Titre de l’invention : Procédé d’acquisition d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique à balayage ciblé

L’invention concerne le domaine de l’imagerie destinée à l’observations d’échantillons biologiques, et plus particulièrement un procédé de balayage d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique composés d’une pluralité de cellules.

Lors de l’observation par microscopie d’échantillons biologiques, notamment par microscopie optique à fluorescence, un microscope traditionnel balaye tout le volume (cuboïde) englobant la structure d’intérêt.

Ceci présente toutefois un inconvénient majeur, car les fluorophores ont des effets délétères sur les cellules de l’échantillon, dont les processus biologiques peuvent être compromis par une trop longue exposition : ce phénomène est notamment qualifié de phototoxicité. Il est donc désirable, afin d’éviter leur dégradation, de limiter autant que possible l’exposition des échantillons, tant au niveau spatial que temporel.

Dans l’art antérieur, il est connu, pour tenter de limiter les effets de la phototoxicité, d’accélérer la vitesse d’imagerie en remplaçant des miroirs galvanométriques de balayage laser par des systèmes résonnants ou par des déflecteurs acousto-optiques. Toutefois ces approches ne permettent pas d’obtenir une qualité d’image aussi bonne que celles obtenues par balayage classique. De plus, elles ne résolvent pas entièrement le problème de la phototoxicité, car la même quantité de lumière incidente est délivrée à l’échantillon in fine, mais seulement plus rapidement.

Une autre méthode pour tenter de limiter l’illumination subie par les cellules, dite d’illumination adaptative, consiste à contrôler l’instrument d’acquisition pour moduler l’intensité lumineuse et maintenir un rapport signal sur bruit constant dans l’image capturée. Ceci est notamment réalisé à l’aide d’un marquage des membranes cellulaires. Néanmoins, cette approche a tendance à illuminer davantage le centre des cellules, nécessairement plus sombre que leur contour, qui n’est pas une zone d’intérêt pour l’observateur, qui cherche au contraire à étudier le contour cellulaire. En outre, même si cette approche permet de réduire l’intensité lumineuse lors de l’illumination, elle nécessite tout de même d’illuminer chaque voxel de l’échantillon, y compris ceux qui ne seraient pas d’intérêt.

L'invention a donc pour but de fournir un procédé d’acquisition d’échantillons biologiques qui surmonte ces inconvénients, c’est-à-dire en limitant autant que possible l'exposition lumineuse de l’échantillon tant au niveau spatial que temporel, tout en fournissant une image de bonne qualité.

Pour ce faire, l’invention tire parti du fait que certains échantillons biologiques, tels que les tissus cellulaires, sont organisés dans l’espace et que l’expérimentateur possède une information préalable sur ladite organisation. Ainsi, par exemple, les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) réparti sur une surface. L’invention se propose de fournir une méthode qui illumine un volume restreint à l’objet d’intérêt, telle qu’une surface épithéliale. A cet effet l’invention a pour objet un procédé d’acquisition d’image d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans une surface de référence définie par une pluralité de pixels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage d’une surface de référence, au cours duquel seul un sous-ensemble des pixels de la surface de référence, dit ensemble initial des pixels sondés, est illuminée, b) détermination de pixels brillants parmi les pixels sondés, dit ensemble de pixels sondés brillants, c) pré-sélection, au voisinage des pixels sondés brillants, d’un ensemble de pixels non illuminés pouvant appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon, dit ensemble de pixels à estimer, d) estimation de l’intensité lumineuse des pixels à estimer, e) sélection, parmi l’ensemble de pixels à estimer, à l’aide de l’estimation de leur intensité lumineuse, de pixels considérés comme brillants par application d’un critère prédéterminé, dits pixels à sonder, f) balayage de la surface de référence, au cours duquel seul l’ensemble de pixels à sonder est illuminé.

On entend par pixel au voisinage d’un pixel, un pixel contenu dans une zone de recherche définie par une distance, dite de propagation, prédéterminée. Par exemple, cette distance de propagation est comprise entre 1 et 3 pixels. Grâce au fait qu’à partir d’un pré-balayage illuminant un faible nombre de pixels, l’on détermine des pixels brillants, puis que l’on pré-sélectionne au voisinage de ces derniers des pixels susceptibles d’être eux-aussi brillants, et que l’on détermine un ensemble de pixels à balayer (sonder) lors d’une étape ultérieure dont la probabilité est grande qu’ils appartiennent à la même structure d’intérêt que les pixels brillants initiaux, on peut restreindre le balayage à ces pixels à sonder.

