述各孔混匀， 培养版用胶带封口， 放 37°C温箱培养。

5、 于实验后 17-24h观察记录 Uu生长情况。 当 Uu菌液对照孔呈现阳性生长时， 此时能抑制 Uu生长的最 低抗生素浓度为该药样的最低 MIC， 实验结束时的 MIC为最终 MIC (24h)。

对抗解脲支原体和肺炎支原体菌株进行 MIC测定， 进行 4次测定， 结果显示如下：

异戊 I的 MIC值为 0.025〜0.125 g/ml,

异戊 II的 MIC值为 0.025〜0.125 g/ml，

异戊 III的 MIC值为 0.025〜0.125 g/ml，

可利霉素 0.025〜0.125 g/ml，

乙酰螺旋霉素 0.5μΕ/ιη1，

红霉素 5 g/ml，

阿奇霉素 0.025〜0.125 g/ml。

上述结果表明， 异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III、 可利霉素有良好的抗 Uu作用， 与阿奇霉素作用相似， 优 于乙酰螺旋霉素， 红霉素在本组药样中抗 Uu作用效果最差。 对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋 霉素 I、 π、 in或左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III制剂 也进行了相同的试验， 其获得的结果相似。 实验例 4 左旋异戊酰螺旋霉素 I、 Π、 III临床试验

左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III (实施例 1制得)、 阿奇霉素治疗敏感菌引起的成人急性呼吸道感 染包括 急性细菌性咽炎、 化脓性扁桃体炎、 急性气管 -支气管炎、 轻症肺炎等的疗效和安全性。

采用多中心、 随机、 双盲、 双模拟对照试验。 在 5家医院按统一临床试验方案同时进行。

一、 受试者入选标准

1、 年龄为 18 65岁的成年男女患者；

2、 敏感菌引起的急性呼吸道感染包括急性细菌性 咽炎、 急性化脓性扁桃体炎、 急性气管 -支气管炎、 轻症 肺炎和急性鼻窦炎等；

3、 入选前必须签署知情同意书；

4、 所有受试者在研究期间及给药后至少 3个月内实施避孕。

二、 受试者排除标准

1、 有肝、 肾功能不全者 （血 Cr>1.5mg/dl ALT>正常上限）；

2、 妊娠期或哺乳期妇女；

3、 有胃肠道疾患无法口服药物者；

4、 入选本试验前一周内曾服过抗菌药者；

5、 有长期酗酒史者。

试验结果经过统计学专家统计， 临床疗效 （FAS ) 为：

异戊 I、 异戊 II、 异戊 III、 阿奇霉素的疗效分别为 92.30%、 92.30%、 92.30%、 89.61%。

细菌清除率为：

异戊 I、 异戊 II、 异戊 III、 阿奇霉素的细菌清除率分别为： 97.56%、 97.56%、 97.56%、 92.86%。

不良反应为：

异戊 I、 异戊 II、 异戊 III、 阿奇霉素的不良反应分别为 2.5%、 2.5%、 2.5%、 7.6%。

通过临床试验表明， 异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III是安全有效的抗感染类新药。 对本发明其它实施例所制备的左旋异戊酰螺旋 霉素 I、 II、 III或左旋异戊酰螺旋霉素 I、 II、 III制剂也 进行了相同的试验， 其获得的结果相似。