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Patent Searching and Data


Title:
LIPOSOME COMPRISING GULURONIC ACID OLIGOSACCHARIDE, PREPARATION METHOD, AND USE THEREOF FOR PROMOTING IMMUNE ACTIVITY
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2021/184405
Kind Code:
A1
Abstract:
A liposome comprising a guluronic acid oligosaccharide, and a preparation method thereof. The liposome is prepared from a guluronic acid oligosaccharide, lecithin, cholesterol and Tween 80. The liposome suspension undergoes an ultrasonic treatment and homogenization treatment during the preparation process. The prepared liposome comprising the guluronic acid oligosaccharide has good stability, small particle size, high encapsulation rate, and has an effect of promoting immune activity.

Inventors:
XU XU (CN)
YANG PENG (CN)
BI DECHENG (CN)
YAO LIJUN (CN)
LI MEITING (CN)
CAO JUE (CN)
LI WENHAO (CN)
FU PAN (CN)
LIN YUE (CN)
HUANG XUSHENG (CN)
Application Number:
PCT/CN2020/081269
Publication Date:
September 23, 2021
Filing Date:
March 26, 2020
Export Citation:
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Assignee:
UNIV SHENZHEN (CN)
International Classes:
A61K9/127; A61K31/715; A61K47/24; A61K47/26; A61K47/28; A61P37/04
Foreign References:
CN104814929A2015-08-05
CN103536534A2014-01-29
Attorney, Agent or Firm:
SHENZHEN TALENT PATENT SERVICE (CN)
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Claims:
权利 要 求 书

[权利要求 1] 一种古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 其特征在于, 由古罗糖醛酸低聚糖、 脂质体膜、 吐温 80组成, 古罗糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1 : (9-11 ) , 古罗糖醛酸低聚糖与吐温 80的质量比为 1: (3. 5-4. 5)

; 所述脂质体膜由卵磷脂和胆固醇组成, 脂质体膜中胆固醇的含量为 18-22%。

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 其特征在于, 古罗 糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1: 10, 古罗糖醛酸低聚糖与吐 温 80的质量比为 1: 4; 脂质体膜中胆固醇的含量为 20%。

[权利要求 3] 一种如权利要求 1所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特 征在于, 包括以下步骤:

51、 将卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中, 然后除去有机溶剂, 形成脂 质体膜; 将古罗糖醛酸低聚糖和吐温 80溶于去离子水中, 形成糖溶液; 所述糖 溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 4. 5-5. 5 mg/mL, 吐温 80的浓度 为 18-22 mg/mL;

52、 将糖溶液转移至盛装脂质体膜的容器中, 使脂质体膜悬浮在糖溶 液中, 得到脂质体悬液;

53、 对脂质体悬液进行超声处理, 得到超声悬液;

54、 对超声悬液进行均质处理, 得到溶于水中的古罗糖醛酸低聚糖脂 质体。

[权利要求 4] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S1中, 所述糖溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 5 mg/mL, 吐温 80的浓度为 20 mg/mL。

[权利要求 5] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S1中, 所述有机溶剂为无水乙醇。

[权利要求 6] 根据权利要求 5所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S1中, 通过减压蒸发除去有机溶剂。 [权利要求 7] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S3中, 在室温下对脂质体悬液进行水浴超声, 超声频率为 20-30 kHz, 超声时间为 13-17 min

[权利要求 8] 根据权利要 7所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征在 于, 步骤 S3中, 超声时间为 15 min

[权利要求 9] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S4中, 脂质体悬液用高压均质机均质 3 min, 设置压强为 60-80 Mpa

[权利要求 10] 一种如权利要求 1所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的促免疫活性的用 途。

Description:
一种 古罗 糖醛 酸低 聚糖 脂质 体 、 其制备 方法 、 其促 免疫 活性 的用 途 技术领域

[0001] 本申请是以申请号为 202010185114. 3、 申请日为 2020年 3月 16日的中国专利申 请为基础, 并主张其优先权, 该申请的全部内容在此作为整体引入本申请中 。