De cette manière, on ne sonde pas de façon systématique toute la surface de référence, ce qui limite l’illumination de la surface de référence. En outre, les pixels à sonder ayant une grande probabilité d’appartenir la structure d’intérêt de l’échantillon on ne réduit pas la vitesse d’acquisition de l’image. En effet, le procédé selon l’invention permet de rapidement aboutir à une image précise des échantillons biologiques, en particulier de tissus cellulaires car elle tire parti du fait que les contours des cellules ont naturellement tendance à suivre des lignes. En d’autres termes, on cible avantageusement et efficacement la fraction de pixels à balayer qui permette d’obtenir rapidement une image de qualité sans trop illuminer l’échantillon.

La pré-sélection, l’estimation et/ou la sélection des pixels à sonder peut notamment s’appuyer sur les connaissances de l’expérimentateur sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon.

Ainsi, de préférence, on effectue, avant l’étape de pré-balayage, une étape de collecte d’informations sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique.

La collecte d’informations peut consister à sélectionner de manière automatique les données sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique, par exemple en fonction de sa nature, qui peut être renseignée par l’utilisateur ou selon des observations préalables. De manière alternative ou complémentaire, l’utilisateur pourra renseigner de manière manuelle, par entrée de données ou par sélection dans ladite base de données, la nature de l’échantillon et/ou son organisation dans l’espace. Dans une variante il est également possible de sélectionner de manière arbitraire, ou par défaut, un certain type d’organisation dans l’espace.

Par exemple, on pourra collecter l’information selon laquelle les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) répartis sur une surface, comme une coque. Pour les échantillons biologiques tels que les organoïdes, on pourra collecter l’information selon laquelle les tissus cellulaires sont répartis sur une structure sphérique, ou encore sur une structure ovoïde pour les organoïdes d’embryons. Naturellement il ne s’agit que d’exemples et toute autre structure géométrique pourra être envisagée.

De préférence, la pré-sélection, l’estimation et/ou la sélection des pixels à sonder est effectuée à l’aide des informations collectées sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon.

De préférence, le critère prédéterminé permettant de considérer un pixel comme étant brillant est que l’intensité lumineuse du pixel considéré est supérieure à un seul prédéterminé d’intensité lumineuse. Le critère de dépassement d’un certain seuil d’intensité lumineuse est un critère efficace pour déterminer si un pixel appartient à la surface d’intérêt de l’échantillon puisque la surface d’intérêt de l’échantillon sera plus brillante que le reste de la surface de référence. De préférence, l’image de la surface de référence étant inscrite dans un fond, le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond de l’image. Le critère de dépassement d’un certain seuil d’intensité lumineuse en fonction de l’estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond de l’image permet d’éviter de confondre un pixel lumineux appartenant à la surface d’intérêt de l’échantillon avec un pixel lumineux appartenant au fond de l’image. On entend par « fond » de l’image l’ensemble des pixels n’étant pas brillants car non peuplé en sources lumineuses. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une analyse statistique de l’intensité lumineuse des pixels du fond, de préférence de sorte qu’un pixel ayant une intensité lumineuse supérieure au seuil d’intensité lumineuse ait plus de 99% de chances de ne pas appartenir à l’ensemble de pixels formant le fond de l’image. On s’assure ainsi d’une très faible chance de confondre un pixel lumineux appartenant à la surface d’intérêt de l’échantillon avec un pixel lumineux appartenant au fond de l’image. De préférence, on réitère les étapes b), c), d), e) et f) jusqu’à interruption volontaire par un opérateur ou jusqu’à détermination qu’aucun point brillant ne soit déterminé à l’étape b).

