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CN104814929A | 2015-08-05 | |||
CN103536534A | 2014-01-29 |
权利 要 求 书 [权利要求 1] 一种古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 其特征在于, 由古罗糖醛酸低聚糖、 脂质体膜、 吐温 80组成, 古罗糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1 : (9-11 ) , 古罗糖醛酸低聚糖与吐温 80的质量比为 1: (3. 5-4. 5) ; 所述脂质体膜由卵磷脂和胆固醇组成, 脂质体膜中胆固醇的含量为 18-22%。 [权利要求 2] 根据权利要求 1所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 其特征在于, 古罗 糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1: 10, 古罗糖醛酸低聚糖与吐 温 80的质量比为 1: 4; 脂质体膜中胆固醇的含量为 20%。 [权利要求 3] 一种如权利要求 1所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特 征在于, 包括以下步骤: 51、 将卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中, 然后除去有机溶剂, 形成脂 质体膜; 将古罗糖醛酸低聚糖和吐温 80溶于去离子水中, 形成糖溶液; 所述糖 溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 4. 5-5. 5 mg/mL, 吐温 80的浓度 为 18-22 mg/mL; 52、 将糖溶液转移至盛装脂质体膜的容器中, 使脂质体膜悬浮在糖溶 液中, 得到脂质体悬液; 53、 对脂质体悬液进行超声处理, 得到超声悬液; 54、 对超声悬液进行均质处理, 得到溶于水中的古罗糖醛酸低聚糖脂 质体。 [权利要求 4] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S1中, 所述糖溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 5 mg/mL, 吐温 80的浓度为 20 mg/mL。 [权利要求 5] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S1中, 所述有机溶剂为无水乙醇。 [权利要求 6] 根据权利要求 5所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S1中, 通过减压蒸发除去有机溶剂。 [权利要求 7] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S3中, 在室温下对脂质体悬液进行水浴超声, 超声频率为 20-30 kHz, 超声时间为 13-17 min [权利要求 8] 根据权利要 7所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征在 于, 步骤 S3中, 超声时间为 15 min [权利要求 9] 根据权利要求 3所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备方法, 其特征 在于, 步骤 S4中, 脂质体悬液用高压均质机均质 3 min, 设置压强为 60-80 Mpa [权利要求 10] 一种如权利要求 1所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的促免疫活性的用 途。 |
[0001] 本申请是以申请号为 202010185114. 3、 申请日为 2020年 3月 16日的中国专利申 请为基础, 并主张其优先权, 该申请的全部内容在此作为整体引入本申请中 。
[0002] 技术领域
[0003] 本申请属于医药制剂技术领域, 具体涉及一种古罗糖醛酸低聚糖脂质体、 其制 备方法、 其促免疫活性的用途。
[0004] 背景技术
[0005] 古罗糖醛酸低聚糖 (Polyguluronate, PG) 主要是由褐藻胶通过分级处理得到 的, 它是由多个 a -L-古罗糖醛酸 (G) 通过 a -1, 4糖苷键连接而成的糖链。 褐 藻胶具有特殊的生理、 生化特性, 如无毒、 稳定性、 抗肿瘤和增强免疫活性等 , 近年来受到广泛关注, 但其高黏性限制了其功能的发挥, 将褐藻胶经过分级 处理, 得到的低聚糖的生物活性显著提高, 并可产生新的生物活性。 但褐藻胶 低聚糖价格较高, 因此提高古罗糖醛酸低聚糖的生物利用度尤为 重要。
[0006] 脂质体是由具有双亲性的磷脂分子分散于水中 自发形成的闭合囊泡, 具有亲水 性和疏水性, 既能包埋水溶性物质又能包埋脂溶性物质, 是一种特殊型载体。 为了增加脂质体膜的流动性, 在脂质体的制备过程中往往会加入胆固醇, 胆固 醇能够调节脂质体双分子层膜的流动性, 在一定程度上能促进药物包封, 并提 高其稳定性。 脂质体作为一种新型药物载体, 能够增强药物的稳定性和靶向性 , 提高药物的生物利用度, 降低药物的毒副作用, 延长药物在体内的循环时间 , 达到药物控释缓释的目的。