[0002] 技术领域

[0003] 本申请属于医药制剂技术领域, 具体涉及一种古罗糖醛酸低聚糖脂质体、 其制 备方法、 其促免疫活性的用途。

[0004] 背景技术

[0005] 古罗糖醛酸低聚糖 (Polyguluronate, PG) 主要是由褐藻胶通过分级处理得到 的, 它是由多个 a -L-古罗糖醛酸 (G) 通过 a -1, 4糖苷键连接而成的糖链。 褐 藻胶具有特殊的生理、 生化特性, 如无毒、 稳定性、 抗肿瘤和增强免疫活性等 , 近年来受到广泛关注, 但其高黏性限制了其功能的发挥, 将褐藻胶经过分级 处理, 得到的低聚糖的生物活性显著提高, 并可产生新的生物活性。 但褐藻胶 低聚糖价格较高, 因此提高古罗糖醛酸低聚糖的生物利用度尤为 重要。

[0006] 脂质体是由具有双亲性的磷脂分子分散于水中 自发形成的闭合囊泡, 具有亲水 性和疏水性, 既能包埋水溶性物质又能包埋脂溶性物质, 是一种特殊型载体。 为了增加脂质体膜的流动性, 在脂质体的制备过程中往往会加入胆固醇, 胆固 醇能够调节脂质体双分子层膜的流动性, 在一定程度上能促进药物包封, 并提 高其稳定性。 脂质体作为一种新型药物载体, 能够增强药物的稳定性和靶向性 , 提高药物的生物利用度, 降低药物的毒副作用, 延长药物在体内的循环时间 , 达到药物控释缓释的目的。

[0007] 申请内容

[0008] 本申请针对古罗糖醛酸低聚糖的生物利用度有 待进一步提高的问题, 提供一种 稳定性好、 粒径小、 包封率高的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 及该种古罗糖醛酸 低聚糖脂质体的制备方法, 以及该古罗糖醛酸低聚糖脂质体促免疫活性的 用途 [0009] 为实现上述目的, 本申请采用以下技术方案。

[0010] 本申请的第一方面, 提供一种古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 由古罗糖醛酸低聚糖 、 脂质体膜、 吐温 80组成, 古罗糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1: (9-11

) , 古罗糖醛酸低聚糖与吐温 80的质量比为 1: (3. 5-4. 5) ; 所述脂质体膜由 卵磷脂和胆固醇组成, 脂质体膜中胆固醇的含量为 18-22%。

[0011] 优选的, 古罗糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1: 10, 古罗糖醛酸低聚糖 与吐温 80的质量比为 1: 4; 脂质体膜中胆固醇的含量为 20%。

[0012] 本申请的另一方面, 提供以上所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制 备方法, 包 括以下步骤:

[0013] S1、 将卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中, 然后除去有机溶剂, 形成脂质体膜。

[0014] 优选的, 所述有机溶剂为无水乙醇。

[0015] 更优选的, 通过减压蒸发除去有机溶剂。

[0016] 将古罗糖醛酸低聚糖和吐温 80溶于去离子水中, 形成糖溶液; 所述糖溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 4. 5-5. 5 mg/mL, 吐温 80的浓度为 18-22 mg/mL。

[0017] 优选的, 所述糖溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 5 mg/mL, 吐温 80的浓度 为 20 mg/mL。

[0018] S2、 将糖溶液转移至盛装脂质体膜的容器中, 使脂质体膜悬浮在糖溶液中, 得 到脂质体悬液。

[0019] S3、 对脂质体悬液进行超声处理, 得到超声悬液。

[0020] 优选的, 在室温下对脂质体悬液进行水浴超声, 超声频率为 20-30 kHz, 超声 时间为 13-17 min。

[0021] 更优选的, 超声时间为 15 min。

[0022] S4、 对超声悬液进行均质处理, 得到溶于水中的古罗糖醛酸低聚糖脂质体。

[0023] 优选的, 脂质体悬液用高压均质机均质 3 min, 设置压强为 60-80 Mpa。

[0024] 更优选的, 脂质体悬液用高压均质机均质时设置压强为 80 Mpa。

[0025] 优选的, 上述溶于水中的古罗糖醛酸低聚糖脂质体保存 于 4 ° C的环境中。

[0026] 本申请的再一方面, 提供以上所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体促免 疫活性的用 途。

[0027] 本申请所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体具有促 免疫活性的作用, 具有用于促免 疫活性的用途, 可应用于促免疫活性药物、 食品等产品的制备。

[0028] 与现有技术相比, 本申请的有益效果是:

[0029] 本申请通过将所述质量比的古罗糖醛酸低聚糖 、 卵磷脂、 胆固醇和吐温 80制作 成脂质体, 尤其是制备过程中对形成的脂质体悬液进行超 声处理和均质处理时 , 通过控制超声处理的温度、 时间、 频率及均质的压强和时间, 所制备的古罗 糖醛酸低聚糖脂质体形态良好, 呈球形, 稳定性好, 粒径小, 包封率较高, 古 罗糖醛酸低聚糖脂质体的包封率为 68. 26 土 2. 11%, 粒径为 45. 69 ±3. 6 nm。 本 申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体具有促免 疫活性的作用。

[0030] 附图说明

[0031] 图 1为吸光度对古罗糖醛酸低聚糖含量的标准曲 图;

[0032] 图 2为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径 布图;

[0033] 图 3为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的扫描 镜图;

[0034] 图 4为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体储藏稳 性的结果;

[0035] 图 5为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体温度稳 性结果;

[0036] 图 6为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体 pH稳定性结果;

[0037] 图 7为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠 核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细 胞活力的影响;

[0038] 图 8为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对 RAW264. 7细胞分泌 N0的影响。

[0039] 具体实施方式

[0040] 为了更充分的理解本申请的技术内容, 下面结合具体实施例对本申请的技术方 案作进一步介绍和说明。

[0041] 实验材料及试剂

[0042] 卵磷脂、 胆固醇、 吐温 80购于上海麦克林生化公司; 无水乙醇购于广东光华科 技股份有限公司; 小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 购于美国模式培养保藏所; 高糖 DMEM培养基、 青霉素、 链霉素、 胎牛血清、 脂多糖 (LPS) 购于 Gibco公司 ; 磺胺、 萘基乙烯基二胺购于上海生工生物工程股份有 限公司。 [0043] 二、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备

[0044] 本申请所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体及其制 备方法, 具体如下: 称取 4 g卵 磷脂和 1 g胆固醇溶于 40 mL无水乙醇中, 待完全溶解后转移至 500 mL圆底烧瓶 中, 60 ° (:水浴减压蒸发除去有机溶剂, 形成脂质体膜。 称取 0. 5 g古罗糖醛酸 低聚糖和 2 g吐温 80, 加去离子水定容至 100 mL, 形成糖溶液。 将糖溶液转移到 圆底烧瓶中, 继续旋转洗膜至瓶壁上的薄膜完全脱落, 形成脂质体悬液。 将得 到的脂质体悬液在室温下超声 15 min (超声频率 20-30 kHz) , 得到超声悬液。 将超声悬液用高压均质机 (80 Mpa) 处理 3 min, 得到溶于水中的古罗糖醛酸低 聚糖脂质体。 制备所得溶液置于 4 ° (:冰箱保存备用。

[0045] 三、 标准曲线的制作

[0046] 称取 100 mg的古罗糖醛酸低聚糖, 加去离子水定容至 100 mL, 作为标准溶液, 备用。 取 8支试管并编号, 向 1至 7号管中加 1 mL去离子水, 第 8号管中加入 2 mL 标准溶液, 并从中吸取 1 mL加入到第 7号管, 以此类推, 1号管为去离子水。 向 所有试管中加入 0. 5 mL 5%苯酚溶液, 再加入 2. 5 mL浓硫酸溶液, 沸水浴 20 min , 冷却到室温后, 490 nm波长下测其吸光度。 以吸光度为横坐标, 糖浓度为纵 坐标, 作图, 标准曲线图如图 1所示。

[0047] 四、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体包封率测定

[0048] 将 1 mL古罗糖醛酸低聚糖脂质体稀释 10倍后, 取 3 mL稀释液加入到超滤管中 ( 截留分子量: 30000 Da) , 8000 rpm, 4 ° C, 离心 10 min, 利用硫酸苯酷法分 别测定超滤管内外溶液中的糖含量 (W ^ W 。 根据下面公式计算古罗糖醛 酸低聚糖脂质体包封率:

[0049] 包封率 (%) = (1-W外 /W总) X 100 % (W总=评外 +W 内)

[0050] 本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的包封率为 68. 26±2. 11%。

[0051] 五、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体粒径测定

[0052] 将 1 mL古罗糖醛酸低聚糖脂质体稀释 5倍后, 利用纳米激光粒度分析仪测定其 粒径和多分散指数 (PDI) , 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径 分布 图如图 2所示。 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径 为 45. 69±3. 6 nm [0053] 六、 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体扫描电 镜图

[0054] 将制备好的古罗糖醛酸低聚糖脂质体稀释 10倍后, 滴加到铜网上, 待自然风干 后, 利用扫描电镜观察脂质体形貌特征, 图 3为本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖 脂质体的扫描电镜图。