Ainsi, l’on peut obtenir une image à haute résolution sans avoir à illuminer l’ensemble ou une grande partie de l’échantillon, et donc en réduisant significativement la phototoxicité de l’acquisition. Par exemple, grâce à l’invention, pour un tissu biologique épithélial, il est possible d’obtenir une image de qualité comparable à une acquisition traditionnelle en n’illuminant que moins de 10% de la surface de référence dans lequel se trouve l’échantillon.

Selon une variante de l’invention, l’étape a) consiste à balayer tous les pixels de la surface de référence et n’illuminer que les pixels à sonder. Cette variante est bien adaptée aux cas d’utilisation d’un microscope à miroirs résonants, à miroirs galvanométriques, et à miroirs polygonaux. En revanche, elle nécessite la connaissance de la position de balayage en temps réel afin de moduler, également en temps réel, l’illumination pour éclairer les points voulus. Selon une autre variante de l’invention, l’étape a) consiste à ne balayer et illuminer que les pixels à sonder. L’avantage de cette variante est que l’acquisition d’image sera plus rapide du fait qu’un volume restreint est balayé, en plus de générer une illumination réduite. En contrepartie, dans le cas d’utilisation d’un microscope à miroirs galvanométriques, il doit être fait attention à ce que les sauts ne soient pas trop fréquents ou soient faits suffisamment lentement pour ne pas entraîner les miroirs dans un régime instable. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, les pixels de l’ensemble initial de pixels sont répartis aléatoirement dans le volume de référence.

Afin de limiter autant que possible l’illumination de l’échantillon, le sous-ensemble de pixels initialement sondés représente entre 0,01% et 0,2% des pixels de la surface de référence, de préférence entre 0,05% et 0,1 % des pixels de la surface de référence.

De préférence, l’étape d’estimation de l’intensité des pixels à estimer implique une estimation numérique de l’intensité lumineuse des pixels, par exemple par une interpolation au plus proche voisin, une inférence bayésienne ou utilise un réseau neuronal convolutif. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’étape d’estimation de l’intensité des pixels à estimer impliquant une interpolation numérique au plus proche voisin, au cours de l’étape de sélection des pixels à sonder, on sélectionne un pixel à sonder par le fait que le pixel sondé le plus proche est brillant.

L’invention concerne également un dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en oeuvre le procédé selon l’invention.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal, un microscope non-linéaire, un microscope à scanner acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. De préférence, le dispositif d’acquisition d’image comprend un système d’illumination comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique.

Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels :

[Fig. 1] la figure 1 est une vue schématique d’un dispositif d’acquisition d’image selon un mode de réalisation particulier de l’invention. [Fig. 2] la figure 2 est une vue schématique en perspective d’un volume de référence dans lequel se trouve un tissu épithélial.

[Fig. 3] la figure 3 est une diagramme schématique représentant le procédé d’acquisition d’image selon l’invention.

[Fig. 4] la figure 4 est vue schématique d’un détail du tissu cellulaire de la figure 2.

[Fig. 5] la figure 5 est vue schématique des pixels du détail V de la figure 4. Description détaillée

On a représenté à la figure 1 un exemple d’un dispositif d’acquisition 10 d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage selon un mode de réalisation particulier de l’invention.

Le dispositif d’acquisition 10 comprend un microscope, auquel est adjoint une matrice d’illumination tel qu’une matrice de micro-miroirs (« Digital Micromirror Device » en terminologie anglo-saxonne), ci-après désignée par DMD 14, placée dans un plan conjugué au plan focal, c’est-à-dire le plan de l’échantillon de l’objectif 12 du microscope à l’aide d’un ou plusieurs relais optiques 16, par exemple composé d’une pluralité de lentilles 17 et de miroirs 18, réfléchissants ou semi-réfléchissants.

En amont du DMD se trouve un laser 19, de préférence colimaté et élargi pour couvrir la surface du DMD. L’ensemble composé par le laser 19, le DMD 14 et le relais 16 constitue un système d’illumination ciblée 20. Afin d’obtenir une illumination en trois dimensions, il est possible soit de déplacer l’objectif suivant l’axe optique du microscope, soit d’utiliser une lentille électro accordable pour déplacer le plan de focalisation de l’illumination et de la détection conjointement, soit encore d’utiliser un système de téléfocalisation à deux objectifs, par exemple tel que celui décrit dans E. J. Botcherby, R. Juskaitis, M. J. Booth, and T. Wilson, “An optical technique for remote focusing in microscopy,” Opt. Commun. 281 (4), 880-887 (2008).