[0007] 申请内容
[0008] 本申请针对古罗糖醛酸低聚糖的生物利用度有 待进一步提高的问题, 提供一种 稳定性好、 粒径小、 包封率高的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 及该种古罗糖醛酸 低聚糖脂质体的制备方法, 以及该古罗糖醛酸低聚糖脂质体促免疫活性的 用途 [0009] 为实现上述目的, 本申请采用以下技术方案。
[0010] 本申请的第一方面, 提供一种古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 由古罗糖醛酸低聚糖 、 脂质体膜、 吐温 80组成, 古罗糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1: (9-11
) , 古罗糖醛酸低聚糖与吐温 80的质量比为 1: (3. 5-4. 5) ; 所述脂质体膜由 卵磷脂和胆固醇组成, 脂质体膜中胆固醇的含量为 18-22%。
[0011] 优选的, 古罗糖醛酸低聚糖与脂质体膜的质量比为 1: 10, 古罗糖醛酸低聚糖 与吐温 80的质量比为 1: 4; 脂质体膜中胆固醇的含量为 20%。
[0012] 本申请的另一方面, 提供以上所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制 备方法, 包 括以下步骤:
[0013] S1、 将卵磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中, 然后除去有机溶剂, 形成脂质体膜。
[0014] 优选的, 所述有机溶剂为无水乙醇。
[0015] 更优选的, 通过减压蒸发除去有机溶剂。
[0016] 将古罗糖醛酸低聚糖和吐温 80溶于去离子水中, 形成糖溶液; 所述糖溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 4. 5-5. 5 mg/mL, 吐温 80的浓度为 18-22 mg/mL。
[0017] 优选的, 所述糖溶液中, 古罗糖醛酸低聚糖的浓度为 5 mg/mL, 吐温 80的浓度 为 20 mg/mL。
[0018] S2、 将糖溶液转移至盛装脂质体膜的容器中, 使脂质体膜悬浮在糖溶液中, 得 到脂质体悬液。
[0019] S3、 对脂质体悬液进行超声处理, 得到超声悬液。
[0020] 优选的, 在室温下对脂质体悬液进行水浴超声, 超声频率为 20-30 kHz, 超声 时间为 13-17 min。
[0021] 更优选的, 超声时间为 15 min。
[0022] S4、 对超声悬液进行均质处理, 得到溶于水中的古罗糖醛酸低聚糖脂质体。
[0023] 优选的, 脂质体悬液用高压均质机均质 3 min, 设置压强为 60-80 Mpa。
[0024] 更优选的, 脂质体悬液用高压均质机均质时设置压强为 80 Mpa。
[0025] 优选的, 上述溶于水中的古罗糖醛酸低聚糖脂质体保存 于 4 ° C的环境中。
[0026] 本申请的再一方面, 提供以上所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体促免 疫活性的用 途。
[0027] 本申请所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体具有促 免疫活性的作用, 具有用于促免 疫活性的用途, 可应用于促免疫活性药物、 食品等产品的制备。
[0028] 与现有技术相比, 本申请的有益效果是:
[0029] 本申请通过将所述质量比的古罗糖醛酸低聚糖 、 卵磷脂、 胆固醇和吐温 80制作 成脂质体, 尤其是制备过程中对形成的脂质体悬液进行超 声处理和均质处理时 , 通过控制超声处理的温度、 时间、 频率及均质的压强和时间, 所制备的古罗 糖醛酸低聚糖脂质体形态良好, 呈球形, 稳定性好, 粒径小, 包封率较高, 古 罗糖醛酸低聚糖脂质体的包封率为 68. 26 土 2. 11%, 粒径为 45. 69 ±3. 6 nm。 本 申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体具有促免 疫活性的作用。
[0030] 附图说明
[0031] 图 1为吸光度对古罗糖醛酸低聚糖含量的标准曲 图;
[0032] 图 2为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径 布图;
[0033] 图 3为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的扫描 镜图;
[0034] 图 4为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体储藏稳 性的结果;
[0035] 图 5为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体温度稳 性结果;