[0055] 七、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体储藏稳定性

[0056] 将古罗糖醛酸低聚糖脂质体放置于 4 ° C的环境中。 取放置不同天数的古罗糖醛 酸低聚糖脂质体, 稀释 5倍后, 利用纳米激光粒度分析仪测定其粒径, 以粒径作 为评价脂质体稳定性指标。 图 4为本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体储 稳 定性的结果。

[0057] 储藏时间对本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂 质体稳定性影响结果如图 4所示 , 随着储藏时间延长, 古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径逐渐增大, 这是因为脂 质体是热力学不稳定体系, 容易聚集和降解。 由图可知, 前 12天, 古罗糖醛酸 低聚糖脂质体粒径增加较快, 但 12天后, 粒径基本稳定, 可见本申请制备的古 罗糖醛酸低聚糖脂质体稳定性较好。

[0058] 八、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体温度稳定性

[0059] 取 3 mL本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 分别置于 15 mL

4、 20、 37、 55和 80 ° C的水溶液中, 100 rpm水浴 2 h, 测定脂质体的粒径, 本 申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体温度稳定 性结果如图 5所示。

[0060] 温度对古罗糖醛酸低聚糖脂质体的稳定性结果 如图 5所示, 从图中可以看出, 随着温度升高, 脂质体粒径越大, 4 ° C时脂质体粒径最小, 表明 4 ° C下脂质体 最稳定。

[0061] 九、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体 pH稳定性

[0062] 取 3 mL本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 分别置于 15 ml pH=2. 5、 5. 0 、 7. 0和 8. 5的 0. 01 mol/L的 PBS ( 150 mM NaCL) 缓冲液中, 室温处理 2 h, 测定 脂质体的粒径, 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体 pH稳定性结果如图 6所示

[0063] pH对古罗糖醛酸低聚糖脂质体稳定性的影响如 6所示, 酸性条件下对脂体粒 径影响较大, 在 pH=7. 0时, 质体粒径最小, 表明在中性条件下, 古罗糖醛酸低 聚糖脂质体稳定性好, 因此, 古罗糖醛酸低聚糖脂质体应保存在中性环境中 。 [0064] 十、 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠 单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细胞活力的影响

[0065] 将 RAW264. 7细胞接种于 96孔板中, 每孔细胞数为 2 X 10 5 个, 贴壁培养 2_6 h后 , 弃去上清, 分别加入 0. 1、 0. 5、 1. 0 mg/mL的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 培养 24 h, 之后每孔加入 10 y LCCK-8试剂 , 孵育 1 h后, 用酶标仪检测在波长 450 nm下的吸光值。 本申请制备的古罗糖醛 酸低聚糖脂质体对小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细胞活力的影响如图 7所示。 [0066] 古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细胞活力的影响结 果如图 7所示, 与对照组相比, 甚至高达 1 mg/mL的古罗糖醛酸低聚糖脂质体溶 液, 对 RAW264. 7细胞活力均无明显影响。

[0067] 十一、 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠 单核巨噬细胞 (RAW264. 7 ) 分泌 N0的影响

[0068] 将 RAW264. 7细胞接种于 96孔板中, 每孔细胞数为 2 X 10 5 个, 贴壁培养 2_6 h后 , 弃去上清, 分别加入 0. 1、 0. 5、 1. 0 mg/mL的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 培养 24 h o 利用 Griess法检测细胞培养液中 NO 2 - 的含量, 间接获得 N0的生成量。 具体操 作如下: 从每孔培养基上清液中吸取 50 y L细胞悬液, 加入 50 y L磺胺试剂反 应 5 min, 再加入 50 y L萘基乙烯基二胺试剂, 避光孵育 5 min, 然后用酶标仪 检测 545 nm波长下的吸光值。 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对 RAW264. 7细胞分 泌 N0的影响如图 8所示。

[0069] 古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 分泌 N0的影响如图 8所示, 古罗糖醛酸低聚糖脂质体能够促进 RAW264. 7细胞分泌 N0, 呈浓度依赖性 , 且效果要优于同浓度的古罗糖醛酸低聚糖。

[0070] 以上所述仅以实施例来进一步说明本申请的技 术内容, 以便于读者更容易理解 , 但不代表本申请的实施方式仅限于此, 任何依本申请所做的技术延伸或再创 造, 均受本申请的保护。 发明 概述 技术 问题 问题 的解决方 案 发明 的有益效 果