Dans l’exemple illustré sur les figures, la technique consistant à déplacer l’objectif est utilisée, s’agissant de la plus simple.

Le dispositif d’acquisition d’image 10 comprend en outre un dispositif de détection 21 , par exemple une caméra 22 reliée à un ordinateur 24. Le dispositif de détection 21 , en association avec le système d’illumination 20, permet d’acquérir un nombre arbitraire de points discrets, ou voxels, dans un volume de référence V dans lequel est placé un échantillon biologique B, qui est ici un tissu cellulaire épithélial, illustrés de manière schématique à la figure 2. De préférence, les voxels ainsi acquis sont à la limite de résolution du microscope 12.

On cherche ici à étudier la surface S, dite surface de référence, de l’échantillon biologique B, afin d’observer des cellules C et en particulier leur contour, comme illustré à la figure 4.

Le dispositif d’acquisition d’image 10 est apte à mettre en oeuvre un procédé d’acquisition d’image selon l’invention représenté de façon schématique à la figure 3.

De préférence, on effectue une étape de collecte d’informations 90 sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique B. Comme illustré à la figure 3, un pré-balayage 100 des pixels de la surface de référence S est effectué. Au cours de cette étape, seul un sous-ensemble des pixels de la surface de référence, dit ensemble initial de pixels sondés W ¹ _d , est illuminé par le système d’illumination 20. De préférence, le sous-ensemble des pixels de la surface de référence S représente entre 0,01% et 0,2% des pixels de la surface de référence S, de préférence entre 0,05% et 0,1% des pixels de la surface de référence S. Dans le mode de réalisation illustré sur les figures, le sous-ensemble des pixels de la surface de référence S représente 0,1% des pixels de la surface de référence S. Ainsi on illumine une très faible fraction de l’échantillon biologique B.

En pratique, concernant les microscopes à balayage utilisant un scanner (miroir galvanométrique, miroir résonant, miroir polygonal, scanner acousto-optique), deux possibilités s’offrent pour contrôler spatialement l’illumination : soit balayer tous les pixels de la surface de référence S et n’illuminer que les pixels sondés, soit ne balayer et illuminer que les pixels sondés.

Dans le premier cas, on peut par exemple laisser le dispositif d’acquisition 10 balayer toute la surface de référence S façon systématique, mais en modulant le système d’illumination 20 de façon à contrôler quels points dans l’espace seront illuminés. Cette modalité est adaptée aux miroirs résonants, aux miroirs galvanométriques, et aux miroirs polygonaux. Elle nécessite la connaissance de la position de balayage en temps réel afin de moduler, aussi en temps réel, l’illumination pour éclairer les pixels voulus.

Dans le second cas, on peut faire en sorte que le dispositif d’acquisition 10 saute d’un pixel à l’autre rapidement, c’est-à-dire sans balayer les pixels au moment du saut : ceci est possible avec les scanner acousto-optiques, et avec les miroirs galvanométriques. Lorsque dispositif d’acquisition 10 est utilisé de telle sorte, le bénéfice est que l’imagerie sera plus rapide du fait qu’une surface plus restreinte est balayée en plus de générer une illumination réduite. Cependant, dans le cas des miroirs galvanométriques, il faut faire attention à ce que les sauts ne soient pas trop fréquents ou soient faits suffisamment lentement pour ne pas entraîner les miroirs dans un régime instable.

Quelle que soit la technique utilisée, lors de cette étape de pré-balayage 100, les pixels de l’ensemble initial de pixels sondés peuvent être répartis aléatoirement dans la surface de référence S englobant la surface d’intérêt de l’échantillon B. Puis, au cours d’une étape 200, dite de détermination, on détermine les pixels brillants PB parmi les pixels sondés.

De préférence, le critère prédéterminé permettant de considérer un pixel comme étant brillant est que l’intensité lumineuse du pixel considéré est supérieure à un seul prédéterminé d’intensité lumineuse.

Dans le mode de réalisation tel qu’illustré, l’image de la surface de référence S étant inscrite dans un fond F (représenté en gris sur la figure 2), le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond F de l’image.