[0036] 图 6为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体 pH稳定性结果;
[0037] 图 7为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠 核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细 胞活力的影响;
[0038] 图 8为本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对 RAW264. 7细胞分泌 N0的影响。
[0039] 具体实施方式
[0040] 为了更充分的理解本申请的技术内容, 下面结合具体实施例对本申请的技术方 案作进一步介绍和说明。
[0041] 实验材料及试剂
[0042] 卵磷脂、 胆固醇、 吐温 80购于上海麦克林生化公司; 无水乙醇购于广东光华科 技股份有限公司; 小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 购于美国模式培养保藏所; 高糖 DMEM培养基、 青霉素、 链霉素、 胎牛血清、 脂多糖 (LPS) 购于 Gibco公司 ; 磺胺、 萘基乙烯基二胺购于上海生工生物工程股份有 限公司。 [0043] 二、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体的制备
[0044] 本申请所述的古罗糖醛酸低聚糖脂质体及其制 备方法, 具体如下: 称取 4 g卵 磷脂和 1 g胆固醇溶于 40 mL无水乙醇中, 待完全溶解后转移至 500 mL圆底烧瓶 中, 60 ° (:水浴减压蒸发除去有机溶剂, 形成脂质体膜。 称取 0. 5 g古罗糖醛酸 低聚糖和 2 g吐温 80, 加去离子水定容至 100 mL, 形成糖溶液。 将糖溶液转移到 圆底烧瓶中, 继续旋转洗膜至瓶壁上的薄膜完全脱落, 形成脂质体悬液。 将得 到的脂质体悬液在室温下超声 15 min (超声频率 20-30 kHz) , 得到超声悬液。 将超声悬液用高压均质机 (80 Mpa) 处理 3 min, 得到溶于水中的古罗糖醛酸低 聚糖脂质体。 制备所得溶液置于 4 ° (:冰箱保存备用。
[0045] 三、 标准曲线的制作
[0046] 称取 100 mg的古罗糖醛酸低聚糖, 加去离子水定容至 100 mL, 作为标准溶液, 备用。 取 8支试管并编号, 向 1至 7号管中加 1 mL去离子水, 第 8号管中加入 2 mL 标准溶液, 并从中吸取 1 mL加入到第 7号管, 以此类推, 1号管为去离子水。 向 所有试管中加入 0. 5 mL 5%苯酚溶液, 再加入 2. 5 mL浓硫酸溶液, 沸水浴 20 min , 冷却到室温后, 490 nm波长下测其吸光度。 以吸光度为横坐标, 糖浓度为纵 坐标, 作图, 标准曲线图如图 1所示。
[0047] 四、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体包封率测定
[0048] 将 1 mL古罗糖醛酸低聚糖脂质体稀释 10倍后, 取 3 mL稀释液加入到超滤管中 ( 截留分子量: 30000 Da) , 8000 rpm, 4 ° C, 离心 10 min, 利用硫酸苯酷法分 别测定超滤管内外溶液中的糖含量 (W ^ W 。 根据下面公式计算古罗糖醛 酸低聚糖脂质体包封率:
[0049] 包封率 (%) = (1-W外 /W总) X 100 % (W总=评外 +W 内)
[0050] 本申请的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的包封率为 68. 26±2. 11%。
[0051] 五、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体粒径测定
[0052] 将 1 mL古罗糖醛酸低聚糖脂质体稀释 5倍后, 利用纳米激光粒度分析仪测定其 粒径和多分散指数 (PDI) , 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径 分布 图如图 2所示。 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径 为 45. 69±3. 6 nm [0053] 六、 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体扫描电 镜图
[0054] 将制备好的古罗糖醛酸低聚糖脂质体稀释 10倍后, 滴加到铜网上, 待自然风干 后, 利用扫描电镜观察脂质体形貌特征, 图 3为本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖 脂质体的扫描电镜图。
[0055] 七、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体储藏稳定性
[0056] 将古罗糖醛酸低聚糖脂质体放置于 4 ° C的环境中。 取放置不同天数的古罗糖醛 酸低聚糖脂质体, 稀释 5倍后, 利用纳米激光粒度分析仪测定其粒径, 以粒径作 为评价脂质体稳定性指标。 图 4为本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体储 稳 定性的结果。