Plus particulièrement le seuil d’intensité lumineuse est déterminé en fonction d’une analyse statistique de l’intensité lumineuse des pixels du fond, de préférence de sorte qu’un pixel ayant une intensité lumineuse supérieure au seuil d’intensité lumineuse ait plus de 99% de chances de ne pas appartenir à l’ensemble de pixels formant le fond F de l’image.

Ensuite, au cours d’une étape suivante, dite de pré-sélection 300, on considère au voisinage des pixels sondés brillants, un ensemble de pixels non illuminés (ou non sondés), dits pixels à estimer, pouvant appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon. Certains de ces pixels sont susceptibles d’être brillants.

Ainsi, au cours d’une étape d’estimation 350, on estime l’intensité lumineuse des pixels à estimer. L’estimation peut impliquer une interpolation numérique telle qu’une interpolation au plus proche voisin préalablement balayé. Dans des variantes, l’étape de d’estimation 350 implique une estimation par inférence bayésienne ou encore utilise un réseau neuronal convolutif.

Puis, au cours d’une étape de sélection 400, on sélectionne parmi les pixels à estimer, à l’aide de l’estimation de leur intensité lumineuse, ceux considérés comme brillants par application d’un critère prédéterminé.

De préférence, le critère prédéterminé permettant de considérer un pixel comme étant brillant est que l’intensité lumineuse du pixel considéré est supérieure à un seul prédéterminé d’intensité lumineuse.

On peut, de la même manière que lors de l’étape de détermination 200, prévoir que le seuil d’intensité lumineuse soit déterminé en fonction d’une estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond F de l’image. Plus particulièrement le seuil d’intensité lumineuse peut être déterminé en fonction d’une analyse statistique de l’intensité lumineuse des pixels du fond, de préférence de sorte qu’un pixel ayant une intensité lumineuse supérieure au seuil d’intensité lumineuse ait plus de 99% de chances de ne pas appartenir à l’ensemble de pixels formant le fond F de l’image. Ces pixels sélectionnés à l’aide de l’estimation de leur intensité lumineuse, dit pixels à sonder P _s , ont une grande chance d’être effectivement brillants une fois balayés (sondés) et d’appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon B. De préférence, les étapes de pré-sélection 300, d’estimation 350 et/ou de sélection 400 des pixels à sonder P _s étant de préférence effectué à l’aide des informations collectées sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique B au cours de l’étape 90. Une fois l’étape 400 de sélection effectuée, au cours d’une étape de balayage

500, on balaie la surface de référence S, mais seuls l’ensemble de pixels à sonder P _s sont illuminé.

On a illustré à la figure 5 la façon dont fonctionne les étapes 100 à 500 détaillées ci-dessus lorsque l’étape d’estimation implique une interpolation au plus proche voisin. Sur cette figure, les pixels sont représentés par des carrés. Les pixels blancs sont des pixels non illuminés (ou non sondés), c’est-à-dire n’ayant fait l’objet d’aucune illumination résultant d’un balayage.

Les pixels pleins les plus foncés représentent des pixels sondés brillants PB, c’est-à-dire des pixels balayés au cours de l’étape de pré-balayage 100 et témoignant de la présence du contour cellulaire C. Là encore, on pourra identifier les pixels sondés brillants PB comme étant des pixels dont le seuil d’intensité lumineuse est supérieur à une valeur prédéterminée, par exemple en fonction d’une estimation de l’intensité lumineuse des pixels appartenant au fond F de l’image. Cette estimation pourra se éventuellement se faire en fonction d’une analyse statistique de l’intensité lumineuse des pixels du fond, de préférence de sorte qu’un pixel ayant une intensité lumineuse supérieure au seuil d’intensité lumineuse ait plus de 99% de chances de ne pas appartenir à l’ensemble de pixels formant le fond F de l’image

Les pixels pleins plus clairs sont des pixels qui ont été balayés mais sont non brillants PNB, c’est-à-dire hors de ce contour cellulaire, et donc sans intérêt pour l’utilisateur.