[0057] 储藏时间对本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂 质体稳定性影响结果如图 4所示 , 随着储藏时间延长, 古罗糖醛酸低聚糖脂质体的粒径逐渐增大, 这是因为脂 质体是热力学不稳定体系, 容易聚集和降解。 由图可知, 前 12天, 古罗糖醛酸 低聚糖脂质体粒径增加较快, 但 12天后, 粒径基本稳定, 可见本申请制备的古 罗糖醛酸低聚糖脂质体稳定性较好。
[0058] 八、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体温度稳定性
[0059] 取 3 mL本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 分别置于 15 mL
4、 20、 37、 55和 80 ° C的水溶液中, 100 rpm水浴 2 h, 测定脂质体的粒径, 本 申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体温度稳定 性结果如图 5所示。
[0060] 温度对古罗糖醛酸低聚糖脂质体的稳定性结果 如图 5所示, 从图中可以看出, 随着温度升高, 脂质体粒径越大, 4 ° C时脂质体粒径最小, 表明 4 ° C下脂质体 最稳定。
[0061] 九、 古罗糖醛酸低聚糖脂质体 pH稳定性
[0062] 取 3 mL本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 分别置于 15 ml pH=2. 5、 5. 0 、 7. 0和 8. 5的 0. 01 mol/L的 PBS ( 150 mM NaCL) 缓冲液中, 室温处理 2 h, 测定 脂质体的粒径, 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体 pH稳定性结果如图 6所示
[0063] pH对古罗糖醛酸低聚糖脂质体稳定性的影响如 6所示, 酸性条件下对脂体粒 径影响较大, 在 pH=7. 0时, 质体粒径最小, 表明在中性条件下, 古罗糖醛酸低 聚糖脂质体稳定性好, 因此, 古罗糖醛酸低聚糖脂质体应保存在中性环境中 。 [0064] 十、 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠 单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细胞活力的影响
[0065] 将 RAW264. 7细胞接种于 96孔板中, 每孔细胞数为 2 X 10 5 个, 贴壁培养 2_6 h后 , 弃去上清, 分别加入 0. 1、 0. 5、 1. 0 mg/mL的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 培养 24 h, 之后每孔加入 10 y LCCK-8试剂 , 孵育 1 h后, 用酶标仪检测在波长 450 nm下的吸光值。 本申请制备的古罗糖醛 酸低聚糖脂质体对小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细胞活力的影响如图 7所示。 [0066] 古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 细胞活力的影响结 果如图 7所示, 与对照组相比, 甚至高达 1 mg/mL的古罗糖醛酸低聚糖脂质体溶 液, 对 RAW264. 7细胞活力均无明显影响。
[0067] 十一、 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠 单核巨噬细胞 (RAW264. 7 ) 分泌 N0的影响
[0068] 将 RAW264. 7细胞接种于 96孔板中, 每孔细胞数为 2 X 10 5 个, 贴壁培养 2_6 h后 , 弃去上清, 分别加入 0. 1、 0. 5、 1. 0 mg/mL的古罗糖醛酸低聚糖脂质体, 培养 24 h o 利用 Griess法检测细胞培养液中 NO 2 - 的含量, 间接获得 N0的生成量。 具体操 作如下: 从每孔培养基上清液中吸取 50 y L细胞悬液, 加入 50 y L磺胺试剂反 应 5 min, 再加入 50 y L萘基乙烯基二胺试剂, 避光孵育 5 min, 然后用酶标仪 检测 545 nm波长下的吸光值。 本申请制备的古罗糖醛酸低聚糖脂质体对 RAW264. 7细胞分 泌 N0的影响如图 8所示。
[0069] 古罗糖醛酸低聚糖脂质体对小鼠单核巨噬细胞 (RAW264. 7) 分泌 N0的影响如图 8所示, 古罗糖醛酸低聚糖脂质体能够促进 RAW264. 7细胞分泌 N0, 呈浓度依赖性 , 且效果要优于同浓度的古罗糖醛酸低聚糖。
[0070] 以上所述仅以实施例来进一步说明本申请的技 术内容, 以便于读者更容易理解 , 但不代表本申请的实施方式仅限于此, 任何依本申请所做的技术延伸或再创 造, 均受本申请的保护。 发明 概述 技术 问题 问题 的解决方 案 发明 的有益效 果