Les pixels indiqués en hachures sont les pixels résultant de l’étape 350 de pré sélection de l’ensemble de pixels non illuminés pouvant appartenir à une structure d’intérêt de l’échantillon car étant au voisinage d’au moins un pixel préalablement sondé, qu’il s’agisse de pixels brillants PB OU non brillants PNB. Autrement dit, les pixels indiqués en hachures sont l’ensemble de pixels à estimer P _E .

On entend par pixel au voisinage d’un pixel, un pixel contenu dans une zone de recherche définie par une distance, dite de propagation, prédéterminée. Par exemple, cette distance de propagation est comprise entre 1 et 3 pixels.

Parmi les pixels à estimer P _E , ceux dont l’intensité lumineuse des pixels estimée fait qu’ils sont considérés comme brillants après l’étape 400 de sélection, c’est-à-dire l’ensemble des pixels à sonder P _s , sont marqués d’un cercle. Dans le cas d’une estimation de l’intensité lumineuse implique une interpolation au plus proche voisin, on attribue au pixel considéré la valeur d’intensité lumineuse du pixel préalablement sondé le plus proche. Ainsi, comme illustré à la figure 5, les pixels à sonder P _s sélectionnés sont ceux dont la valeur estimée correspond à l’intensité lumineuse un pixel brillant PB, c’est-à-dire ceux dont le plus proche voisin est un pixel brillant PB.

Cette méthode permet de rapidement aboutir à une image précise des échantillons biologiques, en particulier de tissus cellulaires car elle tire parti du fait que les contours des cellules ont naturellement tendance à suivre des lignes. Une fois le balayage 500 de la surface de référence S effectué, au cours duquel seul l’ensemble de pixels à sonder PS est illuminé, au cours d’une étape de décision 600, il est possible de mettre en oeuvre le procédé de façon itérative, de sorte à répéter les étapes de détermination 200 des pixels brillants parmi les pixels sondés, de pré sélection 300, d’estimation 350, de sélection 400 des pixels à sonder P _s et de balayage 500 de ces pixels à sonder P _s .

L’étape de décision 600 permet à l’inverse de sortir de la boucle itérative, ici par exemple par voie de sortie 700, 800.

La première voie de sortie 700 provient d’une décision de l’utilisateur de sortir de la boucle itérative et balayer l’ensemble des pixels à sonder les plus récents afin d’établir une image haute résolution d’une surface qui sera proche de la surface d’intérêt réelle de l’échantillon B. Cette image haute résolution résulte de l’addition de tous les pixels balayés aux différentes itérations du procédé d’acquisition.

En cela l’utilisateur peut effectuer un compromis entre temps d’acquisition et précision recherchée selon son expérience ou ses besoins. En effet, sortir de la boucle itérative lors d’une des premières itérations est plus rapide. A l’inverse, sortir de boucle à la suite de plusieurs itérations est plus lent mais permet de balayer une surface présomptive dont le recouvrement avec la structure réelle est plus grand.

Une autre voie de sortie 800 est une sortie dite « automatique ». En effet, après plusieurs interpolations de la surface d’intérêt, les nouveaux pixels sondés sont choisis dans le voisinage des points brillants sondés lors des itérations précédentes. L’espace des pixels sondés se propage itérativement dans la structure d’intérêt et le processus s’arrête lorsque aucun nouveau point brillant n’est détecté lors d’une itération.

Le principe présenté est adaptable à tout type de microscope reposant sur une illumination ponctuelle de l’échantillon dans le but de générer le signal lumineux. Le ou les voxels brillants sont balayés dans l’échantillon, généralement plan par plan. Ainsi, le procédé d’acquisition d’image s’adapte à des microscopes tels que le microscope confocal utilisant des miroirs galvanométriques, résonants, ou polygonaux, les microscopes non-linéaires (fluorescence, Raman cohérent, SHG) à miroir galvanométriques, résonants ou polygonaux, les microscopes utilisant des scanners acousto-optiques, les microscopes à matrice d’illumination (« programmable array microscope » en terminologie anglo-saxonne). L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier. Il est notamment possible de prévoir l’application du procédé d’acquisition selon l’invention à d’autres échantillons biologiques que les tissus cellulaires évoquées dans la présente description, et d’utiliser des techniques de microscopie alternatives.